CN108359448A - 一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及制备方法及用途 - Google Patents

一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及制备方法及用途 Download PDF

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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Abstract

本发明公开了一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及制备方法及用途，制备方法为：(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸，用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；(2)将三条寡聚核苷酸配成相应的水溶液；(3)制备每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液；(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和硝酸银水溶液，磷酸盐缓冲溶液，硼氢化钠水溶液，搅拌，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；本发明的三枝状核酸纳米银荧光团簇具有较强荧光效应，稳定，进而提高荧光材料在分析检测中的灵敏度，并扩展核酸纳米银荧光材料的应用范围。能够检测D型氨基酸。

Description

一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物功能荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及其制备方法。
背景技术
随着纳米科学和生物技术的不断发展，纳米荧光材料在环境检测、生物识别检测、生物成像标记、生物催化等领域的应用越来越广泛，引起世界各国政府和学术界高度关注。
传统的D型氨基酸分析检测方法，有光学分析法、电化学分析法、核分析法、色谱分析法、电子显微镜分析法等。上述方法已经用于目标物的检测，检测线低、重复性较好，但需要于依赖大型分析仪器和专业操作人员，且操作费时，分析成本较高。
贵金属纳米团簇是指银、金、或铜等贵金属元素的几个到几十个原子组成的超小型分子级聚集体。其界于金属原子与金属纳米颗粒之间，粒径小于2nm，接近于电子的费米波长(约0.7nm)。在纳米材料合成中，模板试剂的选择尤为重要，目前被用为模板试剂的主要由两种聚酰胺－胺型树枝状高分子和单链核酸。核酸具有良好的生物相容性，但目前相关研究仅仅利用单链核酸合成纳米银材料，无法对纳米银团簇性能进行调控，如稳定性及荧光的调控。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有较强荧光效应的三枝状核酸纳米银荧光团簇。
本发明的第二个目的是提供一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种三枝状核酸纳米银荧光团簇检测D型氨基酸的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸，用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；
(2)将合成后的三条寡聚核苷酸分别放入水中，在室温条件下，振荡，获得浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液；
(3)取相同体积的，体积为0.5-30μL的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液与10μL浓度为200-800mM的氯化钠水溶液，补充水至100μL，混合均匀，加热至80-95℃，冷却至室温，得到每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液；
(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和0.3-5mM的硝酸银水溶液，混合均匀，加入pH＝5-8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-60min，加入0.3-5mM硼氢化钠水溶液，搅拌0.5-2h，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；
所述每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为1:1-20:1-20，所述磷酸盐缓冲溶液的加入量是每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液体积的45-55倍。
第一寡聚核苷酸的核苷酸序列优选SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
第二寡聚核苷酸的核苷酸序列优选SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；
第三寡聚核苷酸的核苷酸序列优选SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
上述第一、第二和第三寡聚核苷酸还可以选用其它序列，用于形成带有相同粘性末端的三枝状DNA。
上述方法制备的三枝状核酸纳米银荧光团簇。
上述三枝状核酸纳米银荧光团簇在检测D型氨基酸的用途。
本发明的优点：
与现有技术相比，本发明的三枝状核酸纳米银荧光团簇具有较强荧光效应，稳定，进而提高荧光材料在分析检测中的灵敏度，并扩展核酸纳米银荧光材料的应用范围。能够检测D型氨基酸。
附图说明
图1为三枝状DNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2为各实施例制备的三枝状核酸纳米银荧光团簇荧光光谱图。
图3为三枝状核酸纳米银荧光团簇为探针对D-氨基酸检测。
具体实施方式
三枝状DNA是指形像Y字的双链DNA。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸，用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；
三条寡聚核苷酸的序列分别为：
SEQ ID NO.1:
5’--3’
SEQ ID NO.3:
5’--3’
SEQ ID NO.5:
5’--3’
上述三个序列的5’的22个核苷酸组成的序列为粘性末端；
SEQ ID NO.1序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用虚线标注)与SEQ ID NO.5序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用虚线标注)反向互补：
SEQ ID NO.1序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用双线标注)与SEQ ID NO.3序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用双线标注)反向互补：
SEQ ID NO.3序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用波浪线标注)与SEQ ID NO.5序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用波浪线标注)反向互补：
(2)将合成后的三条寡聚核苷酸分别放入水中，在室温条件下，振荡，获得浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸(SEQ ID NO.1)水溶液、第二寡聚核苷酸(SEQ ID NO.3)水溶液和第三寡聚核苷酸(SEQ ID NO.5)水溶液；
(3)取体积均为0.5μL、浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液与10μL浓度为200mM的氯化钠水溶液，补充水至100μL，混合均匀，加热至80℃，冷却至室温，得到每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液(见图1)；
(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和0.3mM的硝酸银水溶液，混合均匀，加入pH＝5的磷酸盐缓冲溶液，搅拌5min，加入0.3mM硼氢化钠水溶液，搅拌0.5h，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；
所述每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为1:1:1，所述磷酸盐缓冲溶液的加入量是每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液体积的45倍。
实施例2
一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸:用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；
三条寡聚核苷酸的序列分别为：
SEQ ID NO.2:5’-ACCCTTACCCTTACCCTTACCC -3’
SEQ ID NO.4:5’-ACCCTTACCCTTACCCTTACCC -3’
SEQ ID NO.6:5’-ACCCTTACCCTTACCCTTACCC -3’
上述三个序列的5’的22个核苷酸组成的序列为粘性末端；
SEQ ID NO.2序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用虚线标注)与SEQ ID NO.6序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用虚线标注)反向互补：
SEQ ID NO.2序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用双线标注)与SEQ ID NO.4序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用双线标注)反向互补：
SEQ ID NO.4序列的第37-50个核苷酸组成的序列(用波浪线标注)与SEQ ID NO.6序列的第23-36个核苷酸组成的序列(用波浪线标注)反向互补：
(2)将合成后的三条寡聚核苷酸分别放入水中，在室温条件下，振荡，获得浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸(SEQ IDNO.2)水溶液、第二寡聚核苷酸(SEQ ID NO.4)水溶液和第三寡聚核苷酸(SEQ ID NO.6)水溶液；
(3)取体积均为15μL、浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液与10μL浓度为500mM的氯化钠水溶液，补充水至100μL，混合均匀，加热至90℃，冷却至室温，得到每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液；
(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和2.5mM的硝酸银水溶液，混合均匀，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液，搅拌30min，加入0.3mM硼氢化钠水溶液，搅拌1.5h，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；
所述每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为1:10:10，所述磷酸盐缓冲溶液的加入量是每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液体积的50倍。
实施例3
一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸:用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；
三条寡聚核苷酸的序列同实施例1的三条寡聚核苷酸的序列；
(2)将合成后的三条寡聚核苷酸分别放入水中，在室温条件下，振荡，获得100μM的第一寡聚核苷酸(SEQ ID NO.1)水溶液、第二寡聚核苷酸(SEQ ID NO.3)水溶液和第三寡聚核苷酸(SEQ ID NO.5)水溶液；
(3)取体积均为30μL、浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液与10μL浓度为800mM的氯化钠水溶液，补充水至100μL，混合均匀，加热至95℃，冷却至室温，得到每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液；
(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和5mM的硝酸银水溶液，混合均匀，加入pH＝8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌60min，加入5mM硼氢化钠水溶液，搅拌2h，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；
所述每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为1:20:20，所述磷酸盐缓冲溶液的加入量是每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液体积的55倍。
本发明以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所述的寡聚核苷酸为例，但并不限制本发明，凡能以碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸:用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA都可以用于本发明。
实施例4
以实施例1制备的三枝状核酸纳米银荧光团簇为荧光探针，取50μl,分别加入2μlD-氨基酸氧化酶和10μl氯化铁，加入D-丙氨酸水溶液，使终浓度分别为：10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M，用水补齐200μl，在室温下反应45min实验通过荧光强度的变化实现D-丙氨酸的检测。此时体系里面D-氨基酸氧化酶浓度为0.8U/ml，氯化铁浓度0.1mM，D-丙氨酸终浓度10-3-10-10M，结果见图3。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种三枝状核酸纳米银荧光团簇及制备方法及用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctaaccct aaccctaacc ctcacgctgt cctaaccatg accgtcgaag 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acccttaccc ttacccttac cccacgctgt cctaaccatg accgtcgaag 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctaaccct aaccctaacc ctcttcgacg gtcatgtact agatcagagg 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acccttaccc ttacccttac cccttcgacg gtcatgtact agatcagagg 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctaaccct aaccctaacc ctcctctgat ctagtagtta ggacagcgtg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccttaccc ttacccttac cccctctgat ctagtagtta ggacagcgtg 50

Claims (4)

1.一种三枝状核酸纳米银荧光团簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据碱基互补配对原则，设计并合成三条寡聚核苷酸，用于形成每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA；
(2)将合成后的三条寡聚核苷酸分别放入水中，在室温条件下，振荡，获得浓度均为100μM的第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液；
(3)取相同体积的，体积为0.5-30μL的所述第一寡聚核苷酸水溶液、第二寡聚核苷酸水溶液和第三寡聚核苷酸水溶液与10μL浓度为200-800mM的氯化钠水溶液，补充水至100μL，混合均匀，加热至80-95℃，冷却至室温，得到每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液；
(4)取每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液和0.3-5mM的硝酸银水溶液，混合均匀，加入pH＝5-8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-60min，加入0.3-5mM硼氢化钠水溶液，搅拌0.5-2h，得到三枝状核酸纳米银荧光团簇；
所述每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA、硝酸银和硼氢化钠的摩尔比为1:1-20:1-20，所述磷酸盐缓冲溶液的加入量是每枝都带有相同粘性末端的三枝状DNA溶液体积的45-55倍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述第一寡聚核苷酸的核苷酸序列用SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示；所述第二寡聚核苷酸的核苷酸序列用SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示；所述第三寡聚核苷酸的核苷酸序列用SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求1或2的方法制备的三枝状核酸纳米银荧光团簇。
4.权利要求3的三枝状核酸纳米银荧光团簇在检测D型氨基酸的用途。
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