CN104259453A - 一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米棒的合成，金纳米棒二聚体组装，金纳米棒二聚体表面配体修饰，金纳米棒二聚体不对称修饰，细胞内金纳米棒二聚体表征等步骤。本发明充分利用金纳米棒的表面性质，通过其端面和侧面各异的化学性质，将亲疏水性不同的配体分别修饰于组装成二聚体的金纳米棒表面，再根据配体的亲-疏水性不同使得高聚物只在侧面修饰，而裸露出的端面可以用于穿膜肽的修饰。这样不仅能够保证金纳米棒在细胞中的稳定性，还能使其进入细胞的效率大大增加。本发明提供了一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，得到了结构均一，生物相容性好的金纳米棒二聚体。

Description

一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法
技术领域
本发明涉及一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
随着纳米技术的发展，越来越多的纳米材料被运用于生物体中发挥其独特的光电性质。其中，金纳米材料以其独特的光学特性和良好的生物相容性受到了广泛的研究和应用。金纳米棒是一种棒状的金纳米粒子，其存在着端面和侧面两个等离子吸收峰，其高效的光热转换效率使其成为生物医学领域一种优异的治疗手段。但是，传统的晶种生长法制得的金纳米棒，在制备过程中使用十六烷基三甲基溴化铵作为稳定剂。这种高聚物本身对生物体具有一定的毒性，需要对制得的金纳米棒进行合适的改性才能运用于生物体中。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，其得到了结构均一，生物相容性好的金纳米棒二聚体。
本发明的技术方案，一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，步骤为：
（1）金纳米棒的合成：采用晶种生长法合成横向等离子吸收峰控制在650nm的金纳米棒GNR；
（2）金纳米棒二聚体组装：在步骤（1）得到的金纳米棒GNR的端面修饰分子量为1000的聚乙二醇PEG-1000，离心重悬后再分别修饰DNA1及DNA2，分别得到GNR-DNA1及GNR-DNA2的复合体，再将两种复合体混匀，得到金纳米棒二聚体；
（3）金纳米棒二聚体表面配体修饰：将步骤（2）得到的金纳米棒二聚体侧面修饰上正十八硫醇配体，得到配体修饰的金纳米棒二聚体；
（4）金纳米棒二聚体不对称修饰：将步骤（3）得到的配体修饰的金纳米棒二聚体与两亲高聚物聚苯乙烯-聚乙二醇PS-PEG混匀并油浴，得到只有侧面修饰有高聚物的金纳米棒二聚体；
（5）细胞内金纳米棒二聚体表征：将经过步骤（4）改性的金纳米棒二聚体与穿膜肽TAT偶联，得到金纳米棒二聚体-TAT复合体，将其与细胞孵育培养后，对其紫外-可见光谱进行扫描表征。
具体如下：
（1）金纳米棒的合成：
①晶种合成：洁净的三角烧瓶中取0.1mL的4g/L的氯金酸溶液边搅拌边加入到1mL 0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液CTAB中，溶液颜色由无色变成黄褐色；然后加入 0.12mL 新配制的0.01M 硼氢化钠溶液快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
②金纳米棒生长：取5mL 4g/L氯金酸溶液加入到5mL 0.2 M 十六烷基三甲基溴化铵溶液中，并加入4mL超纯水；另取0.125mL 0.01M硝酸银溶液和65μL 0.1M抗坏血酸溶液分别加入到上述混合体系中，28.0℃下搅拌反应2min，溶液由褐色变成无色；最后加入 0.05mL步骤 ①所得晶种溶液搅拌20s之后28.0℃静置反应4h，得到金纳米棒溶液；
（2）金纳米棒二聚体组装：
取100mL上述步骤②制得的金纳米棒溶液，7500 r/min离心10min，去上清，沉淀重悬于10mL 5mM CTAB溶液中；将金纳米棒与PEG-1000以摩尔浓度1:100的比例混匀，静置12h之后取5mL修饰好PEG金纳米棒将其与DNA1以摩尔浓度1:30的比例混匀；另取5mL修饰好PEG金纳米棒将其与DNA2混匀，分别静置12h之后，分别7500 r/min离心10min，并重悬于5mL 5mM CTAB溶液中，得到GNR-DNA1及GNR-DNA2的复合体，再将两种复合体等体积混匀，静置12h之后得到金纳米棒二聚体；
（3）金纳米棒二聚体表面配体修饰：
将步骤（2）得到的金纳米棒二聚体7500 r/min离心10min并重悬于超纯水中，此过程重复3次；取120μL 10mM正十八硫醇的乙醇溶液加入到250μL金纳米棒二聚体溶液中混匀；
（4）金纳米棒二聚体不对称修饰：
将670μL二甲基甲酰胺DMF与80μL 8mg/mL PS-PEG混匀之后加入到上述步骤（3）修饰好正十八硫醇的金纳米棒二聚体中，94℃油浴2h，冷却至室温，得到只有侧面修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体；
（5）细胞内金纳米棒二聚体表征：
取1mL上述步骤（4）修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体加入到5mL超纯水中，7500 r/min离心10min 沉淀重悬于200μL超纯水中；取7μL的所述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体滴加到碳膜支持的铜网上，进行透射电镜表征；
另取其500μL上述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体与2μL 5mM TAT溶液混匀，偶联12h后，7500 r/min离心10min，沉淀重悬于500μL细胞培养液（90% 1640基础培养基+10%胎牛血清）中，将其与Hela细胞混匀，37℃培养12h之后，利用紫外-可见光谱表征。
所述DNA的编号、序列及长度如表1所示。
表1  DNA的编号、序列及长度
编号 序列(5’-3’) 长度
DNA1 TAGGAATAGTTATAAAAAAAAAAAA-SH 25
DNA2 TTATAACTATTCCTAAAAAAAAAAA-SH 25
注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
本发明的有益效果：本发明充分利用金纳米棒的表面性质，通过其端面和侧面各异的化学性质，将亲疏水性不同的配体分别修饰于组装成二聚体的金纳米棒表面，再根据配体的亲-疏水性不同使得高聚物只在侧面修饰，而裸露出的端面可以用于穿膜肽的修饰。这样不仅能够保证金纳米棒在细胞中的稳定性，还能使其进入细胞的效率大大增加。本发明提供了一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，得到了结构均一，生物相容性好的金纳米棒二聚体。
附图说明
图1金纳米棒二聚体不对称改性之后的透射电镜图。
图2 金纳米棒二聚体在细胞内的紫外-可见光图谱。
具体实施方式
实施例1
所有的玻璃仪器都用王水浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2 MΩ的Milli-Q 超纯水。
（1）金纳米棒的合成：
①晶种合成：洁净的三角烧瓶中取0.1mL的4g/L的氯金酸溶液边搅拌边加入到1mL 0.2M的CTAB中，溶液颜色由无色变成黄褐色。然后加入 0.12mL 新配制的0.01M 硼氢化钠溶液快速搅拌 2 min。溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色。
②金纳米棒生长：取5mL 4g/L氯金酸溶液加入到5mL 0.2M CTAB中，并加入4mL超纯水。另取0.125mL 0.01M硝酸银溶液和65μL 0.1M 抗坏血酸溶液分别加入到上述混合体系中， 28.0℃下搅拌反应 2 min，溶液由褐色变成无色。最后加入 0.05mL晶种溶液搅拌20s之后28.0℃静置反应4h，得到金纳米棒溶液。
（2）金纳米棒二聚体组装：
取100mL上述制得的金纳米棒溶液，7500r/min离心10min，去上清，沉淀重悬于10mL 5mM CTAB溶液中。将金纳米棒与PEG-1000以摩尔浓度1:100的比例混匀，静置12h之后取5mL修饰好PEG金纳米棒将其与DNA1以摩尔浓度1:30的比例混匀。另取5mL与DNA2混匀，分别静置12h之后，分别7500 r/min离心10min并重悬于5mL 5mM CTAB溶液中，得到GNR-DNA1和GNR-DNA2的复合体，再将两种复合体等体积混匀，静置12h之后得到金纳米棒二聚体。
（3）金纳米棒二聚体表面配体修饰：
将上述得到的金纳米棒二聚体7500 r/min离心10min并重悬于超纯水中，此过程重复3次。取120μL 10mM正十八硫醇的乙醇溶液加入到250μL金纳米棒二聚体溶液中，混匀。
（4）金纳米棒二聚体不对称修饰：
将670μL DMF与80μL 8mg/mL PS-PEG混匀之后加入到上述修饰好正十八硫醇的金纳米棒二聚体中，94℃油浴2h，冷却至室温，得到只有侧面修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体。
（5）细胞内金纳米棒二聚体表征：
取1mL上述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体加入到5mL超纯水中，7500 r/min离心10min 沉淀重悬于200μL超纯水中。取7μL的所述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体滴加到碳膜支持的铜网上，进行透射电镜表征；另取500μL上述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体，将其与2μL 5mM TAT溶液混匀，偶联12h后，7500 r/min离心10min，沉淀重悬于细胞培养液中。取500μL含有金纳米棒二聚体的细胞培养液与Hela细胞混匀，37℃培养12h之后，利用紫外-可见光谱表征。

Claims (3)

1.一种具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，其特征在于步骤为：
（1）金纳米棒的合成：采用晶种生长法合成横向等离子吸收峰控制在650nm的金纳米棒GNR；
（2）金纳米棒二聚体组装：在步骤（1）得到的金纳米棒GNR的端面修饰分子量为1000的聚乙二醇PEG-1000，离心重悬后再分别修饰DNA1及DNA2，分别得到GNR-DNA1及GNR-DNA2的复合体，再将两种复合体混匀，得到金纳米棒二聚体；
（3）金纳米棒二聚体表面配体修饰：将步骤（2）得到的金纳米棒二聚体侧面修饰上正十八硫醇配体，得到配体修饰的金纳米棒二聚体；
（4）金纳米棒二聚体不对称修饰：将步骤（3）得到的配体修饰的金纳米棒二聚体与两亲高聚物聚苯乙烯-聚乙二醇PS-PEG混匀并油浴，得到只有侧面修饰有高聚物的金纳米棒二聚体；
（5）细胞内金纳米棒二聚体表征：将经过步骤（4）改性的金纳米棒二聚体与穿膜肽TAT偶联，得到金纳米棒二聚体-TAT复合体，将其与细胞孵育培养后，对其紫外-可见光谱进行扫描表征。
2.根据权利要求1所述具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，其特征在于具体步骤为：
（1）金纳米棒的合成：
①晶种合成：洁净的三角烧瓶中取0.1mL的4g/L的氯金酸溶液边搅拌边加入到1mL 0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液CTAB中，溶液颜色由无色变成黄褐色；然后加入 0.12mL 新配制的0.01M 硼氢化钠溶液快速搅拌2min，溶液颜色即由黄褐色变为浅棕色；
②金纳米棒生长：取5mL 4g/L氯金酸溶液加入到5mL 0.2 M 十六烷基三甲基溴化铵溶液中，并加入4mL超纯水；另取0.125mL 0.01M硝酸银溶液和65μL 0.1M抗坏血酸溶液分别加入到上述混合体系中，28.0℃下搅拌反应2min，溶液由褐色变成无色；最后加入0.05mL步骤 ①所得晶种溶液搅拌20s之后28.0℃静置反应4h，得到金纳米棒溶液；
（2）金纳米棒二聚体组装：
取100mL上述步骤②制得的金纳米棒溶液，7500 r/min离心10min，去上清，沉淀重悬于10mL 5mM CTAB溶液中；将金纳米棒与PEG-1000以摩尔浓度1:100的比例混匀，静置12h之后取5mL修饰好PEG金纳米棒将其与DNA1以摩尔浓度1:30的比例混匀；另取5mL修饰好PEG金纳米棒将其与DNA2混匀，分别静置12h之后，分别7500 r/min离心10min，并重悬于5mL 5mM CTAB溶液中，得到GNR-DNA1及GNR-DNA2的复合体，再将两种复合体等体积混匀，静置12h之后得到金纳米棒二聚体；
（3）金纳米棒二聚体表面配体修饰：
将步骤（2）得到的金纳米棒二聚体7500 r/min离心10min并重悬于超纯水中，此过程重复3次；取120μL 10mM正十八硫醇的乙醇溶液加入到250μL金纳米棒二聚体溶液中混匀；
（4）金纳米棒二聚体不对称修饰：
将670μL二甲基甲酰胺DMF与80μL 8mg/mL PS-PEG混匀之后加入到上述步骤（3）修饰好正十八硫醇的金纳米棒二聚体中，94℃油浴2h，冷却至室温，得到只有侧面修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体；
（5）细胞内金纳米棒二聚体表征：
取1mL上述步骤（4）修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体加入到5mL超纯水中，7500 r/min离心10min 沉淀重悬于200μL超纯水中；取7μL的所述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体滴加到碳膜支持的铜网上，进行透射电镜表征；
另取500μL上述修饰有PS-PEG的金纳米棒二聚体与2μL 5mM TAT溶液混匀，偶联12h后，7500 r/min离心10min，沉淀重悬于500μL细胞培养液中，将其与Hela细胞混匀，37℃培养12h之后，利用紫外-可见光谱表征。
3.根据权利要求1、2所述具有生物相容性的金纳米棒二聚体不对称修饰方法，其特征在于DNA1序列为5′-TAGGAATAGT TATAAAAAAA AAAAA -SH -3′；
DNA2序列为5′-TTATAACTAT TCCTAAAAAA AAAAA -SH -3′。
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