CN105622620B - 一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法通过将水溶性卟啉分子与可溶性硝酸盐在酸性、避光以及室温的条件下进行反应，得到包含有卟啉光敏剂的反应体系，该体系经过处理后，得到卟啉光敏剂，为一种纳米聚集体，具有细胞成像和光动力治疗特性。此外，由本发明提供的制备方法工艺简单，无需复杂的合成步骤以及后处理步骤，易于操作，成本较为低廉，因此，易于生产上的推广。

Description

一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料制备领域，特别地，涉及一种光敏剂的制备方法，更具体地涉及一种卟啉光敏剂的制备方法，该卟啉光敏剂具有可视化动力治疗特性。

背景技术

光动力作用是指在光的作用下，在光敏剂的参与下，使机体细胞或生物分子发生机能或者形态的变化，严重时可以使细胞发生损伤或坏死。由于这种作用必须有氧参加，所以又称为光敏化-氧化作用，在化学上称这种作用为光敏化作用，在生物学和医学上称为光动力作用。

利用上述这种光动力作用治疗疾病的方法，被称为光动力治疗法(PDT)。光动力治疗法为一种能够根治早期癌症并减小癌症晚期肿瘤尺寸的一种临床方法。该方法是通过将光、光敏剂和分子氧(³O₂)相互作用为基础，并且使得光敏剂暴露在适当的光线下，从而产生具有细胞毒性的氧物种(ROS)，与此同时转移到组织细胞，该氧物种高效选择性的对病变细胞和组织产生破坏。

近年来，PDT技术也被运用于一些非肿瘤性疾病，如尖锐湿疣、牛皮癣、鲜红斑痣、类风湿性关节炎、眼底黄斑病变、血管成形术后再狭窄等疾病的治疗。

光敏剂作为光动力治疗当中的药物是研究光动力治疗发展的关键所在。光敏剂是一类特殊的化学物质，其基本作用为传递能量：它能够吸收光子，在被激发后能够将吸收的光能迅速传递给其它分子，并使自身回到基态。

在1993～1997年间，第一个商业化的光敏剂是Porfimer Sodium，其成功在美国、加拿大、欧盟、日本及韩国陆续批准上市，使得PDT领域的研究逐渐活跃并受到重视。近年来，随着光动力治疗药物的研发逐步增多及激光设备技术的提高，PDT的研究迅速发展并迎来了一个新的高峰。

目前，已批准上市或正在临床研究的新的光敏剂近十种，越来越多的光敏剂正在被研究和制备当中，大多数光敏剂通过化学合成等方法进行制备，除了成本高，制备过程不环保等问题，多步反应合成分子所导致的制备成本的增加也成为光敏剂市场化的严重阻碍。为了适应市场化的需求，寻求一种制备方法简单，价格低廉的光敏剂具有非常大的研究意义，同时也为研究人员提出了巨大挑战。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：通过将水溶性卟啉分子与可溶性硝酸盐在酸性、避光以及室温的条件下进行反应，得到包含有卟啉光敏剂的反应体系，最终所得卟啉光敏剂为一种纳米聚集体，且具有细胞成像和光动力治疗特性，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将水溶性卟啉和可溶性硝酸盐加入到水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉可由式Ⅰ所示：

其中，R为极性基团，优选为磺酸基芳烃基、N-烷基吡啶基及其衍生物基团如N-烷基苯并吡啶基、氨基芳烃基、季铵基芳烃基或羧基芳烃基；

2)将步骤1)中的体系的pH调至酸性；

3)在室温和避光条件下，将步骤2)中调节pH后的体系静置，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂，为一种纳米聚集体，该纳米聚集体的尺寸为200～500nm。

由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂在光动力治疗方面中的应用。

本发明提供的制备方法工艺简单，无需复杂的合成步骤以及后处理步骤，易于操作，成本较为低廉，因此，易于生产上的推广。

另外，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂为一种纳米聚集体，且该纳米聚集体的尺寸均一，具有细胞成像功能和光动力治疗特性，此外，该卟啉光敏剂对细胞基本无毒害，不影响细胞活力。

附图说明

图1示出实施例1所得的卟啉光敏剂的扫描电镜照片；

图2示出实施例1所得的卟啉光敏剂的透射电镜照片；

图3示出实施例4所得的卟啉光敏剂的扫描电镜照片；

图4示出实施例7所得的卟啉光敏剂在细胞核上的成像照片；

图5示出在细胞成像的试验例中培养细胞的细胞照片；

图6示出商业细胞核染料Hoechst33258在培养细胞的细胞核上的成像照片；

图7示出由图4、图5与图6叠加而成的照片；

图8示出在光动力治疗特性测试的试验例中的培养细胞在紫外光作用前的共聚焦成像照片；

图9示出在光动力治疗特性测试的试验例中的培养细胞在紫外光作用后的共聚焦成像照片；

图10示出在光动力治疗特性测试的试验例中的培养细胞在紫外光作用前后的细胞存活率对比图。

附图标号

1-紫外光作用前；

2-紫外光作用后。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

根据本发明的一方面，提供了一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法包括以下三个步骤：

步骤一、将水溶性卟啉和可溶性硝酸盐加入到水中，混合均匀。

在上述步骤一中，所述水溶性卟啉由式Ⅰ所示：

其中，R为极性基团，特别地，优选为磺酸基芳烃基、N-烷基吡啶基及其衍生物基团、氨基芳烃基、季铵基芳烃基或是羧基芳烃基。

当R为磺酸基芳烃基时，R选自下述结构式中的一种：

其中，X为Cl、Me、OMe或F。

当R为N-烷基吡啶基及其衍生物基团，R选自下述结构式中的一种：

当R为氨基芳烃基时，R选自下述结构式中的一种：

当R为季铵基芳烃基时，R选自下述结构式中的一种：

当R为羧基芳烃基时，R选自下述结构式中的一种：

在优选的实施方式中，所述基团R为磺酸基芳烃基以及羧基芳烃基。进一步的，R选自下述结构中的一种：

在优选的实施方式中，所述基团R为磺酸基芳烃基。进一步的，R选自下述结构中的一种：

在更优选的实施方式中，R选自下述结构式中的一种：

在上述步骤一中，所述可溶性硝酸盐并没有特别地限制，选用的硝酸盐能在水中形成均一的水溶液即可。

作为可溶性硝酸盐的实例，具体提及：硝酸钠、硝酸铅、硝酸钡、硝酸锌、硝酸镉、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铈、硝酸铬、硝酸铋、硝酸镍、硝酸银、硝酸钯、硝酸铂、硝酸铱和镧系金属硝酸盐中的一种或多种。

作为镧系金属硝酸盐的实例，具体提及：硝酸镧、硝酸铈、硝酸镨、硝酸钕、硝酸钷、硝酸钐、硝酸铕、硝酸钆、硝酸铽、硝酸镝、硝酸钬、硝酸铒、硝酸铥、硝酸镱和硝酸镥。

在优选的实施方式中，所述可溶性硝酸盐选自下述硝酸盐中的一种或多种：硝酸钠、硝酸钙、硝酸锌、硝酸铬、硝酸镉、硝酸铋、硝酸镍和硝酸铒。

在进一步优选的实施方式中，所述可溶性硝酸盐选自下述硝酸盐中的一种或多种：硝酸钠、硝酸钙、硝酸锌、硝酸铬、硝酸镉、硝酸铋、硝酸镍和硝酸铒。

在更进一步优选的实施方式中，所述可溶性硝酸盐选自下述硝酸盐中的一种或多种：硝酸钠、硝酸铋、硝酸铬和硝酸铒。

在上述步骤一中，作为水的实例，具体提及：自来水、蒸馏水、矿泉水和去离子水。

在优选的实施方式中，所述水溶性卟啉和可溶性硝酸盐的摩尔比为使得水溶性卟啉：可溶性硝酸盐＝1：(0.1～25)，进一步的，摩尔比优选1：(0.5～10)，进一步的，摩尔比优选为1：(1～8)，摩尔比最优选为1：(1.2～4)。

在上述步骤一中，水溶性卟啉分子和可溶性硝酸盐的添加方并不受到具体的限制，只要二者能够在水中形成均一稳定的溶液即可。

根据本发明，可以将水溶性卟啉分子和可溶性硝酸盐直接添加到水中，也可以将水溶性卟啉分子和可溶性硝酸盐分别配置成一定摩尔浓度的水溶液，然后再将各自的水溶液加入到水中，形成稳定均一的溶液。

步骤二、将步骤一中的体系的pH调至酸性。

在上述步骤二中，特别地，选用无机酸调节体系的pH值，其中无机酸的种类并没有特别的限制，可根据实际需求选择无机酸中的一种或多种。

作为无机酸的实例，具体提及：盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碘酸、硼酸、碳酸、偏磷酸、焦磷酸、次磷酸、硅酸和氢溴酸。

在优选的实施方式中，无机酸为下述所提及酸中的一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸和碳酸。

在进一步优选的实施方式中，无机酸为下述所提及酸中的一种或多种：盐酸、硝酸和硫酸。

在更进一步优选的实施方式中，无机酸为下述所提及酸中的一种或多种：盐酸和硝酸。

在上述步骤二中，无机酸的浓度并没有特别地限制，可根据实际需求，配制无机酸的浓度，然后利用配制好浓度的无机酸用来调节体系的pH。

特别地，选用无机酸将体系的pH值调至在0.1～5，进一步的，优选1.0～4，更优选为2～3。

步骤三、在室温和避光条件下，将步骤二中调节pH后的体静置，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

在上述步骤三中，特别地，静置的时间至少6为小时，进一步的，静置的时间至少为12小时，更进一步的，静置的时间至少为18小时，静置时间最优选为24小时。

在上述步骤三中，最终获得包含有卟啉光敏剂的反应体系为一种固液分离的非均相体系。其中，固态物质为最终产物，即卟啉光敏剂。

在上述步骤三中，反应体系静置后，可通过自然沉降得到最终产物，也可以通过给予的外力使得固态物质沉降得到最终产物，特别地，可通过离心作用使得固态物质得到沉降。

在上述步骤三中，最终得到的包含有卟啉光敏剂的反应体系经过沉降后，对得到的沉淀物，即卟啉光敏剂依次进行洗涤，冻干。

其中，选用去离子水对沉淀物进行洗涤。

其中，洗涤的次数并不受到具体的限制，可根据实际需求选择洗涤的次数，只要能将沉淀物洗涤干净即可。

特别地，将沉淀物用去离子水洗涤1～5次，为了提高作业效率且达到洗净沉淀物上吸附的杂质离子的目的，优选将沉淀物洗涤2～4次，进一步的，优选3次。

其中，冻干的条件为在真空条件下且温度为-40℃。

综合而言，在上述步骤二中，用无机酸将体系调节至酸性，特别地，使得体系的pH值为0.1～5，在酸性环境下，有利于卟啉光敏剂在水溶液中的充分生长，从而得到纳米聚集体。

综上所述，本发明通过简单复配的方法，制备得到具有细胞成像和光动力治疗特性的卟啉光敏剂，且在制备过程中用水作溶剂，简单环保。此外，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂为一种具有纳米尺寸的聚集体，且尺寸均一。

由本发明提供的制备方法最终得到的卟啉光敏剂，为一种纳米聚集体。该纳米聚集体为一种内部空心的棒状结构或是球形结构，该聚集体尺寸为200～500nm。

根据本发明的另一方面，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂用作光动力治疗领域中的光敏剂。

由本发明提供的制备方法最终得到的卟啉光敏剂为一种能够被细胞摄取的产品，该卟啉光敏剂被细胞摄取后，对细胞并无毒害，但是在光刺激下，却能够产生对细胞有毒的单线态氧，从而达到杀死癌细胞的功能。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明。不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

1)将0.12g水溶性卟啉和0.048g硝酸铋加入100ml水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉由下式所示：

其中，R为

2)选用10mol/l盐酸将步骤1)中体系的pH调至2.5；

3)将调节好pH后的体系在避光和室温条件下静置12小时，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

经过扫描电镜测试，所得卟啉光敏剂为纳米聚集体，其形貌为棒状结构，平均尺寸约为400nm，如图1所示；经透射电子显微镜测试，该聚集体为空心结构，如图2所示。

实施例2

1)将0.12g水溶性卟啉和0.04g硝酸铬加入100ml水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉由下式所示：

其中，R为

2)选用10mol/l的盐酸将步骤1)中体系的pH调至2.8；

3)将调节好pH后的体系在避光和室温条件下静置16小时，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

经过扫描电镜测试，所得卟啉光敏剂的平均尺寸为400nm。

实施例3

1)将0.12g水溶性卟啉和0.04g硝酸铒加入100ml水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉由下式所示：

其中，R为

2)选用10mol/l的硫酸将步骤1)中体系的pH调至4；

3)将调节好pH后的体系在避光和室温条件下静置6小时，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

经过扫描电镜测试，所得卟啉光敏剂的平均尺寸为400nm，透射电子显微镜测试显示所得纳米聚集体为空心结构。

实施例4

1)将0.12g水溶性卟啉和0.008g硝酸钠加入100ml水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉由下式所示：

其中，R为

2)选用10mol/l的硫酸将步骤1)中体系的pH调至1；

3)将调节好pH后的体系在避光和室温条件下静置24小时，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系。

经过扫描电镜测试，所得卟啉光敏剂的平均尺寸为200nm，经过扫描电镜测试显示所得纳米聚集体为球形结构，结果如图3所示。

试验例

扫描电子显微镜测试

通过扫描电子显微镜对实施例1所得的卟啉光敏剂进行测试，其结果如图1所示。

通过图1可以得出，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂为纳米聚集体，纳米聚集体的形貌为棒状结构，且尺寸均一。

通过如3可以得出，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂为纳米聚集体，纳米聚集体的相貌为球形结构，且尺寸均一。

透射电子显微镜测试

通过透射电子显微镜对实施例1所得的卟啉光明进行测试，其结果如图2所示，其聚集体为空心结构。

通过图2可以得出，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂为一种空心结构。

细胞成像测试

将实施例1中所得的卟啉光敏剂与海拉细胞采用下述方法进行细胞培养：将实施例1中所得的卟啉光敏剂配成浓度为10μM/l的水溶液，将海拉细胞(细胞密度为5×10³个/孔，150μl/孔)种植在96孔板中24h，然后将卟啉光敏剂水溶液加入到种植好的细胞中培养4小时。然后杀死细胞，选用商业细胞核染料—Hoechst33258对上述培养细胞的细胞核进行标记，然后利用激光共聚焦进行测试，结果如图分别如图4、图5和图6所示。

将上述图4、图5和图6进行叠加，获得图7。

由图4、图6以及与图7对比可以得知，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂和商业细胞核染料的成像位置、形态和数量一致，以及将图4与图5对比可以得出，卟啉光敏剂具有在细胞核上成像的功能。

光动力治疗特性测试

一、将实施例1中所得的卟啉光敏剂与海拉细胞采用下述方法进行细胞培养：将实施例1中所得的卟啉光敏剂配成两组浓度均为10μM/l的水溶液，再将两组海拉细胞(每组细胞密度均为5×10³个/孔，150μl/孔)分别种植在96孔板中并培养24h，两组培养细胞中均加入配制好的卟啉光敏剂水溶液培养4小时，然后用PBS缓冲液洗去未进入细胞的光敏剂。选择其中一组培养好的细胞在365nm紫外光下照射10分钟，然后两组培养细胞均继续培养48小时。

通过激光共聚焦显微镜对紫外光作用前和紫外光作用后的培养细胞进行测试，结果分别如图8和图9所示。

由图8、图9可以得出：由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂在紫外光的作用下，能够产生对细胞有毒的单线态氧，从而具备杀死癌细胞的功能，且具有较强的杀死细胞的能力。

二、分别完成下述两组实验：

1)将实施例71中所得光敏剂分别配成0.01μM/l、0.1μM/l、1μM/l、5μM/l、10μM/l、20μM/l、50μM/l和100μM/l的水溶液，然后将八组海拉细胞(每组细胞密度均为5×10³个/孔，150μl/孔)分别种植在96孔板中并培养24h，将上述不同浓度的光敏剂水溶液分别加入到每组种植好的海拉细胞中培养4小时后，用PBS缓冲液洗去未进入细胞的光敏剂，然后继续培养48小时。

2)将实施例1中所得光敏剂再次分别配成0.01μM/l、0.1μM/l、1μM/l、5μM/l、10μM/l、20μM/l、50μM/l和100μM/l的水溶液，然后将八组海拉细胞(每组细胞密度为5×10³个/孔，150μl/孔)分别种植在96孔板中24h，将上述不同浓度的光敏剂水溶液分别加入到每组种植好的海拉细胞中，4小时后，将各组培养好的细胞在365nm紫外光下照射10分钟后，继续培养48小时。

最后通过采用磺基罗丹明B染色法(sulforhodamine B，SRB)对紫外光照射前后的培养细胞的细胞存活率进行测试，结果如图10所示。

其中，细胞存活率可用下列公式计算：

细胞存活率％＝(A540nm处被处理后的细胞/A540nm处控制细胞数)×100％，其中A540nm为染色后细胞在540nm处的吸收值。重复三次实验取平均值，IC₅₀值以卟啉光敏剂聚集体浓度(μM)表示。

由图10可以得出：由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂在没有紫外光的刺激时，对细胞是无毒害的，基本不影响细胞存活率，而经过紫外光作用后，光敏剂产生对细胞有害的单线态氧，使细胞存活率大幅下降，因此卟啉光敏剂在紫外光作用下，具备较强的杀死细胞的能力。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将水溶性卟啉和可溶性硝酸盐加入到水中，混合均匀，其中，所述可溶性硝酸盐为硝酸钠、硝酸铅、硝酸钡、硝酸锌、硝酸镉、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铬、硝酸铋、硝酸镍、硝酸银、硝酸钯、硝酸铂、硝酸铱和镧系金属硝酸盐中的一种或多种，水溶性卟啉由式Ⅰ所示：

其中，R为磺酸基芳烃基、N-烷基吡啶基、

氨基芳烃基、季铵基芳烃基或羧基芳烃基，

所述水溶性卟啉和可溶性硝酸盐的摩尔比为水溶性卟啉：可溶性硝酸盐＝1：(0.1～25)；

2)选用无机酸将步骤1)中的体系的pH调至0.1～5；

3)在室温和避光条件下，将步骤2)中调节pH后的体系静置，静置时间至少为6小时，获得包含有卟啉光敏剂的反应体系，

将步骤3)中获得的含有卟啉光敏剂的体系经过离心得到沉淀，然后对沉淀依次用去离子水洗涤、冻干，

所述卟啉光敏剂为一种纳米聚集体，其尺寸为200～500nm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤1)中，

当R为磺酸基芳烃基时，R为：

当R为N-烷基吡啶基时，R选自下述结构式中的一种：

当R为氨基芳烃基时，R为：

当R为季铵基芳烃基时，R选自下述结构式中的一种：

当R为羧基芳烃基时，R为：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中，

所述可溶性硝酸盐为硝酸钠、硝酸钙、硝酸锌、硝酸铬、硝酸镉、硝酸铋、硝酸镍和硝酸铒中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中，所述可溶性硝酸盐为硝酸钠、硝酸铋、硝酸铬和硝酸铒中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碘酸、硼酸、碳酸、偏磷酸、焦磷酸、次磷酸、硅酸和氢溴酸中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中，所述无机酸为盐酸、硝酸和硫酸中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中，将体系的pH值调节至1.0～4。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中，将体系的pH值调节至2～3。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中，所述水溶性卟啉和可溶性硝酸盐的摩尔比为水溶性卟啉：可溶性硝酸盐＝1：(1.2～4)。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤3)中，静置时间至少为24小时。