CN106770049A - 基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,首先通过晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒,然后制备特异性设计矩形DNA折纸,最后按照纳米金棒与DNA折纸按摩尔比为5:1的比例加入纳米金棒,在45℃~20℃条件下循环梯度退火,使特定尺寸纳米金棒与特异性设计矩形DNA折纸杂交,使得纳米金棒构建成Dolmen结构。还包括上述晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒以及经ssDNA1所示核苷酸序列修饰后的纳米金棒的制备工艺。本发明借助琼脂糖电泳和透射电镜进行表征,利用纳米金棒组装体在暗场显微镜暗场图中特殊颜色的特点,容易与扫描电镜共定位,与刻蚀手段相比,具有简便、可靠、低成本、较低的实验条件要求等优势。
Description
技术领域
本发明属于检测分析领域,具体涉及基于DNA折纸模板纳米金棒构建Dolmen结构的方法及其应用。
背景技术
美国加州理工学院资深研究员Paul Rothemund发明了“DNA折纸术”,这是一种具有创新性的自下而上的组装技术。先借助纳米仪器,画好折叠物的形状,然后用折叠的DNA长链把这个形状填满,而DNA短链就是固定折叠的DNA长链的“图钉”。Rothemund用计算机计算每一个作品所需DNA短链的数量,然后将这些DNA短链“钉”在长链构成的支架上,就构成了各种图案。该技术具有过程简单、容易操作和极高产率等优点,目前已广泛应用于生物传感、物质检测、单分子水平分析、疾病诊断及治疗等领域。
近年来,在金纳米棒(Gold NanoRods,GNRs)方面的研究已取得了飞跃式的进步,当前人们可以利用模板法、光化学法、晶种生长法以及电化学法等多种方法制备出长径比不同的金纳米棒,由于其具有各向异性及独特的光谱特征,故在生物检测、医学诊断、光学成像以及光谱研究等诸多领域广泛应用。
在原子系统中,当一个分立的激发态能级与一个连续的激发态能级相重叠时,两个激发态之间会出现干涉,从而使原子系统的光谱呈非对称线型,这一效应称为法诺(Fano)共振。最近,金属微纳结构中的Fano共振由于在非线性、增强透射、光学开关与调制等方面具有重要应用,因而引起了人们的广泛兴趣。Richard Vaia(Biswas,S.,Duan,J.,Nepal,D.,Pachter,R.,&Vaia,R.(2013).Nano Letters,13(5),2220-2225.)利用刻蚀通过Top-Down方法搭建Dolmen结构,生动有效地向我们展示了该结构的法诺效应。颜灏(Pal,S.,Deng,Z.,Wang,H.,Zou,S.,Liu,Y.,&Yan,H.(2011).Journal of the AmericanChemical Society,133(44),17606-9.)利用空间可循址性和DNA特异性结合将纳米金棒杂交到DNA折纸,并排列成相应的空间构型。但迄今为止,还没有使用Bottom-Up(自下而上)方法将纳米金棒和DNA折纸组装成Dolmen结构用于法诺效应的研究和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于通过自下而上方法将DNA折纸和纳米金棒构建成Dolmen结构,该结构具有的法诺效应可用于光学和等离子体领域检测,丰富了DNA纳米结构的检测手段;本发明还提供了上述结构的制备方法及应用。
为达到上述目的,本发明的技术方案为基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,包含以下步骤:
(1.1)通过晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒;
(1.2)制备特异性设计矩形DNA折纸;
(1.3)按照纳米金棒与DNA折纸按摩尔比为5:1的比例加入纳米金棒,在45℃~20℃条件下循环梯度退火,使特定尺寸纳米金棒与特异性设计矩形DNA折纸杂交,使得纳米金棒构建成Dolmen结构。
上述晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒具体包括:
(2.1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液搅拌混匀,加入摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的硼氢化钠水溶液;
(2.2)将步骤2.1获得的混合溶液置于20℃~40℃条件下,静置反应1~3h。
进一步,晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒具体包括:
(3.1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液按体积比10:1~40:1混合,搅拌混匀;
(3.2)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.1的溶液中加入摩尔浓度为1mM~100mM的硝酸银溶液和摩尔浓度为0.1mol/L~2mol/L的盐酸溶液,搅拌1~5min;
(3.3)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.2的溶液中滴加摩尔浓度为
10mmol/L~200mmol/L的抗坏血酸溶液,溶液从黄色迅速变为无色,搅拌1~5min;
(3.4)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.3的溶液中滴加步骤2.1的稀释液,搅拌1~5min,静置反应10~20h;
(3.5)溶液从无色变成棕色,反应结束,采用离心提纯法浓缩步骤3.4获得的溶液,将离心产物分散到超纯水中。
上述纳米金棒为经ssDNA1所示核苷酸序列修饰后的纳米金棒,通过以下方法制备:
(4.1)根据步骤3.5中离心产物溶液与ssDNA1所示核苷酸序列按体积比为100:1~20:1混合,搅拌混匀,在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(4.2)将步骤4.1溶液滴加氯化钠溶液,滴加3~5次,每次滴加不超过5μL,间隔时间0.5~1h,滴加完毕后在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(4.3)采用离心提纯法浓缩步骤4.2获得的溶液,将离心产物常温保存。
上述特异性设计矩形DNA折纸通过以下方法制备:
(5.1)将摩尔浓度为1nmol/L~5nmol/L的M13mp18噬菌体环状单链DNA分子与摩尔浓度为10nmol/L~50nmol/L的订书钉单链按和设计捕获单链按体积比1:1:1~1:5:5混合,搅拌混匀;
(5.2)将步骤5.1的溶液在95℃~25℃条件下梯度退火,反应结束后,离心提纯。
本发明的有益效果在于:
(1)DNA折纸具有精确的空间可寻址性,加入纳米金棒后可以高效精确组装;
(2)Dolmen结构具有法诺效应,在特定光波长下出现很明显的“零吸收”现象;
(3)本发明借助琼脂糖电泳和透射电镜进行表征,利用纳米金棒组装体在暗场显微镜暗场图中特殊颜色的特点,容易与扫描电镜共定位,因此与刻蚀手段相比,具有简便、可靠、低成本、较低的实验条件要求等优势。
附图说明
图1为Dolmen结构组装和检测示意图;
图2为合成特定尺寸(75×30nm)纳米金棒透射电镜图;
图3为分离提纯Dolmen结构的琼脂糖凝胶电泳分析结果;
图4为进过提纯后的Dolmen结构透射电镜图;
图5为对Dolmen结构法诺效应检测结果,其中a为暗场显微镜下结构呈现的光斑,b为Dolmen结构扫描电镜图,c为散射强度检测结果。
具体实施方式
现结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细的说明。本发明所述Dolmen结构构建及检测的原理如图1所示,在矩形折纸的两面修饰捕获链,利用DNA特异性杂交,将修饰上巯基DNA的纳米金棒组装上折纸,使用暗场显微镜检测其法诺效应。
基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法可以概括为首先通过晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒,然后与特异性设计矩形DNA折纸杂交,最后使纳米金棒构建成Dolmen结构。
其中晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒通过以下方法制备:
(1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液搅拌混匀,加入摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的硼氢化钠水溶液;
(2)将步骤(1)获得混合溶液置于20℃~40℃条件下静置反应1~3h。
作为优选,晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒通过以下方法制得:
(1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液按体积比10:1~40:1混合,搅拌混匀;
(2)20~40℃条件边搅拌边向步骤(1)的溶液中加入摩尔浓度为1mM~100mM的硝酸银溶液和摩尔浓度为0.1mol/L~2mol/L的盐酸溶液,搅拌1~5min;
(3)20~40℃条件边搅拌边向步骤(2)的溶液中滴加摩尔浓度为10mmol/L~200mmol/L的抗坏血酸溶液,溶液从黄色迅速变为无色,搅拌1~5min;
(4)20~40℃条件边搅拌边向步骤(3)的溶液中滴加权利要求2中步骤(1)的稀释液,搅拌1~5min,静置反应10~20h;
(5)溶液从无色变成棕色,反应结束,采用离心提纯法浓缩步骤(4)获得的溶液,将离心产物分散到超纯水中。
其中,纳米金棒为经ssDNA1修饰的纳米金棒,可以通过以下方法制得:
(1)纳米金棒溶液与ssDNA1所示核苷酸序列按体积比为100:1~20:1混合,搅拌混匀,在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(2)将步骤(1)溶液滴加氯化钠溶液,滴加3~5次,每次滴加不超过5μL,间隔时间0.5~1h,滴加完毕后在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(3)采用离心提纯法浓缩步骤(2)获得的溶液,将离心产物常温保存。
作为优选,特异性设计矩形DNA折纸有以下方法制得:
(1)将摩尔浓度为1nmol/L~5nmol/L的M13mp18噬菌体环状单链DNA分子与摩尔浓度为10nmol/L~50nmol/L的订书钉单链按和设计捕获单链按体积比1:1:1~1:5:5混合,搅拌混匀;
(2)将步骤(1)的溶液在95℃~25℃条件下梯度退火,反应结束后,离心提纯。
其中,纳米金棒与DNA折纸杂交构建成Dolmen结构有以下方法制得:
将纳米金棒与DNA折纸按摩尔比为5:1的比例加入纳米金棒,最后在45℃~20℃条件下循环梯度退火,通过琼脂糖电泳分离提纯。
基于DNA折纸模板纳米金棒构建Dolmen结构的方法及其应用,其特征在于,所述结构在一定光波长范围内具有法诺效应,可用于光学器件等领域应用。
为便于本领域的技术人员进一步理解和实施本发明,现提供本发明中相关步骤的具体实施例如下:
实施例1、关于晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒晶种制备:
(1)将10mL摩尔浓度为0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液和0.25mL摩尔浓度为0.01mol/L的氯金酸水溶液搅拌混匀,快速加入经过冰水浴的0.6mL摩尔浓度为0.01mol/L硼氢化钠水溶液,剧烈搅拌2min;
(2)将步骤(1)获得混合溶液置于30℃条件下静置反应2h。
实施例2、关于晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒生长液制备:
(1)将40mL摩尔浓度为0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液和2mL摩尔浓度为0.01mol/L的氯金酸水溶液混合,搅拌混匀;
(2)30℃条件下边搅拌边向步骤(1)的溶液中加入0.3mL摩尔浓度为0.01mol/L的硝酸银溶液和0.8mL摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液,搅拌5min;
(3)30℃条件下边搅拌边向步骤(2)的溶液中滴加0.30ML摩尔浓度为0.1mol/L的抗坏血酸溶液,溶液从黄色迅速变为无色,搅拌2min;
(4)30℃条件下边搅拌边向步骤(3)的溶液中滴加0.08mL稀释5倍的晶种稀释液,搅拌2min,静置反应12h;
(5)溶液从无色变成棕黑色,反应结束后,采用离心提纯法浓缩步骤(4)获得的溶液,将离心产物分散到超纯水中。
通过透射电子显微镜表征本实施例制备获得的特定尺寸纳米金棒的形貌,结果如图2所示。从TEM图结果可见,本实施例制备获得的纳米金棒材料粒径均一、分布均匀,进过测量统计,纳米金棒长度为75±2nm,直径为25±3nm。实施例1制备获得的纳米金棒溶液用于实施例3中制备经ssDNA1修饰的纳米金棒的原料。
实施例3、关于制备经ssDNA1修饰的纳米金棒:
取实施例2中150μL纳米金棒溶液,制备ssDNA1修饰的纳米金棒:
(1)将150μL纳米金棒溶液离心清洗2次,4500rpm离心10分钟,将离心产物分散到100μL超纯水中;
(2)取5μL100μM的ssDNA1加入到步骤(1)中的溶液,同时加入1.5μL质量分数为1%的十二烷基硫酸钠溶液,震荡混匀,置于温度为37℃、转速为250rpm的恒温摇匀仪,震荡孵育4h;
(3)往步骤(2)溶液中滴加2mol/L的氯化钠溶液,每次滴加2.5μL,间隔半小时,滴加4次,滴加完毕后,置于温度为37℃、转速为250rpm的恒温摇匀仪,震荡孵育8h;
(4)步骤(3)反应结束后,采用离心提纯法浓缩步骤(3)获得的ssDNA1修饰的纳米金棒,离心提纯参数为4000rpm,10min,离心提纯三次,最终得到15μL的浓缩纳米金棒溶液,常温放置待用。
其中,与末端修饰捕获链的订书钉链互补的SH-DNA序列如下:
5’-TTTTTTTTTTTTTTT AGCGA-3’,(ssDNA1)。
实施例4、关于特异性设计矩形DNA折纸制备:
(1)将M13mp18噬菌体环状单链DNA、100多条未修改的订书钉链、末端修饰捕获链的订书钉链(CaptureDNA)按照1:10:10的摩尔比进行混合,即加入的体积分别为2.5μL、5μL、5μL,然后加入10μL 10×TAE-Mg2+缓冲液(Mg 2+浓度12.5mol/L),补超纯水至最终体积为100μL,震荡摇匀。
(2)将步骤(1)将混合溶液置于PCR仪中以0.1℃/10s的速率从95℃~20℃退火,反应后使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉链,4℃放置待用。
其中,订书钉链末端修饰捕获链(CaptureDNA)的序列如下:
AAAAAAAAAAAAAAA。
实施例5、关于纳米金棒与DNA折纸杂交构建成Dolmen结构制备:
将10μL浓缩后经ssDNA1修饰的纳米金棒与10μL特异性设计矩形DNA折纸按摩尔比为5:1的比例将两者配比后杂交,放入PCR仪中45℃~20℃梯度退火,反应12h,加入5μL质量分数为60%的蔗糖溶液混合待用。
实施例6、关于提纯混合溶液中Dolmen结构的琼脂糖凝胶电泳分析及观察结构形成的可行性实验:
(1)配置0.5%的琼脂糖凝胶溶液,加热溶液使之沸腾2次后,流水冷却至50℃以下,加入2.5μL Nucleic Acid Stain核酸染料,混匀,倒入制胶板,插好梳子,使之凝固。
(2)分别向各个泳道加样如下:
1号泳道:DNA折纸;
2号泳道:SH-DNA修饰后纳米金棒;
3号泳道:加入蔗糖溶液后的Dolmen结构混合液。
采用100V恒压下工作30min,将电泳完毕后的凝胶放入凝胶成像系统中,300ms曝光,拍照,结果见图3。由图3可知,由于折纸上修饰了三根纳米金棒,和单纯的折纸(见1号泳道)相比,跑的较慢;和单纯的纳米金棒(见2号泳道)相比,跑的更慢,则其较单个的DNA折纸,位于其的更上方(此处上方是指距离点样胶孔位置越近,下同)。在3号泳道中,由于纳米金棒相比于折纸是过量加入的,所以没有杂交上折纸的纳米金棒跑的位置与2号泳道的一样。本实施例结果证实了本发明所述的Dolmen结构形成的可行性。
将凝胶放在白光板上,切取结构对应的凝胶条带,把条带置于透析袋中,由于透析带可以截留小分子,再次通过电泳作用(方法同上),可以使结构从切取的凝胶条带中跑出,截留在透析袋中。吸出透析带中的溶液通过离心提纯,4000rpm,10min,提纯后的溶液待用。
取300目碳支持膜,滴入10μL提纯后的溶液,常温干燥后采用投射电子显微镜进行表征,表征结果如图4所示,在图中我们可以看到形成的Dolmen结构数量很多,同时存在纳米金棒摆放的不是很规则,主要由于纳米金棒上修饰的SH-DNA与折纸上捕获链杂交形成双链后会发生一定的摆动,是纳米金棒不能完全按照设计规则摆放。
实施例6对Dolmen结构法诺效应的检测
取长宽为3cm×1cm的ITO玻璃,在导电面滴入10μL提纯后的溶液,静置10min,使样品吸附到表面。超纯水冲洗三次,氮气吹干。用碳素笔在样品吸附位置刻画“十”字型标记线,便于样品在暗场显微镜与扫描电镜下共定位,表征结果如图5中a、b图。
在不同极化方向(0°~150°)偏振光的作用下,Dolmen结构的散射强度由图5中c图所示,从0°~150°不同极化方向作用下,其散射强度在波长为880nm左右处明显出现低谷,即为法诺共振。
因此,本发明利用DNA折纸和纳米金棒独特优势,将DNA折纸和特定尺寸的纳米金棒组装成Dolmen结构,其具有的法诺效应在光学领域和等离子体研究检测拓展思路,开辟新的路径。
最后需要说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明所限定的范围。
Claims (5)
1.基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,其特征在于,所述方法包含以下步骤:
(1.1)通过晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒;
(1.2)制备特异性设计矩形DNA折纸;
(1.3)按照纳米金棒与DNA折纸按摩尔比为5:1的比例加入纳米金棒,在45℃~20℃条件下循环梯度退火,使特定尺寸纳米金棒与特异性设计矩形DNA折纸杂交,使得纳米金棒构建成Dolmen结构。
2.根据权利要求1所述基于DNA折纸模板纳米金棒构建Dolmen结构的方法,其特征在于,所述晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒具体包括:
(2.1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液搅拌混匀,加入摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的硼氢化钠水溶液;
(2.2)将步骤2.1获得的混合溶液置于20℃~40℃条件下,静置反应1~3h。
3.根据权利要求2所述基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,其特征在于,所述晶种生长法制备特定尺寸纳米金棒具体包括:
(3.1)将摩尔浓度为0.01mol/L~1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液和摩尔浓度为1mmol/L~100mmol/L的氯金酸水溶液按体积比10:1~40:1混合,搅拌混匀;
(3.2)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.1的溶液中加入摩尔浓度为1mM~100mM的硝酸银溶液和摩尔浓度为0.1mol/L~2mol/L的盐酸溶液,搅拌1~5min;
(3.3)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.2的溶液中滴加摩尔浓度为10mmol/L~200mmol/L的抗坏血酸溶液,溶液从黄色迅速变为无色,搅拌1~5min;
(3.4)20~40℃条件下,边搅拌边向步骤3.3的溶液中滴加步骤2.1的稀释液,搅拌1~5min,静置反应10~20h;
(3.5)溶液从无色变成棕色,反应结束,采用离心提纯法浓缩步骤3.4获得的溶液,将离心产物分散到超纯水中。
4.根据权利要求3所述基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,其特征在于,所述纳米金棒为经ssDNA1所示核苷酸序列修饰后的纳米金棒,通过以下方法制备:
(4.1)根据步骤3.5中离心产物溶液与ssDNA1所示核苷酸序列按体积比为100:1~20:1混合,搅拌混匀,在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(4.2)将步骤4.1溶液滴加氯化钠溶液,滴加3~5次,每次滴加不超过5μL,间隔时间0.5~1h,滴加完毕后在20~40℃条件下震荡孵育2~10h;
(4.3)采用离心提纯法浓缩步骤4.2获得的溶液,将离心产物常温保存。
5.根据权利要求1所述基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法,其特征在于所述特异性设计矩形DNA折纸通过以下方法制备:
(5.1)将摩尔浓度为1nmol/L~5nmol/L的M13mp18噬菌体环状单链DNA分子与摩尔浓度为10nmol/L~50nmol/L的订书钉单链按和设计捕获单链按体积比1:1:1~1:5:5混合,搅拌混匀;
(5.2)将步骤5.1的溶液在95℃~25℃条件下梯度退火,反应结束后,离心提纯。
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