CN113201532A - Dna折纸框架脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA折纸框架脂质体及其制备方法,所述DNA折纸框架脂质体包括磷脂分子和DNA折纸框架,DNA折纸框架包括DNA圆环折纸和锚定在DNA圆环折纸上的脂化DNA,脂化DNA与磷脂分子结合,用于将磷脂分子固定在DNA折纸框架上。本发明的DNA折纸框架脂质体通过将脂化DNA锚定在DNA折纸框架上,再利用该DNA折纸框架将脂质体模板化,以实现所制备的DNA折纸框架脂质体的尺寸固定且具有良好的分散性;同时,DNA折纸框架具有优异的结构稳定性,以控制并推进脂质体的生长进程;进一步的,DNA折纸框架还具有生物相容性和可寻址性,通过在DNA折纸框架上设置多个脂化DNA以形成多个成核点,使磷脂分子自组装形成生物膜。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA折纸框架脂质体及其制备方法,属于DNA纳米技术领域。
背景技术
细胞膜的结构和功能极为复杂。它们定义细胞内不同细胞器的区域并介导生物分子的运输。细胞生物学的一个中心任务是阐明脂质双分子层和其他驱动膜动力学和控制细胞行为的分子(如蛋白质)之间的相互作用。在一个相对不复杂的可控系统中使用具有明确定义特性的人工膜是分析复杂细胞机械的一种有效方法。在生物技术中,设计定制的脂质双层膜也是一个备受瞩目的目标,它为药物传递和生物传感等领域带来了新机会。
目前,已经有大量的方法来制造人工膜,尤其是以单膜囊泡的形式。囊泡的制造一般包括以下三个步骤。首先,脂类溶解在一种良好的溶剂中(例如:油、氯仿以及含洗涤剂的水溶液),在这些溶剂中,脂类分散为单个分子或小的聚集物(例如:胶束)。然后,脂质被转移到一种不含洗涤剂的水溶液中,使双层膜自组装,最终形成囊泡,这可以通过多种方式实现,包括干燥/再水合、透析和反相蒸发等步骤,在这一阶段调整实验条件通常可以有效地产生具有预期性能的囊泡。最后,外力(例如:超声波或挤压)可以应用到囊泡上,以控制它们的大小和提高单分散性。
然而,尽管可控几何测量和表面化学技术在制备囊泡方面取得了突破性进展,但现有技术仍存在以下一个或多个缺陷:
(1)以纳米精度控制囊泡的大小(更不用说形状)仍然是一个挑战;(2)特定囊泡类型所需的实验条件往往是根据经验确定的,而且可能存在批次与批次之间的差异;(3)一些粒径控制方法在很大程度上依赖于脂类的成分,这限制了它们的适应性;(4)特定的技术,即使用专业类型的实验仪器,而这些仪器在普通的生物化学实验室是不容易得到的。
有鉴于此,确有必要提出一种DNA折纸框架脂质体及其制备方法,以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA折纸框架脂质体及其制备方法,该方法不仅能够形成固定大小的具有良好分散性的脂质体,而且该脂质体还具有良好的生物相容性和可寻址性,实现生物膜的自组装。
为实现上述目的,本发明提供了一种DNA折纸框架脂质体,所述DNA折纸框架脂质体包括磷脂分子和DNA折纸框架,所述DNA折纸框架包括DNA圆环折纸和锚定在所述DNA圆环折纸上的脂化DNA,所述脂化DNA与所述磷脂分子结合,用于将所述磷脂分子固定在所述DNA折纸框架上。
作为本发明的进一步改进,所述DNA圆环折纸的内侧设有DNA连接链,所述脂化DNA包括DNA单链,所述DNA单链与所述DNA连接链以互补的方式结合。
作为本发明的进一步改进,所述脂化DNA包括连接在所述DNA单链上的马来酰亚胺脂质,所述磷脂分子以所述马来酰亚胺脂质作为成核点,并沿所述成核点向四周生长。
作为本发明的进一步改进,所述DNA圆环折纸的内侧延伸出16条所述DNA连接链,每条所述DNA连接链均与1个脂化DNA连接,每个脂化DNA上的每条DNA单链均连接1个马来酰亚胺脂质,每个马来酰亚胺脂质均可以与多个所述磷脂分子结合。
为实现上述目的,本发明还提供了一种DNA折纸框架脂质体的制备方法,应用于前述的DNA折纸框架脂质体,包括以下步骤:
制备DNA圆环折纸;
制备脂化DNA;
将脂化DNA锚定在DNA圆环折纸上,得到DNA折纸框架;
将磷脂分子与DNA折纸框架组装,得到DNA折纸框架脂质体。
作为本发明的进一步改进,制备DNA圆环折纸的步骤具体为:将骨架链与订书钉链按比例混合均匀,在1×TAE-Mg2+溶液中进行聚合酶链式反应,得到DNA折纸溶液,使用1×反应缓冲溶液制备不同浓度的甘油梯度密度液,并将所述甘油梯度密度液置于离心管内,所述甘油梯度密度液的密度从上到下依次递增,将所述DNA折纸溶液置于所述甘油梯度密度液的顶层,纯化后得到DNA圆环折纸。
作为本发明的进一步改进,制备脂化DNA的步骤具体为:使用磷酸三乙酯溶液还原所述5’端修饰巯基的DNA单链,得到还原后的巯基DNA单链,在真空环境下,将所述还原后的巯基DNA单链与马来酰亚胺脂质混合均匀,使用1%辛基-β-D-葡萄糖苷溶液在27℃的条件下反应2小时并透析16小时,得到脂化DNA溶液,使用1×反应缓冲溶液稀释碘克沙醇得到不同浓度的碘克沙醇梯度密度液,将所述脂化DNA溶液置于所述碘克沙醇梯度密度液的底部,在4℃的条件下静置过夜后,纯化得到脂化DNA。
作为本发明的进一步改进,所述马来酰亚胺脂质的摩尔质量浓度至少为所述还原后的巯基DNA单链摩尔质量浓度的20倍,所述脂化DNA的摩尔质量浓度至少为所述DNA折纸框架摩尔质量浓度的160倍。
作为本发明的进一步改进,制备DNA折纸框架的步骤具体为:将所述DNA圆环折纸与所述脂化DNA混合均匀后,从37℃缓慢降温至27℃,反应8小时,得到DNA折纸框架。
作为本发明的进一步改进,制备DNA折纸框架脂质体的步骤具体为:将磷脂分子与所述DNA折纸框架混合均匀后,加入1%的辛基-β-D-葡萄糖苷溶液,在27℃的条件下反应2小时并透析16小时,得到DNA折纸框架脂质体溶液,使用1×TAE-Mg2+缓冲液稀释碘克沙醇得到不同浓度的碘克沙醇梯度密度液,并将所述碘克沙醇梯度密度液置于离心管内,所述碘克沙醇梯度密度液的密度从上到下依次递增,将所述DNA折纸框架脂质体溶液置于所述碘克沙醇梯度密度液的底部,纯化得到DNA折纸框架脂质体。
本发明的有益效果是:本发明的DNA折纸框架脂质体通过将脂化DNA锚定在DNA折纸框架上,再利用该DNA折纸框架将脂质体模板化,以实现所制备的DNA折纸框架脂质体的尺寸固定且具有良好的分散性;进一步的,DNA折纸框架具有优异的结构稳定性,以控制并推进脂质体的生长进程;此外,DNA折纸框架还具有生物相容性和可寻址性,通过在DNA折纸框架上设置多个脂化DNA以形成多个成核点,使磷脂分子自组装形成生物膜。
附图说明
图1是本发明形成DNA折纸框架脂质体的示意图。
图2是本发明中甘油梯度密度液分离纯化DNA圆环折纸的示意图。
图3是本发明中碘克沙醇梯度密度液分离纯化脂化DNA的示意图。
图4是本发明中碘克沙醇梯度密度液分离纯化DNA折纸框架脂质体的示意图。
图5是本发明中DNA圆环折纸的原子力显微镜表征图。
图6是本发明中DNA圆环折纸的透射电镜表征图。
图7是本发明中DNA折纸框架脂质体的透射电镜表征图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
请参阅图1所示,本发明提供了一种DNA折纸框架脂质体9,其中,DNA折纸框架脂质体9包括多个磷脂分子8和DNA折纸框架7,DNA折纸框架7包括DNA圆环折纸71和脂化DNA72,脂化DNA72包括DNA单链721和马来酰亚胺脂质722。
其中,马来酰亚胺脂质722可以与磷脂分子8连接,并作为磷脂分子8生长的成核点,磷脂分子8沿成核点向四周生长,以实现磷脂分子自组装形成生物膜,将马来酰亚胺脂质722与DNA单链721组装形成脂化DNA72,以实现脂化DNA72与磷脂分子8连接;进一步的,DNA圆环折纸71的内侧延伸出DNA连接链712,DNA单链721与DNA连接链712以互补的方式结合,以实现脂化DNA72与DNA圆环折纸71连接形成DNA折纸框架7,进一步实现DNA折纸框架7与磷脂分子8的连接,具体的,DNA单链721为5’端修饰巯基的DNA单链。如此设置,可以实现磷脂分子8在固定尺寸的DNA折纸框架7内生长,形成固定尺寸的DNA折纸框架脂质体9。
具体的,每个马来酰亚胺脂质722均与每个脂化DNA上的每条DNA单链721连接,每个马来酰亚胺脂质722分子均可以连接多个磷脂分子8,每条DNA单链721与每条DNA连接链712互补连接,本实施例中,DNA圆环折纸71的内侧延伸出16条DNA连接链712,当然,在其他实施例中,DNA圆环折纸71内侧延伸出DNA连接链712的数量可以根据实际情况进行调整,只要能够实现DNA圆环折纸71与磷脂分子8连接,使磷脂分子8生长成为固定尺寸的DNA折纸框架脂质体9的目的即可。
制备DNA折纸框架脂质体9主要包括以下步骤:
S1:制备DNA圆环折纸71。
S11:将骨架链711与订书钉链713按摩尔质量浓度比为1:10的比例混合均匀,在1×TAE-Mg2+缓冲溶液(配比为:40mM三羟基甲基氨基甲烷,20mM乙酸,12.5mM乙酸镁,2mM乙二胺四乙酸,pH=7.8)中使用聚合酶链式反应(PCR)程序进行组装,得到DNA圆环折纸溶液73。其中,骨架链711为p8064骨架链,订书钉链713的数量为225条。
S12:请参阅图2所示,使用1×反应缓冲溶液(配比为:25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES),140mM氯化钾,pH=7.4)稀释甘油制备15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%七个甘油梯度密度液10,将七个甘油梯度密度液10按从上之下甘油密度依次递增的顺序加入离心管中,将离心管放置在4℃的冰箱中,过夜得到密度梯度平滑均匀的甘油梯度密度液10,将DNA圆环折纸溶液73置于甘油梯度密度液10的顶部,将该DNA圆环折纸溶液73通过离心、分离和提纯,得到DNA圆环折纸71。
具体的,未组装的订书钉链713处于甘油梯度密度液10的上层位置,成型良好的DNA圆环折纸71处于甘油梯度密度液10的中层位置,成型不佳的DNA圆环折纸处于甘油梯度密度液10的下层位置。
本文中,mM是单位“毫摩尔每升(mmol/L)”的简写,下同。
S2:制备脂化DNA72。
S21、在真空条件下,将DNA单链721与马来酰亚胺脂质722混合均匀,使用1%辛基-β-D-葡萄糖苷溶液在27℃的条件下反应2小时,并透析16小时,得到脂化DNA溶液74。
其中,DNA单链721为巯基DNA单链,具体为:由于巯基易氧化形成二硫键,故使用磷酸三乙酯溶液还原5’端修饰巯基的DNA单链,得到还原后的DNA单链,磷酸三乙酯的摩尔质量浓度是5’端修饰巯基的DNA单链摩尔质量浓度的1000倍;马来酰亚胺脂质722(18:1MPBPE)在使用前放置于真空皿中干燥过夜;本步骤中,马来酰亚胺脂质722的摩尔质量浓度至少是DNA单链721摩尔质量浓度的20倍。
S22、请参阅图3所示,采用等密度梯度溶液离心、分离与纯化脂化DNA溶液74,使用1×反应缓冲溶液将60%的碘克沙醇稀释后得到20%的碘克沙醇溶液。具体的,梯度密度液分为三层:底层为150μl的脂化DNA溶液74和200μl的60%碘克沙醇;中层为250μl的20%碘克沙醇溶液;顶层使用1×反应缓冲溶液补至距离心管开口1cm处。将梯度密度液置于4℃的条件下静置过夜,得到密度梯度平滑均匀的梯度密度液。通过离心、分离和提纯得到脂化DNA72。
具体的,脂化DNA72处于梯度密度液上层位置,DNA单链二聚体723处于中层位置,DNA单链721处于下层位置。
S3:将脂化DNA72锚定在DNA圆环折纸71上,得到DNA折纸框架7。
将脂化DNA72与DNA圆环折纸71混合均匀,从37℃开始缓慢降温至27℃,反应8小时,使脂化DNA72锚定到DNA圆环折纸71的特定位置上形成DNA折纸框架7。本步骤中,脂化DNA72的摩尔质量浓度至少是DNA圆环折纸71摩尔质量浓度的160倍。
S4:将磷脂分子8与DNA折纸框架7组装,得到DNA折纸框架脂质体9。
S41、将磷脂分子8[99.2%二油酰基卵磷脂(DOPC),0.8%2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(丽丝胺罗丹明B磺酰)(铵盐)(18:1Liss Rhod PE)]与DNA折纸框架7混合均匀后,加入1%辛基-β-D-葡萄糖苷(OG)溶液,在27℃的条件下,反应2h并透析16h。通过洗涤、移除洗涤剂以及纯化后得到DNA折纸框架脂质体溶液91,其中,在使用1%辛基-β-D-葡萄糖苷(OG)溶液洗涤脂质、移除洗涤剂的过程中,实现了磷脂分子8在DNA折纸框架7上的自组装。
S42、请参阅图4所示,等密度梯度离心、分离和纯化DNA折纸框架脂质体溶液91。使用1×TAE-Mg2+缓冲液稀释碘克沙醇溶液以制备6%、10%、14%、18%、22%和26%六个浓度的碘克沙醇梯度密度液20,同时,将DNA折纸框架脂质体9加入60%碘克沙醇密度液中。将含有DNA折纸框架脂质体9的60%碘克沙醇密度液置于离心管的底部,随后,在离心管中加入其它六种浓度的碘克沙醇梯度密度液20,碘克沙醇梯度密度液20从上之下的密度依次递增,将离心管置于4℃下静置过夜得到分布趋于平滑的碘克沙醇梯度密度液20。通过离心、分离和提纯后得到DNA折纸框架脂质体9。
具体的:DNA折纸框架脂质体9位于碘克沙醇梯度密度液20上层位置;未组装的磷脂分子8位于中层位置,未组装的DNA圆环折纸71位于下层位置。
请参阅图5和图6所示,可以观察到DNA圆环折纸71的尺寸均一,形状呈环形,即证明了DNA圆环折纸71制备成功。
请参阅图7所示,可以观察到DNA圆环折纸71形状呈环形;DNA折纸框架脂质体9呈现圆球状,且DNA折纸框架脂质体9的透光度比DNA圆环折纸71好,故图中较亮的圆球状物质为DNA折纸框架脂质体9,即说明DNA折纸框架脂质体9制备成功。
需要说明的是:为了描述方便,本发明对DNA折纸框架脂质体的制备步骤进行了S1~S4的划分,但是在实际的制备过程中,也可以先进行步骤S2,换句话说,步骤S1~S2并没有具体的前后顺序的限制,本领域技术人员可以根据实际情况对DNA圆环折纸71及脂化DNA72的制备顺序进行调整,此处不作任何限制。
综上所述,本发明的DNA折纸框架脂质体9通过设计固定尺寸的DNA折纸框架7,并利用DNA折纸框架7将脂质体模板化,使得所制备的脂质体尺寸固定、具有良好分散性;同时,DNA折纸框架7具有优异的结构稳定性,故可以控制并推进脂质体的生长进程;进一步的,DNA折纸框架7还具备生物相容性和可寻址性,可以通过DNA折纸框架7上的脂化DNA72形成多个成核点,以实现磷脂分子8沿成核点向四周生长,进一步实现了生物膜的自组装。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种DNA折纸框架脂质体,其特征在于:所述DNA折纸框架脂质体包括磷脂分子和DNA折纸框架,所述DNA折纸框架包括DNA圆环折纸和锚定在所述DNA圆环折纸上的脂化DNA,所述脂化DNA与所述磷脂分子结合,用于将所述磷脂分子固定在所述DNA折纸框架上。
2.根据权利要求1所述的DNA折纸框架脂质体,其特征在于:所述DNA圆环折纸的内侧设有DNA连接链,所述脂化DNA包括DNA单链,所述DNA单链与所述DNA连接链以互补的方式结合。
3.根据权利要求2所述的DNA折纸框架脂质体,其特征在于:所述脂化DNA包括连接在所述DNA单链上的马来酰亚胺脂质,所述磷脂分子以所述马来酰亚胺脂质作为成核点,并沿所述成核点向四周生长。
4.根据权利要求3所述的DNA折纸框架脂质体,其特征在于:所述DNA圆环折纸的内侧延伸出16条DNA连接链,每条所述DNA连接链均与1个脂化DNA连接,每个脂化DNA上的每条DNA单链均连接1个马来酰亚胺脂质,每个马来酰亚胺脂质均可以与多个所述磷脂分子结合。
5.一种DNA折纸框架脂质体的制备方法,应用于权利要求1~4中任一项所述的DNA折纸框架脂质体,其特征在于,包括以下步骤:
制备DNA圆环折纸;
制备脂化DNA;
将脂化DNA锚定在DNA圆环折纸上,得到DNA折纸框架;
将磷脂分子与DNA折纸框架组装,得到DNA折纸框架脂质体。
6.根据权利要求5所述的DNA折纸框架脂质体的制备方法,其特征在于,制备DNA圆环折纸的步骤具体为:将骨架链与订书钉链按比例混合均匀,在1×TAE-Mg2+溶液中进行聚合酶链式反应,得到DNA折纸溶液,使用1×反应缓冲溶液制备不同浓度的甘油梯度密度液,并将所述甘油梯度密度液置于离心管内,所述甘油梯度密度液的密度从上到下依次递增,将所述DNA折纸溶液置于所述甘油梯度密度液的顶层,纯化后得到DNA圆环折纸。
7.根据权利要求5所述的DNA折纸框架脂质体的制备方法,其特征在于,制备脂化DNA的步骤具体为:使用磷酸三乙酯溶液还原所述5’端修饰巯基的DNA单链,得到还原后的巯基DNA单链,在真空环境下,将所述还原后的巯基DNA单链与马来酰亚胺脂质混合均匀,使用1%辛基-β-D-葡萄糖苷溶液在27℃的条件下反应2小时并透析16小时,得到脂化DNA溶液,使用1×反应缓冲溶液稀释碘克沙醇得到不同浓度的碘克沙醇梯度密度液,将所述脂化DNA溶液置于所述碘克沙醇梯度密度液的底部,在4℃的条件下静置过夜后,纯化得到脂化DNA。
8.根据权利要求7所述的DNA折纸框架脂质体的制备方法,其特征在于:所述马来酰亚胺脂质的摩尔质量浓度至少为所述还原后的巯基DNA单链摩尔质量浓度的20倍,所述脂化DNA的摩尔质量浓度至少为所述DNA折纸框架摩尔质量浓度的160倍。
9.根据权利要求5所述的DNA折纸框架脂质体的制备方法,其特征在于,制备DNA折纸框架的步骤具体为:将所述DNA圆环折纸与所述脂化DNA混合均匀后,从37℃缓慢降温至27℃,反应8小时,得到DNA折纸框架。
10.根据权利要求5所述的DNA折纸框架脂质体的制备方法,其特征在于,制备DNA折纸框架脂质体的步骤具体为:将磷脂分子与所述DNA折纸框架混合均匀后,加入1%的辛基-β-D-葡萄糖苷溶液,在27℃的条件下反应2小时并透析16小时,得到DNA折纸框架脂质体溶液,使用1×TAE-Mg2+缓冲液稀释碘克沙醇得到不同浓度的碘克沙醇梯度密度液,并将所述碘克沙醇梯度密度液置于离心管内,所述碘克沙醇梯度密度液的密度从上到下依次递增,将所述DNA折纸框架脂质体溶液置于所述碘克沙醇梯度密度液的底部,纯化得到DNA折纸框架脂质体。
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