CN114377627B - 一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法 - Google Patents

一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法 Download PDF

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Abstract

一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，属于复杂结构人工细胞模型制备技术领域。所述方法为：使用氯仿作为溶剂，同时具有两亲性和温度响应自组装行为的基元作为溶质，配制浓度为2～30mg/mL的溶液，加入NBD‑PE作为荧光染色剂；在容器中加入基元氯仿溶液，在惰性气体环境下使氯仿挥发，加入三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，对溶液进行剪切振荡；将溶液在一定升温速率下升温到50～65℃，保持恒温20～40min，在一定降温速率下降至室温即可。利用磷脂分子的自组装性能在生理条件下通过一步法制备洋葱状多层磷脂人工细胞；该洋葱状多层磷脂人工细胞具有稳定的多层内膜结构和良好的生物相容性；该洋葱状多层磷脂人工细胞的尺寸及层数可调控。

Description

一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的 方法
技术领域
本发明属于复杂结构人工细胞模型制备技术领域，具体涉及一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法。
背景技术
细胞是构成自然界中已知生物的基本结构和功能单元，是生命体中最基本的“生命”实体，代表了现代生命发展的终极模型。然而，由于细胞结构的复杂性，以及细胞内时刻进行的化学反应及物质交换，使得对细胞结构和功能的研究工作难以进行。因此，研究者们采用自下而上的策略，构建出多种人工细胞模型，主要包括半透膜球形组装体、聚合物胶囊、蛋白质胶囊和磷脂胶囊等。这些人工细胞模型的构建不仅有助于了解细胞生命的起源和演化过程，还能够有效地克服真实细胞的脆弱性以及复杂性，为研究细胞结构和功能提供了简单有效的平台，因此具有重要的科学意义。
值得关注的是，细胞结构最重要的性质之一就是其区室化结构，也就是由细胞的生物膜系统将细胞与外环境和将细胞内各区室隔开的重要结构。该生物膜系统包括细胞膜、核膜以及细胞器膜等膜结构，它们在细胞的生命活动中具有重要作用：(1)将细胞内部环境与外部环境分隔开，提供稳定的细胞内部环境；(2)为蛋白提供附着位点，为反应提供场所，并参与信号传递和物质传输等重要过程；(3)在细胞内形成互不干扰的微区，保证细胞生命活动的高效性和有序性。细胞的生物膜成分主要由磷脂、鞘脂和胆固醇等组成。其中，磷脂分子由两条疏水的脂肪酸链和一个亲水的磷酸盐头部基团构成，由其形成的磷脂双分子层，构成了细胞生物膜系统的基本骨架。磷脂分子自发形成磷脂双分子层的性质，也是目前构建基于磷脂分子的人工细胞的基础。因此，基于磷脂分子的人工细胞的构建近年来得到了研究者们极大的关注。
近些年来，研究者已经提出了多种方法制备基于磷脂分子的人工细胞，主要包括水合法、电形成法、乳液转移法及复乳模板法等。然而，目前大多数的制备方法存在操作复杂，且难以在生理条件下形成磷脂人工细胞囊泡的缺点。例如，电形成法利用交流电场促进磷脂膜的水合和溶胀，是大量制备单层巨型磷脂囊泡的典型方法，但由于电场会对溶剂或磷脂产生影响，常常难以应用于生理条件下囊泡的制备；乳液转移法与复乳模板法可制备尺寸较为均一的囊泡结构，但存在有机溶剂残留的问题，影响了磷脂囊泡的生物相容性；水合法虽然具有操作简单和在生理条件下形成的优点，但是其制备的微米级尺寸的磷脂囊泡存在尺寸分布不均且形貌难以得到有效调控的问题。同时，在结构上，上述制备方法所制得的接近真实细胞尺寸的磷脂人工细胞多为单层或双层结构，难以满足模拟真实细胞复杂内部膜结构的需求。目前利用超声波辅助法等构建的多层人工细胞的方法中，产品多为纳米级别结构(如专利CN201610747167.3)，难以模拟真实细胞尺寸(2-30μm)以及多区室结构的理化性质。因此，如何利用简单的操作方法在生理条件下制备出微米级别的洋葱状多层磷脂结构的人工细胞成为本领域的一个科学难题。
发明内容
本发明的目的是为了解决难以在生理条件下利用一步法直接构建含有多层内膜结构的人工细胞模型的问题，提供了一种利用直接控温法在三乙酸甘油酯的水溶液中制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法。本发明之所以能够利用一步控温法制备洋葱状多层磷脂人工细胞，与以往控温法相比，最大创新点在于反应溶液中加入了三乙酸甘油酯。因为该物质具有良好的温度响应溶解性，对磷脂分子的自组装过程有重要影响，在此基础上通过多次实验优化，实现了目前的技术效果。
本发明利用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)磷脂分子的两亲性，通过将温度升高到其相转变温度以上，利用其自组装行为得到不同形貌的多层磷脂人工细胞膜结构。该方法可以通过改变原料的投放比例以及振荡过程中的剪切力大小实现对磷脂人工细胞尺寸及层数的调控，并且还可以通过改变溶剂配比实现对磷脂人工细胞内部区室结构的调控。同时，本发明采用一步控温法调控了磷脂分子的组装过程，实现了对多层磷脂膜结构的有效控制，成功地制备出洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞模型，为不同尺度的物质的自组装、细胞生物学研究和仿生研究提供了理论指导和生物膜模型。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，所述方法步骤为：
步骤一：使用氯仿作为溶剂，同时具有两亲性和温度响应自组装行为的基元作为溶质，配制浓度为2～30mg/mL的溶液，加入质量分数为基元加入量2～5％的NBD-PE[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)-1，2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙铵盐]作为荧光染色剂；所述同时具有两亲性和温度响应自组装行为的基元为DPPC、其他磷脂分子或高分子材料中的一种；在一定范围内，随着基元加入量的提高，多层磷脂人工细胞的直径增大，层数增加；
步骤二：在容器中加入步骤一得到的基元氯仿溶液，在惰性气体环境下使氯仿挥发，加入三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，使用旋涡混合器或振荡器对溶液进行剪切振荡；振荡过程中，磷脂被均匀地分散在溶液中，所得被分散的磷脂的荧光显微镜照片如图1；所述混合溶液与基元氯仿溶液的体积比为100：1；
步骤三：将步骤二配制的溶液在一定升温速率下升温到50～65℃，保持恒温20～40min，在升温及恒温过程中，磷脂会发生自组装行为，自组装过程显微镜照片如图2。然后在一定降温速率下降至室温，得到磷脂人工细胞。所得磷脂人工细胞荧光显微镜照片如图3。
优选地，步骤一中，所述磷脂分子为DMPC或DSPC；所述高分子材料为两亲性Janus树枝状聚合物。
优选地，步骤二中，所述三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液中超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6～9。在一定范围内，三乙酸甘油酯的加入量会影响多层磷脂人工细胞的内部形貌与层间规整度。
优选地，步骤二中，所述剪切振荡的频率为800～2000rpm。在一定范围内，随着频率的增加，多层磷脂人工细胞的直径减小，层数减少。
优选地，步骤三中，升温和降温速率分别为5～30℃·min-1和2～10℃·min-1。温度变化速率会影响磷脂双层膜结构的自组装过程，进而影响多层磷脂人工细胞的层间形貌。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
1、通过一步控温法在生理条件下制备多层磷脂人工细胞，该方法操作简便、快速、成本低，产量大；
2、该磷脂人工细胞具有稳定的多层内膜结构和良好的生物相容性；
3、该多层磷脂人工细胞的尺寸及层数均可调控。
附图说明
图1为磷脂分散在溶剂中标尺为5μm的荧光显微镜照片；
图2为磷脂在加热条件下自组装成人工细胞过程中标尺为50μm的显微镜照片；
图3为磷脂人工细胞标尺为10μm的荧光显微镜照片；
图4为实施例1中形成的标尺为5μm的单层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图5为实施例1中形成的标尺为5μm的双层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图6为实施例2中形成的标尺为5μm的多层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图7为实施例3中形成的标尺为8μm的多层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图8为实施例4中形成的标尺为5μm的磷脂层间距较大的多层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图9为实施例4中形成的标尺为5μm的磷脂层间距较小的多层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图10为DPPC磷脂加入量与人工细胞平均尺寸关系图；
图11为多层磷脂人工细胞平均层数与平均直径关系图；
图12为实施例5中形成的标尺为5μm的具有多室结构的多层磷脂人工细胞荧光显微镜照片；
图13为实施例6中形成的标尺为50μm的多层磷脂人工细胞显微镜照片；
图14为本发明涉及的DPPC磷脂分子结构式。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
本发明是利用DPPC磷脂分子的两亲性以及其在相转变温度以上的流动性，通过调控溶液配比以及升温、降温速率使磷脂分子自组装形成多层磷脂人工细胞的方法。该方法可以通过改变原料的配比以及振荡过程中的剪切力大小来调控磷脂人工细胞的尺寸及层数，能够得到具有洋葱状多层磷脂双分子膜结构的人工细胞。利用该方法而采用其他同时具有两亲性和温度响应自组装行为的基元，如磷脂分子(DMPC、DSPC等)或者高分子材料(两亲性Janus树枝状聚合物等)制备洋葱状多层磷脂膜的人工细胞模型，都属于该专利的保护范围。
磷脂为细胞的生物膜系统的重要组成成分，具有良好的生物相容性。DPPC磷脂分子由两条疏水的脂肪酸链和一个亲水的磷酸盐头部基团构成，结构式如图14所示，该结构具有两亲性，可将温度升高到其相转变温度以上，利用其在溶液中的疏水相互作用来实现自组装行为，形成磷脂双分子层结构。此外，由于DPPC磷脂分子的相转变温度为41℃，高于室温，使其人工细胞结构可以在室温下保持稳定的液晶形态。这种含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的制备方法操作简单，可实现批量生产。
实施例1：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为2mg/mL的DPPC溶液，加入质量分数为2％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为1200rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在20℃·min-1的升温速率下升温到60℃，保持恒温20～30min后在5～10℃·min-1的降温速率下降至室温，得到单层或双层磷脂人工细胞。在此制备条件下，可以得到尺寸最小的磷脂人工细胞，平均直径为11.25μm，该条件下磷脂人工细胞多为单层或双层结构，荧光显微镜照片如图4和5所示。
实施例2：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构的人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为5mg/mL的DPPC溶液，加入质量分数为2％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为1200rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在20℃·min-1的升温速率下升温到60℃，保持恒温20～30min后在5～10℃·min-1的降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。在此制备条件下，可以得到层间形貌最规整的多层磷脂人工细胞，平均直径为21.68μm，平均层数为7层，荧光显微镜照片如图6所示。
实施例3：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构的人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为10mg/mL的DPPC溶液，加入质量分数为2％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为1200rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在20℃·min-1的升温速率下升温到60℃，保持恒温20～30min后在5～10℃·min-1的降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。在此制备条件下，得到磷脂人工细胞平均直径为29.36μm，平均层数为13层，荧光显微镜照片如图7所示。
实施例4：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构的人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为30mg/mL的DPPC溶液，加入质量分数为2％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为800rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在20℃·min-1的升温速率下升温到60℃，保持恒温20～30min后在5～10℃·min-1的降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。在此制备条件下，可以得到尺寸最大的磷脂人工细胞，平均直径为55.25μm，荧光显微镜照片如图8和9所示。该条件下磷脂人工细胞平均层数大于50层，层间距有明显减小，层间的规整性也明显下降。分析发现，提高磷脂加入量可以明显增大磷脂人工细胞的尺寸并使层数增加，但会降低其形貌的规整度。DPPC磷脂加入量与人工细胞平均尺寸关系如图10所示，多层磷脂人工细胞平均层数与平均直径关系如图11。
实施例5：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构的人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为5mg/mL的DPPC溶液，加入质量分数为2％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：9，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为1500rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在30℃·min-1的升温速率下升温到60℃，保持恒温30～40min后在5～10℃·min-1的降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。在此制备条件下，磷脂人工细胞平均直径为25.38μm，随着三乙酸甘油酯的加入量增加，多层结构形貌规整度明显下降，并出现较多多室结构，荧光显微镜照片如图12。
实施例6：
一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构的人工细胞的方法，所述方法具体如下：
步骤一：使用氯仿配制浓度为20mg/mL的DSPC溶液，加入质量分数为3％的NBD-PE作为荧光染色剂；
步骤二：在EP管中加入10μL步骤一配制的磷脂氯仿溶液，在氮气环境下使氯仿挥发，加入1mL三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6，使用数字旋涡混合器剪切振荡，频率为1200rpm；
步骤三：将步骤二配制的溶液在20℃·min-1的升温速率下升温到65℃，保持恒温30～40min后在2～5℃·min-1的降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。在此制备条件下，磷脂人工细胞平均直径为38.95μm，显微镜照片如图13。

Claims (4)

1.一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，其特征在于：所述方法步骤为：
步骤一：配置5~30mg/mL的基元氯仿溶液，使用NBD-PE作为荧光染色剂；所述基元为DPPC、DMPC、DSPC中的一种；
步骤二：在容器中加入步骤一得到的基元氯仿溶液，在惰性气体环境下使氯仿挥发，加入三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液，对溶液进行剪切振荡；所述混合溶液与基元氯仿溶液的体积比为100：1；
步骤三：将步骤二配制的溶液在一定升温速率下升温到50~65℃，使温度达到基元的相转变温度以上，保持恒温20~40 min，然后在一定降温速率下降至室温，得到含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞。
2.根据权利要求1所述的一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，其特征在于：步骤二中，所述三乙酸甘油酯和超纯水的混合溶液中超纯水及三乙酸甘油酯体积比为100：6~9。
3.根据权利要求1所述的一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，其特征在于：步骤二中，所述剪切振荡的频率为800~2000 rpm。
4.根据权利要求1所述的一种一步控温法制备含有洋葱状多层磷脂膜结构人工细胞的方法，其特征在于：步骤三中，升温和降温速率分别为5~30 ℃·min-1和2~10 ℃·min-1。
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