CN111671727A - 一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法 - Google Patents

一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法。本发明属于囊泡模型制备技术领域，具体涉及一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法。本发明是为了解决现有单一组分囊泡存在的不足，如磷脂囊泡稳定性差，聚合物囊泡渗透性差，其膜几乎没有流动性，蛋白质囊泡渗透性较高而流动性较差的问题。方法：1、首先将Chol‑COOH接枝到BSA‑NH2表面；2、将BSA‑NH2与PNIPAM耦合得到BSA‑Chol/PNIPAM；3、构筑蛋白质囊泡；4.基于疏水相互作用将磷脂与蛋白质囊泡共组装成多元杂合囊泡。本发明以天然细胞膜的主要成分为基元构建的多元杂合微尺度囊泡。

Description

一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微 尺度囊泡的方法
技术领域
本发明属于囊泡模型制备技术领域，具体涉及一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法。
背景技术
细胞膜主要由磷脂、蛋白质、糖脂和胆固醇等物质组成，磷脂双分子层构成了细胞膜的基本骨架，蛋白质镶嵌在磷脂双分子层中起到支撑作用，胆固醇的存在可以有效地调节磷脂的流动性，各种组成成分在细胞膜中具有各异的功能和特性，正是这种组分和功能的多样性对细胞的正常运作提供了可能。科学家们以自然界中的细胞结构为灵感，构建了与天然细胞结构相似的囊泡模型。囊泡是一个由封闭膜构成的有序结构，在其内可以封装绝大多数客体分子，如蛋白质、基因片段甚至小分子药物；此外，中空结构为一系列生命活动，如发出信号、通信、感觉、新陈代谢或生长的进行提供了场所。
近年来，各种囊泡模型相继被提出，如磷脂囊泡，聚合物囊泡和蛋白质囊泡等；Stuart A.Whitehead等人发明了一种以氧代二苯并环辛炔(ODIBO)-脂质和含叠氮脂质为基元，通过薄膜水化法构建了两种功能化的磷脂囊泡的方法，利用ODIBO和叠氮基团的环加成反应来驱动膜融合，这项工作为触发融合在药物传递领域的应用提供了一个平台，也为理解脂质结构和膜组成对融合的影响提供了一个平台(Stuart A.Whitehead,ChristopherD.McNitt,et al.Artificial Membrane Fusion Triggered by Strain-PromotedAlkyne-Azide Cycloaddition[J].Bioconjugate Chem.2017,28,923-932.)。SvenjaWinzen等人发明了一种以聚二甲基硅氧烷-2-甲基恶唑啉(PDMS-b-PMOXA)和1,2-二肉豆素-甘油酯-3-磷酸胆碱(DMPC)为基质，采用薄膜水化挤出法制备了直径为200nm，双层膜的厚度为17nm的复合聚合物-脂质和聚合物-胆固醇亚微米单胞囊泡的方法，并且囊泡放置在室温中可稳定存在4周以上；低温透射电镜和原子力显微镜研究表明，与纯聚合物和聚合物脂质囊泡相比，囊泡膜中胆固醇的存在会导致更高的填充密度，从而导致膜厚度的减少和弯曲刚度的显著增加(Winzen S,Bernhardt M,Schaeffel D,et al.Submicronhybrid vesicles consisting of polymer–lipid and polymer–cholesterol blends[J].Soft Matter,2013,9(25):5883-5890.)。类弹性蛋白多肽(ELP)是一种源自原弹性蛋白的五重复多肽，随着温度升高至转变温度以上，在水溶液中发生从可溶到不溶的反相转变。因此JuLie A.Champion等人基于该物质的特性，将合成的两亲性复合蛋白mCherry-ZE/ZR-ELP和EGFP-ZE/ZR-ELP，通过热引发的方式自组装形成蛋白质囊泡(Park W M,ChampionJ A.Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles[J].Journal of the American Chemical Society,2014,136(52):17906-17909.)，该报道提供的这种在生物相容性环境中制备蛋白质囊泡的通用方法，为可以折叠的且有生物学功能的蛋白质，例如酶或受体配体，掺入囊泡膜中用于实际应用提供了可能。目前这些仿生原细胞模型分别具有原细胞和药物载体所需的一部分特性，如磷脂囊泡具有优良的流动性和生物相容性好；聚合物囊泡在膜的韧性、稳定性和化学多样性等方面表现出巨大优势；蛋白质囊泡作为坚固的载体，在极端酸性和基本条件下能够稳定，并可与其他分子偶联从而赋予其更多的功能。但是由单一组分构成的囊泡也存在诸多的缺点，其中磷脂囊泡稳定性差，聚合物囊泡渗透性差，其膜几乎没有流动性，蛋白质囊泡渗透性较高而流动性较差等；因此这些单一组分的囊泡均不能真实有效的具备类似天然细胞膜的性质及功能。
发明内容
本发明是为了解决现有单一组分囊泡存在的不足，如磷脂囊泡稳定性差，聚合物囊泡渗透性差，其膜几乎没有流动性，蛋白质囊泡渗透性较高而流动性较差的问题，而提供了一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法。
一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法具体是按以下步骤进行的：
一、将BSA-NH2溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成BSA-NH2溶液；所述BSA-NH2溶液的浓度为1.0～2.0mg/mL；所述BSA-NH2的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为1mg:(0.1～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
二、将Chol-COOH溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成胆固醇溶液；所述胆固醇溶液的浓度为0.02～0.1mg/mL；所述Chol-COOH的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为0.1mg:(0.3～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
三、将胆固醇溶液以0.5～3mL/min的速率滴入BSA-NH2溶液中，再依次加入EDAC和DMAP，充分搅拌混合后在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol；所述胆固醇溶液与BSA-NH2溶液的体积比为1:(0.5～2)；所述EDAC的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(0.5～1.0)mL；所述DMAP的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(2.5～10)mL；
四、将BSA-Chol溶于PBS缓冲溶液中在磁力搅拌下配制成BSA-Chol溶液；然后将PNIPAM放入蒸馏水中，并置于-24℃溶解，配制成PNIPAM溶液；将PNIPAM溶液以0.5～3mL/min的速率滴加到BSA-Chol溶液中，得到反应液，在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol/PNIPAM耦合物；所述BSA-Chol溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PNIPAM溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PBS缓冲溶液的pH值为8.5；所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:(1～1.5)；
五、将BSA-Chol/PNIPAM耦合物溶于纯净水中，配置成耦合物水溶液，向其中依次加入pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液、浓度为0.5～1g/mL的交联剂，根据水油比例1：(8～15)添加异辛醇，并快速充分摇晃30～60s，然后静置，在室温下反应12～20h，离心管底部生成白色产物，通过75％的酒精和蒸馏水转移、清洗，得到水相蛋白质囊泡溶液；所述耦合物水溶液的浓度为5～20mg/mL；所述耦合物水溶液与pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液的体积比为1:(0.2～1)；所述耦合物水溶液与浓度为0.5～1g/mL的交联剂的体积比为1:(0.2～0.5)；
六、将荧光磷脂配制成荧光磷脂氯仿溶液；将荧光磷脂氯仿溶液采用氩气将氯仿蒸发，然后加入蒸馏水配制成荧光磷脂水溶液；将荧光磷脂水溶液加入到水相蛋白质囊泡溶液中震荡，并在室温下放置0.5～2h，得到杂合囊泡水溶液；所述荧光磷脂氯仿溶液的浓度为1～2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液的浓度为0.1～0.2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液与水相蛋白质囊泡溶液的体积比为1:(2.5～10)。
本发明的有益效果：
本发明采用细胞膜的主要成分(磷脂、蛋白质和胆固醇)通过皮克林微乳液法(Pickering emulsion)成功构建杂合囊泡，实现了囊泡的稳定性，膜多样性和膜流动性等多种性能，为模拟细胞提供了一种新的细胞模型构筑方法。此外，该发明也为囊泡作为潜在的药物载体，以及应用于生物反应器等领域提供了新的方法。
附图说明
图1是实施例一油相蛋白质囊泡的明场显微镜照片；
图2是实施例一水相蛋白质囊泡的明场显微镜照片；
图3是实施例一杂合囊泡的绿色荧光共聚焦显微镜照片；
图4是实施例一杂合囊泡的明场显微镜照片；
图5是实施例二杂合囊泡的绿色荧光共聚焦显微镜照片；
图6是实施例二杂合囊泡的明场显微镜照片；
图7是实施例一水相蛋白质囊泡的扫描电子显微镜照片；
图8是实施例一杂合囊泡的扫描电子显微镜照片；
图9是实施例一杂合囊泡经过部分荧光漂白后的绿色荧光共聚焦显微镜照片；
图10是实施例一杂合囊泡经过部分荧光漂白再恢复的绿色荧光共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法具体是按以下步骤进行的：
一、将BSA-NH2溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成BSA-NH2溶液；所述BSA-NH2溶液的浓度为1.0～2.0mg/mL；所述BSA-NH2的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为1mg:(0.1～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
二、将Chol-COOH溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成胆固醇溶液；所述胆固醇溶液的浓度为0.02～0.1mg/mL；所述Chol-COOH的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为0.1mg:(0.3～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
三、将胆固醇溶液以0.5～3mL/min的速率滴入BSA-NH2溶液中，再依次加入EDAC和DMAP，充分搅拌混合后在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol；所述胆固醇溶液与BSA-NH2溶液的体积比为1:(0.5～2)；所述EDAC的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(0.5～1.0)mL；所述DMAP的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(2.5～10)mL；
四、将BSA-Chol溶于PBS缓冲溶液中在磁力搅拌下配制成BSA-Chol溶液；然后将PNIPAM放入蒸馏水中，并置于-24℃溶解，配制成PNIPAM溶液；将PNIPAM溶液以0.5～3mL/min的速率滴加到BSA-Chol溶液中，得到反应液，在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol/PNIPAM耦合物；所述BSA-Chol溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PNIPAM溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PBS缓冲溶液的pH值为8.5；所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:(1～1.5)；
五、将BSA-Chol/PNIPAM耦合物溶于纯净水中，配置成耦合物水溶液，向其中依次加入pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液、浓度为0.5～1g/mL的交联剂，根据水油比例1：(8～15)添加异辛醇，并快速充分摇晃30～60s，然后静置，在室温下反应12～20h，离心管底部生成白色产物，通过75％的酒精和蒸馏水转移、清洗，得到水相蛋白质囊泡溶液；所述耦合物水溶液的浓度为5～20mg/mL；所述耦合物水溶液与pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液的体积比为1:(0.2～1)；所述耦合物水溶液与浓度为0.5～1g/mL的交联剂的体积比为1:(0.2～0.5)；
六、将荧光磷脂配制成荧光磷脂氯仿溶液；将荧光磷脂氯仿溶液采用氩气将氯仿蒸发，然后加入蒸馏水配制成荧光磷脂水溶液；将荧光磷脂水溶液加入到水相蛋白质囊泡溶液中震荡，并在室温下放置0.5～2h，得到杂合囊泡水溶液；所述荧光磷脂氯仿溶液的浓度为1～2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液的浓度为0.1～0.2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液与水相蛋白质囊泡溶液的体积比为1:(2.5～10)。
本实施方式将胆固醇溶液以0.5～3mL/min的速率滴入BSA-NH2溶液中此时pH约为9.2。
本实施方式中BSA-NH2表示氨基化牛血清白蛋白，Chol-COOH表示羧基化胆固醇，PNIPAM表示聚N-异丙基丙烯酰胺。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述BSA-NH2溶液的浓度为1.5mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中所述胆固醇溶液的浓度为0.04mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中所述胆固醇溶液与BSA-NH2溶液的体积比为1:1。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：骤四中所述BSA-Chol溶液的浓度为0.8mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:1.2。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤五中所述耦合物水溶液的浓度为10mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五中所述耦合物水溶液与浓度为0.8g/mL的交联剂的体积比为1:0.3。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五中所述交联剂为NHS-PEG16-NHS。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：所述荧光磷脂水溶液与水相蛋白质囊泡溶液的体积比为1:5。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法具体是按以下步骤进行的：
一、将10mgBSA-NH2溶于6mLDMSO试剂中，再向其中滴加1mL碳酸氢钠缓冲溶液，配制成BSA-NH2溶液；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:5；
二、称取1.159g的胆固醇于100mL的三口圆底烧瓶中，加入50mL的氯仿溶解样品，之后依次加入3.6g丁二酸酐，0.5mL的三乙胺和0.2g的DMAP，62℃回流反应6h，用碱性碳酸氢钠溶液(0.1mol/L)洗反应液2遍，少量稀盐酸溶液调至pH为弱酸性，水洗2遍，后经过柱层析色谱柱提纯，得到羧基化的胆固醇(Chol-COOH)；将0.3mg Chol-COOH溶于6mLDMSO试剂中，再向其中滴加1mL碳酸氢钠缓冲溶液，配制成胆固醇溶液；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为50mmol/L；
三、将胆固醇溶液以0.5～3mL/min的速率滴入BSA-NH2溶液中，再依次加入10mgEDAC和1mgDMAP，充分搅拌混合后在室温下反应12h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol；
四、将5mg BSA-Chol溶于PBS缓冲溶液中在磁力搅拌下配制成BSA-Chol溶液；然后将5mg PNIPAM放入蒸馏水中，并置于-24℃下溶解，配制成PNIPAM溶液；将PNIPAM溶液以0.5～3mL/min的速率滴加到BSA-Chol溶液中，得到反应液，在室温下反应20h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol/PNIPAM耦合物；所述BSA-Chol溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PNIPAM溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PBS缓冲溶液的pH值为8.5；所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:(1～1.5)；
五、将1mg BSA-Chol/PNIPAM耦合物溶于100μL纯净水中，配置成耦合物水溶液，取20μL耦合物水溶液于1.5mL离心管内，然后依次加入10μL的pH为8.5的NaHCO3缓冲溶液,5μL浓度为0.1g/mL的交联剂；再350μL添加异辛醇，并快速充分摇晃30s，然后静置，在室温下反应12h，离心管底部生成白色产物，即为油相蛋白质囊泡，其明场显微镜照片如图1所示，通过75％的酒精和蒸馏水转移、清洗，得到水相蛋白质囊泡溶液；所述交联剂为NHS-PEG16-NHS；
六、将荧光磷脂配制成荧光磷脂氯仿溶液；将荧光磷脂氯仿溶液采用氩气将氯仿蒸发，然后加入蒸馏水配制成荧光磷脂水溶液；取5μL荧光磷脂氯仿溶液于1.5mL的EP管中，用氩气将氯仿蒸发，后加入蒸馏水配制成0.1mg/mL荧光磷脂水溶液；取4μL上述荧光磷脂水溶液加入到20μL水相蛋白质囊泡溶液中，轻轻震荡溶液并在室温下放置1h，得到杂合囊泡水溶液；通过共聚焦显微镜可观察到磷脂成功固定于蛋白质囊泡膜表面共同组装成杂合囊泡，其绿色荧光共聚焦显微镜照片如图3所示，明场显微镜照片如图4所示，SEM照片如图8所示。
基于荧光漂白技术研究杂合囊泡膜流动性：取5μL杂合囊泡水溶液加入到培养皿中，在培养皿上加入盖玻片，在荧光共聚焦显微镜下观察，然后采用荧光漂白技术将杂合囊泡上的荧光进行淬灭，其绿色荧光共聚焦显微镜照片如图9所示，然后原位观察囊泡的荧光能否恢复，其绿色荧光共聚焦显微镜照片如图10所示，从而判断囊泡膜的流动性。
图1是实施例一油相蛋白质囊泡的明场显微镜照片；从图中可以看出，蛋白质囊泡为表面光滑的球形结构，常温条件下可稳定存在。
图2是实施例一水相蛋白质囊泡的明场显微镜照片；从图中可以看出，转移水相的蛋白质囊泡依然可以稳定存在，其形貌较好。
图3是实施例一杂合囊泡的绿色荧光共聚焦显微镜照片；从图中可以看出，磷脂成功固定于蛋白质囊泡膜上，共同组装成杂合囊泡。
图4是实施例一杂合囊泡的明场显微镜照片；从图中可以看出，二次组装成的杂合囊泡，不会因为磷脂在蛋白质囊泡膜上的再次组装而改变尺寸大小，并且杂合囊泡能够稳定存在。
图7是实施例一水相蛋白质囊泡的扫描电子显微镜照片；从图中可以看出，蛋白质囊泡具有清晰的膜结构，并且由于胆固醇在膜上的支撑作用，使得蛋白质囊泡的刚性增强。
图8是实施例一杂合囊泡的扫描电子显微镜照片；杂合囊泡具有清晰的膜结构，并且由于胆固醇在膜上的支撑作用，使得杂合囊泡的刚性增强。
图9是实施例一杂合囊泡经过部分荧光漂白后的绿色荧光共聚焦显微镜照片；从图中可以看出，图中右上区域的杂合囊泡经过部分荧光漂白后，几乎完全失去了荧光，根据图中直线的标注，可清晰看出漂白区域荧光被淬灭。
图10是实施例一杂合囊泡经过部分荧光漂白再恢复的绿色荧光共聚焦显微镜照片；与图9进行对比可以发现，未漂白区域的荧光减弱，漂白区域的荧光由于磷脂在膜上的流动而增强，因此可以推断杂合囊泡膜具有流动性。
实施例二：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中所述的Chol-COOH与BSA-NH2反应用量均为0.6mg。其它与具体实施例一相同；
图5是实施例二杂合囊泡的绿色荧光共聚焦显微镜照片；从图中可以看出，磷脂成功固定于蛋白质囊泡膜上，共同组装成杂合囊泡，并与图3进行荧光强度比较发现，蛋白质膜上胆固醇的数目一定程度上会影响胆固醇对磷脂的固定能力；
图6是实施例二杂合囊泡的明场显微镜照片；从图中可以看出，杂合囊泡能够稳定存在。

Claims (10)

1.一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法具体是按以下步骤进行的：
一、将BSA-NH2溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成BSA-NH2溶液；所述BSA-NH2溶液的浓度为1.0～2.0mg/mL；所述BSA-NH2的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为1mg:(0.1～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
二、将Chol-COOH溶于DMSO试剂中，再向其中滴加碳酸氢钠缓冲溶液，配制成胆固醇溶液；所述胆固醇溶液的浓度为0.02～0.1mg/mL；所述Chol-COOH的质量与碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为0.1mg:(0.3～0.5)mL；所述碳酸氢钠缓冲溶液的浓度为25～50mmol/L；所述DMSO试剂中DMSO与H2O的体积比为1:(5～10)；
三、将胆固醇溶液以0.5～3mL/min的速率滴入BSA-NH2溶液中，再依次加入EDAC和DMAP，充分搅拌混合后在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol；所述胆固醇溶液与BSA-NH2溶液的体积比为1:(0.5～2)；所述EDAC的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(0.5～1.0)mL；所述DMAP的质量与BSA-NH2溶液的体积比为1mg:(2.5～10)mL；
四、将BSA-Chol溶于PBS缓冲溶液中在磁力搅拌下配制成BSA-Chol溶液；然后将PNIPAM放入蒸馏水中，并置于-24℃溶解，配制成PNIPAM溶液；将PNIPAM溶液以0.5～3mL/min的速率滴加到BSA-Chol溶液中，得到反应液，在室温下反应12～24h，反应完成后过滤、透析、冷冻干燥，得到BSA-Chol/PNIPAM耦合物；所述BSA-Chol溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PNIPAM溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PBS缓冲溶液的pH值为8.5；所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:(1～1.5)；
五、将BSA-Chol/PNIPAM耦合物溶于纯净水中，配置成耦合物水溶液，向其中依次加入pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液、浓度为0.5～1g/mL的交联剂，根据水油比例1：(8～15)添加异辛醇，并快速充分摇晃30～60s，然后静置，在室温下反应12～20h，离心管底部生成白色产物，通过75％的酒精和蒸馏水转移、清洗，得到水相蛋白质囊泡溶液；所述耦合物水溶液的浓度为5～20mg/mL；所述耦合物水溶液与pH为8.0～9.0的NaHCO3缓冲溶液的体积比为1:(0.2～1)；所述耦合物水溶液与浓度为0.5～1g/mL的交联剂的体积比为1:(0.2～0.5)；
六、将荧光磷脂配制成荧光磷脂氯仿溶液；将荧光磷脂氯仿溶液采用氩气将氯仿蒸发，然后加入蒸馏水配制成荧光磷脂水溶液；将荧光磷脂水溶液加入到水相蛋白质囊泡溶液中震荡，并在室温下放置0.5～2h，得到杂合囊泡水溶液；所述荧光磷脂氯仿溶液的浓度为1～2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液的浓度为0.1～0.2mg/mL；所述荧光磷脂水溶液与水相蛋白质囊泡溶液的体积比为1:(2.5～10)。
2.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤一中所述BSA-NH2溶液的浓度为1.5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤二中所述胆固醇溶液的浓度为0.04mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤三中所述胆固醇溶液与BSA-NH2溶液的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤四中所述BSA-Chol溶液的浓度为0.8mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤四中所述BSA-Chol与PNIPAM的质量比为1:1.2。
7.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤五中所述耦合物水溶液的浓度为10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤五中所述耦合物水溶液与浓度为0.8g/mL的交联剂的体积比为1:0.3。
9.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于步骤五中所述交联剂为NHS-PEG16-NHS。
10.根据权利要求1所述的一种基于疏水相互作用构筑蛋白质/磷脂/胆固醇多元杂合微尺度囊泡的方法，其特征在于所述荧光磷脂水溶液与水相蛋白质囊泡溶液的体积比为1:5。
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