CN107648620A - 携载caix适体的靶向超声纳米泡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，包括脂质单分子外壳、固定在脂质单分子层外壳外侧的靶向适体、以及包裹在脂质单分子层外壳内部的生物惰性气体，靶向适体为单链DNA，其基因序列为：AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。本发明要解决的技术问题是提供一种靶向性高、组织穿透力强、分子量小、亲和力高、稳定性好且针对多种肿瘤的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物超声显影技术领域，具体涉及一种携载CAIX适体的靶向超声纳米泡及其制备方法。
背景技术
自1967年首次发现可增强超声显像的微小空气泡后，超声造影剂(UCAs)就得到了十足发展，由原先简单的空气微泡到目前临床应用的脂质包裹六氟化硫的微泡，有效提高了超声造影检查技术诊断肿瘤的准确性。用于肿瘤超声显像的超声造影剂主要有两个不足：①粒径为微米级,难以穿过肿瘤血管壁进入肿瘤组织间隙，仅能实现血池内显像；②仅能实现某一特定类型的肿瘤细胞靶向显像，如前列腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞靶向显像。目前尚无用于多种恶性肿瘤实质细胞靶向超声分子显像的靶向超声造影剂。
为实现多种恶性肿瘤的靶向超声显像，需将与多种肿瘤细胞膜上表达的靶点有高特异性、高亲和力的配体连接到超声造影剂表面。随着基因工程的不断发展，通过SELEX技术可获得与金属离子、生物大分子以及细胞高特异性和高亲和力结合的核酸适体，其在分子间作用力下形成不同的特定空间结构，可与相应的靶点特异性结合。核酸适体具有分子量小、无免疫源性、作用范围广、稳定性好、与靶点的亲和力和特异性高、并且易于修饰，是超声分子影像学理想的靶向配体。
尽管目前超声造影剂可增强肿瘤的显像能力，但传统的超声造影剂组织穿透力低，仅能实现肿瘤的血池内显像；或肿瘤类型比较局限，仅能实现单一肿瘤的靶向显像。为实现多种肿瘤实质细胞的靶向超声分子显像，需要对其进行进一步改进。碳酸酐酶IX(CAIX)是多种肿瘤细胞表达的膜蛋白，如乳腺癌、肾癌、宫颈癌、肺癌等。目前尚无靶向结合CAIX的适体，也无实现多肿瘤实质细胞靶向超声分子显像的靶向纳米级超声造影剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种靶向性高、组织穿透力强、分子量小、亲和力高、稳定性好且针对多种肿瘤的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，包括脂质单分子外壳、固定在脂质单分子层外壳外侧的靶向适体、以及包裹在脂质单分子层外壳内部的生物惰性气体，靶向适体为单链DNA，其基因序列为：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
进一步，所述脂质单分子外壳包括如下质量份数的组分：
二棕榈酰磷脂酰胆碱15份；
二棕榈酰磷酯酰乙醇胺12份；
1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺6份。通过其携带的马来酰亚胺可与巯基修饰的适体发生化学反应，从而靶向纳米泡表面可连接CAIX适体，且其携带的PEG2000可有效避免体内内皮网状系统对其摄取，提高其在体内的稳定性。
进一步，还包括有巯基，所述靶向适体通过巯基与所述的1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺进行化学连接。巯基与马来酰亚胺的化学反应安全无毒性、反应明确，不会与适体上核酸序列产生交叉反应。
进一步，所述的生物惰性气体是全氟丙烷。全氟丙烷是惰性气体，在水中溶解度低，扩散速率低，生物相容性高，故有利于维持靶向纳米泡的稳定性。
进一步，其粒径为400-600nm。超声造影增强显像的原因是微泡内含有气体，较其周围生物介质易于压缩，其在超声场中具有较强的回波反射性能，能显著增强超声信号，且其含有的气体越多，增强信号能力越大。但肿瘤新生血管壁的间隙在380-780nm之间，只允许粒径小于700nm的颗粒穿过肿瘤血管壁进入肿瘤组织间隙。靶向纳米泡特异性增强肿瘤实质细胞显像不仅需要其内含有气体，而且需要其进入肿瘤组织间隙，故综合考虑其增强显像能力和穿透性，靶向纳米泡的粒径应在400-600nm。
采用本发明技术方案的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，经实验验证，脂质单分子层外壳经过1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺修饰，靶向适体是经过巯基修饰形成巯基化适体，然后通过巯基与马来酰亚胺化学反应将脂质单分子层外壳和适体连接起来，从而形成了一种靶向于多种恶性肿瘤的靶向纳米级超声微泡，巯基与马来酰亚胺之间连接稳定，且安全无毒性，可用于临床转化，而粒径在400-600nm之间的纳米级微泡的分子量小、穿透力强、成像效果好，适体与多种肿瘤细胞膜上表达的CAIX特异性结合，实现多种肿瘤实质细胞的靶向超声分子显像。
进一步，携载CAIX适体的靶向超声纳米泡的制备方法，操作方法为：
1)取二棕榈酰磷脂酰胆碱15份、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺12份、1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺6份溶于1ml的混悬液中,混悬液的原料及比例为,磷酸盐缓冲液：甘油＝9:1，摇床中振荡过夜，转速为210r/min；
3)将上述混悬液移入西林瓶中，用全氟丙烷气体置换其内的空气，在ST-银汞胶囊调和器中震荡90s，在4℃冰箱中静置过夜；即静置8～16h；
4)通过离心方法纯化获得空白超声纳米泡，离心条件：300r/min，计3min；
5)按每108个空白纳米泡中加入1uM靶向适体的比例，将空白纳米泡和靶向适体在还原的37℃环境中反应2h，制备得携载CAIX适体的靶向纳米泡。
经实验证明，可成功获得携载CAIX适体的靶向超声纳米泡。
附图说明
图1为本发明携载CAIX适体的靶向超声纳米泡的模式图。
图2为表面等离子共振技术检测不同浓度下适体CA9-540与蛋白CAIX亲和力。
图3为染料DiI标记纳米泡脂质膜的荧光图。
图4为携载荧光素6-FAM修饰适体CA9-540的靶向纳米泡荧光图。
图5为染料DiI和荧光6-FAM双重标记的靶向超声纳米泡荧光图。
图6为靶向纳米泡与CAIX阳性表达肾癌786-O细胞的结合示意图。
图7为靶向纳米泡与CAIX阳性表达宫颈癌Hela细胞的结合示意图。
图8为空白纳米泡与CAIX阳性表达肾癌786-O细胞的结合示意图。
图9为空白纳米泡与CAIX阳性表达宫颈癌Hela细胞的结合示意图。
图10为靶向纳米泡与CAIX阴性表达胰腺癌BxPC-3细胞的结合示意图。
图11为空白纳米泡与CAIX阴性表达胰腺癌BxPC-3细胞的结合示意图。
图12为靶向纳米泡与适体封闭后的CAIX阳性表达肾癌786-O细胞的结合示意图。
图13为靶向纳米泡与适体封闭后的CAIX阳性表达宫颈癌Hela细胞的结合示意图。
图14为靶向纳米泡与适体封闭后的CAIX阴性表达胰腺癌BxPC-3细胞的结合示意图。
图15为实验一的三种核酸适体与CAIX蛋白亲和力示意图。
图16为实验二的第一组纳米级超声造影剂的粒径示意图。
图17为实验二的第二组纳米级超声造影剂的粒径示意图。
图18为实验二的第三组纳米级超声造影剂的粒径示意图。
图19为实验二的第四组纳米级超声造影剂的粒径示意图。
具体实施方式
本发明携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其制备方法为：
1.适体筛选及鉴定
设计合成长度为80个核苷酸序列的单链DNA核苷酸库为模板，库容量为1015，在一定缓冲条件下与CAIX蛋白胞外区混合温育，形成蛋白-适体复合物，将未与蛋白结合的单链DNA洗脱，对与蛋白结合的适体分子进行分离、纯化，以纯化后的适体分子作为模板进行PCR扩增富集，进行下一轮筛选。通过10轮的筛选与扩增，得到与CAIX蛋白有高亲和力的靶向适体CA9-540，其基因序列为：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。通过表面等离子共振技术和细胞免疫荧光技术分别检测适体CA9-540与蛋白CAIX和肿瘤细胞的结合能力，检测的结果为：适体CA9-540与CAIX蛋白的解离常数KD为343nM，可特异性结合CAIX阳性表达的肿瘤细胞(786-O和Hela细胞)，而不与CAIX阴性表达肿瘤细胞(BXPC-3细胞)结合。如图2所示，表明CAIX适体与CAIX蛋白及CAIX阳性表达肿瘤细胞间特异性高、亲和力较高。
2.靶向超声纳米泡的制备
1)称量配比二棕榈酰磷脂酰胆碱5mg、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺4mg、1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺2mg溶于1ml的混悬液中(磷酸盐缓冲液：甘油＝9:1)，37℃摇床中振荡过夜，转速为210r/min；
2)第二天将上述含有脂质成分的混悬液移入西林瓶中，用全氟丙烷气体置换其内的空气，在ST-银汞胶囊调和器中震荡90s，转速为4500r/min，后置于4℃冰箱中静置过夜；
3)通过离心去除未反应的脂质，离心条件：300g/min，计3min；再一次离心去除微米泡，获得空白超声纳米泡，离心条件：300r/min，计3min；
4)取浓度为5mM乙二胺四乙酸10ul、浓度为5mM三(2-羧乙基)膦10ul、浓度为100uM的靶向适体10ul，于37℃摇床中孵育1h，活化适体中的巯基；
5)按每108个空白纳米泡中加入1uM靶向适体的比例，将空白纳米泡和活化的靶向适体在37℃环境中反应2h，制备携载CAIX适体的靶向纳米泡。
所制得的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡示意图，如图1所示。
3.靶向超声纳米泡性能检测及研究
1)验证适体CA9-540与纳米泡成功连接
用细胞膜红色荧光探针(DiI)标记纳米泡的脂质膜，6-羧基荧光素(6-Carboxy-fluorescein，6-FAM)对适体CA9-540羧基端进行修饰，并将本发明携载6-FAM修饰适体的靶向超声纳米泡于激光共聚焦显微镜下观察，观察的结果为：如图3所示，图中灰色小点(彩色影像为红色)代表纳米泡脂质膜，如图4所示，图中白色小点(彩色影像为绿色)代表适体CA9-540，如图5所示，图中白色小点代表两者(图3和图4中的红色和绿色，即纳米泡脂质膜和适体CA9-540)完全重合，表明靶向纳米泡表面携载CAIX适体，即携载CAIX适体的靶向超声纳米泡成功构建。
(2)体外验证靶向超声纳米泡与CAIX阳性表达的肿瘤细胞特异性
将上述制备的靶向超声纳米泡和空白纳米泡(未连接适体CA9-540的纳米泡)按1×107纳米泡/ml加入贴壁培养过夜的肿瘤细胞中，同时为深入研究靶向超声纳米泡的特异性，预先采用1mol/ml的适体CA9-540对其中一组肿瘤细胞封闭1小时。在纳米泡与肿瘤细胞孵育半小时后，用磷酸盐缓冲液进行漂洗，在倒置显微镜下观察靶向和空白纳米泡与阳性表达CAIX和阴性表达CAIX肿瘤细胞结合情况。如图6、7所示，阳性表达CAIX的786-O和Hela肿瘤细胞周围聚集较多的靶向超声纳米泡，如图8、9所示，而空白纳米泡不能与CAIX阳性表达的肿瘤细胞结合。如图10、11所示，靶向和空白纳米泡均不能与CAIX阴性表达的BXPC-3肿瘤细胞结合。如图12、13所示，在预先使用适体封闭后，786-O和Hela细胞结合的靶向超声纳米泡数量明显减少，如图14所示，而BXPC-3肿瘤细胞结合的靶向超声纳米泡数量无明显变化，表明携载CAIX适体的靶向纳米泡特异性结合CAIX阳性表达肿瘤细胞，未结合CAIX阴性表达肿瘤细胞。
(3)体内验证靶向超声纳米泡在CAIX阳性表达移植瘤组织中的超声显像特征
通过裸鼠尾静脉分别注射上述制备的靶向超声纳米泡和空白纳米泡后，采用IU22超声诊断仪进行超声造影显像，分别采集移植瘤灰阶、血流和靶向与空白纳米泡的造影图像。结果显示，在CAIX阳性表达的裸鼠移植瘤(786-O和Hela移植瘤)中靶向超声纳米泡的显像峰值强度明显高于空白纳米泡的显像峰值强度，而在CAIX阴性表达的裸鼠移植瘤(BXPC-3移植瘤)中靶向超声纳米泡的显像峰值强度与空白纳米泡的显像峰值强度无明显差异，表明靶向纳米泡特异性增强CAIX阳性表达肿瘤组织的超声显像强度，而不特异性增强CAIX阴性表达肿瘤组织的超声显像强度。
实验一：CAIX适体的筛选
构建出用于CAIX适体筛选的核酸适体文库，其序列为
AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA(5’-3’)，其首尾各有二十个核苷酸固定序列，用于固定适体结构，中间为核苷酸可变序列，库容是1015，共筛选出3条核酸适体序列，分别是：
CA9-214：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTACTCCCACACACCACAACGTTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
CA9-540：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
CA9-819：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGCACACACACACACCACAACATTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
如图15所示，通过表面等离子共振技术可见CA9-540亲和力明显高于其他两种核酸适体。
实验二：优化脂质材料和比例
二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈基磷脂酸均是常规制备脂质纳米泡的脂质材料。由于上述脂质材料尚未进行化学基团修饰，无法将配体连接到纳米泡表面，构建出靶向纳米泡。目前的连接方法主要有：①静电粘附，将带电荷配体连接到带相反电荷的脂质纳米泡表面，但该方法连接效率低；②生物素-亲和素系统，将生物素化的配体连接到亲和素化的脂质纳米泡表面，由于其具有免疫源性，难以实现临床转化；③碳二亚胺法，将氨基化的配体连接到羧基化的纳米泡表面，反应过程中可能会发生交叉反应，影响配体和靶点的亲和力；④巯醚法，将巯基化的配体连接到马来酰亚胺修饰的纳米泡表面，该法是化学连接，安全稳定，可用于临床转化。1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺是马来酰亚胺修饰的脂质材料，可用来连接纳米泡和适体。由于不同脂质材料及比例制备出的纳米泡粒径不一，而肿瘤血管的滞留渗透效应只允许粒径小于700nm的颗粒穿过肿瘤血管进入肿瘤组织间隙，同时超声显像是基于组织声阻抗的差异进行显像，超声造影剂粒径太小，难以有效增强超声显像，因此为兼顾超声造影剂的显像能力和穿透能力，需制备出粒径在400-600nm的靶向超声纳米泡。
分组：
第一组：二棕榈酰磷脂酰胆碱：二棕榈酰磷酯酰乙醇胺：1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺＝5:4:2；
第二组：二棕榈酰磷脂酰胆碱：二棕榈酰磷酯酰乙醇胺：二棕榈酰磷脂酰甘油：二棕榈基磷脂酸：1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺＝5:2:2:1:1；
第三组：二棕榈酰磷脂酰胆碱：二棕榈酰磷酯酰乙醇胺：二棕榈酰磷脂酰甘油：1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺＝5:2:2:2；
第四组：二棕榈酰磷酯酰乙醇胺：二棕榈酰磷脂酰甘油：二棕榈基磷脂酸：1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺＝4:2:3:2。
将上述四组脂质材料分别溶于甘油和磷酸盐缓冲液的水合液中，通过机械振荡法和离心漂浮法制备纳米级超声造影剂，如图16～19所示：通过马文粒径仪测得的粒径分别是：第一组(430.7±80.39)nm、第二组(367.5±57.51)nm、第三组(706.1±107.5)nm、第四组(615.3±85.50)nm，只有第一组的脂质材料和比例满足实验需求，即二棕榈酰磷脂酰胆碱：二棕榈酰磷酯酰乙醇胺：1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺＝5:4:2。
核苷酸序列表如下：
<110>第三军医大学第一附属医院
<120>携载CAIX适体的靶向超声纳米泡及其制备方法
<160>3
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>protein_bind
<400>1
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTACTCCCACACACCACAACGTTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
<210>2
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>protein_bind
<400>2
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
<210>3
<211>80
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>protein_bind
<400>3
AGCAGCACAGAGGTCAGATGCACACACACACACCACAACATTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
<110> 第三军医大学第一附属医院
<120>携载CAIX适体的靶向超声纳米泡及其制备方法
<160>3
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>protein_bind
<400>1
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTACTCCCACACACCACAACGTTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
<210>2
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> protein_bind
<400>2
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA
<210>3
<211>80
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221> protein_bind
<400>3
AGCAGCACAGAGGTCAGATGCACACACACACACCACAACATTGCTAGTCCTTGTTCGTGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
Claims (6)
1.携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其特征在于，包括脂质单分子外壳、固定在脂质单分子层外壳外侧的靶向适体、以及包裹在脂质单分子层外壳内部的生物惰性气体，靶向适体为单链DNA，其基因序列为：
AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGTGCGCAGTGATGTGGTTGGTCCTATGCGTGCTACCGTCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
2.根据权利要求1所述的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其特征在于：所述脂质单分子外壳包括如下质量份数的组分：
二棕榈酰磷脂酰胆碱 15份；
二棕榈酰磷酯酰乙醇胺 12份；
1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺 6份。
3.根据权利要求2所述的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其特征在于：还包括有巯基，所述靶向适体通过巯基与所述的1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺进行化学连接。
4.根据权利要求1~3任意一条所述的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其特征在于：所述的生物惰性气体是全氟丙烷。
5.根据权利要求4所述的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡，其特征在于：其粒径为400-600nm。
6.根据权利要求5所述的携载CAIX适体的靶向超声纳米泡的制备方法，其特征在于：操作方法为：
1）取二棕榈酰磷脂酰胆碱15份、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺12份、1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺胺-聚乙二醇2000-N-马来酰亚胺6份溶于1ml的混悬液中,混悬液的原料及比例为,磷酸盐缓冲液：甘油 =9:1，摇床中振荡过夜，转速为210r/min；
3）将上述混悬液移入西林瓶中，用全氟丙烷气体置换其内的空气，在ST-银汞胶囊调和器中震荡90s，在4℃冰箱中静置过夜；
4）通过离心方法纯化获得空白超声纳米泡，离心条件：300r/min，计3min；
5）按每108个空白纳米泡中加入1uM靶向适体的比例，将空白纳米泡和靶向适体在还原的37℃环境中反应2h，制备得携载CAIX适体的靶向纳米泡。
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