CN107648617A - 用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法，包括壳聚糖纳米粒和脂质微泡，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡之间通过生物素和亲和素的作用形成复合物。壳聚糖纳米粒与亲和素形成相互作用后，再加入脂质微泡，所述脂质微泡为生物素化脂质微泡，壳聚糖纳米粒与生物素化脂质微泡在亲和素作用下形成复合物。与现有技术相比，本发明通过生物素和亲和素将脂质微泡与壳聚糖纳米粒偶联起来，制备了一种壳聚糖纳米粒微泡复合物，它既弥补了脂质微泡作为基因释放载体的不足，又解决了壳聚糖纳米粒靶向性不强的缺点。

Description

用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种超声介导基因递送的载体，具体涉及一种用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法。
背景技术
超声微泡(又称超声造影剂)的外壳一般由脂质、白蛋白、多聚物以及表面活性剂等成分组成，内核气体则为空气或全氟丙烷等惰性气体，其结构特点决定了其具有携载基因或药物的能力，因而被视为一种较理想的基因或药物载体。目前常用的超声微泡主要有SonoVue、Optison、Definity等，已有大量研究应用它们联合超声介导体内外基因转染的报道。
为了进一步提高基因治疗效果，需要超声微泡能够携载大量的目的基因，同时在体内输送过程中不被酶降解破坏，甚至还具有靶向特异结合的能力，这就需要寻找新型材料制备功能更强大的载基因微泡。载基因微泡的制备主要考虑以下几个方面：泡膜成分的挑选，其最好有一定的柔韧性和强硬度，这样才能保证制备的微泡在体内外都能稳定保存及输送；核心气体的挑选，常用的氟碳气体因为其弥散作用较慢，并且是一种安全的惰性气体而作为首选使用，同时其成像效果满意；靶向性和稳定性的问题，如果对已经制备好的载基因微泡进行表面修饰(如连接特定的抗体或配体等)，这样就可以实现目的基因的靶向治疗作用。
从振荡生理盐水产生无泡膜包裹的超声造影剂到目前的靶向多功能超声造影剂，其结构越来越复杂，功能越来越多，制备流程也越来越复杂困难。目前，超声微泡制备的常见方法主要有中和法、机械振荡法、冷冻干燥法、声振空化法、乳化法等。机械振荡的方法可弥补传统的声振法对基因损伤的缺点，同时基因可被包裹或镶嵌于磷脂双分子层上而不是简单地吸附连接，因而可以显著提高微泡的基因包裹能力。在制备过程中，需要根据不同的材料及功能要求选择合适的制备方法，可以单独使用一种方法，也可以多种方法联合使用。
随着制备工艺的不断完善和改良，超声微泡在疾病诊疗过程中发挥越来越重要的作用，因而制备高效、靶向特异、安全的新型微泡已成为该研究领域的关键问题。根据泡膜材料及携载物质的不同，基因与微泡的结合方式有几种：静电作用，治疗基因以非共价方式结合吸附于微泡表面；目的基因借助共价键吸附于微泡表面；将基因融合到微泡的外壳成分中(作为外壳的组成材料)，在实现基因携载作用的同时可以有利于提高微泡的稳定性；目的基因被压缩包被在微泡的内部，此种方法可以避免在体内循环时目的基因被冲刷脱掉或者被酶降解破坏等问题；首先目的基因被包裹在脂质体或纳米粒中，接着以非共价或共价方式(如生物素-亲和素作用系统、静电吸附等)将包裹基因的纳米粒连接到已经制备好的超声微泡上。通过与阳离子微泡的电荷相互作用或在制备时将DNA与微泡成分混合，将质粒DNA黏附到微泡膜上，带正电荷基团与带负电荷的质粒DNA间发生静电相互作用，使DNA受到保护从而增强基因转染效率。
壳聚糖作为一种天然的阳离子聚合物，具有低毒、低免疫原性、良好生物相容性、价格低廉、易降解等优点，被广泛应用于生物医药领域。在酸性环境下，壳聚糖上的氨基质子化可带上正电荷，与带负电的基因通过静电作用形成复合物。而在生理条件下(pH＝7.40)，壳聚糖不能质子化，壳聚糖/基因复合物能稳定地存在于生理环境，在一定程度上保护基因不被细胞环境中溶酶体、核酸酶等物质降解，因此壳聚糖被认为是一种理想的非病毒载体。然而目前，并没有关于壳聚糖/基因复合物在体内转染实验方面的报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法，既弥补了脂质微泡作为基因释放载体的不足，又解决了壳聚糖纳米粒靶向性不强的缺点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，包括壳聚糖纳米粒和脂质微泡，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡之间通过生物素和亲和素的作用形成复合物。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，所述壳聚糖纳米粒包括壳聚糖和基因，所述壳聚糖为生物素化壳聚糖，生物素化壳聚糖与基因制备成壳聚糖纳米粒后再与脂质微泡作用。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，所述脂质微泡为生物素化脂质微泡，壳聚糖纳米粒与生物素化脂质微泡在亲和素的作用下形成复合物。
用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，包括如下步骤：
第一步，壳聚糖纳米粒的合成：在45℃下，将生物素化壳聚糖溶解在醋酸溶液中，过滤后，加入适量的基因溶液，涡旋1min后静置，备用即可；
第二步，微泡的制备：将生物素化磷脂按照比例加入含有氯仿的烧瓶中， 65℃水浴，在涡旋仪中振荡时通入氮气，待溶剂挥发后，真空下旋转蒸发除去氯仿，接着将混合物用缓冲液水化，然后向烧瓶中通入氟碳气体，机械震荡混合物45s获得脂质微泡；
第三步，微泡复合物的合成：向合成的壳聚糖纳米粒中加入适量的亲和素，并在室温下孵育15min，加入磷酸盐缓冲液，充分洗涤去除未反应的亲和素，接着加入所述脂质微泡，在室温下孵育15min后，用磷酸盐缓冲液去除未反应的微泡，从而获得微泡复合物。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(1)中，先将生物素化壳聚糖溶解在pH为5.5的醋酸溶液中，再将其体积稀释至20倍，并采用过滤器过滤，除去生物素化壳聚糖中的不溶物。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(1)中，所述基因溶液为基因溶解在硫酸钠溶液中的混合溶液，所述硫酸钠溶液的浓度为4.3mmol/L，基因与硫酸钠溶液的质量体积比为1：5(g/L)。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(1)中，每100mg的所述生物素化壳聚糖，加入10ug基因溶解在50μL 的硫酸钠溶液所形成的基因溶液中。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(2)中，所述生物素化磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素 (DSPE-PEG2000-biotin)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素(DSPE-PEG2000-biotin)的摩尔比为18：1：1。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(2)中，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇三者组成，所述三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇的体积比为8:1:1。
优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，所述步骤(3)中，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡的摩尔比为1:1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过生物素和亲和素将脂质微泡与壳聚糖纳米粒偶联起来，制备了一种壳聚糖纳米粒微泡复合物，它既弥补了脂质微泡作为基因释放载体的不足，又解决了壳聚糖纳米粒靶向性不强的缺点。
附图说明
图1为本发明中所述脂质微泡的光学显微镜图；
图2为本发明中所述微泡复合物的光学显微镜图；
图3为本发明中所述微泡复合物的荧光显微镜图；
图4为本发明中所述壳聚糖纳米粒的粒径分布图；
图5为本发明中所述壳聚糖纳米粒的电位分布图；
图6为本发明中所述脂质微泡与微泡复合物的粒径分布图；
图7为本发明中所述脂质微泡的电位分布图；
图8为本发明中所述微泡复合物的电位分布图；
图9为本发明中不同所述微泡复合物的细胞毒性作用图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，包括如下步骤：
第一步，壳聚糖纳米粒的合成：在45℃下，将100mg的生物素化壳聚糖溶解在pH为5.5的醋酸溶液中，再将其体积稀释至20倍，并采用过滤器过滤，除去生物素化壳聚糖中的不溶物，接着加入适量的基因溶液，涡旋1min后静置，备用即可。
基因溶液为基因溶解在硫酸钠溶液中的混合溶液，所述硫酸钠溶液的浓度为4.3mmol/L，基因与硫酸钠溶液的质量体积比为1：5(g/L)，基因溶液由 10ug基因溶解在50μL的硫酸钠溶液而形成。
第二步，微泡的制备：将生物素化磷脂按照比例加入含有氯仿的烧瓶中， 65℃水浴，在涡旋仪中振荡时通入氮气，待溶剂挥发后，真空下旋转蒸发除去氯仿，接着将混合物用缓冲液水化，然后向烧瓶中通入氟碳气体，机械震荡混合物45s获得脂质微泡。
生物素化磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素(DSPE-PEG2000-biotin)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素(DSPE-PEG2000-biotin)的摩尔比为18：1： 1。
缓冲液由三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇三者组成，所述三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇的体积比为8:1:1。
第三步，微泡复合物的合成：向合成的壳聚糖纳米粒中加入适量的亲和素，亲和素为FITC标记的亲和素，并在室温下孵育15min，加入磷酸盐缓冲液，充分洗涤去除未反应的亲和素，接着加入所述脂质微泡，脂质微泡与壳聚糖纳米粒的摩尔比为1:1，在室温下孵育15min后，用磷酸盐缓冲液去除未反应的微泡，从而获得微泡复合物。
实施例2
在实施例1的基础上，将实施例1中制备的脂质微泡与微泡复合物放在4℃冰箱中放置1h，分别取适量制备的脂质微泡与微泡复合物，加入0.5mL磷酸盐缓冲液进行稀释，并在普通光镜和荧光显微镜下观察脂质微泡与微泡复合物的形态特点，同时用电位粒度仪检测它们的粒径及表面电位。
普通光学显微镜下观察，脂质微泡的壁非常光滑完整，如图1所示。通过与图1对比可知，微泡复合物的壳聚糖纳米粒呈花环状围绕在脂质微泡周围，如图2所示。由此可知，壳聚糖纳米粒与脂质微泡之间形成了相互作用。并且，再对照如图3所示的荧光图，FITC标记的壳聚糖纳米粒呈现为绿色，绿色的花环状结构围绕在脂质微泡周围，说明了围绕在脂质微泡周围为物质是壳聚糖纳米粒，壳聚糖纳米粒围绕在脂质微泡周围，再此证实了脂质微泡与壳聚糖纳米粒成功复合在一起了。
实施例3
在实施例1的基础上，以表达绿色荧光蛋白的质粒(pEGFP-C3)为报告基因，将报告基因分别加入到脂质微泡与微泡复合物中并充分搅拌混合，一段时间后，取离心后的脂质微泡与微泡复合物的上清液于Nanodrop2000分光光度仪中检测游离基因的浓度，通过计算可得脂质微泡与微泡复合物的基因携载率情况，并测定了其电位以及粒径，见表1和表2：
携载率的计算公式为：基因携载率(％)＝(总浓度-游离浓度)/总浓度
表1脂质微泡与微泡复合物的基因携载率
表2各种载体的电位、粒径及基因携载率对比情况
通过以上数据表明，通过壳聚糖纳米粒与脂质微泡所形成的微泡复合物比单独的脂质微泡的携载率要大，克服了脂质微泡作为基因释放载体的不足。
实施例4
在实施1的基础上，为了说明本发明微泡复合物的细胞毒性，进行了相关的细胞毒性检测，具体过程如下：
1、0.25％胰蛋白酶消化293T细胞形成单细胞悬液，然后调整细胞浓度为 1×104mL-1，每孔100μL接种于96孔培养板中，细胞培养箱内培养24h，弃上清液；
2、分组包括实验组和对照组，实验组共3组，分别为1、2、3组，1、2、 3组各加入5％、10％、15％浓度的微泡复合物；对照组：只接种细胞，培养液中不加入微泡复合物；空白组(即调零组)：不加细胞，只加单独的培养液。每组设4个平行复孔，各组均做3次重复；
3、进行CCK-8实验，于450nm波长测定各孔的光吸收值，检测细胞存活率，其计算公式为：细胞存活率(％)＝(实验组OD值-空白组OD)/(对照组 OD值-空白组OD值)×100％。
当微泡复合物的浓度小于10％不会引起明显的细胞死亡(细胞存活率＞ 80％)，但随着各实验组微泡复合物浓度升高，细胞活性下降，各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，当微泡复合物浓度达15％时其对细胞的毒性作用明显增强(细胞存活率<70％)，如图9所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，其特征在于：包括壳聚糖纳米粒和脂质微泡，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡之间通过生物素和亲和素的作用形成复合物。
2.根据权利要求1所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，其特征在于：所述壳聚糖纳米粒包括壳聚糖和基因，所述壳聚糖为生物素化壳聚糖，生物素化壳聚糖与基因制备成壳聚糖纳米粒后再与脂质微泡作用。
3.根据权利要求1所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，其特征在于：所述脂质微泡为生物素化脂质微泡，壳聚糖纳米粒与生物素化脂质微泡在亲和素的作用下形成复合物。
4.用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，壳聚糖纳米粒的合成：在45℃下，将生物素化壳聚糖溶解在醋酸溶液中，过滤后，加入适量的基因溶液，涡旋1min后静置，备用即可；
第二步，微泡的制备：将生物素化磷脂按照比例加入含有氯仿的烧瓶中，65℃水浴，在涡旋仪中振荡时通入氮气，待溶剂挥发后，真空下旋转蒸发除去氯仿，接着将混合物用缓冲液水化，然后向烧瓶中通入氟碳气体，机械震荡混合物45s获得脂质微泡；
第三步，微泡复合物的合成：向合成的壳聚糖纳米粒中加入适量的亲和素，并在室温下孵育15min，加入磷酸盐缓冲液，充分洗涤去除未反应的亲和素，接着加入所述脂质微泡，在室温下孵育15min后，用磷酸盐缓冲液去除未反应的微泡，从而获得微泡复合物。
5.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，先将生物素化壳聚糖溶解在pH为5.5的醋酸溶液中，再将其体积稀释至20倍，并采用过滤器过滤，除去生物素化壳聚糖中的不溶物。
6.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述基因溶液为基因溶解在硫酸钠溶液中的混合溶液，所述硫酸钠溶液的浓度为4.3mmol/L，基因与硫酸钠溶液的质量体积比为1：5(g/L)。
7.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，每100mg的所述生物素化壳聚糖，加入10ug基因溶解在50μL的硫酸钠溶液所形成的基因溶液中。
8.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述生物素化磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素(DSPE-PEG2000-biotin)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和磷脂PEG生物素(DSPE-PEG2000-biotin)的摩尔比为18：1：1。
9.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇三者组成，所述三羟甲基氨基甲烷、甘油、丙二醇的体积比为8:1:1。
10.根据权利要求4所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡的摩尔比为1:1。
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