CN113384530A - 一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用 - Google Patents

一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用。该多糖核心Nanocells具有核壳结构，其中以多糖材料组成的纳米粒为核心，其外层包裹有由脂质材料形成的类似脂质体囊膜的脂质膜，药物包载在纳米粒核心里，和/或脂质膜与纳米粒核心之间，和/或包载在脂质膜上。本发明中的多糖核心Nanocells可采用不同的脂质材料或在脂质修饰不同的靶向导向分子、包裹磁性颗粒或添加针对相应疾病部位微环境敏感的材料或药物，获得不同靶向功能的多糖核心Nanocells；可同时将多种机制的药物包载其中，实现对疾病的多功能治疗；在靶向治疗的同时具有缓释长效作用，且可以产生逆转耐药的作用，提高药物疗效和用药依从性。

Description

一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用。
背景技术
靶向治疗一直是疾病治疗追求的理想方式，可以提高药物疗效，克服毒副作用，这在癌症的治疗中更受关注。癌症严重威胁人类健康，给患者及家庭带来极大的身心痛苦与沉重的经济负担。癌症治疗的方法与药物不断推陈出新，其中化疗药物仍是临床癌症治疗的主要手段。普通化疗药物是一把双刃剑，是临床一线常用且有效的癌症治疗手段，但也会因为选择性差产生诸如心、肝、肾、生殖系统等重要脏器损伤的毒副作用，癌症的靶向治疗成为了业界研究的热点。为此，很多研究者致力于靶向抗癌小分子化疗类药物研发，但这些药物价格昂贵。而且普通的和新发现的靶向化疗药物也会在长期用药中产生多药耐药的现象，降低疗效。这些问题都严重阻碍了化疗药物的临床应用，寻找新的靶向治疗手段与逆转多药耐药是解决问题的关键。
纳米药物递送系统广泛应用于靶向治疗研究，包括肿瘤治疗。相关研究表明，使用纳米药物递送系统可有效实现靶向治疗，提高药效、降低毒副作用，也具有一定的逆转化疗药物多药耐药的作用。在靶向治疗研究中应用较多的有脂质体与纳米粒，目前虽有上市产品，但品种仍然很少，如阿霉素、紫杉醇、两性霉素B脂质体，紫杉醇白蛋白纳米粒等。脂质体与纳米粒各具优势与不足。脂质体是具有磷脂双层膜包裹水性核心的球状囊泡，既可以包封水溶性药物又可以包封脂溶性药物，其类似细胞膜的特性使其易于跨越生物障碍而具有良好的生物相容性和亲和性，但脂质体贮存过程中的药物泄漏与不稳定性使其应用受到了限制。纳米粒载药稳定性优于脂质体，但生物相容性与亲和性相对较弱。将脂质体与纳米粒系统结合起来，在纳米粒核心外包裹由脂质材料形成的类似脂质体囊膜的脂质膜，构建Nanocells，有望优势互补、克服不足，获得生物相容性好、载药稳定性高、药物递送性能更优的载药系统。同时所构建的Nanocells可以作为一个制剂技术，采用不同的脂质材料，修饰靶向导向分子或针对相应的靶向机制进行设计，能制得具有不同靶向功能的药物递送系统，可用作不同疾病药物靶向治疗的递送载体。如运载化疗药物还可进一步获得同时具有耐药逆转作用的靶向药物递送系统，克服临床肿瘤化疗的局限与不足，为肿瘤治疗提供新的制剂手段。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多糖核心Nanocells。
本发明的另一目的在于提供所述多糖核心Nanocells的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述多糖核心Nanocells的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种多糖核心Nanocells，其具有核壳结构，其中以多糖材料组成的纳米粒为核心，其外层包裹有由脂质材料形成的类似脂质体囊膜的脂质膜，药物包载在纳米粒核心里，和/或脂质膜与纳米粒核心之间(即脂质膜内)，和/或包载在脂质膜上。
所述的多糖核心Nanocells的粒径为20～500nm。
所述的多糖核心Nanocells可用于不同疾病治疗药物的递送；当用于肿瘤治疗时，所述的药物为各类抗肿瘤药物、血管生成抑制剂和耐药逆转剂中的至少一种。
所述的抗肿瘤药物优选为阿霉素、阿糖胞苷、伊马替尼及其可药用盐中的至少一种；更优选为盐酸阿霉素和甲磺酸伊马替尼中的至少一种。
所述的耐药逆转剂包括P-gp抑制剂；优选为维拉帕米和伊马替尼及其可药用盐中的至少一种；更优选为盐酸维拉帕米、甲磺酸伊马替尼。
所述的血管生成抑制剂优选为血管生成抑制剂SU5416和combretastatin-A4中的至少一种。
所述的多糖材料为海藻酸及其盐、壳聚糖及其衍生物、甲壳素、果胶及其衍生物、淀粉及其衍生物、白芨多糖、葡聚糖、右旋糖苷、卡拉胶、黄原胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶和魔芋葡甘聚糖中的至少一种；优选为果胶、海藻酸钠和壳聚糖中的至少一种。
所述的果胶为相对分子量为39～73k Da的果胶；优选为对相分子量为39k Da的果胶。
所述的海藻酸钠为相对分子量为80～120k Da的海藻酸钠；优选为相对分子量为100k Da的海藻酸钠。
所述的壳聚糖为脱乙酰度≥85％、相对分子量为130～300k Da的壳聚糖；优选为脱乙酰度≥95％的壳聚糖、相对分子量为130～300k Da的壳聚糖。
所述的多糖核心Nanocells为根据所采用的多糖材料的特性按常规制备方法制备多糖纳米粒，可用的常规制备方法有离子胶凝法、乳化离子胶凝法、单凝聚法、溶剂-非溶剂法、乳化溶剂蒸发法、纳米乳法、温度改变法、界面缩聚/聚合法、辐射化学法、膜乳化法。
所述的脂质材料为磷脂(中性磷脂、负电荷磷脂)及其衍生物、荷正电脂质和胆固醇及其衍生物中的至少一种；优选为卵磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)，油酸，亚油酸，棕榈酰同型半胱氨酸、D-α-生育酚基聚(2-乙基-2-恶唑啉)琥珀酸酯(TPOS)、硬脂胺、硬脂酰胺、油酰基脂肪胺衍生物和胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)中的至少一种；更优选为卵磷脂和胆固醇混合得到的脂质，或卵磷脂，胆固醇和DSPE-PEG2000混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素或DSPE-PEG2000-叶酸(即DSPE-PEG2000-Biotin或DSPE-PEG2000-Folate)混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-生物素或DSPE-PEG2000-叶酸混合得到的脂质；最优选为卵磷脂和胆固醇按质量比为1～6：1(优选1～5：1；更优选2～4：1)混合得到的脂质，或卵磷脂，胆固醇和DSPE-PEG2000按质量比为1～6：1：0.1～2(优选1～5：1：0.15～1.5；更优选2～4：1：0.25～1.5)混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-叶酸(DSPE-PEG2000-Folate)按质量比为1～6：1：0.1～2.5(优选1～5：1：0.15～2；更优选2～4：1：0.25～1.5)混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)按质量比为1～6：1：0.1～2.5(优选1～5：1：0.15～2；更优选2～4：1：0.25～1.5)混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸(DSPE-PEG2000-Folate)按质量比为1～6：1：0.1～2：0.1～2.5(优选1～5：1：0.15～1.5：0.15～2；更优选2～4：1：0.25～1.5：0.25～1.5)混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)按质量比为1～6：1：0.1～2：0.1～2.5(优选1～5：1：0.15～1.5：0.15～2；更优选2～4：1：0.25～1.5：0.25～1.5)混合得到的脂质。
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG3000(DSPE-PEG3000)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG4000(DSPE-PEG4000)中的至少一种。
所述的多糖核心Nanocells，为通过如下任一种方法制备得到：
(A)先将多糖材料和药物制备成载药多糖材料纳米粒；然后将载药多糖材料纳米粒分散到水性介质中作为内水相或水相(在逆相蒸发法、二次乳化法中作为内水相；在薄膜分散法中作为水相，该水相一部分包裹成内水相，一部分未被包裹为外水相)，将脂质与药物(需包载在脂质膜上的药物)溶解到有机溶剂中作为有机相，再采用逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法在内水相或水相中的多糖材料纳米粒外层包裹脂质膜，得到多糖核心Nanocells；
(B)将多糖材料和药物分散到水性介质中，得到药物和多糖材料溶液作为内水相或水相，将脂质与药物(需包载在脂质膜上的药物)溶解到有机溶剂中作为有机相，再采用逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法将含有多糖材料和药物的内水相或水相包裹在脂质膜内得到悬液，然后在悬液中加入固化剂使多糖材料核心固化，得到多糖核心Nanocells。
方法(A)中所述的载药多糖材料纳米粒为根据所采用的多糖材料的特性按常规制备方法制备载药多糖纳米粒；所述的常规制备方法包括离子胶凝法、乳化离子胶凝法、单凝聚法、溶剂-非溶剂法、乳化溶剂蒸发法、纳米乳法、温度改变法、界面缩聚/聚合法、辐射化学法、膜乳化法等；可将药物分散在多糖材料溶液中采用上述方法中的一种制成载药多糖材料纳米粒，也可将多糖材料采用上述方法中的一种制成空白纳米粒后再载药制成载药多糖材料纳米粒；优选为通过如下方法制备得到：
(i)将多糖材料溶解到水性介质中，得到多糖溶液作为水相；将乳化剂溶于油性溶剂中作为油相；将水相和油相分散混合均匀，得到稳定的乳剂；然后加入固化剂将其固化，用无水乙醇清洗，再用乙醇溶液和无水乙醇脱水后，离心收集沉淀，烘干，得到空白纳米粒；
(ii)将空白纳米粒加入到药物溶液中，于4～60℃下混合10分钟～12小时(优选室温至50℃下混合10分钟～6小时；更优选室温至40℃下混合10分钟～4小时)，得到载药多糖材料纳米粒。
步骤(i)中所述的水性介质为水或醋酸钠缓冲液；优选为水或pH4.5～5.5的醋酸钠缓冲液。
步骤(i)中所述的多糖溶液的浓度为0.1～50mg/mL；优选为0.2～35mg/mL；更优选为0.5～30mg/mL。
步骤(i)中所述的乳化剂优选为Span 20、Span 80、Span 85和双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)中的至少一种。
步骤(i)中所述的油性溶剂优选为油酸、大豆油、亚油酸、亚麻酸和橄榄油中的至少一种。
步骤(i)中所述的乳化剂与油性溶剂的质量比为0.1～20：80～99.9；优选为0.5～10：90～99.5；更优选为1～10：90～99。
步骤(i)中所述的水相和油相的体积比优选为1：2～35。
步骤(i)中所述的水相和油相均匀分散采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为：150～400W超声0.5～10分钟；更优选为400W超声3～5min。
步骤(i)中所述的多糖材料为海藻酸及其盐、壳聚糖及其衍生物、甲壳素、果胶及其衍生物、淀粉及其衍生物、白芨多糖、葡聚糖、右旋糖苷、卡拉胶、黄原胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶和魔芋葡甘聚糖中的至少一种；优选为果胶、海藻酸钠和壳聚糖中的至少一种。
步骤(i)中所述的固化为使水相中多糖材料固化为纳米粒核心，可加入相应的固化剂或者采用60Co产生的γ射线的辐射交联。
步骤(i)中所述的固化剂为三聚磷酸钠(TPP)，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；优选为CaCl2或三聚磷酸钠(TPP)；当多糖材料为海藻酸钠时，固化剂为CaCl2和多聚赖氨酸中的至少一种；当多糖材料为果胶时，固化剂为CaCl2；当多糖材料为壳聚糖(CTS)时，固化剂为三聚磷酸钠(TPP)。
所述的CaCl2的用量为按每毫升乳剂配比0.05～70mg CaCl2计算；优选为按每毫升乳剂配比0.05～50mg CaCl2计算；更优选为按每毫升乳剂配比0.1～40mg CaCl2计算。
所述的多聚赖氨酸的用量为按每毫升乳剂配比0.05～50mg多聚赖氨酸计算。
所述的三聚磷酸钠(TPP)的用量为按每毫升乳剂配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；优选为按每毫升乳剂配比0.1～40mg三聚磷酸钠计算。
步骤(i)中所述的固化的时间为10min～5h；优选为10min～3h；更优选为20min～2h。
步骤(i)中所述的乙醇溶液优选为体积分数为20～100％的乙醇溶液；优选体积分数为30～100％的乙醇溶液；更优选体积分数为50％～100％的乙醇溶液。
步骤(ii)中所述的药物溶液中空白纳米粒的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL；优选为0.25mg/mL～10mg/mL；更优选为0.5～8mg/mL。
步骤(ii)中所述的药物与空白多糖纳米粒的质量比为1：1～20；优选为1：2～10。
方法(B)中所述的固化剂为三聚磷酸钠(TPP)，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；优选为CaCl2或三聚磷酸钠(TPP)；当多糖材料为海藻酸钠时，固化剂为CaCl2和多聚赖氨酸中的至少一种；当多糖材料为果胶时，固化剂为CaCl2；当多糖材料为壳聚糖(CTS)时，固化剂为三聚磷酸钠(TPP)。
所述的CaCl2的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg CaCl2计算；优选为按每毫升悬液配比0.05～50mg CaCl2计算；更优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg CaCl2计算。
所述的多聚赖氨酸的用量为按每毫升悬液配比0.05～50mg多聚赖氨酸计算。
所述的三聚磷酸钠(TPP)的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg三聚磷酸钠计算。
所述的固化的时间为10min～5h；优选为10min～3h；更优选为20min～2h。
方法(A)中，药物可以包载在纳米粒核心里、脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)以及包载在脂质膜上；包载在纳米粒核心中的药物可以在制备纳米粒时加入多糖溶液里，也可在制备好多糖纳米粒后再浸入药物溶液中载药；包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以加入分散载药纳米粒的内水相或水相中或是加入制备多糖核心Nanocells的外水相中加入或是加入制备得到的多糖核心Nanocells悬液中进行包载；包载在脂质膜上的药物可以分散在溶解脂质的有机相里；包载在不同位置的药物可以是相同的或不同的药物，在同一位置包载的药物可以是一种或两种及以上。
方法(B)中，药物可以包载在纳米粒核心里、脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)以及包载在脂质膜上；包载在纳米粒核心中的药物可以加入多糖材料溶液的水相里；包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以在Nanocells的多糖材料核心固化后制得的多糖核心Nanocells悬液中加入进行包载；包载在脂质膜上的药物可以分散在溶解脂质的有机相里；包载在不同位置的药物可以是相同的或不同的药物，在同一位置包载的药物可以是一种或两种及以上。
方法(A)和(B)中所述包载在脂膜上的药物加入在溶解有脂质材料的有机相中，所述的有机相中含有的脂质材料与药物的质量比为10～100：1(优选为20～100：1)。
方法(A)和(B)中所述的水性介质为水、生理盐水、缓冲盐溶液、枸橼酸溶液、稀盐酸溶液、稀硫酸溶液和硫酸铵溶液中的一种。
所述的缓冲盐溶液优选为磷酸盐缓冲盐溶液或醋酸钠缓冲液；更优选为pH 2.5～7.4的磷酸盐缓冲盐溶液或pH 4.5～5.5的醋酸钠缓冲液。
所述的枸橼酸溶液为0.000135～300mmol/L的枸橼酸溶液；优选为0.0135～1.35mmol/L的枸橼酸溶液。
所述的稀盐酸溶液为0.01～10mmol/L的稀盐酸溶液；优选为0.1～1mmol/L的稀盐酸溶液。
所述的稀硫酸溶液为0.005～5mmol/L的稀硫酸溶液；优选为0.05～0.5mmol/L的稀硫酸溶液。
所述的硫酸铵溶液为100～300mmol/L的硫酸铵溶液；优选为100～250mmol/L的硫酸铵溶液。
方法(A)和(B)中所述的有机溶剂为正己烷、甲醇、异丙醚、二氯甲烷、氯仿中的至少一种；优选为氯仿、二氯甲烷，以及正己烷、甲醇和异丙醚中至少一种组成的混合溶液；优选为氯仿和二氯甲烷中一种，与正己烷按体积比1～4：1(优选1～2：1；更优选1：1)混合得到的有机溶剂，或氯仿和二氯甲烷中一种，与异丙醚按体积比1～4：1(优选1～2：1；更优选1：1)混合得到的有机溶剂，或氯仿和二氯甲烷中一种，与甲醇按体积比1～4：1(优选1～2：1；更优选1：1)混合得到的有机溶剂。
方法(A)和(B)中所述的采用逆相蒸发法和二次乳化法包裹脂质膜时，其内水相和有机相的体积比为1：2～10(优选为1：4～8)；采用薄膜分散法包裹脂质膜时，有机相中脂质的用量为按每毫升水相体积配比2～30mg脂质计算。
方法(A)和(B)中所述的有机相中脂质的浓度为1～20mg/mL；优选为1.5～15mg/mL；更优选为2～13mg/mL；最优选为7mg/mL。
方法(A)中所述的内水相(或水相)中载药多糖材料纳米粒的浓度为0.1～60mg/mL；优选为0.5～50mg/mL；更优选为1～30mg/mL。
方法(B)中所述的内水相或水相中多糖的浓度为0.1～50mg/mL(优选为0.2～35mg/mL；更优选为0.5～30mg/mL)，药物的浓度0.1～20mg/mL(优选为0.2～15mg/mL；更优选为0.5～10mg/mL)。
方法(A)中所述的逆相蒸发法优选为通过如下方法实现：将载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中，形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入药物水溶液(外水相)，继续旋蒸至呈悬液后超声分散，得到多糖核心Nanocells。
所述内水相中载药多糖材料纳米粒的浓度为0.1～60mg/mL；优选为0.5～50mg/mL；更优选为1～20mg/mL。
所述的内水相和有机相的体积比为1：2～10；优选为1：4～8。
所述的药物水溶液的浓度为0～3.00mg/mL；优选为0～1.50mg/mL；更优选为0.30mg/mL。
所述的药物水溶液的用量为按每毫升药物水溶液配比2～30mg脂质计算。
所述的将内水相均匀分散于有机相为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为：150～400W超声0.5～10分钟；更优选为200～400W超声1～5min。
所述的悬液超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟。
方法(A)中所述的二次乳化法优选为通过如下方法实现：将载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中制成初乳；然后将初乳分散到药物水溶液(外水相)中，通过二次乳化制得复乳，再减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散，得到多糖核心Nanocells。
所述内水相中载药多糖材料纳米粒的浓度为0.1～60mg/mL；优选为0.5～50mg/mL；更优选为1～30mg/mL。
所述的内水相和有机相的体积比为1：2～10；优选为1：4～8。
所述的药物水溶液的浓度为0～3.00mg/mL；优选为0～1.50mg/mL；更优选为0.30mg/mL。
所述的药物水溶液的用量为按每毫升药物水溶液配比2～30mg脂质计算。
所述的将内水相均匀分散于有机相为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为：150～400W超声0.5～10分钟；更优选为200～400W超声1～5min。
所述的初乳分散到药物水溶液为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声0.5～10分钟。
所述的悬液超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟。
方法(A)中所述的薄膜分散法优选为通过如下方法实现：将有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，然后加入载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中形成的水相或加入载药多糖材料纳米粒和药物分散在水性介质中形成的水相(该药物的用量为按其在所述水相中浓度为0～3.00mg/mL计算；优选为按其在所述水相中浓度为0～1.50mg/mL计算；更优选为按其在所述水相中浓度为0.30mg/mL计算)，混合水化后超声分散，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells。(包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以在制得的多糖核心Nanocells悬液中加入进行包载，该用于包载在脂质膜内的药物的用量为按其在所述体系的终浓度为0～3.00mg/mL计算；优选为按其在所述体系的终浓度为0～1.50mg/mL计算；更优选为按其在所述体系的终浓度为0.30mg/mL计算)。
所述水相中载药多糖材料纳米粒的用量为0.1～60mg/mL；优选为0.5～50mg/mL；更优选为1～30mg/mL。
所述的水相的用量为按每毫升水相配比2～30mg脂质计算。
所述的超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟；更优选为200～400W超声20秒～6分钟。
方法(B)中所述的逆相蒸发法优选为通过如下方法实现：将药物与多糖材料分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入药物水溶液(外水相)，继续旋蒸至呈悬液后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells(包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以在制得的多糖核心Nanocells悬液中加入进行包载，该用于包载在脂质膜内的药物的用量为按其在所述体系的终浓度为0～3.00mg/mL计算，优选为按其在所述体系的终浓度为0～1.50mg/mL计算，更优选为按其在所述体系的终浓度为0.30mg/mL计算)。
所述的内水相和有机相的体积比为1：2～10，优选为1：4～8。
所述的内水相中多糖的浓度为0.1～50mg/mL(优选为0.2～35mg/mL；更优选为0.5～30mg/mL)；药物的浓度为0.1～20mg/mL(优选为0.2～15mg/mL；更优选为0.5～10mg/mL)。
所述的药物水溶液的浓度为0～3.00mg/mL；优选为0～1.50mg/mL；更优选为0.30mg/mL。
所述的外水相的用量为按每毫升药物水溶液配比2～30mg脂质计算。
所述的将内水相均匀分散于有机相为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为：150～400W超声0.5～10分钟；更优选为200～400W超声1～5min。
所述的悬液超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟。
所述的固化剂为三聚磷酸钠(TPP)，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；优选为CaCl2或三聚磷酸钠(TPP)；当多糖材料为海藻酸钠时，固化剂为CaCl2和多聚赖氨酸中的至少一种；当多糖材料为果胶时，固化剂为CaCl2，当多糖材料为壳聚糖(CTS)时，固化剂为三聚磷酸钠(TPP)。
所述的CaCl2的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg CaCl2计算；优选为按每毫升悬液配比0.05～50mg CaCl2计算；更优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg CaCl2计算。
所述的多聚赖氨酸的用量为按每毫升悬液配比0.05～50mg多聚赖氨酸计算。
所述的三聚磷酸钠(TPP)的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg三聚磷酸钠计算。
所述的固化的时间为10min～5h；优选为10min～3h；更优选为20min～2h。
方法(B)中所述的二次乳化法优选为通过如下方法实现：将药物与多糖材料分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中制成初乳；然后将初乳分散到药物水溶液(外水相)中，通过二次乳化制得复乳，减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells(包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以在制得的多糖核心Nanocells悬液中加入进行包载，该用于包载在脂质膜内的药物的用量为按其在所述体系的终浓度为0～3.00mg/mL计算，优选为按其在所述体系的终浓度为0～1.50mg/mL计算，更优选为按其在所述体系的终浓度为0.30mg/mL计算)。
所述的内水相和有机相的体积比为1：2～10，优选为1：4～8。
所述的内水相中多糖的浓度为0.1～50mg/mL(优选为0.2～35mg/mL；更优选为0.5～30mg/mL)；药物的浓度为0.1～20mg/mL(优选为0.2～15mg/mL；更优选为0.5～10mg/mL)。
所述的药物水溶液的浓度为0～3.00mg/mL；优选为0～1.50mg/mL；更优选为0.30mg/mL。
所述的外水相的用量为按每毫升药物水溶液配比2～30mg脂质计算。
所述的将内水相均匀分散于有机相为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为：150～400W超声0.5～10分钟；更优选为200～400W超声1～5min。
所述的初乳分散到药物水溶液为采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声0.5～10分钟。
所述的悬液超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟。
所述的固化剂为三聚磷酸钠(TPP)，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；优选为CaCl2或三聚磷酸钠(TPP)；当多糖材料为海藻酸钠时，固化剂为CaCl2和多聚赖氨酸中的至少一种；当多糖材料为果胶时，固化剂为CaCl2，当多糖材料为壳聚糖(CTS)时，固化剂为三聚磷酸钠(TPP)。
所述的CaCl2的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg CaCl2计算；优选为按每毫升悬液配比0.05～50mg CaCl2计算；更优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg CaCl2计算。
所述的多聚赖氨酸的用量为按每毫升悬液配比0.05～50mg多聚赖氨酸计算。
所述的三聚磷酸钠(TPP)的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg三聚磷酸钠计算。
所述的固化的时间为10min～5h；优选为10min～3h；更优选为20min～2h。
方法(B)中所述的薄膜分散法优选为通过如下方法实现：将有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，然后加入药物和多糖材料分散在水性介质中形成的水相，混合水化后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells(包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)的药物可以在制得的多糖核心Nanocells悬液中加入进行包载，该用于包载在脂质膜内的药物的用量为按其在所述体系的终浓度为0～3.00mg/mL计算；优选为按其在所述体系的终浓度为0～1.50mg/mL计算；更优选为按其在所述体系的终浓度为0.30mg/mL计算)。
所述的内水相或水相中多糖的浓度为0.1～50mg/mL(优选为0.2～35mg/mL；更优选为0.5～30mg/mL)，药物的浓度0.1～20mg/mL(优选为0.2～15mg/mL；更优选为0.5～10mg/mL)。
所述的水相的用量为按每毫升水相配比2～30mg脂质计算。
所述的超声分散的条件为：100～500W超声10秒～15分钟；优选为150～400W超声20秒～10分钟；更优选为200～400W超声20秒～6分钟。
所述的固化剂为三聚磷酸钠(TPP)，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；优选为CaCl2或三聚磷酸钠(TPP)；当多糖材料为海藻酸钠时，固化剂为CaCl2和多聚赖氨酸中的至少一种；当多糖材料为果胶时，固化剂为CaCl2，当多糖材料为壳聚糖(CTS)时，固化剂为三聚磷酸钠(TPP)。
所述的CaCl2的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg CaCl2计算；优选为按每毫升悬液配比0.05～50mg CaCl2计算；更优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg CaCl2计算。
所述的多聚赖氨酸的用量为按每毫升悬液配比0.05～50mg多聚赖氨酸计算。
所述的三聚磷酸钠(TPP)的用量为按每毫升悬液配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；优选为按每毫升悬液配比0.1～40mg三聚磷酸钠计算。
所述的固化的时间为10min～5h；优选为10min～3h；更优选为20min～2h。
所述的多糖核心Nanocells可采用不同的脂质或对脂质膜表面进行主动靶向分子修饰，按上述两种制备方法制备具有被动靶向、pH敏感靶向、热敏靶向或主动靶向的多糖核心Nanocells；还可将纳米磁性材料包裹在纳米粒核心或脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)，按上述两种制备方法制备具有磁靶向的多糖核心Nanocells；或在多糖核心Nanocells中包载针对相应疾病部位微环境敏感的材料或药物，按上述两种制备方法制备得到针对相应疾病部位微环境靶向的多糖核心Nanocells。
所述的pH敏感靶向、热敏靶向、磁靶向的多糖核心Nanocells的脂质膜中加入长循环脂质；主动靶向的多糖核心Nanocells的脂质膜中加入连接有主动靶向分子的长循环脂质和连接有主动靶向分子的脂质中的一种，和/或长循环脂质；针对相应疾病部位微环境靶向的多糖核心Nanocells的脂质膜中加入长循环脂质，和/或连接有主动靶向分子的长循环脂质和连接有主动靶向分子的脂质中的一种。
所述的主动靶向分子可以是针对不同疾病的治疗靶点的抗体类或配体类靶向分子；多糖核心Nanocells用于肿瘤治疗时，主动靶向分子可以是本领域技术人员已报道的针对肿瘤细胞表面高表达的抗原或受体的抗体或配体；优选为叶酸和生物素中的至少一种；当主动靶向多糖核心Nanocells的靶向分子为叶酸时，所述脂质中含有连接有主动靶向分子叶酸的长循环脂质和/或长循环脂质；当主动靶向多糖核心Nanocells的靶向分子为生物素时，所述脂质中含有连接有主动靶向分子生物素的长循环脂质和/或长循环脂质。
所述的长循环脂质为不同分子量的PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，优选为DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000和DSPE-PEG4000中的至少一种；更优选为DSPE-PEG2000。
所述的连接有叶酸的长循环脂质为连接有叶酸的不同分子量的PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，优选为DSPE-PEG2000-叶酸、DSPE-PEG3000-叶酸和DSPE-PEG4000-叶酸中的至少一种；更优选为DSPE-PEG2000-叶酸。
所述的连接有生物素的长循环脂质为连接有生物素的不同分子量的PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，优选为DSPE-PEG2000-生物素、DSPE-PEG3000-生物素和DSPE-PEG4000-生物素中的至少一种；更优选为DSPE-PEG2000-生物素。
所述的多糖核心Nanocells在制备靶向治疗药物中的应用。
所述的药物包括抗肿瘤药物等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的目的在于综合现有脂质体与纳米粒技术的优势，克服其不足，提供一种具有靶向治疗作用的纳米药物递送系统，是以多糖材料的纳米粒作为核心，外层包裹由脂质材料形成的类似脂质体囊膜的脂质膜的多糖核心Nanocells，可通过选用不同的脂质材料或在脂质修饰不同的靶向导向分子、包裹磁性颗粒或添加针对相应疾病部位微环境敏感的材料或药物，获得不同靶向功能的多糖核心Nanocells。本发明所公开的多糖核心Nanocells可用作多种疾病的靶向治疗用药物载体，降低毒副作用，提高治疗效果。这种纳米药物递送系统在用于递送化疗药物时，不但可实现靶向递药，还可产生逆转耐药的作用。
(2)本发明所公开的多糖核心Nanocells，其纳米粒核心、脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)和脂质膜上均可载药，包载在不同位置的药物可以是相同的或不同的药物，在同一位置包载的药物可以是一种或两种及以上，可以同时将多种治疗机制的药物包载其中，实现对一种疾病多功能治疗的作用，提高药物疗效，降低副作用。
(3)本发明所公开的多糖核心Nanocells在具有脂质体与纳米粒各自作为药物递送系统的特点与优势的基础上，可克服脂质体药物易泄漏的载药稳定性不佳的不足，并结合脂质体生物相容性与亲和性优于纳米粒的优势，同时具有较脂质体和纳米粒更明显的药物缓释作用，从而获得递药性能更佳的新型药物递送系统。在靶向治疗的同时实现长效作用，从而提高药物疗效和用药依从性。
(4)本发明所公开的多糖核心Nanocells其纳米粒核心以多糖为载体材料，具有来源丰富、成本低廉、无毒可生物降解和生物相容性高的优点，具有广大的应用前景。
(5)本发明所公开的多糖核心Nanocells包载化疗药物用于抗肿瘤方面时，不但具有较化疗药物溶液、载化疗药物脂质体更好的抗肿瘤活性外，还具有明显优于脂质体和纳米粒的逆转肿瘤多药耐药和提高化疗药物抗肿瘤活性的作用，有望作为易产生耐药的化疗药物的高效低毒的递送系统，造福广大癌症患者与社会。
附图说明
图1是载阿霉素多糖纳米药物递送系统的透射电镜图；其中，A为载阿霉素果胶纳米粒；B为载阿霉素海藻酸钠纳米粒；C为载阿霉素壳聚糖纳米粒；D为载阿霉素果胶Nanocells；E为载阿霉素海藻酸钠Nanocells；F为载阿霉素壳聚糖Nanocells；G为长循环阿霉素果胶Nanocells；H为叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells；I为生物素靶向阿霉素果胶Nanocells。
图2是载阿霉素多糖Nanocells在不同介质中的体外药物释放曲线图；其中，A、B、C分别为DOX、DOX-ALG-NPs、DOX-ALG-NCs、DOX-LPs在生理盐水、PBS(pH 6.8)和PBS(pH 7.4)中的释药图；D、E、F分别为DOX、DOX-PEC-NPs、DOX-PEC-NCs、DOX-LPs在生理盐水、PBS(pH6.8)和PBS(pH 7.4)中的释药图。
图3是载阿霉素多糖核心Nanocells对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤药效图(与生理盐水组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与DOX组相比，#P<0.05,##P<0.01)；其中，A-E为载阿霉素果胶Nanocells对荷瘤小鼠的抗肿瘤药效图(A为治疗结束后各组小鼠肿瘤组织图；B为治疗期间各组小鼠肿瘤体积变化图；C为治疗结束后各组小鼠肿瘤组织重量图；D为治疗结束后各组小鼠的肿瘤抑制率图；E为治疗期间各组小鼠体重变化图)；图F-H为载阿霉素海藻酸钠Nanocells对荷瘤小鼠的抗肿瘤药效图(图F为治疗期间各组小鼠肿瘤体积变化图，图G为治疗结束后各组小鼠肿瘤组织重量图，图H为治疗结束后各组小鼠的肿瘤抑制率图)。
图4是叶酸和生物素靶向载阿霉素果胶Nanocells在不同介质中的体外药物释放曲线图；其中，A、B、C为DOX、DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-LPNCs、DOX-FLPNCs在生理盐水、PBS(pH 6.8)和PBS(pH7.4)中的释药图；D、E、F为DOX、DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-SPNCs、DOX-BSPNCs在生理盐水、PBS(pH 6.8)和PBS(pH 7.4)中的释药图。
图5是流式细胞仪测定的叶酸和生物素靶向阿霉素多糖Nanocells在敏感细胞株和耐药细胞株中的药物摄取情况图(与DOX相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与DOX-FLPNCs或DOX-BSPNCs相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)；其中，A和C分别为DOX、DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-LPNCs、DOX-FLPNCs、DOX-FLPNCs+FREE FA(游离叶酸)在MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞中的药物摄取情况图；B和D分别为DOX、DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-SPNCs、DOX-BSPNCs在HepG-2细胞和HepG-2/ADR细胞中的药物摄取情况图；E为DOX、DOX-FLPNCs、DOX-FLPNCs+FREE FA(游离叶酸)在WI-38细胞中的药物摄取情况图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，下列实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。其中，
多糖核心Nanocells中多糖纳米粒核心的制备方法为常规制备方法，不限于本发明实施例中的乳化胶凝法，当采用乳化胶凝法制备多糖纳米粒时，所用的乳化体系，包括乳化剂种类及浓度、油水相体积比、油相种类、分散方法及条件等均按常规乳化方法选择，不限于实施例中所列举的实施方式；脂质膜制备方法中的溶解脂质的有机相种类及用量、油水相比例、外水相或水相用量、挥去有机溶剂的温度与时间、分散方法及条件等，脂质中pH敏感脂质、热敏脂质、长循环脂质与连接有靶向分子的长循环脂质的种类与用量等均按常规不同类型脂质体制备方法选择，也不限于本发明实施例中所列举的实施方式；所用的药载比也不限于本发明实施例中所列举的实施方式。
本发明中所用到的中文名称与对应英文缩写请见下表1。
表1
Figure BDA0002410683800000101
本发明实施例中涉及的Hela细胞、HepG-2细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞、NCI-H1299细胞、MCF-7细胞和人胚肺成纤维细胞WI-38细胞购自ATCC，MCF-7/ADR购自南京凯基生物科技发展有限公司，HepG-2/ADR购自上海艾研生物科技有限公司，H22细胞购自上海沪峥生物科技有限公司。如无特殊说明，细胞培养均采用含10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素的RPMI1640培养基培养。
实施例1载阿霉素多糖纳米粒的制备
分别取果胶(相对分子量分别为39、50、73k Da)、海藻酸钠(相对分子量分别为80、100、120kDa)或壳聚糖(脱乙酰度≥95％、85％，相对分子量分别为130、220、300k Da)溶于水或醋酸钠缓冲液(pH＝4.5～5.5)中，得到浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、25、30、35、40、45、50mg/mL的果胶、海藻酸钠或壳聚糖溶液作为水相，分别取乳化剂Span 20、Span80、Span 85或双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)适量溶于油性溶剂油酸、大豆油、亚油酸、亚麻酸或橄榄油中作为不同的油相(乳化剂在油相中的质量百分浓度分别为0.1％,0.2％,0.5％,1％,2％,2.5％,5％,7.5％,10％,15％,20％)，分别按35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1的不同油:水体积比将不同的水相分散于不同的油相中(超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，制得稳定的乳剂。向获得的乳剂中加入相应的固化剂(CaCl2或三聚磷酸钠)，其中：
当水相为果胶和海藻酸钠时，向乳剂体系中加入CaCl2溶液，使加入后乳剂体系中CaCl2的终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2.5、5mg/mL(即按每毫升乳剂加入0.05～5mg CaCl2)；
当水相为壳聚糖(CTS)时，向乳剂体系中加入三聚磷酸钠(TPP)溶液，使加入后乳剂体系中三聚磷酸钠(TPP)的终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2.5、5mg/mL(即按每毫升乳剂加入0.05～5mg TPP)。
在搅拌条件下分别固化10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，离心收集空白纳米粒。将空白纳米粒用无水乙醇清洗后，再依次用体积分数50％的乙醇溶液和无水乙醇脱水后，离心收集沉淀，烘干得到空白多糖纳米粒，即空白果胶纳米粒(PEC-NP)、空白海藻酸钠纳米粒(ALG-NP)、空白壳聚糖纳米粒(CTS-NP)。
分别将各种空白多糖纳米粒以0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15、20mg/mL浓度分散于药物(盐酸阿霉素)溶液中，使药物与空白多糖纳米粒质量比分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:8、1:10，分别于4℃、室温、40℃、60℃下混合载药10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、7.5小时、10小时、12小时，制得载药多糖纳米粒，即载阿霉素果胶纳米粒(DOX-PEC-NPs或DOX-PNPs)、载阿霉素海藻酸钠纳米粒(DOX-ALG-NPs)和载阿霉素壳聚糖纳米粒(DOX-CTS-NPs)。
载药量的计算公式如下：
载药量％＝已包裹药物量/载药纳米粒重量×100％。
在透射电镜下观察到的所制备的各种载阿霉素的多糖纳米粒的代表性形态图如图1A-1C所示，所制备的各种载阿霉素的多糖纳米粒的粒径、电位和载药量的代表性数据如表2所示。其中，图1A-1C和表2所示的具有代表性的各种载阿霉素的多糖纳米粒是按照以下处方参数制备得到的(为优选条件，后续实验中，除非特别说明，均采用在此条件下获得的载药多糖纳米粒)：
代表性的载阿霉素壳聚糖纳米粒制备条件是：壳聚糖(脱乙酰度≥95％，相对分子量130k Da)溶液浓度为5mg/mL，油性溶剂为油酸，乳化剂为AOT、用量为油相的2.5％(质量百分浓度)，油水两相体积比为25:1，超声分散条件为400W、5min，三聚磷酸钠(TPP)溶液在体系中的终浓度为0.2mg/mL，固化时间为1.5h，载药比(即空白多糖纳米粒与药物的质量比，下同)为5:1、空白纳米粒浓度1mg/mL、室温吸附载药3.0h。
代表性的载阿霉素果胶纳米粒制备条件是：果胶(相对分子量39k Da)溶液浓度为30mg/mL，油性溶剂为油酸，乳化剂为AOT、用量为油相的2％(质量百分浓度)，油水两相体积比为30:1，超声分散条件为400W、3min，CaCl2在体系中的终浓度为0.3mg/mL，固化时间为1h，载药比为4:1、空白纳米粒浓度1mg/mL、室温吸附载药2.0h。
代表性的载阿霉素海藻酸钠纳米粒制备条件是：海藻酸钠(相对分子量100kDa)溶液浓度为10mg/mL，油性溶剂为油酸，乳化剂为AOT、用量为油相的2％(质量百分浓度)，油水两相体积比为20:1，超声分散条件为400W、3min，CaCl2在体系中的终浓度为0.2mg/mL，固化时间为20min，载药比为4:1、空白纳米粒浓度1mg/mL、室温吸附载药2.0h。
表2载药多糖纳米粒的表征
样品 平均粒径(nm) zeta电位(mV) 载药量(％)
载阿霉素壳聚糖纳米粒 246.8±10.1 37.6±1.2 10.2±0.6
载阿霉素果胶纳米粒 287.7±1.2 -20.4±1.5 17.2±0.2
载阿霉素海藻酸钠纳米粒 270.7±4.5 -21.2±0.4 19.2±0.1
实施例2载阿糖胞苷果胶纳米粒的制备
分别按药物(盐酸阿糖胞苷)与载体材料质量比为1:1、1:2.5、1:5、1:7.5、1:10将果胶(相对分子量分别为39、50、73k Da)与药物溶于水中，果胶的质量百分浓度分别为5、10、20、30、40mg/mL，得到不同浓度含药的果胶溶液作为水相，分别取乳化剂Span 20、Span80、Span 85或双(2-乙己基)磺基丁二酸钠(AOT)适量溶于油性溶剂油酸、大豆油、亚油酸、亚麻酸或橄榄油中作为不同的油相(乳化剂在油相中的质量百分浓度分别为0.5％,1％,1.5％,2％,2.5％,5％,7.5％,10％)，分别按35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1的不同油:水体积比将不同的水相分散于不同的油相中(超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，制得稳定的乳剂。向乳剂体系中加入CaCl2溶液，使加入后乳剂体系中CaCl2的终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、3、5mg/mL(即按每毫升乳剂加入0.1～5mg CaCl2)，搅拌下分别固化0.5、1、1.5、2、3小时后，离心收集载阿糖胞苷果胶纳米粒。将载药纳米粒用无水乙醇清洗后，再依次用体积分数50％的乙醇溶液和无水乙醇脱水后，离心收集沉淀，烘干得到载阿糖胞苷果胶纳米粒(CYT-PEC-NPs)。
所制备得到的代表性(即按照以下处方参数制备：果胶(相对分子量39k Da)溶液浓度为30mg/mL，果胶与药物质量比为5:1，油性溶剂为油酸，乳化剂为AOT、用量为油相的1.5％(质量百分浓度)，油水两相体积比为30:1，超声分散条件为400W、3min，CaCl2在体系中的终浓度为0.3mg/mL，固化时间为1h)的载阿糖胞苷果胶纳米粒的透射电镜下形态与实施例1按优选条件所制备的载阿霉素果胶纳米粒相似，平均粒径为(283.03±2.30)nm、zeta电位为(-19.45±1.17)mV，载药量为(3.59±0.19)％。
实施例3载阿霉素多糖核心Nanocells的制备
本实施例采用如下任一种方法制备载阿霉素多糖核心Nanocells。
(1)方法(A)：按实施例1的方法分别制备得到载阿霉素的多糖纳米粒，即载阿霉素果胶纳米粒、载阿霉素海藻酸钠纳米粒和载阿霉素壳聚糖纳米粒(通过实施例1中优选条件获得：即阿霉素与空白果胶纳米粒质量比1:4、室温吸附载药制备得到载阿霉素果胶纳米粒；阿霉素与空白海藻酸钠纳米粒质量比1:4，室温吸附载药制备得到载阿霉素海藻酸钠纳米粒；阿霉素与空白壳聚糖纳米粒质量比1:5、室温吸附载药制备得到载阿霉素壳聚糖纳米粒)。将其分别按照载药纳米粒量计0.1、0.5、1、3、5、7.5、10、15、20、30、40、50、60mg/mL的浓度分别分散在水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐溶液(pH2.5、5.0、6.8、7.4)、枸橼酸溶液(0.000135、0.0135、1.35、300mmol/L)、稀盐酸溶液(0.01、0.1、1、10mmol/L)、稀硫酸溶液(0.005、0.05、0.5、5mmol/L)或硫酸铵溶液(100、200、300mmol/L)的水性介质中作为内水相或水相，以正己烷(或甲醇)和氯仿(体积比1:1)的混合溶剂溶解卵磷脂与胆固醇(卵磷脂与胆固醇的质量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1)得有机相(总脂质浓度为1、3、5、7、10、15、20mg/mL)，采用常规制备脂质体的逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法在多糖纳米粒外层包裹脂质膜制成多糖核心Nanocells，具体过程如下：
当采用逆相蒸发法时，将分散有载药(盐酸阿霉素)纳米粒的水相作为内水相，将内水相均匀分散于溶解有脂质(卵磷脂与胆固醇)的有机相中(内水相和有机相的体积比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10；超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，再加入含有药物(盐酸阿霉素)的水溶液(其中药物的浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL；其体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg))，继续旋蒸至呈悬液后超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)和载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。
当采用二次乳化法时，将分散有载药(盐酸阿霉素)纳米粒的水相作为内水相，将内水相均匀分散于溶解有脂质(卵磷脂与胆固醇)的有机相中(内水相和有机相的体积比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10，超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，制成初乳；再将初乳均匀分散于含有药物(盐酸阿霉素)的水溶液(其中药物的浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL；其体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg))，通过二次乳化制得复乳。减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)、载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。
当采用薄膜分散法时，将溶解有脂质的有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，加入分散有载药(盐酸阿霉素)纳米粒的水相(或加入分散有载药(盐酸阿霉素)纳米粒和药物的水相，药物在水相中的浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL)，水相体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg)，水化后，超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)、载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。再在得到的载阿霉素的多糖核心Nanocells的悬液中加入盐酸阿霉素使其在体系中的终浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL，进一步将药物包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)。
(2)方法(B)：将多糖材料(果胶、海藻酸钠或壳聚糖)和药物(盐酸阿霉素)分别溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐溶液(pH2.5、5.0、6.8、7.4)、枸橼酸溶液(0.000135、0.0135、1.35、300mmol/L)、稀盐酸溶液(0.01、0.1、1、10mmol/L)、稀硫酸溶液(0.005、0.05、0.5、5mmol/L)或硫酸铵溶液(100、200、300mmol/L)的水性介质中，以获得的多糖和药物混合溶液作为内水相或水相(其中药物的终浓度为0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、15、20mg/mL；多糖材料的终浓度为0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、25、30、35、40、45、50mg/mL)，以正己烷(或甲醇)和氯仿(体积比1:1)的混合溶剂溶解卵磷脂与胆固醇(卵磷脂与胆固醇的质量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1)得有机相(总脂质浓度为1、3、5、7、10、15、20mg/mL)，采用常规制备脂质体的逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法将含有多糖材料和药物的水相包裹于脂质膜中，用CaCl2或TPP作为固化剂使包裹在脂质膜内水相的多糖材料固化为纳米粒核心，制成多糖核心Nanocells，具体过程如下：
当采用逆相蒸发法时，将溶有多糖材料和药物(盐酸阿霉素)的水相作为内水相，将内水相均匀分散于溶解有脂质(卵磷脂与胆固醇)的有机相中(内水相和有机相的体积比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10；超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入含有药物(盐酸阿霉素)的水溶液(其中药物的浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL；其体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg))，继续旋蒸至呈悬液后超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，再加入CaCl2或TPP(其中，当多糖材料为果胶与海藻酸钠时，使用CaCl2进行固化；当多糖材料为壳聚糖时，使用TPP进行固化)，使加入后体系中CaCl2或TPP的终浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70mg/mL，分别固化10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)和载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。再在得到的载阿霉素的多糖核心Nanocells的悬液中加入盐酸阿霉素，使其体系中的终浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL，进一步将药物包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)。
当采用二次乳化法时，将溶有多糖材料和药物(盐酸阿霉素)的水相作为内水相，将内水相均匀分散于溶解有脂质(卵磷脂与胆固醇)的有机相中(内水相和有机相的体积比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10；超声分散条件：功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)制成初乳，将初乳均匀分散于含有药物(盐酸阿霉素)的水溶液(其中药物的浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL；其体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg))，通过二次乳化制得复乳。减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)，再加入CaCl2或TPP(其中，当多糖材料为果胶与海藻酸钠时，使用CaCl2进行固化；当多糖材料为壳聚糖时，使用TPP进行固化)，使加入后体系中CaCl2或TPP的终浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70mg/mL，分别固化10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)和载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。再在得到的载阿霉素的多糖核心Nanocells的悬液中加入盐酸阿霉素使其体系中的终浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL，进一步将药物包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)。
当采用薄膜分散法时，将溶解有脂质的有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，加入溶有多糖材料和药物(盐酸阿霉素)的水相，水相体积与有机相中脂质的比例为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(mL:mg)，水化后，超声分散(功率分别为100、200、300、400、500W，时间分别为10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、3分钟、5分钟、7钟、10分钟、12分钟、15分钟)得悬液，再加入CaCl2或TPP(其中，当多糖材料为果胶与海藻酸钠时，使用CaCl2进行固化；当多糖材料为壳聚糖时，使用TPP进行固化)，使加入后体系中CaCl2或TPP的终浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70mg/mL，分别固化10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时后，得到载阿霉素的多糖核心Nanocells，即分别为载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)和载阿霉素壳聚糖Nanocell(DOX-CTS-NCs)。再在得到的载阿霉素的多糖核心Nanocells的悬液中加入盐酸阿霉素使其体系中的终浓度分别为0、0.3、0.7、1、2、3mg/mL，进一步将药物包载在脂质膜与纳米粒核心之间(脂质膜内)。
透射电镜下观察到的所制备的各种载阿霉素的多糖核心Nanocells的代表性形态图如图1D-1F所示，所制备的各种载阿霉素的多糖核心Nanocells的粒径、电位和载药量的代表性数据如表3所示；其中，图1D-1F和表3所示的具有代表性的各种载阿霉素的多糖核心Nanocells是按照以下处方参数制备得到的(为优选条件，后续实验中，除非特别说明，均采用在此条件下获得的载药多糖核心Nanocells)：
代表性的载阿霉素壳聚糖Nanocells制备条件是：采用方法(A)的逆相蒸发法，将按实施例1中优选条件获得的载阿霉素壳聚糖纳米粒以5mg/mL浓度分散在水中作为内水相，以正己烷和氯仿(体积比1:1)的混合溶剂溶解卵磷脂与胆固醇(质量比为3:1)得有机相(总脂质浓度为7mg/mL)，内水相和有机相的体积比为1:6，在功率200W下超声分散4分钟成乳，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入含有0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:15(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散3分钟，得到载阿霉素壳聚糖Nanocells(DOX-CTS-NCs)。
代表性的载阿霉素海藻酸钠Nanocells制备条件是：采用方法(A)的逆相蒸发法，将按实施例1中优选条件获得的载阿霉素海藻酸钠纳米粒以5mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿(体积比1:1)的混合溶剂溶解卵磷脂与胆固醇(质量比为3:1)得有机相(总脂质浓度为7mg/mL)，内水相和有机相的体积比为1:6，功率200W下超声分散1分钟成乳，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入含有0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:15(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散20秒，得到载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs)。
代表性的载阿霉素果胶Nanocells制备条件是：采用方法(A)的逆相蒸发法，将按实施例1中优选条件获得的载阿霉素果胶纳米粒以5mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿(体积比1:1)的混合溶剂溶解卵磷脂与胆固醇(质量比为2:1)得有机相(总脂质浓度为7mg/mL)，内水相和有机相的体积比为1:6，功率200W下超声分散5分钟成乳，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入含有0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:15(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散5分钟，得到载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs或DOX-PNCs)。
表3载药多糖核心Nanocells的表征
样品 平均粒径(nm) zeta电位(mV) 载药量(％)
载阿霉素壳聚糖Nanocells 178.0±2.4 -17.5±0.3 1.78±0.08
载阿霉素果胶Nanocells 165.8±4.1 -24.4±1.6 2.61±0.11
载阿霉素海藻酸钠Nanocells 306.5±2.3 -26.1±0.1 2.73±0.02
实施例4：载阿霉素果胶Nanocells和载阿霉素海藻酸钠Nanocells体外释药行为
采用透析袋法测定阿霉素(DOX)、载阿霉素果胶纳米粒(DOX-PEC-NPs，按实施例1优选条件制备)、载阿霉素海藻酸钠纳米粒(DOX-ALG-NPs，按实施例1优选条件制备)、载阿霉素脂质体(DOX-LPs)(制备载阿霉素脂质体所用材料和方法同实施例3优选条件制备代表性载阿霉素果胶Nanocells，仅将制备方法中分散有载阿霉素果胶纳米粒的水相直接换为300mmol/L枸橼酸水溶液，其它条件不变，即可得到载阿霉素脂质体。)、载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs，按实施例3优选条件制备)、载阿霉素海藻酸钠Nanocells(DOX-ALG-NCs，按实施例3优选条件制备)在不同释放介质中的体外释放行为。操作过程简述如下：
分别向透析袋中加入各种载阿霉素的递药系统，扎紧袋口，分别置于生理盐水、PBS(pH 6.8)和PBS(pH 7.4)等不同释放介质中，于37.0±0.5℃的气浴恒温振荡器中，以100r·min-1震荡。分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0h取样、及时补充新鲜释放介质，用高效液相色谱法测定释药样品中阿霉素的含量，并计算累积释药百分率。其中色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈：水＝40：60(用磷酸调整水pH＝3.0)；柱温35℃；流速1.0mL·min-1；检测波长256nm；进样量20μL。
体外释放试验表明，DOX-ALG-NPs、DOX-ALG-NCs、DOX-PEC-NPs、DOX-PEC-NCs和DOX-LPs在生理盐水及pH 6.8和pH 7.4的PBS溶液中均显示出不同程度的缓释作用(图2)。DOX-PEC-NCs和DOX-ALG-NCs在这三种介质中的释放均最慢，明显分别慢于DOX、DOX-PEC-NPs、DOX-ALG-NPs和DOX-LPs在这三种介质中的释放。当释放72h时，DOX、DOX-PEC-NPs、DOX-ALG-NPs和DOX-LPs的累积释放百分率达到90％，而DOX-PEC-NCs和DOX-ALG-NCs的累积释放百分率在80％左右。
实施例5载阿霉素与SU5416的果胶Nanocells的制备
将按实施例1中优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒以5mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿的混合溶剂(体积比1:1)溶解脂质(脂质为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂与胆固醇的质量比为3:1；脂质终浓度为6.7mg/mL)和血管生成抑制剂SU5416(MedChemexpress CO.,Ltd；SU5416与脂质的质量比为1:100)制备得到有机相，将内水相均匀分散于有机相中(内水相和有机相相的体积比为1:6，功率200W下超声分散5分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，再加入含有的0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:15(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散5分钟，得到载阿霉素与SU5416的果胶Nanocells。其形态与实施例3按优选条件所制备的载阿霉素果胶Nanocells相似，平均粒径为(165.8±3.4)nm、zeta电位为(-21.5±1.7)mV，阿霉素的载药量为(2.34±0.22)％、SU5416的载药量为(0.72±0.12)％。
实施例6载阿霉素与维拉帕米的果胶Nanocells的制备
将按实施例1中优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒以5mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿的混合溶剂(体积比1:1)溶解脂质(脂质为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂与胆固醇的质量比为2:1；脂质终浓度为7mg/mL)制备得到有机相，将内水相均匀分散于有机相中(内水相和有机相相的体积比为1:6，功率200W下超声分散5分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，再加入含有0.33mg/mL盐酸阿霉素和0.4mg/mLP-gp抑制剂盐酸维拉帕米(购于Sigma-Aldrich LLC.)的混合水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:13(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散5分钟，制得载阿霉素与维拉帕米的果胶Nanocells。其形态与实施例3按优选条件所制备的载阿霉素果胶Nanocells相似，平均粒径为(152.3±2.0)nm、zeta电位为(-22.2±1.1)mV，阿霉素的载药量为(2.56±0.15)％、盐酸维拉帕米的载药量为(1.82±0.24)％。
实施例7载阿霉素与伊马替尼的果胶Nanocells的制备
将按实施例1中优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒以6mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿的混合溶剂(体积比1:1)溶解脂质(脂质为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂与胆固醇的质量比为3:1；脂质终浓度为6.7mg/mL)制备得到有机相，将内水相均匀分散于有机相中(内水相和有机相相的体积比为1:6，功率200W下超声分散5分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，再加入含有0.33mg/mL盐酸阿霉素和0.8mg/mLP-gp抑制剂甲磺酸伊马替尼(购于MedChemexpress CO.,Ltd)的混合水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:20(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散5分钟，制得载阿霉素与伊马替尼的果胶Nanocells。其形态与实施例3按优选条件所制备的载阿霉素果胶Nanocells相似，平均粒径为(171.2±0.6)nm、zeta电位为(-35.9±2.3)mV，阿霉素的载药量为(2.67±0.13)％、甲磺酸伊马替尼的载药量为(4.56±0.56)％。
实施例8载阿霉素、维拉帕米与SU5416的多糖Nanocells的制备
采用实施例6方法，仅将按实施例1中优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒以6mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，将SU5416与卵磷脂、胆固醇(SU5416与脂质的总质量比为1:100)溶解在正己烷和氯仿的混合溶剂(体积比1:1)里作为有机相，其它条件不变，同法制得载阿霉素、维拉帕米与SU5416的果胶Nanocells。其形态与实施例3按优选条件所制备的载阿霉素果胶Nanocells相似，平均粒径为(174.8±9.2)nm、zeta电位为(-22.2±0.8)mV，阿霉素的载药量为(2.84±0.01)％、维拉帕米的载药量为(1.67±0.18)％、SU5416的载药量为(0.61±0.07)％。
实施例9载阿霉素多糖Nanocells的体外抗肿瘤活性及逆转肿瘤耐药作用
采用MTT测定法考察实施例3优选条件制备的载阿霉素果胶Nanocells和海藻酸钠Nanocells对Hela细胞、HepG-2细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞、NCI-H1299细胞、HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的细胞毒性。取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞浓度为3×104个/mL，培养24h。然后分别加入含不同药物浓度的载阿霉素果胶Nanocells和海藻酸钠Nanocells，孵育至72小时。分别再孵育24、48和72小时，向96孔板的细胞中加入20μL的MTT工作溶液(5mg/mL)，温育4小时，弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO(二甲基亚砜)，用多功能酶标仪在570nm处测定吸光度(OD值)，计算药物对癌细胞生长的抑制率(Inhibitory rate,IR％)。
IR％＝(1-OD药物/OD对照)×100％；
式中：OD药物为各药物处理组细胞的吸光度，OD对照为空白对照组细胞的吸光度。
采用Graph Pad 5.0软件处理，计算当抑制率为50％时对应的药物浓度，即为半数抑制浓度IC50，并计算载阿霉素果胶Nanocells和海藻酸钠Nanocells在HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞中的耐药逆转倍数，结果见表4-表6，耐药逆转倍数的计算公式如下。
耐药逆转倍数＝阿霉素的IC50(耐药细胞株)/阿霉素纳米制剂的IC50(耐药细胞株)。
在所有测试的细胞株上，载阿霉素果胶Nanocells和海藻酸钠Nanocells对癌细胞的杀伤作用均表现出时间和剂量依赖关系，随着作用时间延长、药物浓度增加而增强。载阿霉素果胶Nanocells和海藻酸钠Nanocells对癌细胞的抑制作用分别优于相应的载阿霉素的果胶纳米粒、海藻酸钠纳米粒和脂质体。在72h时，载阿霉素果胶Nanocells对耐药细胞株HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的耐药逆转倍数分别为3.12倍和2.62倍，分别是载阿霉素脂质体的1.40倍和1.71倍；载阿霉素海藻酸钠Nanocells对耐药细胞株HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的耐药逆转倍数分别为3.94倍和3.5倍，分别是载阿霉素海藻酸钠纳米粒的1.41倍和1.25倍，是阿霉素脂质体的1.16倍和1.09倍。
表4 DOX、DOX-PEC-NPs、DOX-LPs与DOX-PEC-NCs对不同细胞株的半数抑制浓度(IC50)
Figure BDA0002410683800000171
Figure BDA0002410683800000181
注：表中DOX-1、DOX-2分别表示DOX在两次细胞实验中的结果；a与b分别表示两次细胞实验中的结果。
表5 DOX、DOX-ALG-NPs、DOX-LPs与DOX-ALG-NCs对不同细胞株的半数抑制浓度(IC50)
Figure BDA0002410683800000182
表6 DOX-LPs、DOX-PEC-NCs、DOX-ALG-NPs与DOX-ALG-NCs在72h对耐药细胞株的耐药逆转作用
Figure BDA0002410683800000183
Figure BDA0002410683800000191
注：表中DOX-LPs-1与DOX-LPs-2分别表示DOX-LPs在两次细胞实验中的结果；a与b分别表示两次细胞实验中的结果。
实施例10载阿霉素果胶Nanocells的体内抗肿瘤活性
按实施例3方法的优选条件，仅将优选条件中“加入含有0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相”的外水相直接换为水，不调节pH值，其它条件不变，制得载阿霉素果胶Nanocells。以移植性H22实体瘤小鼠为动物模型，考察所制得的载阿霉素果胶Nanocells对肿瘤生长的抑制效果。取雄性昆明小鼠，体重20±2g(动物购自广东省医学实验动物中心)，于右前肢腋下皮下注射1×l07/mL的H22细胞悬液，建立小鼠H22肝癌移植瘤模型。接种完成后，给予充足食物和水，备用。所有小鼠均在SPF级的层流架中饲养，笼具、垫料等荷瘤小鼠所接触的所有物品均经灭菌处理。
接种后第7天，将造模成功的小鼠100只称重，随机分成10组，每组10只。各组于接种后第7、11、15天(计为治疗的第0、4、8天)分别通过尾静脉注射每日给予1次生理盐水(Normal saline；0.1mL)、注射用水(Water for injection；0.1mL)、阿霉素溶液(DOX，5.0mg/kg)、阿霉素脂质体(DOX-LPs，5.0mg/kg)、阿霉素果胶纳米粒(DOX-PEC-NPs，5.0、2.5、1.0mg/kg)和阿霉素果胶Nanocells(DOX-PEC-NCs，5.0、2.5、1.0mg/kg)。每日称量小鼠体重，游标卡尺测定肿瘤体积，同时观察小鼠的生长状态，并于治疗的第10天结束实验，处死所有小鼠，剥离瘤体、胸腺和脾脏，称重。各组小鼠的体重、肿瘤大小和重量、抑瘤率结果如图3A-3E所示。
从图中可以看出：模型对照组(生理盐水组与注射用水组)肿瘤最大，而DOX、DOX-LPs、DOX-PEC-NPs以及DOX-PEC-NCs给药组肿瘤生长得到抑制。随着给药剂量的增大，DOX-PEC-NPs与DOX-PEC-NCs两种给药系统的抑制作用越明显，其中DOX-PEC-NPs的高(5.0mg/kg)、中(2.5mg/kg)、低(1.0mg/kg)剂量组的抑瘤率分别为84.09％、47.81％、49.17％；DOX-PEC-NCs的高(5.0mg/kg)、中(2.5mg/kg)、低(1.0mg/kg)剂量组的抑瘤率分别为72.25％、62.66％、54.11％，且具有明显的剂量依赖性。两种给药系统的抑制作用与模型对照组差异明显(P＜0.01)，DOX-PEC-NPs的高剂量组以及DOX-PEC-NCs的高、中剂量组的抑瘤率显著高于高剂量5.0mg/kg的DOX组(55.04％)与DOX-LPs组(58.77％)。
虽然在高剂量时，DOX-PEC-NPs的抑瘤效果优于DOX-PEC-NCs，但在中、低剂量时，DOX-PEC-NCs的抑瘤效果均大于DOX-PEC-NPs，其抑制率在1.0mg/kg时已与5.0mg/kg的DOX原料药及DOX-LPs的接近。在高剂量5.0mg/kg时，各组动物包括DOX-PEC-NPs和DOX-PEC-NCs组的胸腺指数与脾脏指数(胸腺指数和脾脏指数计算方法如下：胸腺指数＝胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)；脾脏指数＝脾脏重量(mg)/小鼠体重(g))均低于未用药物的模型对照组(注射用水组)，说明高剂量时，DOX-PEC-NPs和DOX-PEC-NCs具有一定的毒性，但显著低于DOX。在中、低剂量时，DOX-PEC-NPs和DOX-PEC-NCs组的胸腺指数与脾脏指数与注射用水组无显著性差异，说明在中、低剂量时，DOX-PEC-NPs和DOX-PEC-NCs毒性小。可见，选择中剂量DOX-PEC-NCs可产生高效低毒的抗肿瘤作用。
实施例11载阿霉素海藻酸钠Nanocells的体内抗肿瘤活性
按实施例3方法的优选条件，仅将优选条件中“加入含有0.3mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相”的外水相直接换为水，不调节pH值，其它条件不变，制得载阿霉素海藻酸钠Nanocells。按实施例10方法，以移植性H22实体瘤小鼠为动物模型，考察所制得的载阿霉素海藻酸钠Nanocells对肿瘤生长的抑制效果，所有药物组的阿霉素剂量均为5.0mg/kg。各组小鼠肿瘤组织的体积变化和重量、抑瘤率结果如图3F-3H所示。
从图中可以看出：DOX组在抑制肿瘤生长方面效果不佳，治疗第10天时(即实验结束时)肿瘤体积为1323.60mm3；DOX-LPs的抗肿瘤作用与DOX组相近，实验结束时肿瘤体积为1368.41mm3。与DOX相比，DOX-ALG-NPs和DOX-ALG-NCs可以显著改善治疗效果，实验结束时两组的肿瘤体积分别为746.58mm3和639.92mm3。所测定的各组肿瘤组织的重量也显示出相似的结果，说明DOX-ALG-NCs的抗肿瘤作用最优，再依次是DOX-ALG-NPs、游离DOX和DOX-LPs。
在给予5.0mg/kg DOX溶液与纳米制剂后，所有给药组动物的脾脏指数与胸腺指数均低于生理盐水对照组。但DOX-LPs、DOX-ALG-NPs组的脾脏指数与DOX组相比无显著性差异，DOX-ALG-NCs的脾脏指数则明显大于DOX组；DOX-ALG-NPs组的胸腺指数与DOX组无显著性差异，DOX-LPs和DOX-ALG-NCs组的胸腺指数显着高于DOX组；说明相比于纳米粒和脂质体，DOX-ALG-NCs具有更好的安全性。可见，选择DOX-ALG-NCs可产生高效低毒的抗肿瘤作用。
实施例12叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells的制备
按实施例3的方法，将按实施例1中优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒以5.5mg/mL浓度分散在0.1mmol/L的稀盐酸溶液中作为内水相，以正己烷和氯仿的混合溶剂(体积比1:1)溶解卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000(购自上海芃硕生物科技有限公司)和DSPE-PEG2000-叶酸(购自上海芃硕生物科技有限公司)制备得到有机相，磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸的质量比分别为1:1:0.25:0.1、3:1:0.1:0.25、2:1:0.45:0.9、3:1:0.7:1.3、4:1:1.5:1.5、5:1:0.15:2.5、6:1:2:2；总脂质浓度为4、8、10、12、16、20mg/mL。将内水相均匀分散于有机相中(内水相和有机相相的体积比为1:6，功率200下超声分散4分钟)，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，再加入含有0.33mg/mL盐酸阿霉素的水溶液为外水相，其体积与有机相中脂质的比例为1:20(mL:mg)，调节pH7～8，继续旋蒸至呈悬液后，功率200W下超声分散4分钟，得到叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-FLPNCs)。在有机相中不加入DSPE-PEG2000-叶酸(磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000的质量比分别为1:1:0.25、3:1:0.1、2:1:0.45、3:1:0.8、4:1:1.5、5:1:0.15、6:1:2；总脂质浓度为4、8、10、12、16、20mg/mL)，其它条件不变，同法可制得长循环阿霉素果胶Nanocells(DOX-LPNCs或DOX-SPNCs)。
所制备得到的代表性的长循环阿霉素果胶Nanocells(磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000的质量比为3:1:0.8，总脂质浓度8mg/mL)的平均粒径为(124.3±3.4)nm，zeta电位为(-28.6±1.0)mV，阿霉素的载药量为(2.54±0.35)％。所制备得到的代表性的叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells(磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸的质量比为3:1:0.7:1.3，总脂质浓度10mg/mL)的平均粒径为(125.8±1.5)nm，zeta电位为(-26.6±2.7)mV，阿霉素的载药量为(2.45±0.07)％。透射电镜下观察到的所制备的两种代表性Nanocells的形态图如图1G-1H所示。
实施例13生物素靶向阿霉素果胶Nanocells的制备
按实施例12的方法，仅将溶解在有机相中的脂质换成磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素(购自上海芃硕生物科技有限公司)，磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素的质量比分别为1:1:0.1、3:1:0.25、2:1:0.15、2:1:0.6、4:1:1.5、5:1:2.5、6:1:2，含有0.33mg/mL盐酸阿霉素的水溶液的外水相的体积与有机相中脂质的比例为1:16(mL:mg)，其它条件不变，得到生物素靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-BSPNCs)。
所制备得到的代表性的生物素靶向阿霉素果胶Nanocells(磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素的质量比为2:1:0.6，总脂质浓度8mg/mL)的平均粒径为(123.0±3.3)nm、zeta电位为(28.5±0.8)mV，阿霉素的载药量为(3.08±0.23)％；透射电镜下观察到的形态图如图1I所示。
实施例14各种载阿霉素的药物递送系统的体外释药行为
采用实施例4相同的透析袋法，对阿霉素(DOX)、实施例1优选条件制得的载阿霉素果胶纳米粒(DOX-PNPs)、载阿霉素脂质体(DOX-LIPs；制备同实施例4的DOX-LPs)、实施例3优选条件制得的载阿霉素果胶Nanocells(DOX-PNCs)、实施例12制得的代表性的长循环阿霉素果胶Nanocells(DOX-LPNCs或DOX-SPNCs)和叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-FLPNCs)、实施例13制得的代表性的生物素靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-BSPNCs)在生理盐水、PBS(pH 6.8)和PBS(pH 7.4)中的释药特性分别进行考察，分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h取样，测定释药样品中阿霉素的含量，并计算累积释药百分率，结果见图4。
由图4可知，阿霉素与阿霉素纳米制剂在不同介质中的释药略有不同，即均在生理盐水中释放最快最多，再依次是PBS(pH 7.4)、PBS(pH 6.8)。总体来说，在三种不同的释药介质中，游离阿霉素的释药均最快最多，累积释药百分率最高，而阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells、长循环阿霉素果胶Nanocells、叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells和生物素靶向阿霉素果胶Nanocells均体现出不同程度的缓释效果，缓释效果从弱到强依次为：阿霉素果胶纳米粒<阿霉素脂质体<阿霉素果胶Nanocells<长循环阿霉素果胶Nanocells<或≈(小于或约等于)叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells≈生物素靶向阿霉素果胶Nanocells。在三种介质中，释药2h时，阿霉素果胶纳米粒均释药超过50％，具有突释作用；阿霉素脂质体释药在40～49％，具有一定的突释作用；阿霉素果胶Nanocells、长循环阿霉素果胶Nanocells、叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells和生物素靶向阿霉素果胶Nanocells释药均低于40％，未出现明显的突释效应。在生理盐水中，当药物释放时间分别为24h和72h时，阿霉素、阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells、长循环阿霉素果胶Nanocells、叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells和生物素靶向阿霉素果胶Nanocells的释药量分别为93.12％、85.85％、74.68％、64.95％、64.22％、59.10％、54.07％和93.12％、86.81％、81.88％、76.99％、74.30％、65.78％、67.99％。在PBS(pH 7.4和pH 6.8)介质中，观察到了同样的释药趋势。
实施例15靶向阿霉素果胶Nanocells的体外抗肿瘤活性、逆转肿瘤耐药作用及靶向作用
采用MTT测定法考察叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-FLPNCs)和生物素靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-BSPNCs)对叶酸和生物素过表达的人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌HepG-2细胞、耐药细胞株HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的细胞毒性。取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞浓度为3×104个/mL，培养24h。然后分别加入含不同药物浓度的叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells，孵育至72小时。分别再孵育24、48和72小时，向96孔板的细胞中加入20μL的MTT工作溶液(5mg/mL)，温育4小时，弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO，用多功能酶标仪测定570nm处的吸光度(OD值)，按实施例9同法计算药物对癌细胞生长的抑制率(IR％)、半数抑制浓度IC50及对HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞的耐药逆转倍数(表7、表8)。
采用流式细胞仪检测人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌HepG-2细胞、耐药细胞株HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞、不高表达叶酸受体的人胚肺成纤维细胞WI-38细胞分别对叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells和生物素靶向阿霉素果胶Nanocells的摄取作用。取对数生长期细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞浓度为1x 105个/mL，培养24h。然后分别加入含叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells的培养液(敏感株细胞和耐药株细胞中药物浓度分别为1μg/mL和4μg/mL)，敏感株孵育1h，耐药株孵育4h。吸出药液，用冰PBS洗一次，消化成细胞悬液后转移至10mL离心管中，以1000转/min的速度离心5min。弃去上清，加入1mL冰PBS，轻轻吹打细胞制成均匀的细胞悬液并转移到2mL离心管，以3000转/min的速度离心5min，弃去上清。再重复洗一次，弃去上清。用200μL冷PBS重悬收集到的细胞，并转移到96孔板中上样于流式细胞仪进行检测(激发波长488nm，发射波长575nm)，结果如图5所示。
在所考察的敏感细胞株和耐药细胞株上，叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells对癌细胞的杀伤作用均表现出时间和剂量依赖关系，随着作用时间延长、药物浓度增加而增强。叶酸靶向或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells对癌细胞的抑制作用优于相应的阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells和长循环阿霉素果胶Nanocells，表明叶酸或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells对叶酸或生物素受体过表达的癌细胞株具有靶向作用。
表8的结果显示，叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells在72h对耐药细胞株HepG-2/ADR细胞的耐药逆转倍数为5.5倍，分别高于阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells和长循环载阿霉素果胶Nanocells3.34、3.89、3.18和2.79倍；在48h对耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的耐药逆转倍数为14.68倍，分别高于阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells和长循环载阿霉素果胶Nanocells 7.43、9.53、7和5.89倍。生物素靶向阿霉素果胶Nanocells在48h对耐药细胞株HepG-2/ADR细胞的耐药逆转倍数为5.34倍，分别高于阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells和长循环载阿霉素果胶Nanocells 1.55、3.92、1.68和0.77倍；在48h对耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的耐药逆转倍数为7.78倍，分别高于阿霉素果胶纳米粒、阿霉素脂质体、阿霉素果胶Nanocells和长循环载阿霉素果胶Nanocells4.15、5.66、1.71和4.27倍。这些结果说明，由于叶酸或生物素的靶向作用，可以明显提高Nanocells在耐药细胞株中的逆转耐药作用。
同时，由流式细胞仪所获得的各种肿瘤细胞对DOX及其不同纳米制剂的摄取情况结果(图5)可知，叶酸与生物素受体过表达的HepG-2细胞、MCF-7细胞、HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞对叶酸或生物素靶向阿霉素果胶Nanocells的摄取最高，显著高于其它非靶向的阿霉素纳米制剂；当体系中同时加入游离叶酸后，MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞对叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells的摄取明显下降。而叶酸受体不过表达的WI-38细胞对DOX溶液、叶酸靶向阿霉素果胶Nanocells(DOX-FLPNCs)的摄取无明显差异，且在体系中加入游离叶酸，也未能使WI-38细胞对DOX-FLPNCs的摄取发生明显改变，这一结果进一步证明DOX-FLPNCs对MCF-7细胞、HepG-2细胞、HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞最佳的体外抗癌活性，及其对HepG-2/ADR细胞和MCF-7/ADR细胞最优的耐药逆转作用与其靶向作用有关。
表7 DOX、DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-LPNCs、DOX-FLPNCs、DOX-SPNCs、和DOX-BSPNCs对不同细胞株的半数抑制率(IC50)(
Figure BDA0002410683800000221
n＝3)
Figure BDA0002410683800000222
Figure BDA0002410683800000231
注：表中a与b分别表示两次细胞实验中的结果。与DOX相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与DOX-FLPNCs或DOX-BSPNCs相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。
表8DOX-PNPs、DOX-LIPs、DOX-PNCs、DOX-LPNCs、DOX-FLPNCs、DOX-SPNCs、和DOX-BSPNCs对耐药株细胞HepG-2/ADR和MCF-7/ADR的耐药逆转倍数
Figure BDA0002410683800000232
注：表中a与b分别表示两次细胞实验中的结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多糖核心Nanocells，其特征在于：具有核壳结构，其中以多糖材料组成的纳米粒为核心，其外层包裹有由脂质材料形成的类似脂质体囊膜的脂质膜，药物包载在纳米粒核心里，和/或脂质膜与纳米粒核心之间，和/或包载在脂质膜上。
2.根据权利要求1所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
所述的多糖核心Nanocells的粒径为20～500nm；
所述的药物为抗肿瘤药物、血管生成抑制剂和耐药逆转剂中的至少一种；
所述的多糖材料为海藻酸及其盐、壳聚糖及其衍生物、甲壳素、果胶及其衍生物、淀粉及其衍生物、白芨多糖、葡聚糖、右旋糖苷、卡拉胶、黄原胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶和魔芋葡甘聚糖中的至少一种；
所述的脂质材料为磷脂及其衍生物、荷正电脂质和胆固醇及其衍生物中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
所述的抗肿瘤药物为阿霉素、阿糖胞苷、伊马替尼及其可药用盐中的至少一种；
所述的血管生成抑制剂为血管生成抑制剂SU5416和combretastatin-A4中的至少一种；
所述的耐药逆转剂为维拉帕米和伊马替尼及其可药用盐中的至少一种；
所述的多糖材料为果胶、海藻酸钠和壳聚糖中的至少一种；
所述的脂质材料为卵磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺、棕榈酰基油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰甘油、α-生育酚琥珀酸酯，油酸，亚油酸，棕榈酰同型半胱氨酸、D-α-生育酚基聚(2-乙基-2-恶唑啉)琥珀酸酯、硬脂胺、硬脂酰胺、油酰基脂肪胺衍生物和胆固醇半琥珀酸酯中的至少一种；
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG3000和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG4000中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
所述的脂质材料为卵磷脂和胆固醇按质量比为1～6：1混合得到的脂质，或卵磷脂，胆固醇和DSPE-PEG2000按质量比为1～6：1：0.1～2混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-叶酸按质量比为1～6：1：0.1～2.5混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-生物素按质量比为1～6：1：0.1～2.5混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-叶酸按质量比为1～6：1：0.1～2：0.1～2.5混合得到的脂质，或卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-生物素按质量比为1～6：1：0.1～2：0.1～2.5混合得到的脂质。
5.根据权利要求1～4任一项所述的多糖核心Nanocells，其特征在于，通过如下任一种方法制备得到：
(A)先将多糖材料和药物制备成载药多糖材料纳米粒；然后将载药多糖材料纳米粒分散到水性介质中作为内水相或水相，将脂质与包载在脂质膜上的药物溶解到有机溶剂中作为有机相，再采用逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法在内水相或水相中的多糖材料纳米粒外层包裹脂质膜，得到多糖核心Nanocells；
(B)将多糖材料和药物分散到水性介质中，得到药物和多糖材料的混合溶液作为内水相或水相，将脂质与包载在脂质膜上的药物溶解到有机溶剂中作为有机相，再采用逆相蒸发法、二次乳化法或薄膜分散法将含有多糖材料和药物的内水相或水相包裹在脂质膜内得到悬液，然后在悬液中加入固化剂使多糖材料核心固化，得到多糖核心Nanocells。
6.根据权利要求5所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
方法(A)中所述的载药多糖材料纳米粒通过如下方法制备得到：
(i)将多糖材料溶解到水性介质中，得到多糖溶液作为水相；将乳化剂溶于油性溶剂中作为油相；将水相和油相分散混合均匀，得到稳定的乳剂；然后加入固化剂将其固化，用无水乙醇清洗，再用乙醇溶液和无水乙醇脱水后，离心收集沉淀，烘干，得到空白纳米粒；
(ii)将空白纳米粒加入到药物溶液中，于4～60℃下混合10分钟～12小时，得到载药多糖材料纳米粒；
方法(A)中所述的逆相蒸发法通过如下方法实现：将载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中，形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入药物水溶液，继续旋蒸至呈悬液后超声分散，得到多糖核心Nanocells；
方法(A)中所述的二次乳化法通过如下方法实现：将载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中制成初乳；然后将初乳分散到药物水溶液中，通过二次乳化制得复乳，再减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散，得到多糖核心Nanocells；
方法(A)中所述的薄膜分散法通过如下方法实现：将有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，然后加入载药多糖材料纳米粒分散在水性介质中形成的水相或加入载药多糖材料纳米粒和药物分散在水性介质中形成的水相，混合水化后超声分散，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells；
方法(B)中所述的逆相蒸发法通过如下方法实现：将药物与多糖材料分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中，减压蒸发去除有机溶剂，形成凝胶后，加入药物水溶液，继续旋蒸至呈悬液后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells；
方法(B)中所述的二次乳化法通过如下方法实现：将药物与多糖材料分散在水性介质中形成内水相，然后将其均匀分散于有机相中制成初乳；然后将初乳分散到药物水溶液中，通过二次乳化制得复乳，减压蒸发去除有机溶剂至呈悬液后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells；
方法(B)中所述的薄膜分散法通过如下方法实现：将有机相减压蒸发去除有机溶剂制得薄膜，然后加入药物和多糖材料分散在水性介质中形成的水相，混合水化后超声分散，再向超声后得到的悬液中加入固化剂进行固化，得到多糖核心Nanocells悬液；再在多糖核心Nanocells的悬液中加入药物，得到所述的多糖核心Nanocells；
所述的固化剂为三聚磷酸钠，能够产生Ca2+的有机盐、无机盐和多聚赖氨酸中的至少一种；
所述的固化的时间为10min～5h。
7.根据权利要求6所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
所述的固化剂为CaCl2或三聚磷酸钠；
所述的CaCl2的用量为按每毫升乳剂或悬液配比0.05～70mg CaCl2计算；
所述的三聚磷酸钠的用量为按每毫升乳剂或悬液配比0.05～70mg三聚磷酸钠计算；
所述的药物水溶液的浓度均为0～3.00mg/mL；
所述的在多糖核心Nanocells的悬液中加入的药物均为按其在所述体系的终浓度为0～3.00mg/mL计算。
8.根据权利要求6所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
步骤(i)中所述的水性介质为水或醋酸钠缓冲液；
步骤(i)中所述的多糖溶液的浓度为0.1～50mg/mL；
步骤(i)中所述的乳化剂为Span 20、Span 80、Span 85和双(2-乙己基)磺基丁二酸钠中的至少一种；
步骤(i)中所述的油性溶剂为油酸、大豆油、亚油酸、亚麻酸和橄榄油中的至少一种；
步骤(i)中所述的乳化剂与油性溶剂的质量比为0.1～20：80～99.9；
步骤(i)中所述的水相和油相的体积比为1：2～35；
步骤(i)中所述的水相和油相均匀分散采用超声分散的方式进行，其条件为：100～500W超声10秒～15分钟；
步骤(i)中所述的乙醇溶液为体积分数为20～100％的乙醇溶液；
步骤(ii)中所述的药物溶液中空白纳米粒的浓度为0.1mg/mL～20mg/mL；
步骤(ii)中所述的药物与空白多糖纳米粒的质量比为1：1～20。
9.根据权利要求5所述的多糖核心Nanocells，其特征在于：
方法(A)中所述的内水相或水相中载药多糖材料纳米粒的浓度为0.1～60mg/mL；
方法(A)和(B)中所述的水性介质为水、生理盐水、缓冲盐溶液、枸橼酸溶液、稀盐酸溶液、稀硫酸溶液和硫酸铵溶液中的一种；
方法(A)和(B)中所述的有机溶剂为正己烷、甲醇、异丙醚、二氯甲烷、氯仿中的至少一种；
方法(A)和(B)中所述的有机相中脂质的浓度为1～20mg/mL；
方法(B)中所述的内水相或水相中多糖的浓度为0.1～50mg/mL，药物的浓度0.1～20mg/mL。
10.权利要求1～9任一项所述的多糖核心Nanocells在制备靶向治疗药物中的应用。
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