CN103893123B - 一种脂质体-聚合物杂化纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质体-聚合物杂化纳米粒子及其制备方法和应用。所述脂质体-聚合物杂化纳米粒子包括两亲性聚合物纳米粒子和包覆于所述两亲性聚合物纳米粒子表面的磷脂双分子层，以及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子内部及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子与磷脂双分子层之间的水溶性不同的药物。本发明的纳米粒子具有多层结构，包埋水溶性不同的药物，实现不同药物的协同作用，生物相容性高，血液中的循环时间长，具有靶向和缓控释作用，提高药物的疗效，降低药物的毒副反应，可用于作抗肿瘤药物的载体系统。本发明的制备方法工艺简单，操作过程方便，可实验室小规模生产，也可工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及由水溶性不同的药物和两亲性聚合物以及脂质体组装形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子的制备方法及制得的纳米粒子，及其在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
21世纪的今天虽然医学技术高速发展，癌症仍然是严重威胁人类健康的重大疾病之一。尽管过去几十年中，随着医疗水平的提高癌症患者的生存几率有所提高，但是相对于其他疾病(例如心血管疾病)死亡率的下降速度，癌症的死亡率仍旧很高。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。最新统计资料显示，中国每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡的人数为160万人，现有病历310万。癌症每年给中国造成的经济损失逾千亿元。癌症难以治疗的主要原因之一是肿瘤细胞具有强大的自我调节机制，能快速通过调节自身的代谢通路而产生补偿机制而对各种治疗药物产生抗药性，降低药物对细胞的杀伤力。相对而言，正常细胞，特别是癌症病人的正常细胞，即使经过很长时间的药物治疗，仍然对抗癌药物极其敏感。药物的联合作用是一种非常具有潜力的用来治疗一些通过补偿机制而具有抗药性疾病的治疗方法。所以越来越多的研究者尝试利用不同药物组合来治疗癌症，但是简单地对患者直接给予药物混合治疗存在很多问题，例如难以分析两种或多种药物的药物代谢动力学，另外多种药物在体内的分布一致性也难以确定，同时也无法保证两种药物能同时作用于相同肿瘤细胞。
纳米载药体系(NanoparticleDrugDeliverySystem)是指药物与纳米载体形成的粒径介于1-1000nm的药物输送系统，包括纳米球、纳米囊、纳米粒子和纳米脂质体等。纳米载药体系与其它药物载体相比，表现出明显的优势：1)改善药物水溶性，提高药物的透膜能力和生物利用度。2)提高药物的稳定性，实现可控释，延长药物在体内的半衰期。3)引入具有不同刺激(例如pH、温度和酶等)敏感的生物材料，实现药物在肿瘤部位的可控释放，减轻药物的副作用。4)实现药物在肿瘤部位的富集，由于肿瘤部位新生血管的不完整性，以及缺乏淋巴管的清除作用，导致纳米载体具有被动肿瘤靶向效应，即EPR(EnhancedPermeabilityandRetention)效应。另外，通过在纳米载体表面修饰各种主动靶向配体，如叶酸、RGD多肽等，可以实现纳米粒子对肿瘤部位的的主动靶向。此外，设计特殊的纳米载体，可以使纳米药物穿越血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等天然生物屏障，解决治疗中存在的瓶颈难题。这种特性可以使得纳米粒子在进入正常组织之前优先进入到肿瘤组织当中。所以药物可以在肿瘤组织区域达到比较高的浓度从而减少一些药物的副作用。主动靶向方式主要通过在纳米粒子上连接靶向性的配体或抗体，这样可以使得药物选择性的被运输到肿瘤组织。常用的载药体系主要包括以下几种：多聚化合物、树枝状化合物、脂质体、胶束和一些无机纳米颗粒。聚合物具有很好的力学稳定性，药物包载能力强，但是生物相容性较差。而磷脂制备的脂质体具有很好的生物相容性，尤其是具有适量PEG修饰的脂质体，能够逃逸免疫追捕，延长在体内的循环时间，但是脂质体由于力学性质不稳定，容易造成药物的突然释放，近来一些科学家逐步将脂质体和聚合物两种纳米粒子结合在一起，用磷脂双分子层对聚合物纳米粒子进行包载，制备出聚合物杂化纳米载药体系。
利用脂质体-聚合物杂化纳米材料运输多种药物正在逐渐成为热点。发明人发明和设计了一种利用两亲性聚合物同时包载水溶性不同的药物的方法，本方法简单实用，要求条件低，可以用于大规模工业化生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种脂质体-聚合物杂化纳米粒子及其制备方法和应用，本发明的纳米粒子具有多层结构，包埋水溶性不同的药物，实现不同药物的协同作用，生物相容性高，血液中的循环时间长，具有靶向和缓控释作用，提高药物的疗效，降低药物的毒副反应。本发明的制备方法工艺简单，操作过程方便，可实验室小规模生产，也可工业化大规模生产。
在第一方面，本发明提供一种脂质体-聚合物杂化纳米粒子，包括两亲性聚合物纳米粒子和包覆于所述两亲性聚合物纳米粒子表面的磷脂双分子层，以及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子内部及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子与磷脂双分子层之间的水溶性不同的药物。
在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的脂质体-聚合物杂化纳米粒子的方法，包括如下步骤：
(1)将两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液混合，超声处理形成第一乳液；
(2)将含有表面活性剂的水溶液与所述第一乳液混合，在搅拌下加入疏水性药物的有机溶液，并搅拌均匀，然后超声处理形成第二乳液；
(3)在搅拌下将所述第二乳液加入含有表面活性剂的水溶液，并搅拌均匀，然后蒸去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(4)将所述聚合物纳米粒子悬液和亲水性药物的水溶液与磷脂双分子层薄膜混合，进行薄膜超声处理，得到脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
作为本发明的优选技术方案，所述磷脂双分子层薄膜是通过如下方法制得的：将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂，蒸去有机溶剂，所述卵磷脂和胆固醇自组装成所述磷脂双分子层薄膜。
优选地，所述卵磷脂选自大豆卵磷脂、脑磷脂等各种来源的磷脂和聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂，聚乙二醇一端可以连接相关的靶向基团或者成像基团。
优选地，所述卵磷脂和胆固醇的摩尔比为1:1～1:0.1，例如1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.6、1:0.3或1:0.1，在此摩尔比范围内能够形成较好的磷脂双分子层薄膜。
优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮，更优选为二氯甲烷。
此处和本发明中其它地方出现的“选自”，如没有特别说明，均指可以从所列具体选项中选择一个或至少两个。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)中两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液以体积比2:1～10:1混合，例如以2:1、3:1、4:1、5:1、7:1和9:1混合，在此体积比范围内能形成良好的“油包水”乳液。
优选地，所述步骤(1)中两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液以体积比4:1混合，这是形成“油包水”乳液的一个较佳的体积比。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)中的两亲性聚合物选自聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚赖氨酸-聚丙交酯乙交酯(EPL-PLGA)和聚醚酰亚胺-聚乳酸(PEI-PLA)。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)中的亲水性药物选自阿霉素盐酸盐、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。需要说明的是：本发明不在于亲水性药物的选择，任何亲水性药物均可用于实现本发明。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(1)中的两亲性聚合物的有机溶液中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。
上述制备方法中，所述步骤(1)和步骤(2)中可以采用超声波细胞破碎仪实施超声处理；所述步骤(3)可以采用旋转蒸发仪蒸去有机溶剂；所述步骤(4)可以采用超声清洗仪进行薄膜超声处理，对超声清洗仪的功率没有特殊要求，可根据制备体系大小确定。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液、第一乳液和疏水性药物的有机溶液的体积比为2-5:1-2:0.1-0.5，例如2:1:0.1、2:1:0.5、2:2:0.1、2:2:0.5、5:1:0.1、5:1:0.5、5:2:0.1或5:2:0.5。在此体积比范围内能形成较好、稳定的第二乳液。
优选地，所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液、第一乳液和疏水性药物的有机溶液的体积比为2:1.25:0.25。这是形成第二乳液的一个较佳的体积比。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中的表面活性剂选自聚乙烯醇或其它相似的高分子聚合物。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为1-3％，例如1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.5％、2.7％或2.9％，优选为2％。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中的疏水性药物选自伊立替康和紫杉醇。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。需要说明的是：本发明不在于疏水性药物的选择，任何疏水性药物均可用于实现本发明。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中的疏水性药物的有机溶液中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中的第二乳液和含有表面活性剂的水溶液的体积比为10:2～10:5，例如10:2、10:3、10:4、10:4.5或10:4.8。
优选地，所述步骤(3)中的第二乳液和含有表面活性剂的水溶液的体积比为10:3.5。
本发明中，表面活性剂的作用在于稳定形成的乳液。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中的表面活性剂选自聚乙烯醇或其它相似的高分子聚合物。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中的含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为0.3-1％，例如0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、0.95％或0.98％，优选为0.6％。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)中的亲水性药物选自阿霉素盐酸盐、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂。可以单独使用一种，也可以混合使用至少两种。需要说明的是：本发明不在于亲水性药物的选择，任何亲水性药物均可用于实现本发明。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)的体系中卵磷脂与两亲性聚合物的质量比为1:1～1:10，例如1:1、1:2、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:9.5。在此质量比范围内，卵磷脂与两亲性聚合物的比例比较合理，能够充分利用二者，虽然在此质量比范围以外也能实现本发明，但是该质量比范围是优选的。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(4)的体系中疏水性药物和亲水性药物总量与两亲性聚合物的质量比为1:10～1:100，例如1:10、1:15、1:20、1:30、1:50、1:70、1:80、1:90或1:95。本发明中，疏水性药物和亲水性药物二者可以以任意比例使用，可以根据对具体药物的需求情况决定二者的比例关系，因为本发明的脂质体-聚合物杂化纳米粒子的形成基本上不依赖于疏水性药物和亲水性药物的量。
需要说明的是：本发明的制备方法中，步骤(1)和步骤(4)使用的亲水性药物可以相同，也可以不同。本发明的制备方法适用于包埋抗癌药物，也适用于包埋水溶性不同但需要协同作用一起使用的针对其它疾病的药物。
在第三方面，本发明提供如第一方面所述的脂质体-聚合物杂化纳米粒子在制备抗肿瘤药物的纳米载药体系中的应用。
本发明的有益效果为：本发明采用两次乳化的方法制备包载有水溶性不同药物和两亲性聚合物的聚合物纳米粒子药物，而后采用薄膜超声自组装法将磷脂双分子层包裹在聚合物纳米粒子表面，同时将亲水性药物包载在聚合物纳米粒子和磷脂双分子层的界面，得到包载多种药物、具有多层结构的脂质体-聚合物杂化纳米粒子。所述脂质体-聚合物杂化纳米粒子由于表面的磷脂双分子层，本身生物相容性高，能够成功逃脱网状内皮组织和一些免疫细胞的吞噬，延长在血液中的循环时间，使得纳米粒子药物本身具有靶向和缓控释作用，提高药物的疗效，降低其自身的毒副反应，还实现不同药物协同作用对例如肿瘤细胞等产生多靶点作用，从不同途径对例如肿瘤细胞等产生杀伤作用。
本发明的制备方法是利用两次乳化和薄膜超声法将水溶性不同的药物和纳米材料包载成纳米粒子。所用试剂均为市售普通试剂，设备简单，操作过程方便适用，既可在实验室小规模生产，又可工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的载有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂的纳米粒子透射电镜图。
图2为本发明实施例1制备的载有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂的纳米粒子粒度分布图，可以看出粒径主要分布在60-200nm，分布均匀对称，粒径大小为168.63±24.56nm。
图3为本发明实施例1制备的载有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂的纳米粒子溶解于乙腈的高效液相色谱图，5-氟尿嘧啶(Free5-Fu)在2.4分钟出现特征吸收峰(270nm)，伊立替康(FreeCPT)在7.9分钟出现特征吸收峰(360nm)，奥沙利铂(FreeAXO)在3.2分钟出现特征吸收峰(260nm)，纳米粒子(LNP-5-Fu-AXO-CPT)的样品分别出现了三个特征峰(270nm、260nm和360nm)，表明在所制备的纳米粒子中载有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂三种药物。
图4为本发明的包载有5-氟尿嘧啶(5-Fu)和伊立替康(CPT)两种药物的聚合物纳米粒子(NPs)和包载有5-氟尿嘧啶(5-Fu)、伊立替康(CPT)和奥沙利铂(AXO)三种药物的脂质体-聚合物杂化纳米粒子(LNPs)的在pH＝4.4(a)和pH＝7.2(b)条件下的药物释放曲线。
图5为本发明所制备的5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂三种药物的脂质体-聚合物杂化纳米粒子作用于胰腺癌细胞的细胞毒性柱状图。所用药物总浓度为0.2μmol/mL，可以看出空载纳米粒子对胰腺癌细胞基本没有毒性，而包载有三种药物的纳米粒子对胰腺癌细胞的杀伤作用比游离药物的效果更好。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
制备以伊立替康作为疏水性药物模型、以5-氟尿嘧啶和奥沙利铂作为亲水性药物模型、以mPEG/PLA作为两亲性聚合物模型、以卵磷脂和胆固醇作为脂质体模型并载有三种药物的具有多层结构的脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(1)将20mg的聚合物PLA-PEG溶于1mL二氯甲烷中，作为油相；加入250μL溶有2mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪(宁波新芝超声细胞破碎仪：SCIENTZ-IID)在4％功率下作用4分钟，形成均一乳液；
(3)将2mL的2％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况下加入，同时将250μL溶有2mg/mL伊立替康的二氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌3min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用5分钟；
(5)将10mL的0.6％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌10分钟；
(6)用旋转蒸发仪(东京理化：N-1100D-WD)除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于二氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和奥沙利铂水溶液，并置于超声清洗仪(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)8000-13000rpm离心5-10min，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
在透射电镜下观察纳米粒子，结果如图1所示，可以看出纳米粒子大小约为100nm。
利用激光粒度仪测得纳米粒子的粒径为168.63±24.56nm(图2)；分散度为0.264，zeta电位为-14.6±0.14，表明该溶液稳定性较好；5-氟尿嘧啶包封率为20.5％，伊立替康包封率为96.13％，奥沙利铂包封率为21.37％。
将(9)中的沉淀冷冻干燥后用乙腈溶解，利用高效液相色谱检测，可以看出纳米粒子同时具有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂的特征峰(图3)，说明利用该方法可以将三种药物同时包载到纳米粒子中。
实施例2
制备包载伊立替康、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的纳米粒子，得到粒径大小约为161.63±21.76nm的球形纳米粒子，5-氟尿嘧啶载药量为2％，包封率为20％，具体实施方式如下：
(1)将20mg的聚合物PLA-PEG溶于1mL二氯甲烷中，作为油相；加入250μL溶有8mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪在4％功率下作用4分钟，形成均一乳液；
(3)将2mL的2％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况加入，同时将250μL溶有10mg/mL伊立替康的二氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌3min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用5分钟；
(5)将10mL的0.6％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌10分钟；
(6)用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于二氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和奥沙利铂(1.14g)水溶液，并置于超声清洗仪中(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)8000-13000rpm离心5-10分钟，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
实施例3
制备包载5-氟尿嘧啶和伊利替康两种药物的纳米粒子，得到粒径大小约为165.63±14.38nm的球形纳米粒子，载药量为12％，伊立替康包封率为96％，具体实施方式如下：
(1)将20mg的聚合物PLGA-PEG溶于1mL二氯甲烷中，作为油相，加入250μL溶有0.4mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪在4％功率下作用4分钟，形成均一乳液；
(3)将2mL的2％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况下加入，同时将250μL溶有10mg/mL伊立替康的二氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌3min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用5分钟；
(5)将10mL的0.6％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌10分钟；
(6)用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于二氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和5-氟尿嘧啶水溶液，并置于超声清洗仪中(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)13000rpm离心10分钟，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
实施例4
制备5-氟尿嘧啶、伊利替康和奥沙利铂三种药物纳米粒子，得到粒径大小约为163.63±20.83nm的球形纳米粒子，载药量为5％，奥沙利铂包封率为21％，具体实施方式如下：
(1)将20mg的聚合物PLGA-PEG溶于1mL二氯甲烷中，作为油相；加入250μL溶有0.4mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪在4％功率下作用4分钟，形成均一乳液；
(3)将2mL的2％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况下加入，同时将250μL溶有2mg/mL伊立替康的二氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌3min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用5分钟；
(5)将10mL的0.6％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌10分钟；
(6)用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于二氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和1mL的5mg/mL奥沙利铂水溶液，并置于超声清洗仪中(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)13000rpm离心10分钟，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
实施例5
制备包载紫杉醇、阿霉素盐酸盐和奥沙利铂的纳米粒子，得到粒径大小约为180.53±27.08nm的球形纳米粒子，阿霉素盐酸盐载药量为5％，包封率为50％，具体实施方式如下：
(1)将30mg的聚合物EPL-PLGE溶于1mL三氯甲烷中，作为油相；加入500μL溶有5mg/mL的阿霉素盐酸盐水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪在4％功率下作用10分钟，形成均一乳液；
(3)将5mL的1％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况加入，同时将100μL溶有10mg/mL紫杉醇的三氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌5min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用10分钟；
(5)将12mL的1％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌10分钟；
(6)用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于三氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和奥沙利铂水溶液，并置于超声清洗仪中(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)8000rpm离心10分钟，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
实施例6
制备包载伊立替康、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的纳米粒子，得到粒径大小约为159.63±23.87nm的球形纳米粒子，5-氟尿嘧啶载药量为1.5％，包封率为25％，具体实施方式如下：
(1)将18mg的聚合物PLA-PEG溶于1mL二氯甲烷中，作为油相；加入100μL溶有4mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
(2)利用超声波细胞破碎仪在4％功率下作用5分钟，形成均一乳液；
(3)将2mL的3％聚乙烯醇(PVA)加入圆形烧杯，将(2)制备的乳液在搅拌的情况加入，同时将500μL溶有5mg/mL伊立替康的二氯甲烷缓慢加入；
(4)搅拌7min后取出再次利用超声波细胞破碎仪在5％功率下作用5分钟；
(5)将15mL的0.3％PVA加入圆形烧杯，将(4)制备的乳液，在搅拌的情况下缓慢加入，搅拌15分钟；
(6)用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(7)将0.06g卵磷脂和0.015g胆固醇溶于二氯甲烷，用旋转蒸发仪去除有机溶剂，卵磷脂和胆固醇在烧瓶底部自组装成磷脂双分子层薄膜。
(8)在(7)中加入(6)制备好的聚合物纳米粒子悬液和奥沙利铂水溶液，并置于超声清洗仪中(东芝：SB-5200DTDN)中，用99％的功率超声，使得磷脂双分子层在聚合物纳米粒子表面自组装，形成脂质体-聚合物杂化纳米粒子。
(9)10000rpm离心8分钟，沉淀即为载有水溶性不同抗癌药物的复合纳米粒子。
试验例1
将包载有两种药物(CPT和5-Fu)的聚合物纳米粒子(没有外层的磷脂双分子层)和本发明的方法制备得到的包载有三种药物(CPT、AXO和5-Fu)的脂质体-聚合物杂化纳米粒子分散于pH＝4.4和pH＝7.2的缓冲液中，在不同的时间点取样离心，测得上清液中的药物浓度，计算出药物的释放率(释放率＝药物的释放量/药物的总量*100％)，实验结果如图4所示，可以看出相对于聚合物纳米粒子，脂质体-聚合物纳米粒子的稳定性更好，在酸性(pH＝4.4)和中性(pH＝7.2)条件下都更加稳定，体现在药物的释放率低，可见本发明方法制备得到的脂质体-聚合物杂化纳米粒子具有优异的稳定性，利于药物的缓慢释放。
试验例2
将处于对数生长期的胰腺癌细胞调成1*103个/孔接种于96孔培养板，分别加入5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂游离药物(游离药物组)，空载纳米粒子(不含药物的脂质体-聚合物杂化纳米粒子)和载有三种抗癌药物(5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂)的脂质体-聚合物杂化纳米粒子(载药纳米粒子组)，游离药物和载药纳米粒子组中所有药物的总浓度均为0.2μmol/mL，三种药物的比例完全相同，每种浓度平行5孔。给予10％牛血清RPMI1640培养液，每孔加100μL培养液，分别培养12h、24h、36h和48h后，利用CCK-8法检测每组中细胞的促凋亡作用效果。实验结果如图5所示，每个时间点的三个并列柱状图从左至右依次对应空载纳米粒子、游离药物组和载药纳米粒子组。由图5的结果可以看出，相对于游离药物，载药脂质体-聚合物杂化纳米粒子对胰腺癌细胞的毒性更强，而空载纳米粒子几乎没有表现出对胰腺癌细胞的毒性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (14)
1.一种制备脂质体-聚合物杂化纳米粒子的方法，其特征在于，所述脂质体-聚合物杂化纳米粒子，包括两亲性聚合物纳米粒子和包覆于所述两亲性聚合物纳米粒子表面的磷脂双分子层，以及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子内部及包埋于所述两亲性聚合物纳米粒子与磷脂双分子层之间的水溶性不同的药物；
所述方法包括如下步骤：
(1)将两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液混合，超声处理形成第一乳液；
(2)将含有表面活性剂的水溶液与所述第一乳液混合，在搅拌下加入疏水性药物的有机溶液，并搅拌均匀，然后超声处理形成第二乳液；
(3)在搅拌下将所述第二乳液加入含有表面活性剂的水溶液，并搅拌均匀，然后蒸去有机溶剂，得到聚合物纳米粒子悬液；
(4)将所述聚合物纳米粒子悬液和亲水性药物的水溶液与磷脂双分子层薄膜混合，进行薄膜超声处理，得到脂质体-聚合物杂化纳米粒子；
其中，所述步骤(1)中两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液以体积比2:1～10:1混合，两亲性聚合物选自聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇、聚赖氨酸-聚丙交酯乙交酯和聚醚酰亚胺-聚乳酸，亲水性药物选自5-氟尿嘧啶和奥沙利铂；所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液、第一乳液和疏水性药物的有机溶液的体积比为2-5:1-2:0.1-0.5，表面活性剂选自聚乙烯醇，含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为1-3％，疏水性药物选自伊立替康；所述步骤(3)中的第二乳液和含有表面活性剂的水溶液的体积比为10:2～10:5，表面活性剂选自聚乙烯醇，含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为0.3-1％；所述步骤(4)的体系中卵磷脂与两亲性聚合物的质量比为1:1～1:10，疏水性药物和亲水性药物总量与两亲性聚合物的质量比为1:10～1:100，亲水性药物选自5-氟尿嘧啶和奥沙利铂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂双分子层薄膜是通过如下方法制得的：将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂，蒸去有机溶剂，所述卵磷脂和胆固醇自组装成所述磷脂双分子层薄膜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵磷脂选自大豆卵磷脂、脑磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵磷脂和胆固醇的摩尔比为1:1～1:0.1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷脂双分子层薄膜制备时的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中两亲性聚合物的有机溶液与亲水性药物的水溶液以体积比4:1混合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的两亲性聚合物的有机溶液中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液、第一乳液和疏水性药物的有机溶液的体积比为2:1.25:0.25。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为2％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的疏水性药物的有机溶液中的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和丙酮。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的第二乳液和含有表面活性剂的水溶液的体积比为10:3.5。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的质量浓度为0.6％。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的体系中疏水性药物和亲水性药物总量与两亲性聚合物的质量比为1:10～1:100。
14.如权利要求1所述制备方法制得的脂质体-聚合物杂化纳米粒子在制备抗肿瘤药物的纳米载药体系中的应用。
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