CN105853403B - 一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药技术领域，具体涉及一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体及其制备方法，其中紫杉醇棕榈酸酯，是将棕榈酸与紫杉醇的2'位羟基进行酯化而得到的，属紫杉醇前药。该前药从根本上改变了紫杉醇脂溶性差的不足，实质性的解决了紫杉醇纳米制剂成药性差的问题。本发明针对紫杉醇棕榈酸酯特殊的理化性质，对处方组成与制备工艺进行了匹配性研究，真正意义上研发了一种不含聚氧乙烯蓖麻油的、安全的、质量稳定的、制备工艺简单的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，对紫杉醇在抗肿瘤领域的进一步研究与应用奠定了坚实的基础。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体及其制备方法。
背景技术：
紫杉醇(Paclitaxe1)是从红豆杉科属植物中提取得到的一种二萜类化合物，结构式如式A所示，化学名称5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2,R,3,S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。本品为白色结晶粉末，无臭，无味，不溶于水，且脂溶性也较差，口服几乎不吸收。由于其脂溶性与水溶性均较差，致使给临床制剂的开发与应用带来了难题，其相关研究始于20世纪50年代末期，历时30余年。直至1992年12月，FDA首次批准了美国百时美施贵宝公司的紫杉醇注射液上市，商品名为“泰素”，广泛用于卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的治疗，属一线广谱抗肿瘤药物，一直沿用至今。由于其独特的作用机制和显著的抗肿瘤效果，被誉为20世纪抗肿瘤药物研究领域中最重大的突破。
式A紫杉醇结构式
美国百时美施贵宝公司的紫杉醇注射液，商品名为“泰素”，规格为30mg/5ml。其每毫升注射液中含有6mg紫杉醇、527mg聚氧乙烯蓖麻油和49.7％无水乙醇。尽管“泰素”很好的解决了紫杉醇难溶于水的问题，也体现出了良好的抗肿瘤效果，但由于处方中添加了大量的、具有毒副作用的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油，致使该制剂具有诸多缺陷：①过敏反应频发：泰素说明书以及文献(高鹏，涂家生,聚氧乙烯蓖麻油及其安全性研究进展.药学与临床研究，2010,18(1):59-63.)指出，聚氧乙烯蓖麻油为活性物质，使机体释放出具有过敏作用的组胺，从而导致过敏反应的发生，其过敏反应出现的概率超过40％，致人死亡的报道也屡见不鲜，故过敏反应是泰素最大的安全隐患；②与输液器具相容性较差：文献报道(张虹,杨凤敏,吴静,等.紫杉醇注射液对一次性使用精密输液器中邻苯二甲酸二(2一乙基)己酯的溶出作用.中国医疗器械信息，2014,20(3):61-66；张恩娟,陈琳,曹健.紫杉醇注射液配套输液器中邻苯二甲酸二辛酯的溶出性考察.中药临床,2008.19(2):698-700)，聚氧乙烯蓖麻油为表面活性剂，能够溶解出输液袋及输液管路中所含的增塑剂(邻苯二甲酸二(2一乙基)己酯)，对人体肝肾功能与生殖功能造成损伤；③用药不方便：在泰素说明书中明确其用药前需进行严格的脱敏处理以及准备必要的防护措施。以便于随时急救，并根据情况严格控制输液滴速，若出现过敏反应应及时停药，积极抢救，专人护理，做好抢救记录，使用极其繁琐。鉴于“泰素”存在的诸多问题，如何开发一种不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇静脉给药制剂则成为紫杉醇制剂研究的热点。
目前，随着纳米制剂技术的发展，不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇纳米制剂相继应用于临床。美国生物科学公司研发的注射用紫杉醇(白蛋白结合型)，商品名为于2005年获FDA批准在美国上市，该制剂是将紫杉醇用人血白蛋白包裹制成的纳米冻干粉针剂，不含任何有毒副作用的表面活性剂与增溶剂，有效避免了“泰素”中由于含聚氧乙烯蓖麻油而引起的过敏反应，故在临床使用时无需进行脱敏预防，直接输注即可。目前，该制剂是继“泰素”后最好的紫杉醇注射剂，但其价格昂贵，售价约为6000元人民币/瓶，一个疗程需4瓶，折合费用为2.4万元左右，大大增加了患者的经济负担。另外，处方中的白蛋白是人血白蛋白，是从人血液中提取得到的，潜在的病毒感染风险让人担忧，昂贵的价格让人望而却步；紫杉醇聚合物胶束(-PM)于2007年在韩国上市，不含有聚氧乙烯蓖麻油，是将紫杉醇通过高分子聚合物材料聚乙二醇单甲醚-聚乳酸包裹而制备的胶束制剂，该聚合物属增溶剂，其体内过程以及安全性尚未研究透彻，有待临床进一步研究；南京思科药业有限公司的紫杉醇脂质体(力扑素)，属冻干粉针剂，于2003年在中国上市，同样不含有聚氧乙烯蓖麻油，是用安全性极高的卵磷脂作为包裹材料制备而成的一种脂质体，属较为畅销的紫杉醇注射剂，但该脂质体粒径分布较宽，且难以复溶，临床用药时需借助振荡器振荡5min方可复溶(见紫杉醇脂质体(力扑素)说明书)，使用极其不便；综上所述，目前用于临床的紫杉醇脂质体性价比相对较高，但存在诸多的缺陷与不足。为此，如何开发一种不含聚氧乙烯蓖麻油、质量可靠、使用方便、价格低廉的紫杉醇脂质体或其它纳米包裹制剂是当下研究的热点。
鉴于现有紫杉醇制剂存在的不足，国内外学者对紫杉醇脂质体或其它纳米制剂进行了广泛的研究。我们知道，纳米制剂对肿瘤具有被动靶向作用，可显著提高疗效，并降低毒性。紫杉醇纳米给药系统已成为国内外医药领域的研究热点(张英，杨巧荷,等,紫杉醇纳米制剂研究进展,内蒙古医科大学学报,2014,36(6):560-564；Lan Feng,RussellJ.Mumper,A critical review of lipid-based nanoparticles for taxane delivery,Cancer Letters,2013,334:157–175)。文献(李智，韩静，等.RP-HPLC凝胶分离法测定紫杉醇纳米微乳的包封率.药物分析杂志，2008，25(5):772-775)，研制了一种紫杉醇纳米乳剂，其包封率为85％左右，有近15％的药物渗漏；文献(杨恩芸，王晓君，等.壳聚糖修饰的紫杉醇纳米粒的制备.华西药学杂志，2014,296(3):237-240)，研制了一种壳聚糖修饰的紫杉醇PLGA纳米粒，其包封率仅为80.11％；文献(刘敏，许玉杰，等.高效液相色谱法测定紫杉醇及其脂质纳米粒包封率的方法学研究.分析试验室，2007，26(12):1-5)，研制的紫杉醇脂质体，其包封率仅为68.78％。由此可见，直接将紫杉醇制备成脂质体、乳剂、纳米粒等常规包裹制剂的可实施性相差甚远，主要原因是紫杉醇的脂溶性较低，与包裹材料的相容性不匹配所致。
为此，我们拟通过结构改造来提高紫杉醇的脂溶性，即用脂肪酸与紫杉醇结构中羟基进行酯化反应，得到脂溶性较好的紫杉醇脂肪酸酯前药，从而解决其纳米制剂成药性差的问题，达到高效低毒的研究目的。
通过文献检索，国外也有将脂肪酸与紫杉醇结构中的羟基进行酯化得到紫杉醇脂溶性前药的报道。紫杉醇结构中的2'位羟基与7位羟基都可以与脂肪酸进行酯化，但对7位羟基酯化后，在体内不容易水解释放游离紫杉醇，从而降低疗效，故大部分紫杉醇脂溶性前药系将脂肪酸与紫杉醇的2'位羟基进行酯化。文献(Maria Grazia Sarpietro,SaraOttimo,等,Squalenoyl prodrug of paclitaxel:Synthesis and evaluation of itsincorporation in phospholipid bilayers,International Journal ofPharmaceutics,2012,436:135–140)，研制了角鲨烯酸与紫杉醇2'-羟基酯化的紫杉醇脂溶性前药，与游离紫杉醇相比，紫杉醇角鲨烯酸酯明显增加了与磷脂双分子层的亲和性，虽然提高了脂质体的包裹率，但依然不能完全包裹，仍有药物渗漏；文献(Xi-Yu Ke,Bo-JunZhao,等，The therapeutic efficacy of conjugated linoleic acid-paclitaxel onglioma in the rat,Biomaterials,2010,31:5855-5864)，合成了紫杉醇亚油酸酯，并用10％的聚氧乙烯蓖麻油作增溶剂，制成注射液。该制剂由于紫杉醇亚油酸酯的脂溶性明显好于紫杉醇，故聚氧乙烯蓖麻油的用量降低到了10％，但未能从根本上克服聚氧乙烯蓖麻油带来的毒副作用；文献(Mina Nikanjam,Andrew R,等,Synthetic nano-LDL withpaclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastomamultiforme,Journal of Controlled Release,2007,124:163–171.)，合成了紫杉醇油酸酯，并将其包裹于低密度脂蛋白纳米粒中，相对于游离药物，该脂溶性前药在纳米粒中包载量提高了4倍，虽然包裹性大幅提高，但包封率低于50％，依然不具备成药的可能性；文献(B.B.Lundberg,V.Risovic,等,A lipophilic paclitaxel derivative incorporated ina lipid emulsion for parenteral administration,Journal of Controlled Release,2003,86:93–100.)，制备了一种紫杉醇油酸酯纳米乳，与泰素相比，紫杉醇油酸酯纳米乳药代动力学参数具有明显改善，但处方中含有具有毒副作用的吐温80和三油酸甘油酯，存在极大地安全隐患。另外，油酸本身存在双键，导致其易氧化，不稳定(王炜,张伟敏.单不饱和脂肪酸的功能特性.中国食物与营养,2005,4:44-46)，从而不利于制剂储存。综上所述，紫杉醇脂肪酸酯虽然极大地提高了紫杉醇的脂溶性，但其纳米制剂依然存在包封率低以及制剂安全性差等诸多问题，目前仍未见紫杉醇脂肪酸酯前药的相关制剂上市。
我们知道，不同种类以及碳链长短的脂肪酸酯，必然有不同的理化性质，与脂质包裹材料的相容性也不尽相同，自然而然会表现出各异的体内过程与治疗效果。对紫杉醇而言，与那种脂肪酸匹配成酯，才既能解决脂质体或其它纳米制剂的成药性问题，又能提高疗效，这将是面临的一大难题。中国专利CN1202166A和文献(Shaukat Ali,Imran Ahmad等,Hydrolyzable hydrophobic taxanes:synthesis and anti-cancer activities,Anti-Cancer Drugs,2001,12:117-128.)，记载的是一种紫杉醇的α-溴代基脂肪酸酯及其脂质体，中国专利CN1202166A文本中根本没有记载任何脂质体制备的实施方案，其成药性值得商榷。该专利文献所涵盖脂肪酸碳链长短为C6-C16之间的紫杉醇脂肪酸酯前药，遗憾的是，未进行系统的差异化研究，只是指出随着脂肪酸碳链长度的增加，其体外细胞毒性降低，体内抗肿瘤疗效提高。另外，该专利文献所包含的碳链最长仅C16，而碳链长在C16以上甚至更长的脂肪酸是否毒性就更低、药效就更好，将不得而知。同时，该专利文献明确指出α-溴代基与脂肪酸碳链长短都会影响前药的体内过程，所体现出的治疗效果是由α-溴代基及脂肪酸碳链长短共同作用的结果，故单纯根据碳链长短来推测出最佳紫杉醇脂肪酸酯结构的可能性不大。我们通过试验验证得出，并不是碳链长药效就越好(见本发明的实施例1)。美国专利US 7,235,583B1和PCT专利国际公布WO 00/53231，研究了一种紫杉醇脂肪酸酯及其制剂，其涵盖的脂肪酸链长为C8-C26，同样也未进行脂肪酸碳链长短对药效影响的差异化研究。所记载的制剂依然含有聚氧乙烯蓖麻油，不能保证制剂的安全性，而且该专利明确所涉制剂不包括脂质体，即所述紫杉醇脂肪酸酯不能用于脂质体制备。由此可见，我们拟通过脂肪酸与紫杉醇结构中的羟基进行酯化成酯的研究方案虽然已有公开，但在已公开的专利及文献报道中未对其进行系统的差异化研究，相应制剂也存在诸多不足，未体现出任何真正的、实质性的效果，当然也就无法得出最佳的紫杉醇脂肪酸酯及其制剂。
在研究现有文献无果的情况下，我们系统地对碳链长短为C6-C26间的直链脂肪酸进行了平行对比研究，其中为了保证长期储存的稳定性，拟选用饱和的直链脂肪酸与紫杉醇进行酯化。令人意想不到地发现，在碳链长短为C6-C26间的直链脂肪酸，只有棕榈酸(C16)与紫杉醇成酯时的药效最为突出。经过大量重复实验验证，依然得出本发明的紫杉醇棕榈酸酯的抗肿瘤效果最佳(见本发明的实施例1)，故用棕榈酸与紫杉醇成酯制得的紫杉醇棕榈酸酯前药，显著地提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，是本发明的创造性所在。
本发明所涉及的紫杉醇棕榈酸酯，是由棕榈酸与紫杉醇的2'位羟基进行酯化而得到的，属紫杉醇前药，其结构式如式B所示。
式B紫杉醇棕榈酸酯
通过文献检索，发现国外也已有关于紫杉醇棕榈酸酯前药的相关研究。SimonBenita研究组以紫杉醇棕榈酸酯为模型药物，研制了各种聚酯类纳米靶向给药制剂，如单克隆抗体AMB8LK修饰的免疫PEG-PLA纳米粒(Nir Debotton,Hagit Zer,等,Aquantitative evaluation of the molecular binding affinity between amonoclonal antibody conjugated to a nanoparticle and an antigen by surfaceplasmon resonance，European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2010，74:148-156；Nir Debotton,Marcela Parnes,等,Overcoming the formulationobstacles towards targeted chemotherapy:In vitro and in vivo evaluation ofcytotoxic drug loaded immunonanoparticles,Journal of Controlled Release,2008,127:219–230)、西妥昔单抗修饰的免疫PEG-PLGA纳米粒(Nour Karra,Taher Nassar,等,Antibody conjugated PLGA nano‘particles for targeted delivery of paclitaxelpalmitate:efficacy and biofate in a lung cancer mouse model,Small,2013,9(24):4221-4236)以及靶向上皮细胞黏附分子EpCAM的免疫PEG-PLA纳米粒(Nour Karra,TaherNassar,等Safety and proof-of-concept efficacy of inhaled drug loaded nano-andimmunonanoparticles in a c-Raf transgenic lung cancer model,Current CancerDrug Targets,2013,13:11-29)以及采用溶剂替代法制备紫杉醇棕榈酸酯纳米颗粒(N.Debotton,O.Giladi，等,Novel high-content paclitaxel palmitate nanospheresfor improved cancer treatment,Journal of drug delivery science andtechnology,2009,19(4):275-282)等纳米制剂。根据上述文献记载，纳米粒在制备过程中均采用了有机溶剂丙酮，并选用具有毒副作用的吐温80作为表面活性剂，这些物质在体内存在极大的安全隐患。另外，上述文献记载的纳米粒包封率以及与抗体的靶向结合性均较低，有待于进一步研究。综上所述，目前研究的紫杉醇棕榈酸酯纳米制剂亦存在诸多问题，故研发一种真正意义上高效低毒、制备工艺简单的紫杉醇棕榈酸酯纳米制剂尤为主要，这将再创紫杉醇在抗肿瘤领域中的新篇章。
目前尚无一种安全、高效、质量稳定的紫杉醇棕榈酸酯纳米制剂。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种安全、高效、质量稳定的紫杉醇棕榈酸酯脂质体。本发明的另一目的在于提供紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备方法。
本发明人对碳链长短为C6-C26间的直链脂肪酸与紫杉醇2'位羟基进行酯化得到的系列紫杉醇脂肪酸酯进行了平行对比，意外地发现，只有紫杉醇棕榈酸酯所表现出的抗肿瘤作用最强。在给药剂量为15mg/kg(按紫杉醇计)时，抑瘤率高达70％以上，而其他C6-C26间的紫杉醇脂肪酸酯抑瘤率均小于50％(见实施例1)。经过该差异化研究而得出的紫杉醇棕榈酸酯，真正意义上挖掘出了紫杉醇与脂肪酸成酯方案的实际价值，故意外发现具有实质性效果的紫杉醇棕榈酸酯是本发明的核心技术特征之一。
在制剂类型研究过程中，本发明人意外地发现聚合物胶束、脂肪乳剂、纳米粒等纳米制剂类型的成药性或抗肿瘤效果远远不及脂质体，存在载药量低、药物析出、无法除菌过滤以及药效差等一系列根本性问题(见实施例2)。故本发明将紫杉醇棕榈酸酯制备成脂质体是最佳选择。
本发明提供一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体，常用的制备方法有薄膜蒸发法、逆向蒸发法、乙醇注入法，其中薄膜蒸发法在大生产时可控性较差、步骤繁琐，故我们拟采用相对简单的逆向蒸发法和乙醇注入法来制备脂质体。对紫杉醇棕榈酸酯而言，逆向蒸发法、乙醇注入法均不能很好的实现对该脂质体的制备，所得到的脂质体存在载药量低、混浊、析出沉淀、无法除菌过滤等一系列问题。试验发现，用丙二醇替代乙醇注入恰恰收到了实质性的效果，根本上克服了使用常规制备方法得到的脂质体存在一系列问题的缺陷。故注入用溶剂选用丙二醇或含有丙二醇是本发明的核心技术特征，否则很难予以实施，这与一般脂质体的制备有很大的不同，这可能是药物的性质所决定的(见实施例3)；另外，丙二醇属小分子低级醇，安全性较高，广泛作为注射用溶媒使用，对本制剂而言，制备时需借助丙二醇作注入用溶剂予以完成，属脂质体制备中的一个重要环节，当脂质体制备完成后其不影响制剂的相关特性，故最终脂质体中亦可含有丙二醇，亦可通过超滤将其予以分离去除。
本发明提供一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体，通常脂质体是由卵磷脂或卵磷脂与胆固醇组成。对紫杉醇棕榈酸酯而言，处方中必须添加适量的DSPE-PEG2000，否则无论如何调整处方与工艺，均无法制备出稳定的脂质体，在极短的时间内出现混浊与沉淀的问题。故处方中含有DSPE-PEG2000是本发明的核心技术特征之一(见实施例4)。
本发明正是基于上述发现，才得以制备出符合质量要求的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，方可实现良好的抗肿瘤效果。
本发明的第一方面，提供了一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体，以紫杉醇棕榈酸酯为活性成份，还包括卵磷脂和DSPE-PEG2000。
DSPE-PEG2000的用量控制在0.05-1.0％较为合适，优选用量为0.1-0.5％。
脂质体中，紫杉醇棕榈酸酯的用量为0.1-1％；卵磷脂的用量为1-10％；DSPE-PEG2000的用量是0.05-1.0％(W/V)。
所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，为紫杉醇的前药，其结构式如式B所示：
式B紫杉醇棕榈酸酯
所述的紫杉醇棕榈酸酯，是由棕榈酸与紫杉醇的2'位羟基进行酯化而得到的.
所述的紫杉醇棕榈酸酯，可以通过以下合成步骤得到：
称取紫杉醇10.00g、棕榈酸3.60g、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)2.18g和4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.72g，置于反应容器中，用50ml无水二氯甲烷使溶解；在氮气保护条件下，室温搅拌反应4-24小时，得反应溶液；将反应溶液用5％柠檬酸水溶液洗涤两遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤一遍，旋转蒸发减压去除无水二氯甲烷；分离纯化，即得到紫杉醇棕榈酸酯。
本发明的第二方面，提供了紫杉醇棕榈酸酯脂质体的注射剂，所述的注射剂是一种注射用溶液，也可以是一种冻干粉针剂。
所述的注射剂由紫杉醇棕榈酸酯、卵磷脂组成；所述的注射剂由紫杉醇棕榈酸酯、卵磷脂、DSPE-PEG2000组成；所述的注射剂由紫杉醇棕榈酸酯、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、DSPE-PEG2000组成；所述的注射剂由紫杉醇棕榈酸酯、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、DSPE-PEG2000、冻干保护剂组成；
所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体由下列配方配制而成：
制备注射用溶液时，冻干保护剂为0；
制备冻干粉针剂时，冻干保护剂为0.1-40％克/毫升
较优的，所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体由下列配方配制而成：
较优的，所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体由下列配方配制而成：
其中，上述配方中所述的卵磷脂，选自高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的一种或两种以上合用；优选高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)。
上述配方中所述的冻干保护剂选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸中的一种或两种以上合用；优选麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇中的一种或两种以上合用。
上述配方中的pH调节剂选自枸橼酸、盐酸、氢氧化钠、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、枸橼酸二钠、枸橼酸三钠中的一种或两种以上合用；优选枸橼酸、盐酸、氢氧化钠中的一种或两种以上合用，调节pH值至3-9，优选调节pH值至4-8；更优选调节pH值至4.5-7.5。
本发明的第三方面，提供一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备方法，包括如下步骤：
称取配方量的紫杉醇棕榈酸酯、卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000，加适量注入用有机溶媒，在25-75℃下加热溶解，得有机相；称取适量注射用水，加热至25-75℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品进行乳化，可将其置于高压均质机中进行均质乳化，或将其置于挤出器中依次通过不同孔径的挤出膜挤出，或高压均质后再进行挤出，得脂质体溶液；称取配方量冻干保护剂，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至全量；用pH调节剂调节pH值；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体；也可冻干制备成紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉针。
其中，所述的注射用有机溶媒，选自丙二醇，或与无水乙醇、叔丁醇中的一种或两种以上合用，用量为1-10％克/毫升；优选丙二醇，用量优选为1-5％克/毫升。
所述的注射用有机溶媒，可保留在脂质体中，也可在脂质体粗品乳化后再通过超滤去除。
所述的将脂质体粗品进行乳化，优选挤出乳化法，得到的脂质体粒径分布将更均一；挤出膜孔径选自2.0μm、1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm，选用一种或两种以上依次通过大孔径到小孔径的挤出，优选0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm。
本发明的一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体，粒径为70-130nm。
本发明的第四方面，提供了上述紫杉醇棕榈酸酯脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
紫杉醇棕榈酸酯脂质体的给药剂量为15mg/kg(按紫杉醇计)时，抑瘤率高达70％以上。
所述肿瘤为紫杉醇及其衍生物治疗的肿瘤，包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等。
本发明优点在于：
(1)本研究的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，不含聚氧乙烯蓖麻油、吐温80等任何增溶剂，根本上避免了泰素由聚氧乙烯蓖麻油等增溶剂引起的过敏反应。
(2)本研究的紫杉醇棕榈酸酯脂质体抗肿瘤效果明显好于泰素，显著提高了紫杉醇的抗肿瘤性。
(3)本发明的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，属纳米包裹制剂，有明显的缓控释作用，大大减缓了药物在体内的消除速率，靶向肿瘤部位的药物浓度将更高。
(4)通过匹配的处方工艺，真正意义上克服了紫杉醇及其衍生物制剂成药性差的问题，为紫杉醇的研究与应用奠定了基础。
附图说明
图1.紫杉醇己酸酯、紫杉醇辛酸酯、紫杉醇癸酸酯、紫杉醇月桂酸酯、紫杉醇肉豆蔻酸酯、紫杉醇棕榈酸酯脂质体抗小鼠S180实体瘤的药效学比较结果；
图2.紫杉醇棕榈酸酯、紫杉醇硬脂酸酯、紫杉醇花生酸酯、紫杉醇山嵛酸酯、紫杉醇木质素酸酯、紫杉醇蜡酸酯脂质体抗小鼠S180实体瘤的药效学比较结果；
图3.不同制剂类型的紫杉醇棕榈酸酯纳米制剂抗小鼠S180实体瘤的药效学比较结果。
具体实施方式：
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：对系列不同紫杉醇脂肪酸酯进行体内药效试验的对比评价
中国专利CN1202166A和文献(Shaukat Ali,Imran Ahmad等,Hydrolyzablehydrophobic taxanes:synthesis and anti-cancer activities,Anti-Cancer Drugs,2001,12:117-128；Walter R.Perkins,Imran Ahmad等，Novel therapeutic nano-particles(lipocores):trapping poorly water soluble compounds，InternationalJournal of Pharmaceutics 2000,200:27–39)，记载的是一种紫杉醇的α-溴代基脂肪酸酯，所涵盖脂肪酸碳链长短为C6-C16之间的紫杉醇脂肪酸酯前药；美国专利(US 7,235,583B1)和国际专利(WO 00/53231)，研究了一种紫杉醇脂肪酸酯及其制剂，其脂肪酸长度为C8-C26。上述专利文献，记载了脂肪酸碳链长短在C6-C26之间的紫杉醇脂肪酸酯前药，但未对该范围内的脂肪酸碳链长短进行差异化研究，当然也就无法得出最佳的紫杉醇脂肪酸酯。为此，出于好奇起见，我们系统的对碳链长短为C6-C26间的直链脂肪酸进行平行对比研究，其中为了保证长期储存的稳定性，拟选用饱和的直链脂肪酸与紫杉醇进行酯化。
我们在碳链长短为C6-C26之间内随机设计合成了11个不同脂肪酸碳链的紫杉醇酯，即紫杉醇己酸酯(C6)、紫杉醇辛酸酯(C8)、紫杉醇癸酸酯(C10)、紫杉醇月桂酸酯(C12)、紫杉醇肉豆蔻酸酯(C14)、紫杉醇棕榈酸酯(C16)、紫杉醇硬脂酸酯(C18)、紫杉醇花生酸酯(C20)、紫杉醇山嵛酸酯(C22)、紫杉醇木质素酸酯(C24)、紫杉醇蜡酸酯(C26)，用相同的处方分别将其制备成脂质体，并对其体内抗肿瘤效果进行平行比较。
(一)系列不同紫杉醇脂肪酸酯脂质体的制备
在相同的处方工艺条件下，制备不同紫杉醇脂肪酸酯的脂质体，为了尽量保证制剂的可实施性与平行性，设定较为保守的载药量，按紫杉醇计载药量约1mg/ml。
称取紫杉醇脂肪酸酯适量(按紫杉醇计约100mg)、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2g、DSPE-PEG2000 0.3g，加丙二醇2g，在60℃下加热溶解，得有机相；称取注射用水90g，加热至50℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，用水定容至100ml，过0.22μm滤膜除菌过滤，即得系列不同碳链长短的紫杉醇脂肪酸酯脂质体。
(二)系列不同紫杉醇脂肪酸酯对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的平行对比
取上述制备的11个紫杉醇脂肪酸酯脂质体，以泰素为阳性对照药，进行动物体内药效学的对比评价。试验方案与结果如下所示：
1、小鼠S180肿瘤模型的建立与给药方案的设计
取S180肿瘤细胞(购自：中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，进行体外培养，然后将培养的肿瘤细胞接种在小鼠腹腔内，进行传代，形成腹水，即得S180肿瘤腹水细胞。抽取S180肿瘤的腹水细胞，用生理盐水稀释到浓度为1×106个/ml，得腹水细胞稀释液。取腹水细胞稀释液0.2ml，分别注射在昆明小鼠的右前肢皮下，得小鼠S180肿瘤模型。
分别设定生理盐水组、泰素阳性对照组、紫杉醇脂肪酸酯脂质体供试组，每组8只S180肿瘤模型小鼠。采用小鼠尾静脉注射方式给药，剂量为每次15mg/kg(按紫杉醇计)，隔天给药一次，共给药4次，停药后隔天处死小鼠，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率。由于设计的紫杉醇脂肪酸酯脂质体供试制剂多达11个，故按上述试验方案，将其分为两次试验予以完成，分别记作对比试验一与对比试验二。
抑瘤率＝(生理盐水组瘤重-给药组瘤重)/生理盐水组瘤重×100％
2、对比试验一抗肿瘤效果
对小鼠S180实体瘤的药效学比较结果如表1所示，肿瘤照片见说明书附图中的图1。
表1：系列不同紫杉醇脂肪酸酯对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的对比结果一
| 组别 | 碳链长短 | 瘤重(g) | 抑瘤率 |
| 生理盐水 | / | 1.46±0.58 | / |
| 泰素阳性对照组 | / | 0.52±0.32 | 64.38％ |
| 紫杉醇己酸酯脂质体 | C6 | 1.03±0.53 | 29.45％ |
| 紫杉醇辛酸酯脂质体 | C8 | 0.97±0.66 | 33.56％ |
| 紫杉醇癸酸酯脂质体 | C10 | 0.81±0.47 | 44.52％ |
| 紫杉醇月桂酸酯脂质体 | C12 | 0.88±0.35 | 39.73％ |
| 紫杉醇肉豆蔻酸酯脂质体 | C14 | 0.75±0.29 | 48.63％ |
| 紫杉醇棕榈酸酯脂质体 | C16 | 0.32±0.19 | 78.08％ |
结果分析：在相同的脂质体剂型以及相同载药量情况下，对紫杉醇己酸酯(C6)、辛酸酯(C8)、月桂酸酯(C12)、肉豆蔻酸酯(C14)、棕榈酸酯(C16)脂质体的抗肿瘤效果进行比较。意外的发现，只有紫杉醇棕榈酸酯脂质体的抗肿瘤效果最为突出，抑瘤率高达78.08％，而其他的紫杉醇脂肪酸酯的抑瘤率均小于50％，故紫杉醇棕榈酸酯如此显著的抗肿瘤效果是本发明的实质性意义所在。
3、对比试验二抗肿瘤效果
对小鼠S180实体瘤的药效学比较结果如表2所示，肿瘤照片见说明书附图中的图2。
表2：系列不同紫杉醇脂肪酸酯对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的对比结果二
| 组别 | 碳链长短 | 瘤重(g) | 抑瘤率 |
| 生理盐水 | / | 1.69±0.65 | / |
| 泰素阳性对照组 | / | 0.68±0.44 | 59.76％ |
| 紫杉醇棕榈酸酯脂质体 | C16 | 0.43±0.28 | 74.56％ |
| 紫杉醇硬脂酸酯脂质体 | C18 | 0.89±0.41 | 47.34％ |
| 紫杉醇花生酸酯脂质体 | C20 | 1.01±0.39 | 40.24％ |
| 紫杉醇山嵛酸酯脂质体 | C22 | 1.12±0.46 | 33.73％ |
| 紫杉醇木质素酸酯脂质体 | C24 | 0.98±0.55 | 42.01％ |
| 紫杉醇蜡酸酯脂质体 | C26 | 1.21±0.70 | 28.40％ |
结果分析：在相同的剂型以及载药量情况下，对紫杉醇棕榈酸酯(C16)、硬脂酸酯(C18)、花生酸酯(C20)、山嵛酸酯(C22)、木质素酸酯(C24)、蜡酸酯(C26)脂质体的抗肿瘤效果进行比较。结果显示，依然只有紫杉醇棕榈酸酯脂质体的抗肿瘤效果最好，抑瘤率高达74.56％，而其他的紫杉醇脂肪酸酯的抑瘤率依然维持在50％以下，进一步说明紫杉醇棕榈酸酯的抗肿瘤活性与其他脂肪酸酯相比，具有实质性的不同。
实施例2：不同制剂剂型对紫杉醇棕榈酸酯的成药性研究
分别对脂质体、聚合物胶束、脂肪乳剂、纳米粒的成药性与抗肿瘤效果进行对比研究，为了保守起见，固定载药量为3mg/ml进行平行对比，参照目前紫杉醇的临床用量(成人每次总用量约400mg)，3mg/ml的载药量仅仅属于较低要求。以此为基础，进行相关制剂的研究，现将主要研究方案与结果总结如下：
1、制剂成药性研究
1.1脂质体
称取紫杉醇棕榈酸酯300mg、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3.5g、DSPE-PEG2000 0.3g，加丙二醇3g，在65℃下加热溶解，得有机相；称注射用水85g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.5；过0.22μm滤膜除菌过滤，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
经测定，脂质体呈半透明状，标示含量为99.69％，平均粒径为102.4nm，包封率为99.45％。除菌过滤相当顺畅，通过对处方工艺的适当调整，载药量最高可达到10mg/ml，且稳定性良好，未出现混浊、沉淀或粒径增大等现象，故认为脂质体能够很好的包裹紫杉醇棕榈酸酯，紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制剂成药性良好。
1.2聚合物胶束
紫杉醇聚合物胶束(-PM)，于2007年在韩国上市，是将紫杉醇通过高分子聚合物材料聚乙二醇单甲醚-聚乳酸包裹而制备的胶束制剂。参照该制剂，同样设定载药量为3mg/ml，对紫杉醇棕榈酸酯进行包裹，分别设定紫杉醇棕榈酸酯与聚乙二醇单甲醚-聚乳酸的重量比为1:1、1:5、1:10、1:20、1:30进行试验。
称取紫杉醇棕榈酸酯0.3g、聚乙二醇单甲醚-聚乳酸0.3g(或1.5g、或3g、或6g、或9g)，溶于适量乙腈中，旋转减压蒸发去除乙腈，加90ml水溶解，并定容至100ml，即得不同聚合物材料含量的紫杉醇棕榈酸酯聚合物胶束。
结果显示，载药量为3mg/ml，紫杉醇棕榈酸酯与聚乙二醇单甲醚-聚乳酸的重量比例从1:1-1:30时，即聚乙二醇单甲醚-聚乳酸的用量从0.3％-9％，所制备的紫杉醇棕榈酸酯聚合物胶束完全浑浊，未见有任何包裹的迹象，而对紫杉醇而言，在相同的条件下，1:1的比例已经完全澄清。由此可见，紫杉醇与紫杉醇棕榈酸酯的理化性质完全不同，故聚乙二醇单甲醚-聚乳酸不适合包载紫杉醇棕榈酸酯，故将紫杉醇棕榈酸酯制备成聚合物胶束的可能性不大。
1.3脂肪乳剂
将紫杉醇制备成紫杉醇棕榈酸酯后，与紫杉醇相比，在注射用中链油中的溶解度由原来的小于5mg/ml提高到大于500mg/ml，这将为高载药量脂肪乳剂的制备提供了极大的可能性。为此，我们制备了与紫杉醇棕榈酸酯脂质体相同粒径大小、相同载药量的紫杉醇棕榈酸酯脂肪乳剂。
称取紫杉醇棕榈酸酯0.3g、注射用中链油3g，在60℃下加热搅拌溶解，得油相；称取蛋黄卵磷脂3g、甘油2.5g，分散在80g注射用水中，加热至60℃，得水相；将油相缓缓注入在剪切条件下的水相中，剪切5min，用注射用水定容至100ml，得初乳；将初乳置于高压均质机中，在2万psi下均质5遍，过0.22μm滤膜进行除菌过滤，即得紫杉醇棕榈酸酯脂肪乳剂。
经测定，该乳剂标示含量为100.2％，平均粒径为109.1nm，包封率为99.7％。由于紫杉醇棕榈酸酯在注射用中链油中的溶解度足够大，故载药量随着处方用量的调整，载药量完全可达到10mg/ml以上，且稳定性良好，未出现分层、沉淀或粒径增大等现象，故单从制剂成药性角度来讲，脂肪乳剂是个不错的制剂类型。
1.4纳米粒
文献(Walter R.Perkins,Imran Ahmad等，Novel therapeutic nano-particles(lipocores):trapping poorly water soluble compounds，International Journal ofPharmaceutics 2000,200:27–39.)，制备了一种用DSPE-PEG2000包裹的纳米粒，为此，我们参照该文献制备了紫杉醇棕榈酸酯的纳米粒。
称取处方量的紫杉醇棕榈酸酯0.3g、DSPE-PEG2000 0.3g，用3g无水乙醇溶解，得有机相；称取90ml注射用水，为水相；将有机相在搅拌条件下注入35℃的水相中，用注射用水定容至100ml；然后过0.22μm滤膜进行除菌过滤，即得紫杉醇棕榈酸酯纳米粒溶液。
经测定，所得到的纳米粒溶液，呈半透明状，标示百分含量为99.39％，粒径为99.4nm。另外，通过试验，调整DSPE-PEG2000以及乙醇的用量，载药量高达5mg/ml，甚至更高。故紫杉醇棕榈酸酯纳米粒的制剂成药性良好。
综上所述，从制剂角度来讲，可将紫杉醇棕榈酸酯制备成脂质体、脂肪乳剂以及纳米粒，均能达到较高的载药量。但是否均能达到良好的抗肿瘤效果，则需进一步试验验证，据此来优选出最佳的制剂类型。
2、不同制剂类型的抗肿瘤试验研究
取上述制备的载药量与粒径相当的紫杉醇棕榈酸酯脂质体、脂肪乳剂、纳米粒，进行动物体内抗肿瘤对比试验。
取S180肿瘤细胞(购自：中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，进行体外培养，然后将培养的肿瘤细胞接种在小鼠腹腔内，进行传代，形成腹水，即得S180肿瘤腹水细胞。抽取S180肿瘤的腹水细胞，用生理盐水稀释到浓度为1×106个/ml，得腹水细胞稀释液。取腹水细胞稀释液0.2ml，分别注射在昆明小鼠的右前肢皮下，得小鼠S180肿瘤模型。
分别设定生理盐水组、泰素阳性对照组、紫杉醇棕榈酸酯脂质体组、紫杉醇棕榈酸酯脂肪乳剂组、紫杉醇棕榈酸酯纳米粒，每组8只S180肿瘤模型小鼠。采用小鼠尾静脉注射方式给药，剂量为每次15mg/kg(按紫杉醇计)，隔天给药一次，共给药4次，停药后隔天处死小鼠，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率，药效结果如表3所示，其中肿瘤照片见说明书附图中的图3。
抑瘤率＝(生理盐水组瘤重-给药组瘤重)/生理盐水组瘤重×100％
表3：紫杉醇棕榈酸酯不同制剂类型的抗肿瘤试验结果
| 组别 | 瘤重(g) | 抑瘤率 |
| 生理盐水组 | 1.98±0.71 | / |
| 泰素阳性对照组 | 0.93±0.41 | 53.03％ |
| 紫杉醇棕榈酸酯脂质体组 | 0.59±0.33 | 70.20％ |
| 紫杉醇棕榈酸酯脂肪乳剂组 | 1.17±0.45 | 40.91％ |
| 紫杉醇棕榈酸酯纳米粒 | 1.08±0.39 | 45.45％ |
结果分析：
意外的是，紫杉醇棕榈酸酯脂质体的抗肿瘤尤为突出，远远好于脂肪乳剂组与纳米粒组。紫杉醇棕榈酸酯脂质体的抑瘤率高达78.2％，甚至比泰素都好。这样的结果是我们没想到，完全在我们的预料之外。为了确认该结论，我们又进行了多次试验验证，依然得出相同的结论。由此可见，只有脂质体才是紫杉醇棕榈酸酯的最佳制剂类型，故本发明的脂质体是实现紫杉醇棕榈酸酯良好治疗效果的核心特征所在。
实施例3：丙二醇注入法对紫杉醇棕榈酸酯脂质体开发的重要性
常用的脂质体制备方法，有薄膜蒸发法、逆向蒸发法、乙醇注入法，其中薄膜蒸发法在大生产时可控性较差、步骤繁琐，故我们拟采用相对简单的逆向蒸发法和乙醇注入法来制备脂质体。但对紫杉醇棕榈酸酯而言，逆向蒸发法与乙醇注入法均不能很好的实现对该脂质体的制备，当选用丙二醇注入时，恰恰收到了根本性的效果。上述实施例2用少量丙二醇注入即可制备出良好的脂质体，故以此为例，采用相同的处方，分别对常用的逆向蒸发法与乙醇注入法进行验证。方法与结果如下所示：
1.逆向蒸发法
称取紫杉醇棕榈酸酯300mg、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3.5g、DSPE-PEG2000 0.3g，用10ml氯仿溶解，溶解后加2ml注射用水，超声乳化，得乳浊液；将该乳浊液置于茄形瓶中，在37℃下旋蒸去除氯仿，并使形成凝胶状料液；加入90ml注射用水，将凝胶状料液充分水化，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中进行均质乳化；用注射用水定容至100ml，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
试验结果显示，用逆向蒸发法所制备的脂质体呈乳白色混浊，同样根本无法进行除菌过滤，平均粒径为268.3nm，粒径分布很宽、很乱。同样，我们对组分种类、用量以及制备工艺参数等进行调整，依然无法得到丙二醇注入法的制备效果，出现混浊、粒径分布较宽等现象。故认为逆向蒸发法不具有任何可实施性的迹象，同样远远不及丙二醇注入法。
2.乙醇注入法
称取紫杉醇棕榈酸酯300mg、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3.5g、DSPE-PEG2000 0.3g，加无水乙醇3g，加热溶解，得有机相；称注射用水85g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中进行挤出，发现阻力相当大，根本无法顺利挤出，这与丙二醇注入法挤出顺畅的现象相差甚远。故随即将脂质体粗品转入高压均质机中进行均质乳化，除菌过滤，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
试验结果显示，用乙醇注入法制备的脂质体除菌过滤相当困难，透明度远不如丙二醇注入法所制备的脂质体。平均粒径为163.1nm，粒径分布依然很宽，有较多的大粒径存在。在此基础上，我们对处方工艺进行了调整，但依然无法得到丙二醇注入法的制备效果，基本上均存在粒径分布宽、无法除菌过滤等问题。故认为乙醇注入法对紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备效果不佳，同样远远不及丙二醇注入法。但当无水乙醇与丙二醇合用或叔丁醇与丙二醇合用时，也能制备出良好的脂质体，由此可见丙二醇对该脂质体制备的重要性。
综上所述，常用的制备方法逆向蒸发法、乙醇注入法，均不适合该脂质体的制备，这可能与紫杉醇棕榈酸酯特有的理化性质有关。所得到的脂质体存在载药量低、混浊、析出沉淀、无法除菌过滤等一系列问题。而当选用丙二醇注入时收到了意想不到的效果，大大增加了脂质体的成药性，故注入用溶剂选用丙二醇或含有丙二醇是本发明的核心技术特征，否则很难予以实施，这与通常载药脂质体的制备有很大的区别。试验显示，注入用溶剂的用量为1-10％克/毫升，优选用量为1-5％克/毫升；另外，丙二醇属小分子低级醇，安全性较高，广泛作为注射用溶媒使用，对本制剂而言，制备时必须借助丙二醇作注入用溶剂予以完成，属脂质体制备中的一个重要环节，当脂质体制备完成后其不影响制剂的相关特性，故最终脂质体中亦可含有丙二醇，亦可在制备过程中通过超滤将其予以分离去除。
实施例4 DSPE-PEG2000对紫杉醇棕榈酸酯脂质体开发的关键性
通常脂质体是由卵磷脂或卵磷脂与胆固醇组成。对紫杉醇棕榈酸酯而言，处方中必须添加适量的DSPE-PEG2000，否则无论如何调整处方与工艺，即便是2mg/ml的载药量，也无法制备出稳定的脂质体，在极短的时间内出现混浊与沉淀的问题。典型验证方案如表4与结果如表5所示：
1.试验处方
表4：试验验证方案的处方设计
2.制备工艺
称取处方量的紫杉醇棕榈酸酯、蛋黄卵磷脂(EPCS)、或DSPE-PEG2000，加丙二醇5g，在65℃下加热溶解，得有机相；称注射用水85g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中，进行均质乳化，用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.5；过0.22μm滤膜除菌过滤，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
3.试验结果
由于脂质体本身不能进行热压灭菌，故用0.22μm滤膜进行除菌过滤至关重要。为此，我们重点对上述脂质体的外观、平均粒径以及0.22μm滤膜过滤顺畅性进行考察，结果如表5所示。
表5：DSPE-PEG2000对成药性的影响结果
| 组别 | 外观 | 平均粒径 | 0.22μm滤膜过滤顺畅性 |
| 处方1 | 乳浊液，不透明 | 195.7nm | 阻力很大，根本无法滤过 |
| 处方2 | 乳浊液，不透明 | 174.2nm | 阻力很大，根本无法滤过 |
| 处方3 | 乳浊液，不透明 | 153.1nm | 阻力很大，根本无法滤过 |
| 处方4 | 略半透明 | 130.3nm | 阻力较大，能部分滤过 |
| 处方5 | 半透明均一溶液 | 115.4nm | 滤过较顺畅 |
| 处方6 | 半透明均一溶液 | 100.2nm | 滤过非常顺畅 |
| 处方7 | 半透明均一溶液 | 80.7nm | 滤过非常顺畅 |
结果分析：
当处方中不含有DSPE-PEG2000时，所制备的脂质体溶液，出现混浊现象，粒径偏大，无法除菌过滤(如处方1-3)，同时，我们又对其它脂质材料种类与用量等因素进行了系统的考察，但均无法得到半透明的、可除菌过滤的脂质体，在较短的时间内出现混浊或沉淀现象；当处方中添加极少量的DSPE-PEG2000时，当用量大于0.05％，即使是卵磷脂用量较少，依然能够得到半透明的、可除菌过滤的脂质体。
由此可见，DSPE-PEG2000的加入，对本脂质体而言至关重要，将直接影响脂质体的成药性，是本发明最为核心的技术特征。该现象较为特别，在制备一般的载药脂质体过程中很少遇到该问题，这可能与药物本身的理化性质有关。通过大量试验证明，根据处方组成的不同，DSPE-PEG2000的用量控制在0.05-1.0％较为合适，优选用量为0.1-0.5％。
综上所述，本发明正是基于上述技术特征，才得以制备出符合质量要求的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，方可实现良好的抗肿瘤效果。
实施例5紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇3g，在65℃下加热溶解，得有机相；称注射用水68g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、海藻糖15g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.69；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为100.9nm。
实施例6：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3.5g、DSPE-PEG2000 0.35g，加丙二醇3g，在75℃下加热溶解，得有机相；称注射用水60g，加热至75℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖15g、海藻糖5g、甘露醇15g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为4.70；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为114.4nm。
实施例7：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇3g，在70℃下加热溶解，得有机相；称注射用水65g，加热至75℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、蔗糖5g、甘露醇15g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用磷酸调节pH值为4.21；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为102.8nm。
实施例8：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇3g，在65℃下加热溶解，得有机相；称注射用水65g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径2.0μm、0.6μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、蔗糖10g、甘露醇10g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为6.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为109.4nm。
实施例9：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇4g、无水乙醇3g，在40℃下加热溶解，得有机相；称注射用水60g，加热至40℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、海藻糖15g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.60；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为110.3nm。
实施例10：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇1g、叔丁醇0.5g，在45℃下加热溶解，得有机相；称注射用水75g，加热至45℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖5g、海藻糖10g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为5.00；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为106.6nm。
实施例11：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.4g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)4.5g、DSPE-PEG2000 0.5g，加丙二醇10g，在40℃下加热溶解，得有机相；称注射用水60g，加热至40℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径1.0μm、0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇；称取麦芽糖15g、蔗糖10g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为111.8nm。
实施例12：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯1g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)10g、DSPE-PEG2000 1g、胆固醇1g，加丙二醇10g，在75℃下加热溶解，得有机相；称注射用水75g，加热至75℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中均质乳化，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇；用注射用水定容至100ml；用枸橼酸三钠调节pH值为8.00；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
经测定，平均粒径为130.0nm。
实施例13：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.2g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.3g、DSPE-PEG2000 0.25g，加丙二醇2g，在70℃下加热溶解，得有机相；称取麦芽糖10g、海藻糖15g、注射用水70g，加热至40℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.80；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为104.6nm。
实施例14：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.2g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.0g、DSPE-PEG2000 0.1g，加丙二醇7g，在45℃下加热溶解，得有机相；称取麦芽糖10g、海藻糖15g、注射用水70g，加热至45℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇；用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为4.00；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为109.0nm。
实施例15：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、DSPE-PEG2000 0.3g，加丙二醇5g、叔丁醇1g，在50℃下加热溶解，得有机相；称取麦芽糖8g、海藻糖12g、注射用水70g，加热至50℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为4.30；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为95.5nm。
实施例16：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.1g、大豆卵磷脂1g、DSPE-PEG2000 0.05g，胆固醇0.05g，加丙二醇1g，在65℃下加热溶解，得有机相；称取麦芽糖5g、注射用水85g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为8.0；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为86.7nm。
实施例17：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.7g、氢化大豆卵磷脂(HSPC)3g、蛋黄卵磷脂1g、DSPE-PEG2000 0.8g、胆固醇0.2g，加丙二醇5g、无水乙醇2g，在55℃下加热溶解，得有机相；称注射用水80g，加热至55℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中均质乳化，然后再置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇与无水乙醇；用注射用水定容至100ml；用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾调节pH值为7.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
经测定，平均粒径为117.9nm。
实施例18：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.7g、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)3g、磷脂酰胆碱2g、磷脂酰乙醇胺5g、DSPE-PEG2000 0.8g、胆固醇0.5g，加丙二醇10g，在55℃下加热溶解，得有机相；称注射用水75g，加热至55℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中均质乳化，然后再置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇；用注射用水定容至100ml；用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠调节pH值为7.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
经测定，平均粒径为118.0nm。
实施例19：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.5g、磷脂酰丝氨酸2g、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱1.5g、二硬脂酰磷脂酰胆碱2.5g、DSPE-PEG2000 0.5g、胆固醇0.2g，加丙二醇6g，在65℃下加热溶解，得有机相；称注射用水70g，加热至65℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于高压均质机中均质乳化，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为3.00；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体。
经测定，平均粒径为115.2nm。
实施例20：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.32g，加丙二醇2g，在70℃下加热溶解，得有机相；称注射用水50g，加热至40℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、蔗糖15g、甘露醇15，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸二钠调节pH值为6.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为101.7nm。
实施例21：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.2g、蛋黄卵磷脂3g、鞘磷脂2g、DSPE-PEG2000 0.4g，加丙二醇3g、无水乙醇2g，在25℃下加热溶解，得有机相；称注射用水65g，加热至25℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取乳糖3g、葡萄糖4g、山梨醇8g、苏氨酸5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为4.78；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为95.8nm。
实施例22：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.2g、蛋黄卵磷脂3g、鞘磷脂2g、DSPE-PEG2000 0.4g，加丙二醇4g、无水乙醇1g，在25℃下加热溶解，得有机相；称注射用水65g，加热至25℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取麦芽糖10g、木糖醇5g、苏氨酸5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为5.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为70.0nm。
实施例23：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.4g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)4.5g、DSPE-PEG2000 0.5g，加丙二醇6g，在45℃下加热溶解，得有机相；称注射用水50g，加热至25℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；将脂质体溶液通过超滤去除丙二醇；称取麦芽糖10g、赤藓糖醇10g、甘露醇15g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用枸橼酸调节pH值为3.50；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为110.7nm。
实施例24：紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备
称取紫杉醇棕榈酸酯0.26g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)2.9g、DSPE-PEG2000 0.3g，加丙二醇5g，在50℃下加热溶解，得有机相；称取麦芽糖10g、海藻糖15g、注射用水65g，加热至30℃，搅拌溶解，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，得脂质体粗品；将脂质体粗品置于挤出器中，依次通过孔径0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为9.0；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为100.5nm。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (11)
1.一种紫杉醇棕榈酸酯脂质体，以紫杉醇棕榈酸酯为活性成份，还包括卵磷脂和DSPE-PEG2000；
紫杉醇棕榈酸酯的用量为0.1-1％克/毫升；卵磷脂的用量为1-10％克/毫升；DSPE-PEG2000的用量是0.05-1.0％克/毫升；
该脂质体为一种注射用溶液，注射用有机溶媒选自丙二醇，或丙二醇与无水乙醇、叔丁醇中的一种或两种的组合，用量为1-10％克/毫升。
2.根据权利要求1所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，该脂质体为一种冻干粉针剂。
3.根据权利要求2所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，配方如下：
4.根据权利要求2所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，配方如下：
5.根据权利要求2所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，配方如下：
6.根据权利要求1-4任一项所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的卵磷脂选自高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的一种或两种以上。
7.根据权利要求3-5任一项所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的冻干保护剂选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸中的一种或两种以上。
8.根据权利要求3-5任一项所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的pH调节剂选自枸橼酸、盐酸、氢氧化钠、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、枸橼酸二钠、枸橼酸三钠中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1-5任一项所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体，其特征在于，脂质体的粒径为70-130nm。
10.如权利要求1所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：
称取配方量的紫杉醇棕榈酸酯、卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000，加适量注入用有机溶媒，在25-75℃下加热溶解，得有机相；称取适量注射用水，加热至25-75℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品进行乳化，可将其置于高压均质机中进行均质乳化，或将其置于挤出器中依次通过不同孔径的挤出膜挤出，或高压均质后再进行挤出，得脂质体溶液；称取配方量冻干保护剂，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至全量；用pH调节剂调节pH值；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体；
所述的注射用有机溶媒，选自丙二醇，或丙二醇与无水乙醇、叔丁醇中的一种或两种的组合，用量为1-10％克/毫升。
11.根据权利要求10所述的紫杉醇棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的将脂质体粗品进行乳化，乳化方法为挤出乳化法；挤出膜孔径选自2.0μm、1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm或0.05μm，选用一种或两种以上依次通过大孔径到小孔径的挤出。
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