CN109224084A - Tpgs修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统及及其制备方法、应用 - Google Patents

Tpgs修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统及及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统及及其制备方法、应用。该TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统以磷脂和胆固醇为膜材，表面活性剂TPGS修饰脂质体，多西他赛（DTX）为抗肿瘤药物，采用薄膜分散法、乙醇注入法、超声波分散法、逆向蒸发法和冷冻干燥法等方法来制备，得到的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的粒径在80‑200nm之间，zeta电位为0±30mV，包封率为75‑99%，载药量为3‑15%。本发明制备的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的体外细胞实验和体内药效试验表明：该纳米给药系统能抑制P‑gp的过度表达，减少药物外排，增加药物在肿瘤细胞中的富集，增加细胞毒性和细胞凋亡率，提高了肿瘤治疗效果并能逆转肿瘤多药耐药。

Description

TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统及及其制备方法、 应用
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，特别是涉及一种TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统及其制备方法、以及在抗肿瘤多药耐药中的应用。
背景技术
癌症是导致人类死亡的疾病之一。近年来，癌症的综合治疗方案主要包括手术治疗、放射治疗和化疗。其中，化疗在癌症治疗中起主导作用。然而，化疗往往能够引起多药耐药（Multiple drug resistance MDR）和严重的全身毒性，肿瘤的多药耐药（MDR）是指癌细胞对一种化疗药物产生耐药后，对其他不同结构和作用机制的化疗药物也能产生耐药。这严重影响了癌症的治疗效果。MDR的产生机制复杂，其中一个原因与耐药细胞膜上的药物外排转运体P-糖蛋白（P-gp）的过度表达有关，P-gp能从细胞中排出抗癌药物，降低细胞中药物浓度；此外，也与诱导应急反应阻断细胞凋亡途径有关，肿瘤干细胞和microRNAs也被认为是肿瘤多药耐药因子。因此，需要寻找合适的给药系统来改善药物不良反应并逆转肿瘤的多药耐药是目前癌症治疗的迫切需要。
多西他赛（DTX）是紫杉醇类抗肿瘤药，水溶性差。能通过促进微管蛋白组装成微管，并稳定微管而抑制微管重组，使细胞增殖停止在有丝分裂G2/M期，从而抑制细胞有丝分裂和细胞增殖，诱导细胞凋亡，最终致使细胞死亡。由于DTX独特的作用机制及其在临床研究中的显著治疗效果，使其成为治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和头颈部癌等多种癌症的一线药物。但DTX作为细胞毒性抗癌药物，有严重的全身毒性，病人服用后会发生中性粒细胞减少、周围神经病变、多发性皮肤骨骼毒性等副作用，大大限制了其在临床中的应用。因此，寻找合适的给药系统将药物传递到肿瘤部位，减少药物全身分布，降低毒副作用，提高药物治疗指数是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，该系统可提高多西他赛的溶解性，减少药物的全身分布，降低毒副作用，提高抗肿瘤效果并能逆转肿瘤多药耐药性。
本发明的另一目的是提供上述TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法。
本发明的另一目的是提供上述TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统在抗肿瘤多药耐药中的应用，尤其是乳腺癌和肺癌的抗肿瘤多药耐药方面的应用。
脂质体是一种新型的给药系统，是由单个或多个同心脂质双层组成的磷脂囊泡，中间包裹着亲水区域，具有类似生物膜结构、低毒性、提高难溶性药物的溶解性等特点。将抗癌药物包载于脂质体中可以增加疏水性药物的溶解度，改善药物动力学，增强抗癌效果，降低全身毒性。粒径小于200 nm的脂质体被称为“纳米脂质体”。其有如下优点：首先，纳米脂质体能通过增加药物的有效性和减少药物的全身毒性来提高药物的治疗效果。其次，功能化纳米脂质体能靶向到肿瘤组织，以达到更佳的治疗效果。再次，纳米脂质体能够优先富集到肿瘤组织中，并通过增强EPR效应使抗癌药物具有更大的蓄积能力。近年来，脂质体克服肿瘤多药耐药已受到广泛关注。
TPGS是由D-α生育酚琥珀酸酯与聚乙二醇1000酯化得到的两亲性非离子表面活性剂，可以作为乳化剂、稳定剂、增溶剂，已被FDA批准为安全的药用辅料，广泛应用于医药工业。有研究表明，TPGS作为一种高效安全的P-gp抑制剂，可有效提高药物对肿瘤的毒性，提高摄取，延长体内循环时间。并能与一些纳米载体（脂质体、胶束、纳米粒子）结合用于癌症及抗肿瘤多药耐药的治疗。
基于上述，本发明构建了TPGS修饰的多西他赛纳米脂质体药物传递系统，具体方案为：
一种TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，其特征在于该纳米给药系统是由多西他赛（DTX）、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂制成的包载多西他赛的纳米脂质体制剂。
所述纳米给药系统的粒径为80-200nm，zeta电位为0±30mV，包封率为75-99%，载药量为3-15%。
所述多西他赛（DTX）和磷脂的质量比为1:5~1:30，表面活性剂TPGS和磷脂的质量比为1:8~1:50，胆固醇和磷脂的质量比为1:1~1:20。
所述磷脂为大豆磷脂（SPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000）、维生素E琥珀酸酯聚乙二醇酯（TPGS）、二月桂酰磷脂酰胆碱（DLPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二月桂酰磷脂酰甘油（DOPG）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）中的一种或几种。
上述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征是：将多西他赛（DTX）、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂混合后采用薄膜分散法、乙醇注入法、超声波分散法、逆向蒸发法或冷冻干燥法制备TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统。
本发明以粒径、Zeta电位、包封率及载药量等特性为考察指标，对薄膜分散法制备的TPGS修饰的DTX脂质体的主要影响因素：药脂比、水化介质的种类、水化介质的pH、水化介质的浓度进行筛选，并对其进行优化，最终得到薄膜分散法制备TPGS修饰的多西他赛纳米脂质体的步骤包括：将多西他赛（DTX）、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂溶于适量有机溶剂，减压旋转蒸发，除去有机试剂，然后加入适量水化介质，水浴搅拌30min～1h，超声波细胞粉碎机超声2～6min，膜过滤即得TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统。
所述水化介质为pH5~8，浓度为1~20mmol/ml的磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）。
所述纳米给药系统的剂型为注射剂或者冻干粉针剂。
所述冻干粉针剂中所用的冻干保护剂为乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种，其用量占该纳米给药系统质量的2-10%。
上述TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统在治疗癌症的药物中的应用。
上述TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统抗肿瘤多药耐药中的应用。
本发明构建的TPGS修饰的多西他赛纳米脂质体药物传递系统，具有以下技术特点：
1）本发明以脂质体为载体，包载抗癌一线药物多西他赛，增加了难溶性药物多西他赛的溶解度，降低了多西他赛的全身毒性作用，增强了抗癌效果。特别的，TPGS修饰的多西他赛纳米脂质体在体外细胞毒性实验和细胞凋亡实验中，将来源于人乳腺癌细胞株MCF-7、人阿霉素耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR、人肺癌细胞株A549及人顺铂耐药肺癌细胞株A549/DDP的对数生长期的细胞与不同DTX-Liposome纳米给药系统共培养后，分别采用MTT法和流式细胞仪（FCM）检测细胞活力（IC50）和细胞凋亡率。结果表明TPGS-DTX-Liposome相比于DSPC-DTX-liposome和PEG-DTX-liposome纳米脂质体有着更低的IC50值，即有着相对更高的细胞毒性以及更高的细胞凋亡率。
2）本发明制备的TPGS修饰的多西他赛纳米脂质体表现出了优异的抗肿瘤多药耐药作用。TPGS纳米脂质体在体外细胞摄取实验和P-gp抑制实验中，将来源于人乳腺癌细胞株MCF-7、人阿霉素耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR、人肺癌细胞株A549及人顺铂耐药肺癌细胞株A549/DDP的对数生长期的细胞与经过修饰的不同脂质体纳米给药系统共培养后，分别采用激光共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞仪（FCM）进行定性和定量分析，结果表明TPGS能抑制P-gp的过度表达，减少药物（香豆素-6，代替DTX的水不溶性荧光探针）外排，增加药物在肿瘤细胞中的富集，逆转肿瘤多药耐药。同时，建立荷A549/DDP细胞异种移植肿瘤裸鼠模型，经尾静脉注射给药，通过测定肿瘤体积，体重变化及抑瘤率来评价TPGS-DTX-Liposome、DSPC-DTX-liposome和PEG-DTX-liposome脂质体的体内抗肿瘤多药耐药作用。结果表明相较于其它二组脂质体，TPGS-DTX-Liposome有着更小的肿瘤体积和更高的抑瘤率。
综上所述，本发明制备的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，能明显提高多西他赛的水溶性、降低全身毒性，具有更高的细胞毒性、细胞凋亡率和抑瘤率并且能逆转肿瘤的多药耐药。
附图说明
图1为本发明TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的透射电镜图。其中a为DSPC-DTX-liposome，b为PEG-DTX-liposome，c为TPGS-DTX-liposome。
图2为A549和A549/DDP细胞在不同多西他赛制剂中孵育24h、48h、72h的毒性结果图。a、b和c分别表示A549/DDP细胞孵育24h、48h和72h后的细胞毒性结果图。d、e和f分别表示A549细胞孵育24h、48h和72h后的细胞毒性结果图。
图3为MCF-7和MCF-7/ADR细胞在不同多西他赛制剂中孵育24h、48h、72h的毒性结果图。a、b和c分别表示A549/DDP细胞孵育24h、48h和72h后的细胞毒性结果图。d、e和f分别表示A549细胞孵育24h、48h和72h后的细胞毒性结果图。
图4为A549和A549/DDP细胞在Free-coumarin-6、Coumarin-6-TPGS-liposome、Coumarin-6-PEG-liposome和Coumarin-6-DSPC-liposome中孵育2h后经激光共聚焦观察的细胞摄取图。
图5为MCF-7和MCF-7/ADR细胞在Free-coumarin-6、Coumarin-6-TPGS-liposome、Coumarin-6-PEG-liposome和Coumarin-6-DSPC-liposome中孵育2h后经激光共聚焦观察的细胞摄取图。
图6为A549细胞流式图（A），A549/DDP细胞流式图（B）。其中A、B、C、D、E分别代表对照组、Coumarin-6-DSPC-liposome、Coumarin-6-PEG-liposome、Coumarin-6-TPGS-liposome、Free coumarin-6。
图7为MCF-7细胞流式图（A），MCF-7/ADR细胞流式图（B）。其中A、B、C、D、E分别代表对照组、Coumarin-6-DSPC-liposome、Coumarin-6-PEG-liposome、Coumarin-6-TPGS-liposome、Free coumarin-6。
图8为A549/DDP细胞的CLSM定性摄取图（A），FCM定量摄取图（B）。
图9为MCF-7和MCF-7/ADR细胞的CLSM定性摄取图（A），FCM定量摄取图（B）。
图10为不同多西他赛制剂组在A549和A549/DDP细胞通过FCM检测的凋亡结果图。
图11为不同多西他赛制剂组MCF-7和MCF-7/ADR细胞通过FCM检测的凋亡结果图。
图12为不同多西他赛制剂组对A549/DDP细胞肿瘤移植模型的抗肿瘤结果图，A)肿瘤体积变化图，B) 裸鼠体重变化图。
图13为不同多西他赛制剂组对A549/DDP细胞肿瘤移植模型的抗肿瘤结果图。A)肿瘤组织图（1：PBS，2：DSPC-DTX-liposome，3：PEG-DTX-liposome，4：TPGS-DTX-liposome），B) 抑瘤率结果图。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
实施例1：薄膜分散法制备DSPC-DTX-liposome纳米给药系统
将DTX和DSPC按质量比为1:5~30；chol和DSPC按照质量比1:1~20的比例置于50 ml圆底烧瓶中，加入足量三氯甲烷/乙醇溶液（适量体积比）溶解，37℃水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至圆底烧瓶瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜，再通入2minN2，除尽残留溶剂。然后加入3mlPBS缓冲液（pH5~8，浓度1~20mmol/ml），60℃下水浴搅拌30min~1h，超声波细胞粉碎机超声3min，过0.22μm滤膜，得到DSPC-DTX-liposome，粒径80~200nm，zeta为0±30mV，包封率为90.8±5.1%，载药量为6.0±0.1%。
实施例2：薄膜分散法制备TPGS-DTX-liposome纳米给药系统
将DTX和DSPC按质量比为1:5~30；TPGS和DSPC按照质量比为1:8~50；chol和DSPC按照质量比1:1~20的比例置于50 ml圆底烧瓶中，加入足量三氯甲烷/乙醇溶液（适量体积比）溶解，37℃水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至圆底烧瓶瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜，再通入2minN2，除尽残留溶剂。然后加入3mlPBS缓冲液（pH5~8，浓度1~20mmol/ml），60℃下水浴搅拌30min~1h，超声波细胞粉碎机超声3min，过0.22μm滤膜，得到TPGS-DTX-liposome，粒径80~200nm，zeta为0±30mV，包封率为99.0±0.9%，载药量为8.4±0.01%。
实施例3：冷冻干燥法制备TPGS-DTX-liposome纳米给药系统
将DTX和DSPC按质量比为1:5~30；TPGS和DSPC按照质量比为1:8~50；chol和DSPC按照质量比1:1~20的比例置于50 ml圆底烧瓶中，加入足量三氯甲烷/乙醇溶液（适量体积比）溶解，37℃水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至圆底烧瓶瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜，再通入2minN2，除尽残留溶剂。然后加入3mlPBS缓冲液（pH5~8，浓度1~20mmol/ml），60℃下水浴搅拌30min~1h，超声波细胞粉碎机超声3min，过0.22μm滤膜，得到TPGS-DTX-liposome，加入浓度为2%（m/V）的甘露醇作为冷冻干燥剂，再将其放入-80℃冰箱预冻12小时，取出后放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得冻干制剂，置于4℃储存备用。
TPGS-DTX-liposome的细胞毒性实验：
采用MTT法检测DTX制剂对四种癌细胞的细胞毒性作用。取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ADR、A549、A549/DDP细胞株，消化，计数，1000rpm离心5min，用完全培养基配制成一定浓度的细胞悬液。每种细胞分别设置不同多西他赛制剂组，每组设一系列浓度，每个浓度六个复孔。将以上四种细胞分别取100μl接种至96孔板，每孔5000个细胞，于培养箱中培养24h，弃掉培养液，加入药物溶液；分别培养24、48、72h后，弃掉培养基，每孔加入50μl 5mg/ml的MTT溶液，培养箱中孵育4h，弃上清液，每孔加入500μl二甲基亚砜，于37℃烘箱15min，振荡10min，采用酶标仪于450nm波长下测定OD值并计算IC50值。结果见表1、表2
Cell viability = A450sample/A450control×100%
表1：A549和A549/DDP细胞在不同多西他赛制剂中孵育24h、48h、72h后的IC50值（n=6）
注：** p﹤0.01，与 TPGS-DTX-liposome组相比具有极显著性差异
表2：MCF-7和MCF-7/ADR细胞在不同多西他赛制剂中孵育24h、48h、72h后的IC50值（n=6）
注：** p﹤0.01，与 TPGS-DTX-liposome组相比具有极显著性差异。

Claims (11)

1.一种TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，其特征在于该纳米给药系统是由多西他赛、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂制成的包载多西他赛的纳米脂质体制剂。
2.按照权利要求1所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，其特征在于所述纳米给药系统的粒径为80-200nm，zeta电位为0±30mV，包封率为75-99%，载药量为3-15%。
3.按照权利要求1所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，其特征在于所述多西他赛和磷脂的质量比为1:5~1:30，表面活性剂TPGS和磷脂的质量比为1:8~1:50，胆固醇和磷脂的质量比为1:1~1:20。
4.按照权利要求1或3所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、维生素E琥珀酸酯聚乙二醇酯、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
5.一种如权利要求1至3所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征是：将多西他赛、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂混合后采用薄膜分散法、乙醇注入法、超声波分散法、逆向蒸发法或冷冻干燥法制备TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统。
6.按照权利要求5所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征在于所述薄膜分散法包括以下步骤：将多西他赛、表面活性剂TPGS、胆固醇和磷脂溶于适量有机溶剂，减压旋转蒸发，除去有机试剂，然后加入适量水化介质，水浴搅拌30min～1h，超声波细胞粉碎机超声2～6min，膜过滤即得TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统。
7.按照权利要求7所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征在于所述水化介质为pH5~8，浓度为1~20mmol/ml的磷酸缓冲盐溶液。
8.按照权利要求1-7所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征在于，所述纳米给药系统的剂型为注射剂或者冻干粉针剂。
9.按照权利要求8所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统的制备方法，其特征在于，所述冻干粉针剂中所用的冻干保护剂为乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种，其用量占该纳米给药系统质量的2-10%。
10.一种如权利要求1-3所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统在治疗癌症的药物中的应用。
11.一种如权利要求1-3所述的TPGS修饰的多西他赛脂质体纳米给药系统抗肿瘤多药耐药中的应用。
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