CN112494495B - 一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明创造提供了一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法,避光条件下，将高纯胆固醇、氢化大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、吲哚美辛溶于无水乙醇中，配制成乙醇溶液；得到的乙醇溶液旋转蒸发后形成薄膜，将薄膜进行水化得水化薄膜；在水化薄膜中加入癌细胞膜悬液，挤压后得嵌合吲哚美辛脂质体；将嵌合吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子混合，挤压后得到癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系。本发明创造所述的癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率，极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。

Description

一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法
技术领域
本发明创造属于肿瘤靶向治疗、免疫治疗和靶向递送技术领域，尤其是涉及一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法。
背景技术
肿瘤是世界上致死率最高的疾病之一，肿瘤的发生与肿瘤细胞内PI3K 信号通路的过度激活密切相关，因而靶向抑制肿瘤细胞的PI3K信号通路可产生抗肿瘤作用。PI3K抑制剂ZSTK474在临床前的动物试验中显示出很好的抗肿瘤效果，但临床试验的效果并不令人满意。这可能与其在肿瘤以外的其他组织分布，产生不良反应导致病人不能耐受而停药、从而使疗效受到影响有关。
非甾体类抗炎药吲哚美辛可抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2) 的合成进而减少PGE2介导的M2型巨噬细胞的形成，从而增加肿瘤微环境中具有抗肿瘤活性的M1型巨噬细胞的比例，增强免疫系统对肿瘤细胞的应答能力，实现对肿瘤组织的免疫治疗作用。但吲哚美辛水溶性及稳定性较差，体内半衰期短，增加药物浓度或给药次数常会造成消化道溃疡、头痛等不良反应。
将分子靶向治疗策略与免疫治疗策略结合，直接杀伤肿瘤细胞的同时增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，可提高对肿瘤的治疗效率。但ZSTK474 与吲哚美辛游离药物的组织选择性差，蓄积于正常组织易发生副作用。纳米技术可通过增加药物的比表面积和曲率增加其溶解度和溶出速率，提高生物利用度、控制药物释放，显著降低最大血药浓度及副作用。然而，大多数智能纳米载体通常涉及复杂的制造过程，如材料合成、分离、纯化和修饰，导致批次间的差异化和质量挑战。因此，有必要设计一个简单、可行、稳定、高效的体系。
无载体纳米粒子具备上述特点，且载药量高，无需额外的载体材料，是极具前景的纳米递送系统。但纳米药物进入体内后，可能会被体内免疫系统识别并清除，进而失去其治疗效果。在无载体纳米粒子表面修饰细胞膜，帮助纳米粒子躲避免疫系统的监视，可起到长循环的作用。但癌细胞膜来源有限，限制大规模制备以及应用。
目前，将分子靶向抗肿瘤疗法与免疫疗法联合，直接杀伤肿瘤细胞的同时，改善肿瘤免疫抑制微环境的研究较少，应用无载体纳米粒子并进行细胞膜嵌合负载药物脂质体修饰纳米粒子的递送系统还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在提出一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，通过溶剂交换法制备ZSTK474自组装无载体纳米粒子。利用薄膜分散法制备吲哚美辛脂质体，在水化的薄膜溶液中加入适量癌细胞膜悬液，通过脂质体挤出仪将其修饰于ZSTK474无载体纳米粒子表面构成，增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率，极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)避光条件下，将高纯胆固醇、氢化大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚美辛溶于无水乙醇中，配制成乙醇溶液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇溶液旋转蒸发后形成薄膜，将薄膜进行水化得水化薄膜；
(3)在水化薄膜中加入癌细胞膜悬液，挤压后得嵌合吲哚美辛脂质体；
(4)将步骤(3)得到的嵌合吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子混合，挤压后得到癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系。
在传统吲哚美辛脂质体中加入癌细胞膜，使得癌细胞膜和脂质成分相互嵌合共同构成脂质体。癌细胞膜嵌合吲哚美辛脂质体与普通吲哚美辛脂质体相比增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率；
癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系与细胞膜包裹的ZSTK474无载体纳米粒子相比可极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
进一步的，所述吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子的体积比为1:1-8:1。
进一步的，所述吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子的体积比为6.5:1。
ZSTK474无载体纳米粒子浓度越高，其抗肿瘤效果越好；但是当 ZSTK474无载体纳米粒子浓度太高时，通过电镜发现吲哚美辛脂质体包不住 ZSTK474无载体纳米粒子。
通过比较发现，当二者体积比为6.5:1时，所制备的双药纳米粒子在保证ZSTK药物浓度较高的情况下，包封效果最好，且粒径均匀，因此吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子的体积比优选为6.5:1。
进一步的，所述步骤(3)中反复挤压后得到吲哚美辛脂质体。
进一步的，所述步骤(3)中反复挤压的次数不小于10次。
当挤出次数小于10次时，挤出后的脂质体通过透射电镜观察后发现其形貌不是特别圆整，且有部分脂质体有缺口，没有形成完整的球形；当挤出次数增加至10次时，其形貌形态完整，脂质体没有缺口，形成了完整的球形。
进一步的，所述吲哚美辛的浓度为0.3-0.5mg/mL。
进一步的，所述吲哚美辛的浓度为0.41mg/mL。
进一步的，所述高纯胆固醇、氢化大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚美辛的浓度比为3:1:1:1.2-1.3。
现有技术中各个脂质成分用量、浓度都很高，因此在脂质体挤出过程中难度较大，不易挤出。本体系中显著降低了各个组分的浓度，使得脂质体非常容易挤出，且挤出后脂质体的电镜效果非常好。
进一步的，所述挤压步骤通过脂质体挤出仪完成。
进一步的，所述癌细胞膜悬液通过冻融法破碎癌细胞得到。
进一步的，所述癌细胞膜悬液可以为肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌的细胞膜悬液。
相对于现有技术，本发明创造所述的癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法具有以下优势：
(1)通过溶剂交换法制备ZSTK474自组装无载体纳米粒子。利用薄膜分散法制备吲哚美辛脂质体，在水化的薄膜溶液中加入适量癌细胞膜悬液，通过脂质体挤出仪将其修饰于ZSTK474无载体纳米粒子表面构成，增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率，极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
(2)在传统吲哚美辛脂质体中加入癌细胞膜，使得癌细胞膜和脂质成分相互嵌合共同构成脂质体。癌细胞膜嵌合吲哚美辛脂质体与普通吲哚美辛脂质体相比增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率；癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系与细胞膜包裹的ZSTK474无载体纳米粒子相比可极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
(3)细胞膜融合脂质体可减少癌细胞膜的用量，脂质体的外层脂质分子可装载亲脂性药物吲哚美辛，便于其在肿瘤微环境中释放，增加肿瘤微环境中具有抗肿瘤活性的M1型巨噬细胞的比例，增强分子靶向抗肿瘤药物的抗肿瘤效率。
(4)既可以发挥多种药物联合使用从不同机制抑制肿瘤的生长和转移，又可以发挥生物细胞膜纳米递药系统的主动和被动靶向功能，使其肿瘤治疗效果大大提高，同时减少两药的用量，从而减少毒副作用。
(5)在挤出过程中，癌细胞膜与脂质成分类似，因此癌细胞膜会嵌在脂质层结构中，从而制得嵌合型脂质体纳米药物递送系统，超声使其分散更加均匀。
(6)该体系制备工艺简单、重现性好，普适性强，适于规模化生产，具有很大的潜在前景。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的结构及粒径表征图；
图2为ZSTK474无载体纳米粒子(ZSTK NPs)、吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的粒径大小变化图；
图3为模拟体内环境下，双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的稳定性评价结果图；
图4为肿瘤细胞膜(PC3)与双药脂质体的共定位结果图；
图5为游离吲哚美辛和ZSTK474溶液、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的斑马鱼体内抗瘤效果评价结果图；
图6为游离吲哚美辛和ZSTK474溶液、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)在裸鼠体内抗瘤效果评价结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1
前列腺癌细胞膜(PC3)形成的嵌合脂质体纳米给药体系(即仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs))的制备
具体包括如下步骤：
(1)避光条件下，精确称取高纯胆固醇(CHO-HP)9.58mg、氢化大豆磷脂(HSPC)3.19mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)3.19mg、吲哚美辛(IND)4.1mg加入到10mL无水乙醇中(避光条件下)，在超声，加热(40℃)条件下使其充分溶解，配制成乙醇溶液；
(2)用旋转蒸发器蒸发溶剂30min，在150rpm/min，40℃下蒸发形成薄膜，然后用10mL磷酸盐缓冲液生理盐水pH7.4，在1000rpm/min，40 ℃，搅拌30min条件下对薄膜进行水化，得到水化薄膜；
(3)制备癌细胞膜悬液：
前列腺癌细胞膜的提取：培养约2×107-5×107个PC3细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞，4000rpm离心，弃去上清，收集细胞沉淀，然后用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，把1mL膜蛋白抽提试剂A 与10uL PMSF以100:1的比例混合，加入2×107-5×107细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min，将上述样品溶液在液氮和37℃依次反复冻融3次，然后在4℃，1200g离心15min，小心收集上清液至新的离心管中，切勿触及沉淀，最后4℃，14000g离心30min，以沉淀细胞膜碎片，随后加入适量超纯水，混匀即得癌细胞膜悬液，用BCA法测定细胞膜浓度。
(4)在水化薄膜中加入10mL生理盐水，随后加入30uL癌细胞膜悬液，在1000rpm/min，40℃，搅拌30min条件下对薄膜进行水化，然后利用脂质体挤出仪反复挤压，挤压后得到嵌合吲哚美辛脂质体；
(5)ZSTK474无载体纳米粒子制备：
配置0.5mM的ZSTK474/乙醇溶液，然后取200uL ZSTK474/乙醇溶液逐滴加入到10mL超纯水中，随后搅拌均匀，即得ZSTK474无载体纳米粒子水溶液。
(6)将步骤(4)得到的嵌合吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子按体积比6.5:1混合，通过脂质体挤出仪多次挤出挤压后得到前列腺癌细胞膜(PC3)形成的嵌合脂质体纳米给药体系(即仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs))。
对比例1
吲哚美辛脂质体(IND lip)的制备
采用薄膜分散挤压法制备吲哚美辛脂质体：
首先，精确称取高纯胆固醇(CHO-HP)9.58mg、氢化大豆磷脂(HSPC) 3.19mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)3.19 mg、吲哚美辛(IND)4.1mg加入到10mL无水乙醇中(避光条件下)，在超声，加热(40℃)条件下使其充分溶解，用旋转蒸发器蒸发溶剂30min，在150rpm/min，40℃下蒸发形成薄膜。然后用10mL磷酸盐缓冲液生理盐水pH7.4，在1000rpm/min，40℃，搅拌30min条件下对薄膜进行水化。然后利用脂质体挤出仪，依次通过400nm，200nm滤膜，得到粒径约200nm 左右的吲哚美辛脂质体(IND lip)。
对比例2
ZSTK474无载体纳米粒子(ZSTK NPs)的制备
制备0.5mM的ZSTK474/乙醇溶液，并使其充分溶解，随后取200uL 上述溶液均匀滴加到10mL超纯水中使其充分扩散，利用反溶剂沉淀法制备出ZSTK474无载体纳米粒子(ZSTKNPs)。
对比例3
双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)的制备
将对比例1制备的吲哚美辛脂质体与对比例2制备的ZSTK474无载体纳米粒子以体积比6.5:1的比例混合均匀后，通过脂质体挤出仪多次挤出，得到双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)。
将上述实施例1、对比例1-3制备得到的脂质体进行下述验证性试验：
1.吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的结构及粒径分析
将实施例1制备得到的前列腺癌细胞膜(PC3)形成的嵌合脂质体纳米给药体系(即仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs))、对比例1制备得到的吲哚美辛脂质体(IND lip)、对比例2制备得到的ZSTK474无载体纳米粒子(ZSTK NPs)、对比例3制备得到的双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)各10uL滴加到铜网上待其自然风干，随后用磷钨酸负染，透射电镜观察形貌，结果如图1所示。
图1-A表明，吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的粒径分布均在200nm 左右，ZSTK474无载体纳米粒子的粒径约在130nm左右，且双药纳米粒子 (IND lip+ZSTK NPs)与仿生双药纳米粒子(INDCML+ZSTK NPs)组间粒径无明显差别，说明癌细胞膜嵌合在脂质层中，形成嵌合脂质体。
对比吲哚美辛脂质体与双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)，可以发现双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的粒径较单独的吲哚美辛脂质体也没有发生较大的改变，说明通过一定的挤压作用，ZSTK474无载体纳米粒子被包裹在脂质体内部。
图1-C、1-D、1-E的透射电镜结果与上述粒径分析情况基本一致。
图1-B为各组纳米粒子的Zeta电位测定结果，结果显示ZSTK474无载体纳米粒子的Zeta电位约在-10-15mV之间，吲哚美辛脂质体Zeta电位值约在-20mV左右，而双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的Zeta电位值约在-20mV左右，进一步说明 ZSTK474无载体纳米粒子与吲哚美辛脂质体并不是简单的混合，而是ZSTK474无载体纳米粒子被包在吲哚美辛脂质体内部。
2.吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的稳定性测定
将吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)置于4℃保存，分别在第1、2、 3、4、10天，测定其粒径大小，利用GraphPad Prism软件作图分析，结果如图2所示。
图2的结果表明，制备的ZSTK474无载体纳米粒子(ZSTK NPs)、吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)在一段时间内粒径未发生明显改变，说明制备的纳米粒稳定性较好，不会发生聚集现象。
3.模拟体内环境下吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTKNPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的稳定性评价
将制备好的吲哚美辛脂质体(IND lip)、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)各取200uL，分别加入到1mL的1640培养基、含10％FBS的培养基、含20％FBS的培养基中，混匀后置于37℃孵育，分别于0、3、5、7、9、24h测定粒径大小，结果如图 3所示。
图3-A结果表明双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)24h内在1640培养基、含10％FBS的培养基、含20％FBS的培养基中可以稳定存在，保证后续的体外实验不会受到脂质体药物粒径改变的影响，也可进一步推测其在血液循环过程中保持稳定的粒径。图3-B、3-C从肉眼观察也没有聚沉物产生。
4.肿瘤细胞膜(PC3)嵌入到脂质体上的验证
为了确定肿瘤细胞膜是否嵌入到脂质体中，我们用DiO标记脂质体，用 DiI标记肿瘤细胞膜，在荧光显微镜下观察。
将市售亲脂性膜染料DiII，DiO粉末分别用PBS溶解，使其终浓度为5 mg/mL，将培养的一定数量的PC3细胞用PBS清洗三遍，将配置好的储备 DiI染料用PBS稀释到4uM，加入到细胞中，在孵箱中孵育30min，然后重复3中细胞膜的提取步骤即可得到荧光标记的PC3细胞膜。
采用薄膜分散挤压法制备荧光标记的吲哚美辛脂质体，首先，精确称取高纯胆固醇(CHO-HP)9.5mg、氢化大豆磷脂(HSPC)14mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)1.25mg、吲哚美辛(IND) 4.1mg加入到10mL无水乙醇中(避光条件下)，同时加入15uL储备的 DiO染料，随后重复1中制备吲哚美辛脂质体的步骤，嵌合型脂质体纳米药物的制备步骤同3，随后，取适量样品置于共聚焦小皿，待其风干后荧光显微镜下观察，结果如图4所示。
从图4的荧光成像结果可以看出，DiI标记的细胞膜呈红色荧光，DiO 标记的脂质体呈绿色荧光(见单独的红色和绿色通道)，俩者Merge后有重叠部分，表明细胞膜是嵌合在脂质层中。
(5)游离吲哚美辛和ZSTK474联合、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的斑马鱼体内抗肿瘤效果评价
近年来斑马鱼作为研究脊椎动物肿瘤发病学和发育遗传学的一种模式生物，逐渐受到研究人员们的广泛关注。由于斑马鱼在幼鱼阶段适应性免疫功能不全，易于进行肿瘤异种移植，并且其与人类的基因序列保持高度的相似性，约达87％。因此我们选用斑马鱼作为PC3前列腺癌肿瘤异种移植模型，研究游离吲哚美辛和ZSTK474联合、双药纳米粒子(INDlip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)的体内抗肿瘤效果。
斑马鱼肿瘤模型的建立方法如下：
(1)获取斑马鱼胚胎：实验前一晚将成年AB系斑马鱼雌雄1：1分开放入繁殖缸中，中间放抽板将雌雄鱼隔开。次日8：00am抽板，待产卵15min 后及时收走鱼卵。使用E3培养液冲洗鱼卵，将已死亡的鱼卵除去以免影响健康鱼卵。随后放入10cm培养皿中，加入含0.2mmol/LPTU的培养液，放入32℃孵箱中培养48h。
(2)制备PC3细胞悬液：选取细胞状态良好且处于对数生长期的PC3 细胞，PBS清洗、胰酶消化后用PBS制成细胞悬液。随后加入DiO染料37℃孵箱孵育20min，PBS清洗两边，制备成5×106/mL细胞悬液。
(3)斑马鱼胚胎显微注射：斑马鱼胚胎在48h时用1.2mM的三卡因进行麻醉，随后将斑马鱼胚胎放到2％琼脂糖凝胶上。用显微注射器注射约 20nL体积的细胞悬液于每个斑马鱼胚胎的卵黄囊内，其中包含100个细胞左右。细胞注射后，用荧光显微镜对胚胎进行筛选。选取荧光强度以及细胞面积大小基本一致的胚胎进行后续实验。将胚胎转移置24孔板中，各孔加入2mL含不同药物的E3培养液，置于32℃孵箱中培养48h。
(4)分组及给药方式：胚胎被分为四组，分别为对照组、游离吲哚美辛和ZSTK474联合组、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)组、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)组，给药方式为药浸法，给药持续48h， 48h后采用荧光显微镜观察斑马鱼体内肿瘤细胞荧光强度的变化情况。结果如图5所示。
图5-A结果表明，对照组和各给药组作用48h后荧光显微镜观察可以看出，游离吲哚美辛和ZSTK474联合给药组、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)组、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)组与对照组相比，斑马鱼体内肿瘤的荧光强度明显减小，表明三组药物都可明显抑制斑马鱼体内肿瘤细胞的增殖，且双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)较游离吲哚美辛和ZSTK474联合的抑制效果更明显，仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)由于细胞膜表面一些蛋白具有靶向，黏附作用，因此其在体内的治疗效果明显强于其他各组。
体内药效学测定结果表明，同源肿瘤细胞膜包覆的纳米药物递送系统具有明显的优势，不仅可以发挥纳米药物递送系统的体内长循环，减少药物排出，增加药物在肿瘤部位蓄积的优势，而且利用同源细胞的主动靶向作用，使肿瘤治疗效果明显优于游离药物，该发明具有很大的应用前景。
6游离吲哚美辛和ZSTK474联合、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs) 组、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)组的纳米药物的裸鼠体内药效学评价
(1)制备PC3细胞悬液：选取细胞状态良好且处于对数生长期的PC3 细胞，PBS清洗后用胰酶消化，加入培基制成细胞悬液，计数。然后1000rpm 离心5min，用PBS再清洗两遍，制成密度为1×107/mL的细胞悬液。
(2)培养移植瘤：在裸鼠右侧腹部皮下注射细胞悬液200μL，每只裸鼠大约注射2×106个细胞。
(3)移植瘤块，提前将手术剪、手术镊以及接种针高压灭菌。待肿瘤长至满足移植实验所需瘤块数量和大小时，将裸鼠体内的肿瘤组织取出，放入生理盐水中。用手术剪和手术镊将肿瘤组织剪成20～30mm3的大小均匀的瘤块，再将瘤块移植入正常健康的BALB/c裸鼠体内。
(4)分组及给药方式当裸鼠肿瘤面积长至50～80mm3左右时，随机分为4组，分别为对照组、游离吲哚美辛和ZSTK溶液，双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)组、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)组。各组均采用尾静脉注射方式给药，对照组注射相应体积的生理盐水，每四天给药一次，称量体重并测量肿瘤体积(肿瘤体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度2/2)。30天后处理裸鼠，取出肿瘤组织拍照并称重，计算平均瘤重及肿瘤抑制率。抑瘤率 (％)＝[(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。结束后将肿瘤部分冻存于-80℃冰箱中，部分放入多聚甲醛中固定，一部分置于PCR 保护液中，将心、肝、脾、肺、肾、胰腺、股骨各组织放入4％多聚甲醛中固定。结果如图6所示。
如图6-A和图6-B结果所示，给药过程中仅注射氯化钠生理盐水的对照组随时间增长肿瘤体积增长很快，而游离吲哚美辛和ZSTK溶液、双药纳米粒子(IND lip+ZSTK NPs)、仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)相比对照组增长速度较慢。
仿生双药纳米粒子(IND CML+ZSTK NPs)组与游离ZSTK组及纳米晶体组(IND lip+ZSTK474 NPs)相比可显著抑制肿瘤体积增长。
图6-C结果表明，仿生双药纳米粒子组与游离ZSTK组相比可显著抑制肿瘤质量增大。
图6-D统计结果表明ZSTK各处理组与对照组相比裸鼠体重均无显著影响。
上述试验结果表明，本体系在传统吲哚美辛脂质体中加入癌细胞膜，使得癌细胞膜和脂质成分相互嵌合共同构成脂质体。癌细胞膜嵌合吲哚美辛脂质体与普通吲哚美辛脂质体相比增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率；癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系与细胞膜包裹的无载体纳米粒子相比可极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
经试验证明，本体系对肺癌、乳腺癌、肝癌等同样具有良好的抗肿瘤效果，增加了对肿瘤组织的主动靶向功能，有助于提高药物的抗肿瘤效率，极大的节省肿瘤细胞膜的用量，便于临床应用。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：
具体包括以下步骤：
(1)避光条件下，将高纯胆固醇、氢化大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚美辛溶于无水乙醇中，配制成乙醇溶液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇溶液旋转蒸发后形成薄膜，将薄膜进行水化得水化薄膜；
(3)在水化薄膜中加入癌细胞膜悬液，挤压后得嵌合吲哚美辛脂质体；
(4)将步骤(3)得到的嵌合吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子混合，挤压后得到癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系；
所述吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子的体积比为1:1-8:1；
所述步骤(3)中反复挤压后得到吲哚美辛脂质体；
所述步骤(3)中反复挤压的次数不小于10次。
2.根据权利要求1所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述吲哚美辛脂质体与ZSTK474无载体纳米粒子的体积比为6.5:1。
3.根据权利要求1所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述吲哚美辛的浓度为0.3-0.5mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述吲哚美辛的浓度为0.41mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述高纯胆固醇、氢化大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚美辛的浓度比为3:1:1:1.2-1.3。
6.根据权利要求1所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述挤压步骤通过脂质体挤出仪完成。
7.根据权利要求1所述的一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法，其特征在于：所述癌细胞膜悬液通过冻融法破碎癌细胞得到。
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