CN114209653B - 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114209653B
CN114209653B CN202210068602.5A CN202210068602A CN114209653B CN 114209653 B CN114209653 B CN 114209653B CN 202210068602 A CN202210068602 A CN 202210068602A CN 114209653 B CN114209653 B CN 114209653B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
tumor
delivery system
trmdi
vesicles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210068602.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114209653A (zh
Inventor
田然
张飞
臧凤琳
倪微
王智勇
牛瑞芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital
Original Assignee
Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital filed Critical Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital
Priority to CN202210068602.5A priority Critical patent/CN114209653B/zh
Publication of CN114209653A publication Critical patent/CN114209653A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114209653B publication Critical patent/CN114209653B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用，涉及医学检验技术领域，所述仿生纳米递送系统为核壳结构，其中，所述核为纳米颗粒，所述壳为复合囊泡，解决了传统纳米载体作为外源物质易被免疫系统识别与清除，无法在肿瘤部位跨血管渗透和蓄积以及肿瘤外泌体尺寸不均一，稳定性差，表面组成不具有灵活可控的可调节性，体内长循环性能差等技术问题，本发明提供的仿生纳米递送系统能够实现实现安全性、稳定性、靶向性和长循环性的高度协调，可实现体内的长效循环和精准递送，又具有多功能颗粒的性质，可实现治疗过程的多功能协同一致。

Description

一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域，尤其是涉及一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
纳米药物递送系统，是指利用纳米材料作为载体包裹抗肿瘤药物，通过静脉注射和口服等给药方式帮助药物进入体内，随后再利用相应的方法使药物在局部释放并产生治疗效果。采用药物递送系统一方面可以防止药物提前降解或过早地与生物环境发生相互作用；另一方面通过对纳米药物载体的靶向修饰，可以提高对肿瘤组织的靶向性，降低药物对正常组织的副作用，增加在肿瘤组织的滞留时间，提高药物利用率。
设计制备纳米药物载体用于肿瘤协同治疗具有重要意义。然而纳米载体作为外源物质，无法适应体内生理微环境，易被免疫系统识别与清除，且许多实体瘤组织存在高间质流体压力屏障，阻碍了纳米载体在肿瘤部位的跨血管渗透和蓄积。因此，利用机体天然内源性物质，获得与人体生理微环境、肿瘤类型相匹配的药物载体是纳米技术发展的核心目标。
外泌体由Johnstone等研究者发现，是由细胞所分泌的纳米级囊泡。其结构与细胞类似，外膜由磷脂双分子层组成，内部空腔中包含蛋白质、脱氧核糖核酸和核糖核酸。外泌体在机体内广泛分布，免疫原性低，在细胞间起到信息传递的作用。肿瘤细胞外泌体由于其膜表面特殊结构的脂质和蛋白，对母本细胞具有归巢效应，可在肿瘤微环境中与同源性肿瘤细胞形成聚集体。但肿瘤外泌体作为纳米载体应用尚存在诸多不足：外泌体由于其严格的内源性生成途径，尺寸不均一，稳定性差；外泌体表面组成不具有灵活可控的可调节性，限制了其体内长循环性能。
因此，本领域技术人员亟需研制一种仿生纳米递送系统，以克服当前纳米递送系统的缺点，实现对肿瘤的更好治疗效果。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种仿生纳米递送系统，以解决传统纳米载体作为外源物质易被免疫系统识别与清除，无法在肿瘤部位跨血管渗透和蓄积以及肿瘤外泌体尺寸不均一，稳定性差，表面组成不具有灵活可控的可调节性，体内长循环性能差等技术问题。
本发明提供的仿生纳米递送系统为核壳结构，其中，所述核为纳米颗粒，所述壳为复合囊泡(TREV)。
进一步的，所述纳米颗粒包括纳米载体和功能物质，其中，所述纳米载体包括但不限于聚合物纳米载体、金纳米载体、碳基纳米载体和介孔二氧化硅纳米载体；
和/或，所述功能物质选自光敏剂、化疗药物、成像剂或核酸中的一种或多种。
进一步的，所述光敏剂为吲哚菁绿(ICG)，所述化疗药物为阿霉素(DOX)。
进一步的，所述复合囊泡为肿瘤外泌体囊泡(TEV)和红细胞膜囊泡(REV)通过膜融合技术获得。
本发明的目的之二在于提供一种仿生纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米载体的制备；
(2)将纳米载体和功能物质进行组装得到纳米颗粒；
(3)复合囊泡的制备；
(4)将纳米颗粒和复合囊泡进行组装即得到仿生纳米递送系统。
进一步的，所述复合囊泡的制备方法包括以下步骤：
(1)肿瘤外泌体提取及囊泡制备:将培养好的4T1细胞经梯度离心获得4T1外泌体(4T1 EV)，然后将所得到的外泌体重悬、充分混匀，在冰水浴条件下超声后置于脂质体挤压器内过膜挤出获得 4T1外泌体囊泡TEV；
(2)红细胞的提取及囊泡制备：将抗凝全血在4℃下离心得到下层红细胞，然后将红细胞经重悬-离心-去除上清液操作3-4次后获得压积红细胞。随后将压积红细胞与低渗溶液混合均匀，经过反复低渗3-4次后获得血影细胞膜。将所得到的血影细胞膜重悬，充分混匀后，置于脂质体挤压器过膜挤出，获得红细胞囊泡REV；
(3)复合囊泡的制备：将外泌体与红细胞囊泡分别溶于超纯水中，反复吹打充分混匀，冰水浴超声后将溶液置于脂质体挤压器并在冰浴条件下过膜挤出，获得“肿瘤外泌体-红细胞”复合纳米囊泡TREV。
进一步的，在步骤(1)-(3)中，所述超声的时间均为20-40 s，优选为30s；
和/或，在步骤(1)-(3)中，所述超声的频率均为45-60 KHz，优选为52KHz；
和/或，在步骤(1)-(3)中，所述超声的功率均为90-110 W，优选为100W。
进一步的，在步骤(1)-(3)中，所述过膜挤出步骤均需通过 400目和200目聚碳酸酯膜进行挤出。
进一步的，在步骤(1)和步骤(2)中，所述过膜挤出的次数均为15-25次。
进一步的，在步骤(3)中，所述过膜挤出的次数为40-60次。
进一步的，在步骤(3)中，所述外泌体与红细胞囊泡的数量比为1-3：5，优选为2：5。
进一步的，将纳米颗粒和复合囊泡进行组装的具体方法包括以下步骤：将获得的复合囊泡与纳米颗粒充分混合，经冰浴超声后再通过脂质体挤压器，即可制得仿生纳米递送系统混悬液。
进一步的，所述冰浴超声的时间为20-40s，优选为30s；
和/或，所述冰浴超声的频率为45-60KHz，优选为52KHz；
和/或，所述冰浴超声的功率为90-110W，优选为100W。
本发明的目的之三在于提供一种仿生纳米递送系统在治疗肿瘤或其他疾病方面的应用。
本发明提供的仿生纳米递送系统通过将纳米载体技术与膜融合技术结合起来，可以实现安全性、稳定性、靶向性和长循环性的高度协调，可实现体内的长效循环和精准递送，又具有多功能颗粒的性质，可实现治疗过程的多功能协同一致，具有广泛的应用前景。
本发明提供的仿生纳米递送系统的制备方法简单，成本较低，便于大规模生产，利于生产投放市场。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为仿生纳米递送系统TRMDI的制备示意图，其中A为载吲哚菁绿/阿霉素的介孔硅颗粒MDI的合成示意图，B为复合纳米囊泡制备示意图，C为仿生纳米递送系统TRMDI的组装过程示意图；
图2为共聚焦观察复合纳米囊泡与多孔聚苯乙烯微球仿生组装图；
图3为复合囊泡与金棒组装的TEM图；
图4为TRMDI的表征，其中A为MSNs和TRMDI的TEM图片，B为MSNs、MDI和TRMDI粒径，C为MSNs、MDI和 TRMDI的Zeta电位，D为MDI和TRMDI在去离子水中的稳定性，E为MDI和TRMDI在10％胎牛血清中的稳定性；
图5为免疫印迹实验检测MDI、TMDI、RMDI、TRMDI的表面蛋白成分；
图6为4T1-GFP细胞与Raw264.7细胞对不同药物的摄取；
图7为荷瘤小鼠接受不同治疗后药物的体内组织分布，其中A 为荷瘤小鼠体内的药物代谢分布，B为小鼠的离体脏器与肿瘤组织照片，C为小鼠药物代谢荧光积分柱状图，D为小鼠离体脏器与肿瘤组织荧光积分柱状图(A和B右侧标尺为色标，显示荧光强度的大小)；
图8为TREV囊泡和TRMDI在小鼠体内的生物安全性评价，其中A为小鼠体重变化，B为肝功能检测指标分析，C为肾功能检测指标分析；
图9为不同处理组作用16天后各主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的H&E染色结果，标尺1mm；
图10为荷瘤小鼠接受不同治疗后体内光热效应考察，其中A 为荷瘤小鼠接受不同治疗后在近红外光照射过程光热成像照片，B 为荷瘤小鼠接受不同治疗后肿瘤组织部位温度变化曲线；
图11为荷瘤小鼠接受不同治疗后肿瘤生长情况，其中A为治疗过程说明，B为小鼠体重变化曲线，C为肿瘤体积变化曲线(数值以均值±SD表示，n＝3，**P＜0.01)，D为离体肿瘤照片，E为离体肿瘤瘤重曲线；
图12为荷瘤小鼠接受不同治疗后体内肿瘤组织H&E和ICH染色图；
图13为荷瘤小鼠接受不同治疗后的生存曲线图；
图14为不同处理组作用16天后肺部转移灶分析，其中A为不同处理组作用16天后肺部转移灶照片，B为不同处理组作用16天后肺部转移灶统计分析。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种仿生纳米递送系统，该仿生纳米递送系统为核壳结构，其中，核为纳米颗粒，壳为复合囊泡。
本发明提供的仿生纳米递送系统通过将纳米载体技术与膜融合技术结合起来，可以实现安全性、稳定性、靶向性和长循环性的高度协调，可实现体内的长效循环和精准递送，又具有多功能颗粒的性质，可实现治疗过程的多功能协同一致，具有广泛的应用前景。
在本发明的一种优选实施方式中，纳米颗粒包括纳米载体和功能物质，其中，纳米载体包括但不限于聚合物纳米载体、金纳米载体、碳基纳米载体和介孔二氧化硅纳米载体。
纳米载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包载于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。
在本发明的一种优选实施方式中，功能物质选自光敏剂、化疗药物、成像剂或核酸中的一种或多种。
在本发明中，根据选择的功能物质的不同，其具有光热治疗、光动力治疗、化疗、基因治疗或可视化成像示踪等多种功能，可实现治疗过程的多功能协同一致。
在本发明的进一步优选实施方式中，光敏剂为吲哚菁绿，化疗药物为阿霉素，将TREV、介孔硅颗粒(MSNs)、化疗药物阿霉素(DOX)和光敏剂吲哚菁绿(ICG)等组分多功能组装，制备仿生可视化纳米递药系统TRMDI，TRMDI具有明显的核-壳结构，粒径均匀，保持了纳米级尺寸，且在模拟生理条件下，分散性和体外稳定性良好。TRMDI体外联合治疗效果的研究结果表明，在808 nm近红外光的照射下，TRMDI具有显著的光热效应和光动力效应，明显高于游离的ICG水分散溶液；具有pH/光热双重响应性释药性能，在近红外光的照射下，TRMDI的释药速率明显增加，对 TRMDI对4T1细胞的增殖、侵袭和迁移能力具有协同抑制作用。 TRMDI体内联合治疗效果的研究结果表明，TREV的包覆显著增加了TRMDI递药系统对肿瘤组织的靶向能力和滞留时间，48h内在肿瘤部位的显著蓄积；ICG在近红外波段的荧光使得TRMDI可以用于体内示踪及肿瘤成像；在近红外光的刺激下，TRMDI可以在肿瘤部位药物响应释放；与对照组相比，TRMDI对肿瘤的消融作用明显，能显著抑制原位肿瘤生长，同时具有较好的生物相容性和安全性。
在本发明的一种优选实施方式中，复合囊泡为肿瘤外泌体囊泡 (TEV)和红细胞膜囊泡(REV)通过膜融合技术获得。
TREV具有明显的膜结构，圆整均一，尺寸可控；在模拟生理条件下，分散性和体外稳定性良好；同时囊泡表面保留了外泌体和红细胞的膜蛋白，对同源肿瘤具有靶向性，又降低了巨噬细胞的摄取效率，且对细胞生长毒性不明显。TREV的成功构建实现了同源红细胞膜对鼠源肿瘤外泌体4T1 EV的天然改性，实现了安全性、稳定性、靶向性和长循环性的高度协调。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种仿生纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米载体的制备；
(2)将纳米载体和功能物质进行组装得到纳米颗粒；
(3)复合囊泡的制备；
(4)将纳米颗粒和复合囊泡进行组装即得到仿生纳米递送系统。
本发明提供的仿生纳米递送系统的制备方法简单，成本较低，便于大规模生产，利于生产投放市场。
在本发明的一种优选实施方式中，复合囊泡的制备方法包括以下步骤：
(1)肿瘤外泌体提取及囊泡制备:将培养好的4T1细胞经梯度离心获得4T1外泌体(4T1 EV)，然后将所得到的外泌体重悬、充分混匀，在冰水浴条件下超声后置于脂质体挤压器内过膜挤出获得 4T1外泌体囊泡TEV；
(2)红细胞的提取及囊泡制备：将抗凝全血在4℃下离心得到下层红细胞，然后将红细胞经重悬-离心-去除上清液操作3-4次后获得压积红细胞。随后将压积红细胞与低渗溶液混合均匀，经过反复低渗3-4次后获得血影细胞膜。将所得到的血影细胞膜重悬，充分混匀后，置于脂质体挤压器过膜挤出，获得红细胞囊泡REV；
(3)复合囊泡的制备：将外泌体与红细胞囊泡分别溶于超纯水中，反复吹打充分混匀，冰水浴超声后将溶液置于脂质体挤压器并在冰浴条件下过膜挤出，获得“肿瘤外泌体-红细胞”复合纳米囊泡 TREV。
在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(1)-(3)中，超声的时间均为20-40s，超声的频率均为45-60KHz，超声的功率均为 90-110W。
在本发明的典型但非限制性的实施方式中，在步骤(1)-(3) 中，超声的时间如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40s；超声的频率如为45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59或60KHz；超声的功率如为90、92、94、96、98、100、102、 104、106、108或110W。
通过调整超声的时间、超声的频率和超声的功率，可以制备出粒径可控、尺寸均一的囊泡，可以提高复合纳米囊泡的治疗效果。
在本发明的进一步优选实施方式中，在步骤(1)-(3)中，超声的时间均为30s，超声的频率均为52KHz，超声的功率均为 100W。
在本发明的进一步优选实施方式中，在步骤(1)-(3)中，过膜挤出步骤均需通过400目和200目聚碳酸酯膜进行挤出。
在本发明的进一步优选实施方式中，在步骤(1)和步骤(2) 中，过膜挤出的次数均为15-25次。
在本发明的典型但非限制性的实施方式中，步骤(1)和步骤 (2)中过膜挤出的次数如为15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或25次。
在本发明的进一步优选实施方式中，在步骤(3)中，过膜挤出的次数为40-60次。
在本发明的典型但非限制性的实施方式中，步骤(3)中过膜挤出的次数如为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59或60次。
在本发明中，过膜挤出的次数决定了囊泡的均一性和囊泡质量，按照本发明中的过膜挤出次数进行囊泡制备效果更好。
在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(3)中，外泌体与红细胞囊泡的数量比为1-3：5。
在本发明的典型但非限制性的实施方式中，外泌体与红细胞囊泡的数量比如为1：5、1.5：5、2：5、2.5：5或3：5。
通过调整本优选实施方式中外泌体与红细胞囊泡的数量比，可以找出最佳的反应条件，从而提高复合囊泡的性能，最终达到优化治疗效果的目的。
在本发明的进一步优选实施方式中，在步骤(3)中，外泌体与红细胞囊泡的数量比为2：5。
在本发明的一种优选实施方式中，将纳米颗粒和复合囊泡进行组装的具体方法包括以下步骤：将获得的复合囊泡与纳米颗粒充分混合，经冰浴超声后再通过脂质体挤压器，即可制得仿生纳米递送系统混悬液。
在本发明的一种优选实施方式中，冰浴超声的时间为20-40s，冰浴超声的频率为45-60KHz，冰浴超声的功率为90-110W。
在本发明的典型但非限制性的实施方式中，超声的时间如为 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39或40s；超声的频率如为45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60KHz；超声的功率如为90、92、94、96、98、100、102、104、106、108 或110W。
通过调整超声的时间、超声的频率和超声的功率，可以制备出粒径可控、尺寸均一、具有多种功能的仿生纳米递送系统，可以提高仿生纳米递送系统的治疗效果。
在本发明的进一步优选实施方式中，超声的时间均为30s，超声的频率均为52KHz，超声的功率均为100W。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了仿生纳米递送系统在治疗肿瘤或其他疾病方面的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。
本发明可能涉及的英文缩写表
Figure RE-GDA0003508435530000121
Figure RE-GDA0003508435530000131
Figure RE-GDA0003508435530000141
实施例1
本实施例提供了一种仿生纳米递送系统，其由复合纳米囊泡 TREV对多孔聚苯乙烯微球进行仿生化修饰得到，具体制备方法包括如下步骤：
(1)多孔聚苯乙烯微球(PS-DVB)的制备：室温下，将70 mL乙醇、10mL纯水与8mLSt加入四口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气35min。将含有0.15g AIBN和1g PVP的乙醇溶液倒入烧瓶中，保持氮气环境，升温至70℃，匀速搅拌并反应8h。待反应结束后，将产物进行离心分离并去除上清液，用无水乙醇洗涤2-3次，之后在55℃烘箱中干燥，得到PS实心微球白色粉末，称取粉末质量，备用。将0.26g PS种子加入10mL水中，经过超生分散均匀，加入三口瓶中，加入1.2mL DBP做致孔剂，震荡吸收 24h。将2.6mL St，DVB，甲苯和0.12g BPO加入第一步的溶液中，室温震荡24h。通氮气，70℃反应15h，水洗，醇洗，然后在 50℃烘箱干燥过夜。
(2)复合囊泡的制备：
肿瘤外泌体提取及囊泡制备：培养4T1细胞，当细胞聚合度为 60％时，用10％无外泌体胎牛血清的培养液继续培养36h-48h(根据细胞状态和培养液颜色调整)，大量收集培养液，梯度离心。 4℃，1000g，10min；4℃，10000g，30min；4℃，100000 g，70min×2次，吸去上清，获得4T1外泌体(4T1 EV)，用1 mL预冷的PBS重悬，充分混匀，分装备用。在使用外泌体前，采用BCA法对外泌体溶液中的总蛋白含量进行量化分析，用 Nanosight对外泌体的囊泡数进行统计。将所得到的外泌体重悬、充分混匀，在频率为52KHz，功率为100W的冰水浴条件下超声1 min，置于脂质体挤压器配套的注射器内，分别通过400目和200 目聚碳酸酯膜挤出，挤压过膜20次，获得4T1外泌体囊泡TEV。
红细胞的提取及囊泡制备：制备戊巴比妥那麻醉试剂：称取1 g戊巴比妥粉末溶于100mL无菌的去离子水中，配制成质量浓度为1％的戊巴比妥那溶液；制备抗凝剂：称取1gEDTA-2Na溶于50 mL无菌的去离子水中，配制成质量浓度为2％的EDTA-2Na抗凝溶液。以抗凝剂反复润洗注射器和离心管，37℃烘箱中烘干备用。Balb/c小鼠以0.2mg/kg剂量经腹腔注射1％戊巴比妥那溶液，进行麻醉。以心脏取血的办法，获取小鼠的新鲜血液，将血液立即注入经过抗凝处理的离心管中，充分混匀，备用。按照文献中的办法，从小鼠血液中分离红细胞。具体方法为取5mL抗凝全血， 4℃离心(1000rpm，10min)，吸去上清液和中间白膜层液体 (含血小板和白细胞)，保留下层红细胞。将压积红细胞用3倍体积的预冷生理盐水重悬，依据上述条件离心，如此重复3-4次至上清无色，去除上清液，获得压积红细胞。上述红细胞经多倍稀释后，取10μL加至洁净的血球计数板中，于显微镜下进行计数，重复计三次，取平均值计算浓度并记录。取压积红细胞，按1：5的比例加入低渗溶液，混合均匀，在4℃环境中静置20min，由于溶血的关系，细胞悬液由鲜红色变为透明暗红色，低温离心(4℃，8000rpm)30min，弃上清，获得沉淀。同样的办法，反复低渗3-4 次，甚至可低渗过夜，直至沉淀部分呈乳白色，弃上清，获得白色或者浅红色血影细胞膜。将所得到的血影细胞膜重悬，充分混匀后，置于脂质体挤压器配套的注射器内，通过400目和200目聚碳酸酯膜挤出，挤压过膜20次，获得红细胞囊泡REV。
复合纳米囊泡的制备(示意图见图1B)：NTA测定4T1外泌体和红细胞囊泡的数量，以2×106个4T1细胞外泌体与5×106个红细胞囊泡进行表面融合。方法如下：将外泌体与红细胞囊泡分别溶于超纯水中，反复吹打充分混匀，冰水浴超声1min(频率为52 KHz，功率为100W)，将溶液置于脂质体挤压器配套的注射器内，冰浴条件下通过400目和200目聚碳酸酯膜挤出，反复挤压过膜50次，获得“肿瘤外泌体-红细胞”复合纳米囊泡TREV。
(3)以超纯水为溶液，5×106个TREV囊泡对应于1mg/mL PS-DVB溶液进行PS-DVB的仿生膜修饰，制备得到PS- DVB@TREV。具体方法如下：获得TREV囊泡，使其与PS-DVB 充分混合，冰浴超声60s(频率为90KHz、功率100W)，即可制得PS-DVB@TREV溶液。
实施例2
本实施例提供了一种仿生纳米递送系统，其由复合纳米囊泡 TREV对纳米金棒进行仿生化修饰得到，具体制备方法包括如下步骤：
(1)纳米金棒(Au NR)的制备：采用种子介导生长法制备金棒，制备过程主要分为两步：种子合成与纳米金棒生长。种子合成在29℃水浴中完成，向8.5mL CTAB溶液(0.1M)中加入3.5 mL HAuCl4溶液(1mM)，然后滴加0.8mL NaBH4溶液(8 mM)，持续反应2.5h。纳米金棒生长在29℃水浴中，向122mL CTAB溶液(0.1M)加入112mL HAuCl4溶液(1mM)，再向上述混合物中加入2.24mLAgNO3溶液(10mM)及1.8mLHCl溶液 (2mM)，待充分混合后，将1.62mL抗坏血酸(0.1M)加入到溶液中还原金离子，最后加入特定体积的金种子溶液。上述混合液在29℃水浴中持续搅拌5.5h，使金棒生长完全。反应完毕的溶液 4℃贮存过夜，次日4℃离心，1000g，10min，取上清备用。
(2)复合囊泡的制备方法与实施例1相同。
(3)采用超声和挤压的方法可利用TREV对纳米金棒进行仿生修饰，获得Au NR@TREV。具体复合囊泡TREV与纳米金棒的组装过程如下：过量的TREV与金棒溶液充分混匀，冰浴超声30s (频率为50KHz、功率83W)，后放入脂质体挤压器中，依次将混合物挤压通过孔径为400nm和200nm的聚碳酸酯滤膜进行挤压。反复挤压20个循环后，离心去除TREV，获得方式修饰的Au NR@TREV，并重悬于PBS缓冲液中。
实施例3
本实施例提供了一种仿生纳米递送系统，其由复合纳米囊泡 TREV对纳米金棒进行仿生化修饰得到，具体制备方法包括如下步骤：
(1)介孔硅球(MSNs)的制备：称取0.25g CTAB加入50 mL单口圆底烧瓶中，按顺序用移液枪将25mL去离子水、7.7mL 无水乙醇和77μL二乙醇胺加入烧瓶底部。将体系加热至72℃并保持磁力搅拌，保持反应20min。吸取1.0mL TEOS，逐滴加入圆底烧瓶中，继续保持在72℃条件下磁力搅拌反应55min。关闭磁力搅拌及加热，将反应混合物用移液枪吸取到离心管中，室温离心，14400rpm，13min，弃上清并用蒸馏水洗涤2-3次。将洗涤后的超声沉淀分散到适量无水乙醇中，加入单口圆底烧瓶中，并加入 0.6g NaCl，在72℃条件下继续保持磁力搅拌6.5h。结束反应，将上述反应的单口圆底烧瓶静置5min，然后用移液枪吸取上清到50mL离心管中，室温离心，14400rpm，10min，弃上清并用蒸馏水洗涤2-3次，冻干，计算介孔硅球质量，稀释至浓度为10mg/mL 储存、备用。
(2)载吲哚菁绿/阿霉素的介孔硅颗粒MDI的制备(示意图见图1A)：以超纯水为溶剂，分别配制浓度为1.0mg/mL的 DOX·HCl溶液，ICG溶液和浓度为10mg/mL MSNs溶液。精密量取1mL DOX·HCl溶液，1mL ICG溶液和5mL MSNs溶液混合置于20mL棕色瓶子中充分混匀、避光搅拌过夜，离心去除未载入 DOX·HCl的和ICG，即可得到同时载有DOX/ICG的介孔硅颗粒 MDI。
(3)复合囊泡的制备方法与实施例1相同。
(4)以5×106个TREV囊泡对应于1mg MDI的比例进行 MDI的仿生膜修饰，制备得到TRMDI，示意图见图1C。具体方法如下：获得TREV囊泡，使其与MDI充分混合，冰浴超声30s(频率为52KHz、功率100W)，再通过脂质体挤压器，即可制得 TRMDI混悬液。
对比例1
本对比例提供了一种载吲哚菁绿/阿霉素的介孔硅颗粒MDI，其制备方法与实施例3相同，用于对照实验。
对比例2
本对比例提供了一种采用与实施例3相同的方法制备TEV包覆 MDI的TMDI，用于对照实验。
对比例3
本对比例提供了一种采用与实施例3相同的方法制备REV包覆 MDI的RMDI，用于对照实验。
对比例4
本对比例提供了一种4T1 EV外泌体，其与实施例1中的4T1 EV外泌体相同，用于对照实验。
对比例5
本对比例提供了一种TEV囊泡，其制备方法与实施例1提供的 TEV囊泡制备方法相同，用于对照实验。
对比例6
本对比例提供了一种TREV囊泡，其制备方法与实施例1提供的TREV囊泡制备方法相同，用于对照实验。
试验例1复合囊泡对多种纳米载体的修饰
本试验例对实施例1-3提供的仿生纳米递送系统进行了表征，具体结果如下：
本发明完成复合囊泡TREV与多尺寸颗粒的组装，具体做法是通过超声孵育实现纳米囊泡与微米级尺寸的多孔聚苯乙烯微球进行组装，实验结果见图2。实验中采用以膜染料Dio标记肿瘤外泌体，以Dil标记红细胞囊泡，获得TREV。利用共聚焦显微镜观察，绿色荧光通道和红色荧光通道叠加后重合在一起，镜下看到10 μm大小的微米级光圈，说明复合囊泡成功包裹了多孔聚苯乙烯微球。
接下来，本发明完成TREV与纳米金棒的组装：利用透射电镜进行观察，发现复合囊泡包裹后，颗粒表面均出现明显的膜结构，见图3所示。从结果可以看出，金棒表面均可以看到膜结构，复合囊泡具有普适性，可以简单、快速地与多种纳米材料融合，完成仿生修饰，提示在今后具有比较广的发展方向。
在前面探究了TREV对多种纳米材料可进行仿生修饰的基础上，通过超声法，实现了TREV囊泡对MDI(对比例1)的仿生修饰，获得了仿生载药系统TRMDI(实施例3)。MSNs(对比例 1)与TRMDI的TEM照片如图4A所示。MSNs的粒径均匀、分散均匀、形貌为球状结构，内部有明显的介孔；TRMDI中能看到药物负载，且在表面出现明显的膜结构。MSNs、MDI与TRMDI的粒径与Zeta电位的结果如4B和C所示，MSNs的粒径为 151.1±10.2nm，Zeta电位为-22.5mV；MDI的粒径为161.1±15.8 nm，Zeta电位为-4.08mV；TMDI的粒径为170.1±18.5nm，Zeta电位为-22.4mV；RMDI的粒径为182.3±14.5nm，Zeta电位为-30.6 mV；TRMDI的粒径为184.4±17.5nm，Zeta电位为-27.5mV，与 TEV、REV及TREV膜电位基本一致。通过TEM、粒径及电位检测结果可知，TREV成功包被于MDI表面。
综上所述，本发明中的TREV可以实现对多种纳米载体的修饰，从而构建不同的仿生纳米递送系统，可以达到不同的治疗效果，应用范围较广。
试验例2仿生纳米递送系统的稳定性验证
2.1粒径、粒径分布及稳定性的测定
2.1.1试验方法
将MDI(对比例1)和TRMDI(实施例3)溶液水浴超声30 min，用去离子水稀释，制得MDI与TRMDI的混悬溶液。将上述混悬液滴加于铜网表面，制备TEM电镜样品，观察样品形貌。采用可视化纳米粒度追踪仪检测样品的粒径大小、分布及其Zeta电位。将MDI与TRMDI分别溶于去离子水和含10％胎牛血清的培养液中，4℃条件下放置5天，监测样品粒径变化，评价样品在水溶液和10％胎牛血清培养液中的稳定性。
2.1.2结果与讨论
考察MDI(对比例1)和TRMDI(实施例3)在去离子水和 10％胎牛血清培养液中的稳定性。将MDI和TRMDI分别置于去离子水和含10％胎牛血清的培养液中，4℃放置5天，检测粒径大小及分散系数的变化。如图4C和E所示，MDI在去离子水中粒径及分散系数均是从第3天开始增大，在10％胎牛血清中相对稳定，考虑这是由于MDI吸附了血清中的蛋白，形成蛋白质冠，增加了稳定性；而TRMDI在去离子水和含10％胎牛血清的培养液中，粒径和PDI均未发生显著变化，显示出良好的稳定性，以上结果说明介孔硅球经仿生膜修饰后，稳定性增加，更加适合作为载体应用。
试验例3仿生纳米递送系统的靶向性与长循环验证
3.1 TRMDI表面特异性蛋白的检测
3.1.1试验方法
膜表面全蛋白的检测：将MDI(对比例1)、TMDI(对比例 2)、RMDI(对比例3)、TRMDI(实施例3)溶液中加入1x Loading buffer于97℃干式恒温浴中，变性15min，随后吸取颗粒备用，通过Western blot检测样品中CD63、CD81、TSG101和 CD47的表达情况。
3.1.2结果与讨论：检测将MDI、TMDI、RMDI、TRMDI表面膜蛋白的含量，结果如图5，TMDI和TRMDI表面均检测到外泌体 Marker CD63、CD81和TSG101的表达；RMDI和TRMDI表面均检测到红细胞膜的特征性蛋白CD47的表达。实验结果进一步说明 TREV融合膜成功包覆于MDI表面，具有肿瘤外泌体和红细胞膜表面的特异性蛋白，因此有望发挥双重靶向作用，共载DOX与ICG 实现对同源肿瘤的靶向递送。
3.2 4T1-GFP细胞与Raw264.7细胞对TRMDI的摄取考察
3.2.1试验方法
用蒸馏水清洗12孔板匹配的细胞玻片，于无水乙醇中消毒浸泡、备用。将晾干后的玻片铺于12孔板底部。对玻片进行多聚赖氨酸包被，包被时间30min，回收多聚赖氨酸，晾干、备用。将处于对数期生长的Luc-4T1和Raw264.7细胞根据各自特性消化、收集，加入培养液重悬，对两种细胞分别进行三次计数。将Luc-4T1 与Raw264.7按照1：1的比例，配制总浓度为5×104个/mL的细胞悬液，取1mL细胞悬液垂直滴加入孔板中，每孔细胞总量为5×104个，置于标准培养条件下(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养。常规培养24h后，细胞贴壁，弃去培养液，加入含有MDI(对比例 1)、TMDI(对比例2)、RMDI(对比例3)、TRMDI(实施例 3)的全营养培养液，其中DOX浓度为1.5μg/mL，置于标准培养条件下继续培养。孵育6h后，弃去含药培养基，并用PBS反复洗涤3次，加入4％PFA常温固定10min。吸去PFA，加入PBS洗涤并置于摇床上轻轻晃动，每次5min，转速60转/分，共洗涤3次。将稀释好的DAPI染液加入孔中，覆盖孔底，室温条件下，染色10 min。吸去DAPI，加入PBS洗涤并置于摇床上轻轻晃动，每次10 min，转速60转/分，共洗涤3次。每孔中滴加10μL抗荧光淬灭封片剂，取出玻片，倒扣于载玻片上，常温晾干，激光共聚焦下观察颗粒的胞内分布，以上实验均在避光条件下完成。
3.2.2结果与讨论
仿生纳米系统的最大优势就是由于天然膜的包被，可以使得该递药系统获得膜的相应性能。由于MDI、TMDI、RMDI与TRMDI 中所负载的DOX具有自发荧光，因此我们采用显微镜观察小鼠乳腺癌细胞4T1-GFP与小鼠巨噬细胞Raw264.7共培养体系对颗粒的摄取情况，并进行比较。结果如图6所示，在共培养体系中，4T1- GFP和Raw264.7细胞核均被DAPI染色，4T1-GFP稳定表达绿色荧光蛋白，因此DAPI和GFP的共定位确定4T1细胞，单独DAPI 染色的为巨噬细胞。MDI、TMDI、RMDI与TRMDI各组颗粒均载有DOX，显示为红色荧光。经过6h的摄取过程后，观察发现， MDI组中4T1-GFP和Raw264.7中均有红色荧光信号，表明肿瘤细胞和巨噬细胞均对MDI有摄取；与MDI组相比较，TMDI在4T1- GFP细胞中红色荧光信号明显增强，在Raw264.7细胞中的信号未有明显变化，这是由于TMDI为肿瘤外泌体膜所修饰，对肿瘤细胞有同源靶向性；RMDI在4T1-GFP细胞和Raw264.7细胞中的红色荧光信号均弱于MDI，这是由于红细胞膜的修饰会降低巨噬细胞对 RMDI的摄取；TRMDI在4T1-GFP细胞中红色荧光信号接近于 TMDI组，在Raw264.7细胞中的红色荧光信号接近RMDI组；这是由于TRMDI表面由TREV复合膜的修饰，既保留了外泌体膜对同源肿瘤的靶向性，又保留了红细胞膜表面高表达CD47“不吃我”的性质。
3.3 TRMDI在4T1乳腺癌荷瘤小鼠体内分布考察
3.3.1试验方法
纳米载体的一大优势就是实现对药物的靶向递送，提高药物在肿瘤组织中的蓄积浓度，并延长药物在肿瘤组织的滞留时间。在本发明中，我们利用光敏剂ICG的自身荧光性能，通过小动物活体成像系统，观察MDI(对比例1)、TMDI(对比例2)、RMDI(对比例3)、TRMDI(实施例3)在4T1荷瘤小鼠体内的组织分布，评价其体内的肿瘤组织靶向性和滞留时间。具体方法如下：取20只 Balb/c荷瘤小鼠，当肿瘤体积达到1000mm3时，将其分为5组，经尾静脉分别注射PBS、MDI、TMDI、RMDI和TRMDI(ICG含量1.5mg/kg)。通过小动物活体成像系统，在注射后的4h、12h、24 h和48h对药物在小鼠肿瘤组织和各脏器的分布进行观察。48h后麻醉处死小鼠，分析心、肝、脾、肺、肾等主要脏器和肿瘤组织中的荧光信号，评价各载药体系在主要脏器与肿瘤组织中的分布情况。并利用成像软件对肿瘤部位的荧光强度进行定量分析，绘制荧光强度变化曲线。
3.3.2结果与讨论
光敏剂ICG在近红外波段有荧光性能，可以用于活体的体内示踪。我们以荷瘤小鼠为研究对象，将载有ICG的纳米颗粒MDI、 TMDI、RMDI和TRMDI通过尾静脉注射方式给药，利用小动物活体成像系统观察纳米颗粒在瘤内和体内主要脏器中的分布，评价 MDI、TMDI、RMDI与TRMDI的体内肿瘤组织靶向性和滞留时间。结果如图7A和C，尾静脉注射给药4h后，与PBS对照组相比，各给药组小鼠的肝脏与肿瘤组织中开始出现荧光信号，表明药物通过血液循环进入体循环过程，逐步到达肝脏和肿瘤组织；肿瘤组织的荧光信号强度随着时间的延长而升高，在12h达到峰值，其中MDI主要富集于肝脏，肿瘤部位富集含量较少，而TMDI和TRMDI组在肿瘤部位的信号明显强于MDI组，
考虑这是由于外泌体膜的肿瘤靶向性；之后的36h内，各给药组肿瘤部位的荧光信号强度逐渐减弱；在48h时，RMDI和 TRMDI组在肿瘤部位的信号明显强于其他实验组，考虑这是由于红细胞膜的长循环效应，降低了颗粒的清除速率，延长了在肿瘤组织中的滞留时间。以上结果说明，TREV囊泡的仿生修饰有效提高了TRMDI对肿瘤组织的靶向性，同时降低了TRMDI的免疫原性，减弱了巨噬细胞等免疫系统对TRMDI的识别与清除，进而增加所携载药物在肿瘤病灶的蓄积。
给药48h后，获取离体脏器和肿瘤组织，观察载药颗粒在组织中的蓄积，并通过荧光强度分析，进行组织分布的定量测定。结果如图7B和图7C，PBS对照组各组织几乎没有荧光，排除了组织本身对ICG荧光信号的影响。MDI组的荧光信号主要出现于肺和肝脏，肿瘤组织的信号弱；而TMDI、RMDI与TRMDI组在肿瘤部位的荧光信号均强于MDI组，定量结果显示，TRMDI组的荧光强度是MDI组的3.1倍，说明颗粒主要在肿瘤部位富集，而在肝脏和肾脏中出现微弱的信号，提示了药物的体内代谢过程。TRMDI在肿瘤部位的富集是由TRMV膜的修饰所造成的，一方面提高了颗粒对肿瘤组织的靶向性，另一方面红细胞膜表面所具有的躲避免疫系统识别的功能。综上，小鼠肿瘤部位荧光衰减曲线与活体成像观察结果基本一致，均说明TRMDI具有更为明显的肿瘤组织滞留效应和肿瘤靶向效应。由此表明，TRMDI由于表面的TREV修饰，显著提高了其肿瘤靶向性和体内长循环时间，最终提高了药物在肿瘤部位的蓄积量，这都有利于高效递送DOX与ICG发挥协同治疗作用。
试验例4仿生纳米递送系统的安全性验证
4.1 TRMDI对机体的生物安全性评价
4.1.1试验方法
将15只Balb/c雌性小鼠，随机分为3组，每组5只，分别为 PBS组、TREV囊泡组(对比例4)和TRMDI颗粒组(实施例 3)。实验中采用尾静脉给药的方式，各组注射剂量均为100μL，其中给药组100μL溶液中分别分别包含104个TREV囊泡和以104个TREV囊泡制备得到的TRMDI颗粒。每5天注射一次，共给药 3次，连续监测16天。在此过程中，隔天观测小鼠体重变化，绘制体重变化曲线；在第16天对实验鼠腹腔注射戊巴比妥那进行麻醉，然后采用眼球取血的方式，进行全血的生化检测，测定血清中的ALT、AST、CRE和BUN指标，分析各组的肝肾功能；解剖小鼠，对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行病理学检查。
4.1.2结果与讨论
生物安全性是指外源物质进入机体后，对机体有无明显的刺激性或者是毒性，对脏器有无明显损伤。在本试验中，我们对健康小鼠给予不同的药物，通过对体重变化的监测、肝肾功能的评价、脏器的组织病理学分析，初步评价仿生可视化纳米递药颗粒TRMDI 的生物安全性。首先考察给药后小鼠的体重变化，体重变化记录见图8A，结果提示，与PBS对照组相比，注射了TREV囊泡和 TRMDI颗粒组的小鼠体重无明显变化。通过ELISA检测的方法，对给药后小鼠进行肝功能检测，ALT和AST在血清中的含量结果见图8B；对小鼠进行肾功能检测，CRE和BUN在血清中的含量结果见图8C。结果显示，与PBS对照组相比，注射TREV囊泡和TRMDI颗粒并未对小鼠的肝、肾功能产生影响。小鼠主要脏器的组织病理学分析结果见图9，给药组与对照组相比，主要脏器形态结构无明显变化，可见正常的细胞核形态，未出现水肿、皱缩、坏死等异常形态。这些实验结果均表明TREV囊泡以及利用TREV囊泡制备的TRMDI颗粒安全无毒。
试验例5仿生纳米递药系统体内协同抗肿瘤作用评价
5.1 Balb/c雌性小鼠乳腺癌皮下荷瘤模型的构建
将4T1细胞复苏并稳定传代，当细胞生长至对数期，以 0.125％的胰酶在37℃条件下消化90s，轻轻吹打，收集消化后的细胞，1000rpm低速离心2min，用无菌生理盐水冲洗3遍，镜下计数，调整浓度为1×105个/mL的单细胞悬液。采用直接注射细胞悬液的方法，在Balb/c雌性小鼠腹股沟处的脂肪垫上注射1×104个细胞，完成皮下造模过程。注射完成后，将小鼠置于屏障中继续饲养，隔天观察，并测量肿瘤的长度(L)和宽度(W)，计算肿瘤体积。肿瘤体积按如下公式计算：V(mm3)＝(L×W2)/2
5.2 TRMDI体内光热效应考察
5.2.1试验方法
根据TRMDI在小鼠体内的代谢过程，发现在给药后的12h肿瘤组织中ICG蓄积量最多，选择该时间点进行激光照射，并用红外热成像仪记录肿瘤组织的温度变化情况，评价MDI(对比例1)、 TMDI(对比例2)、RMDI(对比例3)和TRMDI(实施例3)在体内的PTT效应。具体实验方法如下：配制MDI(对比例1)、 TMDI(对比例2)、RMDI(对比例3)和TRMDI(实施例3)溶液(ICG浓度为400μg/mL)；采取尾静脉给药方式，小鼠给药剂量按照体重计算ICG 2mg/kg。在给药后的第12h，腹腔注射戊巴比妥那对小鼠进行麻醉，固定小鼠和激光器，使用808nm近红外激光，功率2.5W/cm2，对肿瘤组织持续照射8min，每1min进行红外成像记录，获得温度变化情况，并绘制温度变化曲线。
5.2.2结果与讨论
基于TRMDI优异的肿瘤组织蓄积能力，我们进一步考察 TRMDI在乳腺癌荷瘤小鼠体内的光热效应。荷瘤小鼠随机分为5 组，尾静脉给药，以PBS/L为对照组，给药组分别为MDI/L、TMDI/L、RMDI/L和TRMDI/L。之前观察到注射药物12h后，肿瘤组织中ICG蓄积量达到最多，因此选择该时间点对肿瘤部位用 808nm近红外激光照射，功率2.5W/cm2，持续照射8min，每1 min进行红外成像记录，获得温度变化情况，并绘制温度变化曲线，评价TRMDI的体内光热效应。结果如图10A和10B，激光照射后，PBS/L组的肿瘤组织几乎无明显温度变化，说明单独的近红外光的照射对温度变化影响不大，不会产生光热治疗效果；而 MDI/L、TMDI/L、RMDI/L和TRMDI/L组的肿瘤组织温度显著升高，且出现时间依赖性，具体表现为持续光照0-4min时，各给药组均快速升温，4min之后升温速度趋于平缓，其中TRMDI/L组升温最快，其温度明显高于其它给药组，5min时温度达到55.3℃； TMDI/L组温度略低于TRMDI/L，5min时温度达到53.8℃； RMDI/L略低于TMDI/L，5min时温度达到51.2℃，之后一直维持在51.1℃；而MDI组是给药组中温度上升幅度最小一组，最高温度升至48.9℃。以上结果表明，TRMDI在小鼠体内具有良好的光热性能，和其他实验组相比较光热作用最强，提示了其在肿瘤光热治疗方面的应用潜力。
5.3 TRMDI体内抗肿瘤效应评价
5.3.1动物模型体内肿瘤生长情况评价
5.3.1.1试验方法
取50只Balb/c荷瘤小鼠，当肿瘤体积约为200mm3时，将其分为5组，进行给药治疗。具体分为PBS组，MDI(对比例1)/激光照射组、TMDI(对比例2)/激光照射组、RMDI(对比例3)/激光照射组与TRMDI(实施例3)/激光照射组(命名为PBS、 MDI/L、TMDI/L、RMDI/L与TRMDI/L)。各组均采取尾静脉注射方式，给药剂量按照体重计算DOX 1.5mg/kg、ICG 2mg/kg；在给药后的第12h，腹腔注射戊巴比妥那对小鼠进行麻醉，固定小鼠和激光器，使用808nm近红外激光，功率2.5W/cm2，对肿瘤组织持续照射5min。光照结束后，将小鼠置于屏障中以相同条件继续饲养，每3天按照同样的方法治疗一次，共治疗2次，观察治疗效果。对实验组小鼠的体重和肿瘤体积进行监测，连续测量16天，每 2天记录一次，详细记录小鼠的体重、肿瘤组织的长和宽，计算肿瘤体积，绘制小鼠的体重变化和肿瘤组织体积变化曲线。另外，在治疗结束后，每组随机取5只小鼠，麻醉处死，剥离肿瘤组织并拍照，称取瘤组织重量，根据瘤组织重量绘制曲线。同时，各组剩余小鼠继续饲养，使其自然生存，对各组的治疗后生存期进行考察，绘制生存曲线。
5.3.1.2结果与讨论
TRMDI的体内协同抗肿瘤效应评价见图11，将荷瘤小鼠分为 5组，当肿瘤体积约为200mm3时，进行给药治疗，具体分为PBS 组/激光照射组，MDI/激光照射组、TMDI/激光照射组、RMDI/激光照射组与TRMDI/激光照射组(命名为PBS/L、MDI/L、 TMDI/L、RMDI/L与TRMDI/L)。各组均采取尾静脉方式给药，给药12h后，使用808nm近红外光对肿瘤组织局部照射，每3天治疗一次，共治疗2次，治疗方法见图11A。在治疗过程中，每2 天称量小鼠体重，小鼠体重变化曲线见图11B，结果显示，与PBS 组相比，各治疗组小鼠体重变化无显著性差异，从一定程度上表明 MDI、TMDI、RMDI和TRMDI颗粒没有明显的体内毒性，生物安全性较好。小鼠原位瘤的体积变化情况见图11C，在16天的过程中，PBS/L组肿瘤体积快速增长，瘤组织体积是最初的7.5倍，这表明单独使用近红外激光照射不能对肿瘤起到消融作用。各给药组的肿瘤体积在治疗开始的6天中均增殖缓慢，但在治疗结束后，出现明显的复发差异。给药后的第16天观察，MDI组肿瘤增殖速度最快，复发明显，瘤组织体积是最初的4.1倍，这可能是因为MDI在体内的滞留时间短而导致化疗/光热治疗的效果均有限；TMDI和 RMDI组的治疗效果均有所增强，瘤组织体积是最初的2.2倍；而经过TREV膜修饰的TRMDI颗粒抑瘤效果最明显，瘤组织体积与最初相比变化不明显，仅为287.6mm3，这说明药物在肿瘤组织中的蓄积量直接影响治疗效果。TRMDI在药物递送过程中兼具有肿瘤组织靶向性和长循环性能，使得药物在肿瘤组织中蓄积量最多，最终实现了有效的化疗/光热治疗的协同治疗，对肿瘤细胞的杀伤作用强。治疗结束后，取肿瘤组织，获得离体组织图片并称量瘤组织重量，结果见图11C和E，与体积变化一致。
5.3.2病理学组织切片染色分析
5.3.2.1试验方法
病理学组织处理过程分为固定、脱水、包埋、切片和染色。具体实验方法如下。
固定：治疗结束后，麻醉处死小鼠，剥离肿瘤组织，在生理盐水中漂洗，去除血渍，将组织切成1cm3的块状，泡入4％中性多聚甲醛缓冲液中固定过夜，取出后切成直径0.6cm大小的方块，放入包埋盒中，标记实验组名称和相应的组织类型，用自来水冲洗包埋盒。
脱水、包埋、切片：将包埋盒取出，甩干上脱水机，设置梯度脱水程序，完成逐级脱水处理；次日，将包埋盒取出，甩干，依次在二甲苯Ⅰ中浸泡25min、二甲苯Ⅱ中浸泡25min，进行透明处理；之后进行石蜡包埋，制备4μm厚度的石蜡切片。
H&E染色方法如下：将组织切片进行脱蜡、水化处理，完成苏木精染色、自来水中漂洗、0.5％伊红染2min、自来水漂洗、蒸馏水漂洗的过程，显微镜下观察染色效果；而后进行组织脱水处理，滴加中性树胶封片，加盖玻片后在显微镜下观察拍照。
Ki67染色方法如下：取处理过的白片，按照Ki67试剂盒操作步骤对各组切片进行Ki67染色，镜下观察拍照，记录肿瘤组织切片中的组织坏死情况。
对实验组进行肿瘤组织剥离，以生理盐水漂洗去除血渍，按照实验分组进行排列、拍照；利用电子天平称取瘤组织重量。
5.3.2.2结果与讨论：
为了进一步评价TRMDI的治疗效果对组织肿瘤性坏死和增殖能力的影响，对肿瘤组织进行H&E和ICH病理学检查，染色结果如图12所示。PBS/L组细胞形态完好，核染色明显，几乎不引起细胞坏死。MDI(对比例1)/L、TMDI(对比例2)/L、RMDI(对比例3)/L和TRMDI(实施例3)/L各治疗组则出现不同程度的细胞形态消失、核固缩、核碎裂和核溶解现象。TRMDI/L组几乎全部处于核碎裂和核溶解状态，坏死的面积明显大于其他治疗组，这与抑制肿瘤生长的结果基本一致，说明TRMDI组对肿瘤组织具有更强的杀伤作用，能诱导肿瘤组织大面积坏死。同时，对肿瘤组织进行CyclinD1和Ki67染色，考察肿瘤组织的增殖能力。PBS/L组的肿瘤热区阳性率大约为95.2％，MDI/L、TMDI/L、RMDI/L和 TRMDI/L组的肿瘤热区的阳性率均有所降低，TRMDI/L的肿瘤热区阳性率为15.8％，在所有实验组中最低，说明TRMDI组对肿瘤组织的增殖抑制作用最明显，这与后期肿瘤大小变化的情况一致。
上述结果表示，TRMDI有效实现了化疗与光热治疗的联合治疗，对局部肿瘤起到了明显的消融。接下来，各给药组荷瘤小鼠自然生存，对治疗后生存期进行考察，绘制生存曲线。结果如图13 所示，PBS/L组小鼠28天内全部死亡；MDI/L组小鼠在35天内全部死亡，TMDI/L组和RMDI/L组小鼠分别在41天和45天内全部死亡；TRMDI/L组小鼠在第52天全部死亡。以上结果表明，仿生可视化纳米递药系统能有效实现化疗与光热治疗的联合治疗，该治疗方法可以适当延长荷瘤小鼠的生存期。
5.4 TRMDI诱发乳腺肿瘤肺转移风险性的影响考察
5.4.1试验方法
将25只Balb/c雌性荷瘤小鼠，随机分为5组，每组5只，分别为PBS组、4T1 EV外泌体组(对比例4)、TEV囊泡组(对比例5)、TREV囊泡组(对比例6)和TRMDI颗粒组(实施例 3)。实验中采用尾静脉注射给药的方式，各组注射剂量均为100 μL，其中给药组100μL溶液中分别包含104个4T1 EV外泌体，和以104个4T1 EV外泌体制备得到的TEV囊泡、TREV囊泡、 TRMDI颗粒。每5天给药一次，共给药3次，在第16天对实验鼠腹腔注射戊巴比妥那处死，然后摘取肺部组织，肉眼观察，计转移灶数量，进行统计分析。
5.4.2结果与讨论
由于肿瘤源性外泌体在肿瘤组织细胞间通讯中发挥重要作用，因此以肿瘤外泌体作为生物纳米材料必须考虑它诱发机体肿瘤发生和转移的风险。乳腺癌的远端转移以肺转移最为常见，对皮下荷瘤小鼠尾静脉注射同源肿瘤细胞是诱发乳腺癌肺转移的造模方法。我们通过对皮下荷瘤小鼠尾静脉注射PBS、4T1 EV外泌体、TEV囊泡、TREV囊泡以及TRMDI颗粒，来评价其诱发乳腺癌肺转移的风险。在给药后的第16天，解剖荷瘤小鼠获得肺部组织，肉眼观察，计转移灶数量。如图14所示，注射4T1 EV组，肺部转移灶明显增多，是PBS组的5.0倍；TEV囊泡、TREV囊泡以及TRMDI 颗粒组和PBS对照组相比，无显著性差异，表明TEV囊泡、TREV 囊泡以及TRMDI递药系统均无明显诱发乳腺癌肺转移的风险。
综上所述，本发明提供的TRMDI在肿瘤组织中可以高浓度蓄积，光照5min后，肿瘤组织局部温度达到55.3℃，产生了明显的光热作用。因为肿瘤是具有一定厚度的组织，随着组织深度的增加近红外光的能量也会降低，因而光热疗法对中心部位的肿瘤组织治疗作用有限。TRMDI所共载的DOX在肿瘤部位的释放对残存细胞产生杀伤和生长抑制作用。在后续的体内抗肿瘤效果评价时，观察到TRMDI能显著抑制原位肿瘤生长，将抑制率提升至90.2％，荷瘤小鼠生存期由28天延长至52天。可见，TRMDI所介导的协同治疗对原位肿瘤有高效的抑制作用。

Claims (12)

1.一种仿生纳米递送系统，其特征在于，所述仿生纳米递送系统为核壳结构，其中，所述核为纳米颗粒，包括介孔二氧化硅纳米载体和吲哚菁绿（ICG）、阿霉素（DOX）两种功能物质；
所述壳为复合囊泡（TREV），由肿瘤外泌体囊泡（TEV）和红细胞膜囊泡（REV）通过膜融合技术获得。
2.一种如权利要求1所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）纳米载体的制备；
（2）将纳米载体和功能物质进行组装得到纳米颗粒；
（3）复合囊泡的制备；
（4）将纳米颗粒和复合囊泡进行组装即得到仿生纳米递送系统。
3.根据权利要求2所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述复合囊泡的制备方法包括以下步骤：
（1）肿瘤外泌体提取及囊泡制备:将培养好的4T1细胞经梯度离心获得4T1外泌体（4T1EV），然后将所得到的外泌体重悬、充分混匀，在冰水浴条件下超声后置于脂质体挤压器内过膜挤出获得4T1外泌体囊泡TEV；
（2）红细胞的提取及囊泡制备：将抗凝全血在4 ℃下离心得到下层红细胞，然后将红细胞经重悬-离心-去除上清液操作3-4次后获得压积红细胞。随后将压积红细胞与低渗溶液混合均匀，经过反复低渗3-4次后获得血影细胞膜。将所得到的血影细胞膜重悬，充分混匀后，置于脂质体挤压器过膜挤出，获得红细胞囊泡REV；
（3）复合囊泡的制备：将外泌体与红细胞囊泡分别溶于超纯水中，反复吹打充分混匀，冰水浴超声后将溶液置于脂质体挤压器并在冰浴条件下过膜挤出，获得“肿瘤外泌体-红细胞”复合纳米囊泡TREV。
4.根据权利要求3所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤（1）-（3）中，所述超声的时间均为20-40s，所述超声的频率均为45-60KHz，所述超声的功率均为90-110W；
5.根据权利要求4所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述超声的时间均为30s，所述超声的频率均为52KHz，所述超声的功率均为100W。
6.根据权利要求3所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤（1）-（3）中，所述过膜挤出步骤均需通过400目和200目聚碳酸酯膜进行挤出；
在步骤（1）和步骤（2）中，所述过膜挤出的次数均为15-25次；
在步骤（3）中，所述过膜挤出的次数为40-60次。
7.根据权利要求3所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述外泌体与红细胞囊泡的数量比为1-3：5。
8.根据权利要求7所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述外泌体与红细胞囊泡的数量比为2：5。
9.根据权利要求2所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，将纳米颗粒和复合囊泡进行组装的具体方法包括以下步骤：将获得的复合囊泡与纳米颗粒充分混合，经冰浴超声后再通过脂质体挤压器，即可制得仿生纳米递送系统混悬液。
10.根据权利要求9所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述冰浴超声的时间为20-40s，所述冰浴超声的频率为45-60KHz，所述冰浴超声的功率为90-110W。
11.根据权利要求10所述的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述冰浴超声的时间为30s，所述冰浴超声的频率为52KHz，所述冰浴超声的功率为100W。
12.根据权利要求1所述的仿生纳米递送系统在制备治疗肿瘤药物方面的应用。
CN202210068602.5A 2022-01-20 2022-01-20 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用 Active CN114209653B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210068602.5A CN114209653B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210068602.5A CN114209653B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114209653A CN114209653A (zh) 2022-03-22
CN114209653B true CN114209653B (zh) 2022-12-02

Family

ID=80708544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210068602.5A Active CN114209653B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114209653B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114934010B (zh) * 2022-07-05 2023-06-27 中国人民解放军空军军医大学 红细胞膜在增加外泌体产量中的应用
CN115252580B (zh) * 2022-08-05 2024-03-19 苏州大学 一种载药红细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
CN115969811A (zh) * 2022-12-19 2023-04-18 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 一种肿瘤靶向的光热光动力联合治疗平台的制备方法及其产品
CN117045607B (zh) * 2023-07-13 2024-05-31 广东医科大学 一种仿生茶多酚纳米颗粒的制备方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111000822A (zh) * 2019-11-11 2020-04-14 沈阳药科大学 阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其用途
WO2020112694A1 (en) * 2018-11-26 2020-06-04 Arytha Biosciences Llc Nanoparticles containing cellular membrane and uses thereof
CN111603454A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020112694A1 (en) * 2018-11-26 2020-06-04 Arytha Biosciences Llc Nanoparticles containing cellular membrane and uses thereof
CN111000822A (zh) * 2019-11-11 2020-04-14 沈阳药科大学 阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其用途
CN111603454A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tumor Exosome Mimicking Nanoparticles for Tumor Combinatorial Chemo-Photothermal Therapy;Ran Tian,et al.;《Front Bioeng Biotechnol.》;20200831;第8卷(第1010期);第1-11页 *
天然膜仿生递药系统在肿瘤治疗中的应用进展;田然等;《中国肿瘤临床》;20211231;第48卷(第13期);第690-694页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114209653A (zh) 2022-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114209653B (zh) 一种仿生纳米递送系统及其制备方法和应用
CN108543074B (zh) 一种用于肿瘤治疗的外泌体包裹的纳米载药系统及其制备
CN113456613B (zh) 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用
CN108451929B (zh) 一种包载固相内核的重组脂蛋白及其制备和应用
CN112494495B (zh) 一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法
Park et al. Dissolving microneedles delivering cancer cell membrane coated nanoparticles for cancer immunotherapy
CN113952461B (zh) 一种仿中性粒细胞纳米递药系统及其制备方法和应用
CN112999153B (zh) 载化疗药物/光敏剂的纳米胶束及其制备方法和应用
CN114259477B (zh) 一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用
CN113633625B (zh) 一种杂膜负载氧化磷酸化抑制剂的纳米药物及其制备方法
CN106177950A (zh) 一种包金纳米棒、其制备方法及应用
CN111450252A (zh) 一种用于靶向堵塞肿瘤血管的药物及其制备方法与应用
Zhang et al. Cell membrane-coated human hair nanoparticles for precise disease therapies
CN111228222B (zh) 纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用
CN115089734B (zh) 载促吞噬肽的碳化MOFs纳米粒和制备方法和在视网膜母细胞瘤的成像和治疗中的应用
CN115804842B (zh) 一种达卡巴嗪纳米微针制剂及其制备方法和应用
Zhang et al. Regulation of CTLs/Tregs via Highly Stable and Ultrasound‐Responsive Cerasomal Nano‐Modulators for Enhanced Colorectal Cancer Immunotherapy
CN110898231A (zh) 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用
CN111298116B (zh) 多肽载药温敏脂质体及其制备方法和应用
Liu et al. Study on biomimetic nano tumor targeted delivery system for chemotherapy-laser immunotherapy
CN111317720A (zh) 一种模拟白细胞的普朗尼克-脂质纳米杂合递药载体及其应用
CN115252580B (zh) 一种载药红细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
CN111012922B (zh) 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法
CN113244172B (zh) 一种siRNA和抗癌药靶向共递送系统及其制备方法和应用
Li et al. Lung-targeted Macrophage Biomimetic Nanocarriers Based on Platycodon Grandiflorum Polysaccharides for Calming Cytokine Storm in Pneumonia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant