CN111012922B - 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 - Google Patents

一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111012922B
CN111012922B CN201911238733.8A CN201911238733A CN111012922B CN 111012922 B CN111012922 B CN 111012922B CN 201911238733 A CN201911238733 A CN 201911238733A CN 111012922 B CN111012922 B CN 111012922B
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
peg
colorectal cancer
nano
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911238733.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111012922A (zh
Inventor
华东
茆勇
尹健
胡静
仇志超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Affiliated Hospital of Jiangnan University Wuxi Fourth Peoples Hospital
Original Assignee
Jiangnan University
Affiliated Hospital of Jiangnan University Wuxi Fourth Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University, Affiliated Hospital of Jiangnan University Wuxi Fourth Peoples Hospital filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201911238733.8A priority Critical patent/CN111012922B/zh
Publication of CN111012922A publication Critical patent/CN111012922A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111012922B publication Critical patent/CN111012922B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法，属于生物医药领域。本发明将聚乙二醇修饰的GO作为运载化疗药物五氟脲嘧啶的载体形成5‑FU/GO‑PEG；并可以在其表面修饰肿瘤细胞表皮生长因子肽(GE11)，得到5‑FU/GO‑PEG‑GE11。本发明药物的生物安全性已在细胞水平和小鼠体内被认证评估，且在体外实验中证实该纳米载体为酸性pH触发药物释放，并验证具有药物输送能力和光热‑化疗的协同作用；此外，还在皮下实体瘤小鼠模型中进行了体内行为示踪和治疗功效评定，有望在临床应用上发挥巨大作用。

Description

一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，随着我国生活水平的提高，饮食结构的改变，结直肠癌的发病率迅速增长。全球每年都有几百万的新病例，几十万的死亡病例，在男女性癌症中，分别位居第三和第二位。因此提高结直肠癌的治疗效果是诸多学者研究的重点。目前治疗结直肠癌的方法主要分为以下4种方式：手术治疗、放射疗法、化学药物疗法、生物疗法。然而单纯的手术治疗现已难以满足癌症患者长年存活的欲望，随着对肿瘤生物学特性的深入了解，
手术联合辅助放化疗和生物靶向治疗的疗效在结直肠肿瘤治疗中显出了明显的优势，使人们对结直肠肿瘤治疗观念发生了明显的改变。进而产生了一种新型的治疗方式，
通过纳米材料装载肿瘤药物靶向治疗结直肠癌，其定位精准，减少化疗药物对健康组织的损伤，成为众多学者的研究热点。
目前五氟尿嘧啶(5-FU)治疗结直肠癌中，其在体内药物的半衰期很短，三个小时就消失了，且不具备靶向治疗的效果。因此，构建一种靶向且能够具有具有较长半衰期的治疗结直肠癌药物是有非常广阔的应用前景。
纳米药物载体主要可以分为无机纳米粒子(包括碳纳米材料、金属及其氧化物纳米材料等)、有机纳米粒子(包括聚合物纳米粒子、脂质体、树状分子等)以及杂化纳米粒子。由于氧化石墨烯具有较大的比表面积，优良的导电性能，表面官能团丰富，易于表面修饰，可以作为一种新型的纳米载体运载肿瘤药物、RNA、小分子肽链等。可以静脉给药、口服、肠内给药、肠外注射或通过动脉进行局部的介入治疗，在药物作用部位附近释放其药物减少对健康组织的毒副作用。并且其在电催化、检测、疾病诊断及治疗等领域应用广泛，因此成为大多学者的研究热点。
目前还未有氧化石墨烯纳米载体在用于结直肠癌的治疗方面的应用。因此，如何将上述多种功能集中于同一种纳米载体用于结直肠癌靶向治疗是一种挑战，同时也具有非常广阔的市场前景。
发明内容
为了实现上述多种功能集中在一种靶向治疗结直肠癌的药物的目的，本发明提出了一种新型整合治疗系统，多个功能性片段被整合在一个生物相容性和安全性良好的载体中。首先使用Hummers法合成氧化石墨烯纳米片层结构，通过羧基化反应制备带有大量羧基基团的氧化石墨烯纳米片层，π-π堆积修饰抗肿瘤药物五氟尿嘧啶，通过酰氨反应，在氧化石墨烯纳米片层表面修饰具有稳定效应的聚乙二醇和具有示踪效果的EGFR受体靶向肽GE11-FITC(FITC-YHWYGYTPQNVI)，得到最终的氧化石墨烯纳米复合材料。本发明药物是将将5-FU装载到氧化石墨烯纳米材料山后延长了其半衰期，从而延长了药物疗效。达到提高肿瘤治愈率的目的。
其中，靶向通路EGFR(表皮生长因子受体)主要位于细胞膜上，是一种蛋白络氨酸激酶受体(RTK)。在实体肿瘤中EGFR高表达或异常表达。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞的迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。
GE11(肿瘤细胞表皮生长因子肽)是一种针对EGFR通路的特异性靶向肽，通过噬菌体肽库筛选技术获得的小分子多肽，由11个氨基酸组成(YHWYGYTPQNVI)，与大分子天然配体相比，其相对分子质量小，免疫原性低；易扩散及靶向性高，可以满足靶向肿瘤的要求；并对肿瘤细胞的生长没有影响。
本发明药物的生物相容性和细胞毒性已被严格评估。在体外研究了纳米片层的稳定性及酸性pH触发药物释放，在HCT-116和SW-620细胞系中都研究药物输送以及药物/光热治疗的协同作用。此外，在皮下实体瘤模型中都进行了体内行为示踪和治疗功效评定。
本发明的第一个目的是提供一种用于靶向治疗结直肠癌的药物，所述药物利用纳米载体材料作为载体，负载五氟尿嘧啶(5-FU)制得；所述纳米载体材料的制备方法包括如下步骤：
(1)制备氧化石墨烯纳米片层材料；
(2)将步骤(1)制得的氧化石墨烯配制成水悬浮溶液，加入碱和羧酸化试剂，制得具有羧基修饰的石墨烯水悬浮溶液；
(3)在步骤(2)所得的石墨烯水悬浮溶液中加入两端修饰氨基的聚乙二醇(PEG)进行缩合反应，反应完成后即得纳米载体材料。
在本发明的一种实施方式中，纳米载体材料与5-FU的质量比为(2.5-4)：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中两端修饰氨基的聚乙二醇(PEG)与石墨烯水悬浮溶液的质量比(4-4.5)：1。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米载体材料的结构如式(1)所示：
Figure BDA0002305595060000031
其中，n为1-20；氧化石墨烯为纳米片层结构。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)还包括：加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再加入质量比1：(4-4.5的两端修饰氨基的聚乙二醇(PEG)进行缩合反应。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)还包括：反应完全后，用盐酸调pH为中性，离心水洗，透析。
在本发明的一种实施方式中，所述靶向治疗结直肠癌的药物的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002305595060000032
其中，
Figure BDA0002305595060000033
为抗肿瘤药物五氟尿嘧啶(5-FU)；式II中包含氧化石墨烯纳米片层结构；式II中包含两端氨基化修饰的α-氢-ω-羟基(氧-1,2-乙二基)的单体结构，n表示其聚合度，为1-20。
在本发明的一种实施方式中，所述靶向治疗结直肠癌的药物(5-FU/GO-PEG)的制备方法是在介质中，加入上述的纳米载体材料和抗肿瘤药物五氟尿嘧啶(5-FU)，混匀。
在本发明的一种实施方式中，所述靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法还包括将混匀后的体系在双蒸水中透析48h。
在本发明的一种实施方式中，纳米载体材料具有较大比表面积的氧化石墨烯纳米片层结构，羧基化反应使其表面带有大量羧基基团，再通过修饰两端氨基化的α-氢-ω-羟基(氧-1,2-乙二基)使其具有良好的稳定性；该纳米复合体系通过π-π堆积装载抗肿瘤药物五氟尿嘧啶；最后通过酰氨反应，制备具有示踪效果的EGFR受体靶向肽GE11(FITC-YHWYGYTPQNVI)，得到最终的氧化石墨烯纳米复合材料；其中，按照质量分数计，所述的纳米复合体系中载有五氟尿嘧啶的量约为25.66％；所述的应用于结直肠癌联合治疗的纳米复合体系输送系统的粒径约为250nm。
本发明的第二个目的是提供一种光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物，所述药物的是将示踪分子FITC及靶向分子多肽GE11通过酰胺反应引入到上述用于靶向治疗结直肠癌的药物中，结构如式(III)所示：
Figure BDA0002305595060000041
其中，式III中包含氧化石墨烯纳米片层结构；
Figure BDA0002305595060000042
为具有示踪效果的表皮生长因子受体(EGFR)受体靶向肽GE11(FITC-YHWYGYTPQNVI)；
Figure BDA0002305595060000043
为抗肿瘤药物五氟尿嘧啶(5-FU)；n为1-20。
在本发明的一种实施方式中，所述光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法包括如下步骤：
(1)上述的靶向治疗结直肠癌的药物5-FU/GO-PEG加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再加入GE11水溶液，室温下反应；
(2)反应完全后，在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物。
在本发明的一种实施方式中，光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法包括如下步骤：
步骤一、目标纳米复合材料GO-PEG的制备：
1)制备GO的水悬浮液；
2)加入氢氧化钠和氯乙酸制备羧基化的GO；
3)超声处理3h后，搅拌过夜；
4)用盐酸调节PH为中性，8000rpm 10min离心洗涤2-3次，透析48h，得到GO-COOH纳米片层材料；
5)制备GO-COOH的水悬浮液；
6)加入质量比1：4的两端修饰氨基的聚乙二醇(PEG)，室温搅拌2h；
7)加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜；
8)用盐酸调PH为中性，离心水洗，透析96h。成功制备GO-COOH-PEG纳米片层材料；
步骤二、靶向治疗系统纳米材料的制备：
1)步骤一所述的目标纳米复合材料制备成GO-PEG水悬浮液；
2)在双蒸水中透析96小时,每隔6小时换水一次,制得纳米片层水溶液；
步骤三、载药靶向治疗系统纳米材料的制备：
1)步骤一所述的目标纳米材料和药物分别用超纯水溶解，混合搅拌48h；
2)混合溶液在双蒸水中透析48h,每隔6h换水一次,制得载药胶束溶液；
3)将聚合物胶束溶液经过2000kd截留分子膜，除去未负载的药物
步骤四、装载药物靶向治疗系统纳米材料的制备：
将步骤三中的载药5-FU/GO-PEG纳米材料水溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌2小时，再加入GE11水溶液，室温搅拌24小时，得到靶向纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11。
有益效果：
该纳米系统具有良好的生物相容性和微弱的细胞毒性。体外和体内均可达到较好的稳定性及酸性pH触发药物释放能力，在HCT-116和SW-620细胞系中都具有很好的药物输送以及药物/光热治疗的协同作用。此外，在皮下实体瘤小鼠模型中的体内行为示踪显示很好的结直肠肿瘤靶向性和明显的肿瘤治疗功效。
附图说明
图1(A)GO纳米片层结构的TEM图像，比例尺：100nm；(B)GO纳米片层结构的AFM图像；(C)5-FU/GO-PEG，5-FU/GO-PEG-GE11和EGFR靶向肽GE11的FTIR图像；(D)GO-PEG-5-FU-GE11在37℃，不同PH条件下5-FU的累积释放曲线。
图2为药物的性能结果图，其中(A)为AFM的数据分析曲线；(B)为GO，GO-COOH，GO-PEG的FTIR图像；(C)为氧化石墨烯纳米复合材料的Zeta电位；(D)为肿瘤药物负载效率；(E)为氧化石墨烯纳米复合材料的动态光散射粒径分布图；(F)为GO-PEG在水，PBS(PH＝7.4)或含有10％FBS的DMEM培养基中的长期稳定性效果图。
图3(A)暴露于808nm激光下不同浓度GO的水分散体在2W·cm-2功率下，10分钟的温度变化曲线；(B)GO溶液在各种功率强度下的温度变化曲线，浓度为1mg·mL-1；(C)在不同摩尔浓度的GSH与GO-PEG温育后GSH图的损失；(D)在不同时间在水浴中在30℃和50℃下测量的GSH图的损失。
图4(A)为GO，GO-PEG，5-FU/GO-PEG-GE11溶液在2W·cm-2的功率密度下的温度变化曲线，浓度为0.4mg·mL-1；(B)分别在水浴和NIR(近红外)808nm照射20分钟加热至50℃下GSH的损失图，GO-PEG的浓度为0.2mg·mL-1。
图5为HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞的流式结果图，细胞分别与不同浓度的5-FU/GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11孵育不同的时间。
图6为HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞与5-FU/GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11孵育6小时后的激光共聚焦显微镜图，绿色荧光来自FITC，蓝色荧光来自细胞核染料DAPI，标尺为25μm。
图7为Z-stack技术显示氧化石墨烯纳米复合材料5-FU/GO-PEG-GE11存在HCT-116细胞中的成像图，细胞核用DAPI染色显示为蓝色，细胞膜用Cell Mask deep redplasmamembrane stain染色显示为红色，纳米材料用FITC染色显示为绿色。
图8为HCT-116，SW-620人结肠直肠癌上皮细胞的细胞存活率，其中(A)各种浓度的GO-PEG纳米片孵育48小时；(B)孵育6小时后，用NIR 808nm照射5分钟，然后培养48小时；(C)用各种浓度的5-FU/GO-PEG-GE11纳米片孵育48小时的细胞的细胞活力；(D)培养6小时后，用NIR 808nm照射5分钟，然后培养48小时。
图9(A)为游离5-氟尿嘧啶孵育48小时的细胞的细胞活力变化图；(B)为GO、GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11的溶血实验结果图。
图10为HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞与5-FU/GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11和游离5-FU孵育48小时后的激光共聚焦显微镜图，其中绿色荧光来自Calcein-AM，红色荧光来自死细胞染料PI，标尺为250μm。
图11为注射氧化石墨烯纳米复合材料5-FU/GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11的皮下结直肠癌实体瘤小鼠器官的离体成像图。
图12为氧化石墨烯纳米载药体系在皮下结直肠癌实体瘤小鼠模型中的癌变组织抑制效果图，和不同处理组处理后小鼠肿瘤的体积变化及最后各组肿瘤组织的图片(***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与其他各组比较)。
图13为经处理的肿瘤组织的重量变化图；其中(A)在第18天处死小鼠后收集的各个肿瘤组织的重量变化图(***P<0.001，*P<0.05，与其他各组比较)；(B)不同处理组小鼠的平均体重变化图。
图14为小鼠肿瘤组织及各器官的H&E染色切片观察，其中(A)心；(B)肝；(C)脾；(D)肺；(E)肾；(F)结直肠；(G)小肠；(H)肿瘤(显微镜放大倍数为200X)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：纳米载体材料的制备
氧化石墨烯纳米片层的合成：
将0.25g石墨粉和0.125g硝酸钠，加入5.75mL浓硫酸中，反应1.5h。随后，将0.75gKMnO4缓慢加入到上述持续搅拌的混合溶液中。为维持溶液温度低于10℃，混合液放置在冰浴中反应2h。然后至于恒温水浴锅，38℃反应0.5h，逐滴加入11.5mL去离子水。移除恒温水浴至于98℃油浴锅中反应0.5h，保持磁力搅拌，此时溶液由紫色变为棕黄色。取出放入38℃油浴锅中，并加入35mL 38℃的温水进一步稀释，再逐滴加入3％H2O2 20mL，溶液保持棕黄色不变。趁热用去离子水9000rpm，15分钟离心洗涤三次，得到产物再用体积比为1：10的盐酸溶液再次9000rpm，15分钟离心洗涤三次，得到的产物用去离子水透析一周，后超声破碎10h得到氧化石墨烯纳米片层材料。
羧基化氧化石墨烯纳米片层的合成：
制备GO的水悬浮液(10mL,1mg·mL-1)，通过加入氢氧化钠(1.2g)和氯乙酸(1.0g)制备羧基化的GO，此反应在冰浴中进行。超声处理3h后，搅拌过夜。用盐酸调节PH为中性，8000rpm 10min离心洗涤2-3次，透析48h，得到GO-COOH纳米片层材料。
聚乙二醇修饰的氧化石墨烯纳米片层的制备：
制备GO-COOH的水悬浮液，加入质量比1：4的两端修饰氨基的聚乙二醇(PEG)，室温搅拌2h，后加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜。用盐酸调PH为中性，透析96h。成功制备GO-COOH-PEG纳米片层材料。
实施例2：靶向治疗结直肠癌的药物(负载五氟尿嘧啶(5-FU)的纳米复合材料5-FU/GO-PEG)的制备
制备成GO-PEG的水悬浮液，加入质量比1：2的化疗药物5-FU，超声处理40min后，室温搅拌24h，去离子水透析48h，除去未装载的5-FU，得到载药纳米复合材料5-FU/GO-PEG。经测量其载药量为25.66％(载体：5-FU＝3：1)，包封率为17.26。
载药纳米材料5-FU/GO-PEG载药量的测定：配置不同浓度的5-FU H2O溶液(0μg·mL-1、2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、10μg·mL-1、12μg·mL-1、14μg·mL-1、18μg·mL-1、20μg·mL-1)，使用UV-Vis测得其265nm处吸光度，并绘制标准曲线。平行实验三次。根据5-FU的标准曲线计算出一定体积5-FU/GO-PEG溶液中5-FU的含量，进一步换算出纳米材料的载药率和包封率。
计算公式如下：
载药量(DLC)(％)＝(实际装载上的五氟尿嘧啶的质量/纳米材料5-FU/GO-PEG质量)×100％
包封率(EE)(％)＝(实际装载上的五氟尿嘧啶的质量/添加五氟尿嘧啶的总质量)×100％。
实施例3：肿瘤细胞表皮生长因子肽(GE11)修饰的纳米复合材料5-FU/GO-PEG-GE11的合成
制备GO-PEG-5-FU的水悬浮液，加入0.3mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌4h，按照浓度比(1:1)加入适量的GE11-FITC靶向肽，搅拌过夜，透析12h，得到5-FU/GO-PEG-GE11纳米片层材料。
实施例4：纳米粒子形貌的表征
通过原子力显微镜测量GO纳米材料的形貌，粒径和分布状态。本实验使用抛光的云母片作为载体，云母片使用浓硫酸和30％双氧水按7：3的混合液在90℃下煮1h处理，烘干备用。将处理好的云母片用体积比为0.1％的APTES试剂浸泡1h，清水洗涤，滤纸擦干。称取一定质量的GO，配置成0.005mg·mL-1的水悬液，用制备好的GO水悬液浸泡处理好的云母片1h，清水洗涤，滤纸擦干，晾干即可测量。
通过透射显微镜测量GO纳米材料的形貌，粒径和分布状态。本实验使用铜网作为载体，将不同浓度的GO水悬液滴加到铜网上，室温自然干燥，即可测量。
结果分析：通过原子力显微镜观察氧化石墨烯的片层厚度，图中显示氧化石墨烯均匀分布于云母片上，纳米粒径在100nm左右。在选定范围内，根据氧化石墨烯片层厚度的数据分析，显示其平均厚度为1.23nm左右。通过透射电镜可以看出GO是薄片层结构，且纳米粒径为111nm左右。
实施例5：纳米粒子以及药物的径粒分布的动态光散射(DLS)表征
将制备好的纳米材料GO，GO-COOH，GO-PEG以及装载好肿瘤药物的5-FU/GO-PEG和装载好EGFR靶向肽的5-FU/GO-PEG-GE11分散在水溶液中，利用动态光散射技术进行纳米粒径和电动电势(zeta电势)的检测分析。
结果分析：通过动态光散射DLS进行径粒检测，GO在水溶液中稳定存在，其纳米粒径在150nm左右，羧基化修饰后GO-COOH的纳米粒径在145nm左右，没有发生较大的变化。经过聚乙二醇修饰的GO-PEG的纳米粒径在155nm左右。装载肿瘤化疗药物5-FU后，其粒径增加至160nm左右。表皮生长因子靶向肽GE11是一条具有17个氨基酸的小分子肽，将其装载到氧化石墨烯纳米材料上，使其粒径扩大至250nm左右。纳米复合材料的分散性在逐渐提高。
通过动态光散射DLS进行zeta电势检测，GO具有-39mV的电位，聚乙二醇修饰后，GO-PEG的电势变为-13mV。装载5-FU和表皮生长因子靶向肽后，电势由-13mV降低至-25mV和-20mV左右，这可能是由于加载较多带有负电的5-FU和GE11，使得电势降低。因此，可以证明纳米复合材料的成功的合成，并且5-FU/GO-PEG-GE11纳米粒子的粒径复合药物递送体系的粒径范围，可以用以上纳米材料进行细胞水平的实验。
实施例6：傅里叶红外光谱(FT-IR)表征
将制备好的纳米材料GO，GO-COOH，GO-PEG，5-FU，GE11以及装载好肿瘤药物的GO-PEG-5-FU和装载好EGFR靶向肽的GO-PEG-5-FU-GE11分散在水溶液中，利用傅里叶红外光谱仪，根据光谱图的不同特征，可检定未知物的功能团、测定化学结构、观察化学反应历程、区别同分异构体、分析物质的纯度等。
结果分析：在氧化石墨烯纳米复合体系材料合成的过程中，FI-IR光谱可以用来表征氧化石墨烯及其化学修饰后的化学组成及结构。如图所示，3374.50cm-1处的峰代表羟基(OH)的伸缩振动，1626.51cm-1处的峰代表羟基的弯曲振动，这些峰证明氧化石墨烯中存在羟基和水分子。1716cm-1处的峰表征为边缘或缺陷处羧基中C＝O的存在，也表征酮基和醌基的存在。对氧化石墨烯进行羧基化和聚乙二醇修饰后，出现一个强峰2923cm-1是由于亚甲基中C-H的伸缩振动引起的。五氟尿嘧啶的特征吸收峰为1637cm-1，通过π-π堆积的方式，将5-FU加载到GO-PEG纳米片层上，5-FU/GO-PEG在1640cm-1处有相似的吸收峰，证明成功装载5-FU。表皮生长因子靶向肽GE11在1516cm-1处有特异吸收，纳米粒子5-FU/GO-PEG-GE11在1516cm-1处有相同的特异吸收，证明，表皮生长因子靶向肽GE11成功修饰。通过红外光谱证实氧化石墨烯纳米复合材料成功制备。
实施例7：氧化石墨烯纳米复合材料的光热效果测定
配置不同浓度的氧化石墨烯水溶液(0mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.8mg·mL-1、1.0mg·mL-1)，置于808nm激光器下，使用不同瓦数照射样品溶液(0.5W·cm-2、1.0W·cm-2、1.5W·cm-2、2.0W·cm-2)，记录10min中内的温度变化。平行实验三次。配置0.4mg·mL-1的GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11的水溶液，置于808nm激光器下，使用2.0W·cm-2功率照射，记录10min中内的温度变化。平行实验三次。
结果分析：为了探索氧化石墨烯复合材料的光热效果，在体外近红外激光照射下检测温度的变化。如图3所示，在相同的GO浓度下(1mg·mL-1)，使用不同功率照射，温度随着功率强度的增强逐渐升高，最高升至55.5℃左右。在相同的功率条件下(2W·cm-2)，对不同浓度的GO水溶液进行808nm激光照射，随浓度的增加，温度逐渐升高，最高浓度与最低浓度的温度差值为25.5℃。GO、GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11溶液在相同浓度(0.4mg·mL-1)下，使用相同的功率(2W·cm-2)照射10min，结果显示(图4A)，经过聚乙二醇修饰的GO纳米材料和装载上肿瘤药物并修饰上EGFR靶向肽的GO纳米材料，具有更好的光热效果，温度可升高至63.3℃左右。因此，说明氧化石墨烯纳米复合材料具有良好的光热效果。
实施例8：氧化石墨烯纳米材料对谷胱甘肽的氧化效果测定
谷胱甘肽的氧化实验，是通过Ellman’s实验证明的，所有实验在黑暗中进行，平行三次。5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是Ellman试剂，通过裂解其二硫键(-S-S-)与谷胱甘肽(GSH)中的硫醇基团(-SH)反应，得到黄色产物(2-硝基-5-硫代苯甲酸)。取225μL浓度为0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.8mg·mL-1、1.0mg·mL-1的GO碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)分别与225μL的0.4mM、0.8mM的GSH碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)混合在1.5mL的离心管中。将所有的离心管温浴并在室温下以150rpm的速度摇动2小时。阳性对照为1mM H2O2+GSH，阴性对照为GSH溶液。然后，向混合溶液中分别加入785μL的0.05M Tri-HCL(pH＝8)溶液和15μL含有100mM DTNB的碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)，12000rpm离心10分钟，分离出GO纳米材料。取200μL上清液加入到96孔培养板中，在酶标仪上记录412nm处的吸光度。使用水浴分别在30℃和50℃下通过Ellman法测定温度依赖性GSH的氧化，设定GO的浓度为0.2mg·mL-1。
通过Ellman法测定NIR 808nm激光诱导的GSH氧化，将含有浓度为0.2mg·mL-1GO纳米材料的225μL碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)与225μL的0.4mM GSH碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)混合在离心管中。然后，将离心管暴露与808nm激光下20分钟，通过电子温度计测得温度并保持在50℃。然后，向混合溶液中分别加入785μL的0.05M Tri-HCL(pH＝8)溶液和15μL含有100mMDTNB的碳酸氢盐缓冲溶液(50mM，pH＝8.7)，12000rpm离心10分钟，分离出GO纳米材料。取200μL上清液加入到96孔培养板中，在酶标仪上记录412nm处的吸光度。
结果分析：谷胱甘肽(GSH)作为生物体内一类含有巯基基团的生物分子，它能够防止氧化应激诱导的细胞成分受损，并且它已经被作为细胞中的氧化应激指标。因此，使用Ellman实验来测定由氧化石墨烯介导的活性氧(ROS)非依赖性氧化应激的可能性。如图所示，通过不同浓度的GSH与不同浓度的氧化石墨烯温育后，在GO浓度为0.2mg·mL-1，GSH浓度为0.4mM时有显著的GSH损失，损失率为43％左右。同时，进一步进行温度依赖性GSH氧化研究，以证实温度对GSH损失的影响。在相同GO浓度下，随着温度上升，GSH的损失增加。同时显示时间依赖性GSH损失，随着时间延长，GSH的损失率增加。在水浴120min，温度30℃时GSH损失7％左右，温度50℃时GSH损失37％左右。由此可见，温度影响GSH的氧化效果。GO纳米材料在808nm激光照射下，温度达到50℃时GSH的氧化水平比水浴50℃时高很多，GSH损失率可达到60％左右，由此可见，激光照射可提高GO纳米材料对GSH的氧化水平。
实施例9：载药纳米材料5-FU/GO-PEG的药物释放测定
在体外模拟载药纳米材料在体内的作用环境，考察其药物释放能力。配置pH＝7.4和pH＝5.6，0.01mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液。取4mL，0.4mg·mL-1的5-FU/GO-PEG的水溶液，置于截留分子量为2000的透析袋，将透析袋用封口夹夹紧，放入50mL离心管中。在离心管中加入40mL不同pH值的释放介质，使透析袋完全浸没在溶液中，加入搅拌子进行搅拌。在72h内的不同时间点进行取样，每次取离心管中的溶液500μL，再向离心管中添加相应pH值的释放介质。收集好的样品使用紫外分光光度计检测265nm处的吸光值，根据建立好的标准曲线，算出各个时间段五氟尿嘧啶的释放量，绘制出五氟尿嘧啶累积释放曲线图。平行实验三次。
结果分析：如图1D所示，在pH 7.4的介质中，5-FU为缓慢释放，在72h的释放过程中，只有10％的累计释放量。而在酸性介质中，在24h内为快速释放，累计达到66％，72h后累计释放量为82％。因此，可以证实5-FU/GO-PEG在中性生理条件下能稳定存在，有较低的药物释放，可减少对正常组织的毒副作用；在癌细胞偏酸的环境下，能快速释放化疗药物，达到治疗的目的。
实施例10：空白纳米材料GO-PEG稳定性的测定
将GO-PEG纳米材料分散在水溶液，磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)和DMEM中，利用动态光散射技术测定其在7天内纳米径粒的变化，进行稳定性的判定。实验平行三次。
结果分析：纳米材料的稳定性是衡量纳米载体最重要的性质之一，对于应用在生物、医药领域的纳米粒子需要稳定分散于一定浓度范围的盐溶液或培养基中。本实验，将氧化石墨烯纳米粒子分别稀释在水溶液，磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)和含有10％胎牛血清的高糖培养基(DMEM)中，使用纳米粒度仪(DLS)测定一周内的纳米径粒变化，结果如图2F所示，在7天内纳米径粒没有明显的变化，分散性也没有明显改变，说明氧化石墨烯纳米粒子可以稳定存在。
实施例11：药物5-FU/GO-PEG-GE11被细胞的吞噬情况考察——流式细胞仪检测
选取HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞，将HCT-116、SW-620细胞以每孔2×105的数目种植在24孔板上。经过36小时的孵育，细胞在孔板中稳定生长，使细胞密度超过90％，小心吸出培养基，用pH＝7.4的PBS洗涤细胞三次。然后加入浓度梯度为30μg·mL-1、60μg·mL-1、120μg·mL-1的纳米材料，纳米材料用培养基DMEM进行稀释。置于培养箱中孵育2、4、6、8、12小时，小心吸出纳米材料，PBS漂洗细胞三次，使用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3分钟，弃去上清，将聚集的细胞分散于PBS中，此操作过程重复三次，以除去残留的纳米材料，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞分散在PBS中，转移至流式管中，用流式细胞仪进行细胞的荧光检测。
结果分析：如图5所示，在相同孵育时间，浓度为60μg·mL-1时，两种结直肠癌细胞对于具有靶向肽GE11纳米材料的摄取量是非靶向纳米材料的2倍，表明具有明显的靶向效果。其中HCT-116细胞的摄取量明显高于SW-620细胞，这是由于纳米材料上的EGFR受体靶向肽GE11与结直肠癌细胞表面的EGFR受体特异性结合，加快纳米材料进入肿瘤细胞的时间。孵育6h时，两种结直肠癌细胞都对具有靶向肽的5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料摄取量大，对不具有靶向肽的5-FU/GO-PEG纳米材料摄取量少。证实，氧化石墨烯纳米材料在修饰GE11肽链后具有癌细胞特意靶向功能，可以快速进入癌细胞中。
实施例12：药物5-FU/GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11被细胞的吞噬情况考察——激光共聚焦实验
本实验选用HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞，将HCT-116、SW-620细胞以每孔8×104的数目种植在激光共聚焦小皿中，置于孵育箱中培养36小时，使细胞在小皿中稳定生长。吸出培养基，加入pH＝7.4的PBS漂洗细胞三次。然后加入用培养基DMEM稀释的纳米材料，5-FU/GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料的浓度为60μg·mL-1，置于孵育箱中孵育6小时。然后，小心吸出材料样品，PBS漂洗细胞三次，去除未进入细胞的纳米材料。每个小皿中加入1mL 4％多聚甲醛溶液，使细胞固定15分钟。吸出甲醛，PBS漂洗细胞三次，加入DAPI水溶液，孵育5分钟。吸出染液，PBS漂洗三次，每次10分钟。加入少量的PBS覆盖住细胞，使其保持湿润，避光放置，即可置于激光共聚焦显微镜下进行操作观察。
结果分析：如图6所示，在相同时间下，对于靶向纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11的摄取HCT-116细胞比SW-620细胞明显摄取的更多更快，细胞荧光强度更强。对于非靶向纳米材料5-FU/GO-PEG，HCT-116细胞和SW-620细胞具有微弱的摄取，细胞荧光强度不明显。这是因为癌细胞对纳米材料的摄取是通过与细胞膜表面的EGFR受体相结合，内吞进入细胞的。因此，该实验结果证实，5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料具有靶向HCT-116细胞的性能。
实施例13：Z-stack技术研究药物5-FU/GO-PEG-GE11在细胞中的分布
本实验选用HCT-116人结直肠癌上皮细胞，将HCT-116细胞以每孔8×104的数目种植在激光共聚焦小皿中，置于孵育箱中培养36小时，使细胞在小皿中稳定生长。吸出培养基，加入pH＝7.4的PBS漂洗细胞三次。然后加入用培养基DMEM稀释的纳米材料，5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料的浓度为60μg·mL-1，置于孵育箱中孵育6小时。然后，小心吸出材料样品，PBS漂洗细胞三次，去除未进入细胞的纳米材料。然后进行细胞膜染色，每个小皿加入200μL的Cell Mask deep red plasma membrane stain染料，避光孵育5分钟，小心吸出膜染料，使用PBS漂洗细胞三次。每个小皿中加入1mL4％多聚甲醛溶液，使细胞固定15分钟。吸出甲醛，PBS漂洗细胞三次，加入DAPI水溶液，孵育5分钟，吸出染液，使用PBS漂洗三次，每次10分钟。加入少量的PBS覆盖住细胞，使其保持湿润，避光放置，即可置于激光共聚焦显微镜下进行操作观察。
结果分析：从图7可以明显看出氧化石墨烯纳米复合材料的绿色荧光与人结直肠癌细胞HCT-116的细胞膜结合，并分布于细胞内部。由此可见，氧化石墨烯纳米复合载体是通过与细胞膜结合，吞噬进入细胞内部。
实施例14：纳米材料GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11的细胞毒性
纳米材料GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11的细胞毒性通过MTT(溴化噻唑蓝四氮唑)法测得，MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。使用酶联免疫检测550nm处的吸光值。本实验选取HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞，将HCT-116、SW-620细胞以每孔9×103的数目种植在96孔板上。细胞经过36小时的培养在孔板上稳定生长，生长密度大于90％，吸出培养基，加入用培养基DMEM稀释不同浓度的纳米材料，GO-PEG的浓度梯度为0μg·mL-1、0.1μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、25μg·mL-1、50μg·mL-1、70μg·mL-1、100μg·mL-1，5-FU/GO-PEG-GE11浓度梯度为0μg·mL-1、0.1μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、25μg·mL-1、50μg·mL-1、80μg·mL-1、100μg·mL-1，每个样品浓度平行6个复孔。37℃培养24小时，吸出材料，PBS洗涤三次，每孔加入100μL使用PBS稀释的0.5mg·mL-1的MTT溶液，孵育箱中避光孵育4小时。弃除MTT溶液然后，每孔加入100μL二甲基亚砜，混合均匀。酶联免疫检测550nm处的吸光值。其中，将没有纳米材料作用的细胞组作为细胞活性100％，将只有DMSO溶液没有细胞的孔作为空白对照组，以校正各孔的吸光值。计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(实验样品组吸光值/没有纳米材料作用的细胞组吸光值)×100％。
结果如图8所示，在孵育空白未载药材料的浓度至100μg·mL-1条件下，细胞活性仍能保持80％以上，表明纳米材料本身对细胞的毒性较低。而孵育了靶向载药的材料在100μg·mL-1孵育浓度下，对结直肠癌细胞有一定的抑制率，尤其对HCT116-细胞更为有效，达到了约70％，加光照后可接近80％，显示了较好的体外治疗效果和一定的靶向作用。
实施例15：空白纳米材料GO、GO-PEG和药物5-FU/GO-PEG-GE11的溶血毒性
将纳米材料溶于无酚红的DMEM培养基中，配置成浓度为0.1μg·mL-1、1μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、35μg·mL-1、60μg·mL-1、100μg·mL-1阳性对照为Triton×100，阴性对照为无酚红的DMEM培养基。先在24孔板中加入250μL不同浓度梯度的DMEM溶液，再添加250μL新鲜的羊血红细胞液，37℃孵育2小时。吸出溶液，10000rpm离心20分钟，取上清液200μL，至于酶标仪测得450nm处的吸光值，计算公式为：
溶血(％)＝(测试样品吸光值-阴性对照吸光值)/(阳性对照吸光值-阴性对照吸光值)×100％。
结果分析：在某些条件下，包括与水的直接接触，红细胞会膨胀至临界体积，然后细胞膜破裂，导致溶血现象，并且在外在物质存在的情况下会加剧红细胞溶血。血管中的血小板可以用过破坏的红细胞释放的二磷酸腺苷加速凝血甚至造成血栓。因此，红细胞的溶血是与材料的生物需相容性相关的一个重要的问题。本实验，测定从0.1-100μg·mL-1的GO、GO-PEG、5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料的溶血效果，结果如图9所示，浓度从0-35μg·mL-1的溶血率均低于1％，60和100μg·mL-1时低于5％，通常溶血率低于10％都表明没有溶血毒性。由此可见，氧化石墨烯复合材料具有溶血低毒性，适用于生物实验。
实施例16：药物5-FU/GO-PEG-GE11的化学药物疗效
纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11的化学药物疗效通过Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒进行检测。本实验选取HCT-116、SW-620人结直肠癌上皮细胞，将HCT-116、SW-620细胞以每孔10×104的数目种植在激光共聚焦小皿中。置于孵育箱中培养24小时，使细胞在小皿中稳定生长。吸出培养基，加入pH＝7.4的PBS漂洗细胞三次。然后加入用培养基DMEM稀释的纳米材料，实验组为5-FU/GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料的浓度为100μg·mL-1，其中5-FU的含量为25μg·mL-1；对照组为游离的肿瘤药物5-FU，其浓度为25μg·mL-1，后置于细胞孵育箱中孵育48小时。然后，小心吸出材料样品，加入胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞(1000rpm，3min)。去掉上清，使用1×Assay Buffer充分清洗细胞2-3次，以充分去除残留的酯酶活性。用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×106的数目，然后加入现配的Calcein-AM/PI活细胞/死细胞染色液，37℃孵育15分钟，吸出染色液，加入少量的1×Assay Buffer使其保持湿润，置于激光共聚焦显微镜进行操作观察。
如图10结果显示，使用游离5-FU处理的细胞，几乎全部存活，保持原有的细胞形态；使用纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11处理的细胞，细胞存活率约为35％左右，体现出良好的化学药物疗效，说明纳米载体能够协同、促进5-FU抑制癌细胞生长；使用纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11和808nm激光照射处理细胞，细胞几乎全部死亡，证实化学药物疗法与光热疗法相结合，可以有效的提高肿瘤治疗效果。
实施例17：皮下结直肠癌实体瘤小鼠模型中5-FU/GO-PEG-GE11的体内分布
构建皮下结直肠癌实体瘤小鼠模型，取4周龄的雄性BALB/c裸鼠，平均体重为20g左右，在右下肢背部处接种100μL 1×107个细胞，首先将细胞重悬于PBS中，再将细胞悬液与基质胶(1：1)混合置于冰上，注射至小鼠背部。一周后，待肿瘤组织尺寸超过200mm3(肿瘤体积＝肿瘤组织长度×肿瘤组织宽度2×0.5)时，将小鼠随机分为两组，每组5只小鼠。分别注射使用罗丹明B修饰的5-FU/GO-PEG和5-FU/GO-PEG-GE11纳米材料，注射时间为2小时、6小时、12小时、24小时、48小时，之后将小鼠的主要器官例如心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织从小鼠体内剥离出来，用荧光成像系统进行拍照记录。
如图11结果分析：通过尾静脉注射2小时后，两组纳米材料都集中在肝脏部位，肿瘤部位有微量的聚集。尾静脉注射6小时后，两组纳米材料在肿瘤上都有部分聚集，带有靶向的一组在肾脏部位有微弱的聚集，非靶向组在肾脏部位有大量的聚集，说明非靶向组在6小时时已经开始代谢。尾静脉注射12小时、24小时后，靶向组在肿瘤部位聚集越来越多，肾脏部位只有微量聚集，说明纳米靶向材料在注射24小时后也没有代谢，在肿瘤部位有良好的聚集效果，从而达到良好的治疗效果；非靶向组肿瘤部位存在聚集，但是也代谢了大量的纳米药物。静脉注射48小时后，两组肾脏部位都有大量的纳米复合材料，开始产生代谢。这些观察结果，都证明氧化石墨烯纳米复合体系5-FU/GO-PEG-GE11具有靶向结直肠癌组织的能力，并将五氟尿嘧啶输送到靶向部位，且具有靶向肽的纳米载体可以在肿瘤部位长时间聚集，达到提高化疗效果的作用。
实施例18：皮下结直肠癌实体瘤小鼠模型中抑制癌变组织生长
在裸鼠皮下种植结直肠癌细胞，构建小鼠实体瘤模型，待肿瘤组织尺寸超过50mm3时，将小鼠随机分为7组，每组4只小鼠，分别注射生理盐水、空白纳米材料GO-PEG、装载肿瘤化疗药物的纳米材料5-FU/GO-PEG以及具有EGFR受体靶向肽GE11的纳米材料5-FU/GO-PEG-GE11，后三组附加808nm激光照射，进行光热疗法。注射的计量按照五氟尿嘧啶的浓度为10mg·kg-1，GO浓度为30mg·kg-1。一周给药三次，一共给药三周，每隔2-3天记录各组小鼠肿瘤组织体积和体重的变化，最后一天将肿瘤组织从体内剥离出来测量体积和重量。
如图12结果分析：具有靶向分子的5-FU/GO-PEG-GE11组并结合光热治疗组的抑制率为90.13％，不结合光热治疗时抑制率为64.38％；不具有靶向分子的GO-PEG-5-FU并结合光热治疗组的抑制率为77.68％，不结合光热治疗时抑制率为59.02％。可以得出结论，5-FU/GO-PEG-GE11结合光热治疗组具有最好抑制肿瘤组织生长的效率，光热治疗联合化学药物疗法，可以有效的提高肿瘤治疗效果。如图13B所示，经过三周的治疗，小鼠的体重没有发生明显变化。
实施例19：不同治疗组对小鼠系统毒性以及癌变组织H&E染色观察
本实验是从组织学角度对不同药物形式对皮下实体瘤小鼠的治疗效果评价。在治疗试验结束后，将小鼠的肿瘤组织及主要器官心、肝、脾、肺、肾、肠从体内剥离出来，记录肿瘤组织的体积和重量。将种瘤组织浸泡在35％的福尔马林溶液中存放两天以上。再用石蜡包埋处理，制成5μm厚度的组织切片，用苏木精和伊红染色，制成组织切片。H&E染色切片制成后，使用光学显微镜观察肿瘤组织细胞的形态，并评价各个处理组织样品对小鼠的系统毒性。
结果分析：如图14所示，各个器官的组织切片均无明显变异或病变，细胞形态完整无明显损伤。实验结果证实，该纳米载药靶向体系对小鼠的系统毒性较小，具有良好的生物相容性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物，其特征在于，所述药物的是将含有示踪分子FITC的靶向分子多肽GE11引入到用于靶向治疗结直肠癌的药物中，结构如下所示：
Figure FDA0003817152690000011
其中，
Figure FDA0003817152690000012
为具有示踪效果的表皮生长因子受体EGFR受体靶向肽GE11；
Figure FDA0003817152690000013
为抗肿瘤药物五氟尿嘧啶5-FU；n为1-20；
用于靶向治疗结直肠癌的药物是利用纳米载体材料作为载体，负载五氟尿嘧啶制得5-FU/GO-PEG；所述纳米载体材料的制备方法包括如下步骤：
(1)制备氧化石墨烯纳米片层材料；
(2)将步骤(1)制得的氧化石墨烯配制成水悬浮溶液，加入碱和羧酸化试剂，制得具有羧基修饰的石墨烯水悬浮溶液；
(3)在步骤(2)所得的石墨烯水悬浮溶液中加入两端修饰氨基的聚乙二醇进行缩合反应，反应完成后即得纳米载体材料；
纳米载体材料的结构如下所示：
Figure FDA0003817152690000014
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，纳米载体材料与5-FU的质量比为(2.5-4)：1。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述步骤(3)中两端修饰氨基的聚乙二醇与石墨烯水悬浮溶液的质量比(4-4.5)：1。
4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述步骤(3)还包括：加入适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再加入质量比1：(4-4.5)的两端修饰氨基的聚乙二醇进行缩合反应。
5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法是：在介质中，加入纳米载体材料和抗肿瘤药物五氟尿嘧啶，混匀即得。
6.根据权利要求1-5任一所述的药物，其特征在于，所述靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法还包括将混匀后的体系在双蒸水中进行透析。
7.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物的制备方法包括如下步骤：
(1)将用于靶向治疗结直肠癌的药物5-FU/GO-PEG与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐混合，然后加入GE11水溶液，室温下进行反应；
(2)反应完全后，在双蒸水中进行透析，即得光热治疗与化疗联合靶向治疗结直肠癌的药物。
CN201911238733.8A 2019-12-06 2019-12-06 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 Active CN111012922B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911238733.8A CN111012922B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911238733.8A CN111012922B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111012922A CN111012922A (zh) 2020-04-17
CN111012922B true CN111012922B (zh) 2022-11-08

Family

ID=70204450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911238733.8A Active CN111012922B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111012922B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109432441A (zh) * 2018-12-12 2019-03-08 郑州大学 一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用
CN109718384A (zh) * 2018-11-20 2019-05-07 广西医科大学 还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109718384A (zh) * 2018-11-20 2019-05-07 广西医科大学 还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用
CN109432441A (zh) * 2018-12-12 2019-03-08 郑州大学 一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
功能化氧化石墨烯的制备及其载药性能研究;潘琪霞等;《化工新型材料》;20161130;第44卷(第11期);第91-93页 *
功能化氧化石墨烯负载氟尿嘧啶制备及体外释放研究;方加龙等;《中国现代应用药学》;20141031;第31卷(第10期);第1215-1219页，尤其是摘要和第1219页右栏最后1段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111012922A (zh) 2020-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Tumor microenvironment responsive FePt/MoS 2 nanocomposites with chemotherapy and photothermal therapy for enhancing cancer immunotherapy
Wang et al. A theranostic nanoplatform: magneto-gold@ fluorescence polymer nanoparticles for tumor targeting T 1 & T 2-MRI/CT/NIR fluorescence imaging and induction of genuine autophagy mediated chemotherapy
Wang et al. Delivery of platinum (IV) drug to subcutaneous tumor and lung metastasis using bradykinin-potentiating peptide-decorated chitosan nanoparticles
Liu et al. Photosensitizer-conjugated redox-responsive dextran theranostic nanoparticles for near-infrared cancer imaging and photodynamic therapy
Kopwitthaya et al. Biocompatible PEGylated gold nanorods as colored contrast agents for targeted in vivo cancer applications
Cui et al. Theranostic gold cluster nanoassembly for simultaneous enhanced cancer imaging and photodynamic therapy
Kim et al. Stimuli-responsive magnetic nanoparticles for tumor-targeted bimodal imaging and photodynamic/hyperthermia combination therapy
Yan et al. Ultrasmall hybrid protein–copper sulfide nanoparticles for targeted photoacoustic imaging of orthotopic hepatocellular carcinoma with a high signal-to-noise ratio
CN110591075B (zh) 一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途
Zhong et al. pH-responsive Ag2S nanodots loaded with heat shock protein 70 inhibitor for photoacoustic imaging-guided photothermal cancer therapy
CN110314136A (zh) 一种基于不饱和脂肪酸纳米粒的肿瘤靶向药物的制备及其应用
Li et al. Temperature-and pH-responsive injectable chitosan hydrogels loaded with doxorubicin and curcumin as long-lasting release platforms for the treatment of solid tumors
Liu et al. Intelligent albumin-stabilized manganese dioxide nanocomposites for tumor microenvironment responsive phototherapy
CN113350524B (zh) 一种肿瘤微环境响应的铁封堵磁性纳米药物及制备方法与应用
CN111150857A (zh) 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用
CN107320738B (zh) 一种四氧化三锰-乳白蛋白纳米球及其制备与应用
Xu et al. MnO2 coated multi-layer nanoplatform for enhanced sonodynamic therapy and MR imaging of breast cancer
CN112007153B (zh) 一种叶绿素铜修饰的树状大分子铜络合物纳米诊疗材料的制备方法
Chiang et al. Circulating tumor-cell-targeting Au-nanocage-mediated bimodal phototherapeutic properties enriched by magnetic nanocores
CN111012922B (zh) 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法
CN114432264B (zh) 一种基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料、制备方法及应用
CN115089734B (zh) 载促吞噬肽的碳化MOFs纳米粒和制备方法和在视网膜母细胞瘤的成像和治疗中的应用
CN110325221B (zh) 用于对癌细胞的选择性荧光标记的纳米载体及其制备方法
Zhao et al. Packaging cordycepin phycocyanin micelles for the inhibition of brain cancer
Shi et al. Fluorescent realgar nanoclusters for nuclear targeting-triggered tumor theranostics

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant