CN109718384A - 还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用。本发明以纳米氧化石墨烯、RGD肽、氨基化聚乙二醇和3,3’‑二硫代二丙酸为原料，利用羧基和氨基在活化剂1‑(3‑二甲氨基丙基)3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺条件下酰胺缩合制得稳定性和生物相容性好、靶向和还原响应释药的药物载体RGD‑GO‑PEG‑DTDP，用于负载阿霉素制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD‑GO‑PEG‑S‑S‑DOX。该载药体系进入血液循环后，主动靶向到达肿瘤组织进入癌细胞，在高浓度谷胱甘肽刺激下，还原响应释放抗癌药物阿霉素，发挥抗癌作用。同时，可以联合光热疗法增强载药体系的抗癌活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用。
背景技术
目前，临床上最常见的癌症治疗手段是手术、化疗和放疗，然而这些治疗手段有很多不足，对正常组织损伤大，且治疗效果具有一定的局限。急需一种对正常组织伤害小且能有效治疗癌症的策略，通过药物输送系统靶向给药结合绿色的光热疗法成为癌症治疗研究领域中的热点。目前，研究一种低毒、生物相容性好、靶向、响应释药的药物传输系统是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体及制备方法和应用，制得稳定性和生物相容性好、靶向性和还原响应释药的药物载体，用于负载阿霉素制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系。该载药体系进入血液循环后，主动靶向到达肿瘤组织进入癌细胞，在高浓度谷胱甘肽刺激下，还原响应释放抗癌药物阿霉素，发挥抗癌作用。
本发明的上述目的，通过以下技术方案予以实现：
一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体，以纳米氧化石墨烯、RGD肽、氨基化聚乙二醇和3,3’-二硫代二丙酸为原料，利用羧基和氨基在活化剂1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺条件下酰胺缩合得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP。
优选地，所述氨基化聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基，分子量为10000，可以提高纳米氧化石墨烯的生物相容性，且使其表面富含氨基，利于引入3,3’-二硫代二丙酸。
一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，包括以下步骤：
S1.将纳米氧化石墨烯溶于水中，超声分散均匀，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1～2h后，加入RGD肽的磷酸盐溶液，搅拌反应12～24h后，加入氨基化聚乙二醇的水溶液，继续搅拌反应12～24h，将所得溶液用透析袋透析3～5天，得到RGD-GO-PEG溶液；
S2.将1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入二甲基亚砜中，超声分散，然后加入3,3’-二硫代二丙酸，超声20～30min，搅拌反应30～60min；
S3.将步骤S2制得的溶液缓慢滴加到步骤S1制得的RGD-GO-PEG溶液中，搅拌反应24h，然后高速离心，用蒸馏水洗涤，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP。
优选地，所述步骤S1中纳米氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、RGD肽、氨基化聚乙二醇的质量比为8～12:80～120:80～120:5～10:100～150；所述氨基化聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基。
优选地，所述步骤S2中1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3’-二硫代二丙酸的质量比为5～6:2～4:2～3。
上述制备方法制得的还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP在制备抗癌药物方面的应用也在本发明的保护范围内。
上述应用，具体是还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP应用于负载阿霉素制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX。
一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系的制备方法，采用上述制备方法制得的还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP于蒸馏水进行重悬，超声分散，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液；向所得溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，超声10～20min，然后滴加阿霉素的磷酸盐PBS溶液，室温下震荡反应24h，制得还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX。
优选地，所述还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP：1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺：阿霉素的质量比为1:2～4:3～3.5；所述1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1。该质量比下，阿霉素的载药量可达37.75％～47.81％。
优选地，所述磷酸盐PBS溶液的pH＝5.50。利用还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体上的3,3’-二硫代二丙酸一端的羧基和阿霉素的氨基进行酰胺化结合，为了减少阿霉素直接通过非共价键吸附于纳米氧化石墨烯上，所以使用pH＝5.50的磷酸盐PBS缓冲溶液作为阿霉素的溶剂。
还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系作为抗癌药物，可用于癌症治疗。该载药体系进入血液循环后，主动靶向到达肿瘤组织进入癌细胞，在高浓度谷胱甘肽刺激下，还原响应释放抗癌药物阿霉素，发挥抗癌作用。
本发明以纳米氧化石墨烯(GO)、RGD肽、氨基化聚乙二醇(6ARM-PEG-NH2，PEG)、3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)为原料，利用羧基和氨基在活化剂1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)条件下酰胺缩合制备稳定性和生物相容性好、靶向和还原响应释药的药物载体RGD-GO-PEG-DTDP，用于负载阿霉素(DOX)制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX。利用能被整合素αvβ3识别的多肽RGD对纳米氧化石墨烯进行靶向性修饰，并用氨基化聚乙二醇修饰结构，提高生物相容性，且使其表面富含氨基，利于引入3,3’-二硫代二丙酸。为了控制药物能在肿瘤组织中快速大量释放，增强疗效，引入能被高浓度谷胱甘肽(glutathione，GSH)还原而断裂的二硫键(3,3’-二硫代二丙酸)，结合广谱抗癌药物阿霉素。谷胱甘肽在胞外血液循环中的浓度极低，不能还原二硫键，而在癌细胞中的浓度高，可以还原二硫键，载药体系进入血液循环，主动靶向到达肿瘤组织进入癌细胞，在高浓度的谷胱甘肽刺激下，释放抗癌药物阿霉素，发挥抗癌作用。同时，可以联合光热疗法增强载药体系的抗癌活性。
本发明具有以下有益效果：
(1)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP具有良好的水溶性和稳定性，便于人体注射或者口服吸收利用。
(2)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP用于人肝癌HepG-2细胞株、人正常肝细胞株7702的体外细胞毒性实验结果显示，该载体在0～100μg/mL对各细胞的相对增殖率均>75％，表明载体在0～100μg/mL的浓度范围内对细胞是安全无毒的，生物相容性好。
(3)对药物载体RGD-GO-PEG-DTDP进行细胞摄取实验时，加入载体孵育4h后，通过merge荧光图谱可以看到HepG-2细胞摄取带有绿色荧光的载体(箭头)相对于7702细胞摄取的多很多，由于RGD肽能特异性识别HepG-2细胞，提高了载体的靶向性。
(4)阿霉素上的氨基通过与还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体上的3,3’-二硫代二丙酸一端的羧基进行酰胺缩合，载体通过化学键结合抗癌药物阿霉素具有较高的载药量，当还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体：1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(这两种活化剂的比例是1:1)：阿霉素的质量比为1:2～4:3～3.5时，阿霉素的载药量可达37.75％～47.81％。在模拟肿瘤环境体外进行释药，谷胱甘肽浓度为10mM的pH＝5.50PBS溶液下释药率可达80％～90％。
(5)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP具有良好的光热性能，用808nm近红外激光照射仪对载体进行照射5min，功率为8W/cm2，载体浓度为0.78μg/mL时，温度达到42℃，能够诱导肿瘤细胞热损伤及加速肿瘤细胞凋亡。用载体培养肿瘤细胞后，进行热疗处理，载体浓度为6.25μg/mL时，细胞相对抑制率达54％～62％。
(6)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX在抑制人肿瘤细胞Hep-G2生长的药物中的应用，以载药体系负载的阿霉素计，浓度为12.5μg/mL时，培养48h后，抑制率80％以上。
(7)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX联合光热疗法抗癌活性显著。在浓度为1.56μg/mL时，载药体系未联合光热疗法，肿瘤细胞Hep-G2的抑制率为55％～65％；载药体系联合光热疗法，肿瘤细胞Hep-G2的抑制率达78％～84％。
(8)通过RGD肽、PEG和DTDP对纳米氧化石墨烯进行修饰，得到稳定性和生物相容性好、靶向和还原响应释药的药物载体RGD-GO-PEG-DTDP；药物载体RGD-GO-PEG-DTDP通过化学键结合抗癌药物阿霉素，制得的载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX同时具备良好的生物相容性、靶向性以及在癌细胞内高浓度的谷胱甘肽下发生还原反应使二硫键断键，从而释放药物，能够控制药物达到病灶处再快速释放。克服了传统化疗药的靶向性差、毒性大的缺陷，是对现有单一功能化药物的一大突破和重要创新。
(9)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX可联合光热疗法，杀伤肿瘤细胞，增强抗肿瘤效果，降低毒副作用，实现一种制剂多重疗效的功能。
附图说明
图1为还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系的示意图；
图2为红外光谱检测所得到的图谱，A为GO，B为RGD-GO，C为RGD-GO-PEG，D为RGD-GO-PEG-DTDP；
图3为GO的X射线光电子能谱；
图4为GO-RGD的X射线光电子能谱；
图5为RGD-GO-PEG的X射线光电子能谱；
图6为RGD-GO-PEG-DTDP的X射线光电子能谱；
图7为扫描电镜图，a，b，c，d分别为GO、RGD-GO、RGD-GO-PEG、RGD-GO-PEG-DTDP的扫描电镜图；
图8为不同浓度载体对细胞毒性的检测图；
图9人正常肝细胞7702摄取FITC-RGD-GO-PEG-DTDP的荧光显微镜图；
图10人肝癌HepG-2细胞摄取FITC-RGD-GO-PEG-DTDP的荧光显微镜图；
图11为阿霉素(DOX)的紫外特征吸收峰图谱；
图12为阿霉素(DOX)标准曲线图；
图13为活化剂对载体载药性能影响的结果图；
图14为不同浓度阿霉素对载体载药性能影响的结果图；
图15为载药体系在不同体外条件下的释放药物情况图；
图16为载体的光热性能研究图；
图17为载药体系体外抗癌活性图；
图18为载体联合热疗对癌细胞的抑制作用图；
图19为载药体系联合热疗对癌细胞的抑制作用图。
具体实施方式
实施例1：还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)、还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备。
(一)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)的制备，具体步骤如下：
S1.称取8mg的纳米氧化石墨烯(GO)溶于10mL水中，超声分散均匀，然后加入80mg的1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和80mg的N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimede，NHS)，搅拌反应1h后，加入5mg的RGD肽(先用5mL，pH＝7.40的磷酸盐缓冲溶液溶解)，搅拌反应12h后，加入100mg的六臂聚乙二醇氨基(6ARM-PEG-NH2，PEG；先用5mL的蒸馏水溶解)，继续搅拌反应12h，将所得溶液用透析袋(MWCO 8000～14000)透析3天，透析介质为蒸馏水，得到RGD-GO-PEG溶液。
S2.称取500mg的EDC和200mg的NHS于20mL的二甲基亚砜(DMSO)中，超声分散，加入200mg的3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)，超声20min，搅拌反应30min。
S3.将步骤S2制得的全部溶液缓慢滴加入步骤S1制得的15mL RGD-GO-PEG溶液中，搅拌反应24h，12500r/min高速离心，用蒸馏水洗涤3次，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(载体RGD-GO-PEG-DTDP)。
(二)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备，具体步骤如下：
采用蒸馏水将步骤S3制得的载体RGD-GO-PEG-DTDP进行重悬，超声分散，得到浓度为1.05mg/mL的载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液；向所得载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液中加入活化剂EDC和NHS，超声10min，滴加1mg/mL阿霉素(DOX)pH＝5.50的PBS溶液，室温下震荡反应24h，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)。载体RGD-GO-PEG-DTDP：活化剂EDC和NHS(这两种活化剂的比例是1:1)：阿霉素的质量比为1:2:3。
实施例2：还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)、还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备。
(一)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)的制备，具体步骤如下：
S1.称取10mg的GO溶于10mL水中，超声分散均匀，然后加入100mg的EDC和100mg的NHS，搅拌反应1.5h后，加入7mg的RGD肽(先用5mL，pH＝7.40的磷酸盐缓冲溶液溶解)，搅拌反应18h后，加入125mg的PEG(先用5mL的蒸馏水溶解)，继续搅拌反应18h，将所得溶液用透析袋(MWCO 8000～14000)透析4天，透析介质为蒸馏水，得到RGD-GO-PEG溶液。
S2.称取550mg的EDC和300mg的NHS于25mL的DMSO中，超声分散，加入250mg的DTDP，超声25min，搅拌反应45min。
S3.将步骤S2制得的全部溶液缓慢滴加入步骤S1制得的15mL RGD-GO-PEG溶液中，搅拌反应24h，12500r/min高速离心，用蒸馏水洗涤4次，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(载体RGD-GO-PEG-DTDP)。
(二)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备，具体步骤如下：
采用蒸馏水将步骤S3制得的载体RGD-GO-PEG-DTDP进行重悬，超声分散，得到浓度为0.85mg/mL的载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液；向所得载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液中加入活化剂EDC和NHS，超声15min，滴加1mg/mL阿霉素(DOX)pH＝5.50的PBS溶液，室温下震荡反应24h，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)。载体RGD-GO-PEG-DTDP：活化剂EDC和NHS(这两种活化剂的比例是1:1)：阿霉素的质量比为1:3:3.25。
实施例3：还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)、还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备。
(一)还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(RGD-GO-PEG-DTDP)的制备，具体步骤如下：
S1.称取12mg的GO溶于10mL水中，超声分散均匀，然后加入120mg的EDC和120mg的NHS，搅拌反应2h后，加入10mg的RGD肽(先用5mL，pH＝7.40的磷酸盐缓冲溶液溶解)，搅拌反应24h后，加入150mg的PEG(先用5mL的蒸馏水溶解)，继续搅拌反应24h，将所得溶液用透析袋(MWCO 8000～14000)透析5天，透析介质为蒸馏水，得到RGD-GO-PEG溶液。
S2.称取600mg的EDC和400mg的NHS于30mL的DMSO中，超声分散，加入300mg的DTDP，超声30min，搅拌反应60min。
S3.将步骤S2制得的全部溶液缓慢滴加入步骤S1制得的15mL RGD-GO-PEG溶液中，搅拌反应24h，12500r/min高速离心，用蒸馏水洗涤5次，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体(载体RGD-GO-PEG-DTDP)。
(二)还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)的制备，具体步骤如下：
采用蒸馏水将步骤S3制得的载体RGD-GO-PEG-DTDP进行重悬，超声分散，得到浓度为1.25mg/mL的载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液；向所得载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液中加入活化剂EDC和NHS，超声20min，滴加1mg/mL阿霉素(DOX)pH＝5.50的PBS溶液，室温下震荡反应24h，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)。载体RGD-GO-PEG-DTDP：活化剂EDC和NHS(这两种活化剂的比例是1:1)：阿霉素的质量比为1:4:3.5。
实施例4：以实施例1为代表，分别做如下表征和性能试验。
1、表征
(1)红外光谱检测(FI-RT)
分别称取干燥的纳米氧化石墨烯GO、RGD-GO、RGD-GO-PEG、载体RGD-GO-PEG-DTDP1mg与100mg KBr粉末于玛瑙研钵研磨均匀，压成薄片，放入样品室，通过傅里叶红外变换光谱仪在4000～400cm-1范围内扫描，得到如图2所示的红外吸收光谱图，光谱A为GO，光谱B为RGD-GO，光谱C为RGD-GO-PEG，光谱D为RGD-GO-PEG-DTDP。A谱中，3427cm-1是氧化石墨烯的O-H的伸缩振动峰，1729cm-1是羧基(C＝O)伸缩振动吸收峰，1627cm-1，1399cm-1，1071cm-1的吸收峰分别是未被氧化的C＝C伸缩振动峰，O-H弯曲振动峰，环氧基团中C-O-C伸缩振动伸；B谱中，1636cm-1是酰胺的C＝O的伸缩振动吸收峰，在1535cm-1，1253cm-1处出现了新的振动峰，是RGD的-δN-H的特征吸收峰和C-N伸缩振动峰；C谱中，1729cm-1的振动峰消失，存在1636cm-1吸收峰，是因为引入PEG的氨基与羧基进行缩合，氧化石墨烯表面羧基基团变成了酰胺基团；D谱中，1729cm-1的振动峰又出现，是因为引入DTDP的羧基基团的存在。
(2)X射线光电子能谱(XPS)
用XPS分析GO-RGD、RGD-GO-PEG、RGD-GO-PEG-DTDP的表面化学元素组成，确定氧化石墨烯是否被成功修饰上相应的功能基团，如图3-6，表1。图4中，在信号399.29eV处出现了N1s的峰，还有根据元素含量表1，GO-RGD的氮元素含量变大，说明RGD接在GO上；图5中，N1s的峰出现，并且氮元素含量增大，是因为用六臂聚乙二醇氨基(PEG)修饰GO-RGD；经过3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)修饰后，在信号163.27eV出现了S2p峰(图6)，表1中得知载体RGD-GO-PEG-DTDP的硫元素含量为1.33％。
表1 GO,GO-RGD,RGD-GO-PEG和RGD-GO-PEG-DTDP的元素含量表
(3)扫描电镜(SEM)
通过SEM观测载体的形貌。图7中，a，b，c，d分别代表GO、RGD-GO、RGD-GO-PEG、RGD-GO-PEG-DTDP的扫描电镜图，在b、c中表面上的小颗粒为RGD肽，c、d的电镜图出现明显的褶皱和卷曲，是由于PEG和DTDP的引入，增大了GO的片层间距。
2、载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液浓度的确定及稳定性实验
按照《药典(2015年版)》规定利用恒重法计算载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液的浓度，在十万分之一天平上精密称取3根5mL的EP管的质量并编号记录，用移液枪精确吸取2.00mL液体转移入EP管中，冷冻干燥，称量，利用减重法计算得出载体浓度。
取1.00mL的载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液于离心管中分别加入蒸馏水和DMEM完全培养基稀释至5mL，超声混匀，4℃下放置30天，于第5天，第15天，第30天，观察其性状是否有沉淀析出以判断其稳定性。结果：载体没有析出沉淀，能溶于蒸馏水和DMEM完全培养基；根据《药典(2015年版)》中关于溶解度的定义及分类判断，本发明制备的载体RGD-GO-PEG-DTDP水溶性良好，溶液中没有载体物质析出，说明该载体稳定性良好，为其在医药学上的应用奠定了基础。
3、载体对细胞毒性
MTT法检测载体RGD-GO-PEG-DTDP对细胞的毒性：
将处于对数生长期的细胞从培养瓶底部用含EDTA的蛋白酶消化下来，800r/min离心5min后弃上清液，用DMEM培养基重悬细胞配制成密度为5×104个/mL，接种到96孔板中，每孔100μL，周围用PBS缓冲液填充以防止边缘化，然后放入5％CO2，37℃的恒温培养箱中培养孵育24h使细胞贴壁，设置调零组(不含任何细胞)、对照组(只含有细胞)和不同浓度梯度的纳米粒子组(终浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0μg/mL)每孔加入100μL，每个浓度设置6个复孔，置于细胞培养箱中孵育48h，把孔里含培养基的药液吸出，用PBS洗，然后每孔加入50μL MTT溶液(0.5mg/mL)，放入细胞培养箱中孵育4h，然后小心吸取每孔中的MTT液，加入150μL DMSO，放在摇床上避光震荡摇匀15min使紫蓝色甲瓒结晶充分溶解显色后在免疫连续酶标仪上490nm波长处测定OD值。按照公式计算细胞的相对增殖率(Relative growth rate,RGR)：
结果显示：还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体用于人肝癌HepG-2细胞株、人正常肝细胞株7702的体外细胞毒性实验结果显示，该载体在0～100μg/mL对各细胞的相对增殖率均>75％，表明载体在0～100μg/mL的浓度范围内对细胞是安全无毒的。如图8。
4、细胞摄取实验
采用FITC标记载体RGD-GO-PEG-DTDP，称取FITC粉末3mg溶于10mL二甲基亚砜中，滴加到装有10mL 1mg/mL的载体液中，室温避光搅拌反应24h，高速离心，用蒸馏水洗涤沉淀，至上清液无色后，用蒸馏水重悬。
取对数生长期的7702细胞和HepG-2细胞以1×105个/mL接种于6孔板内，每孔1.5mL，培养24h，分别加入1mL的FITC-RGD-GO-PEG-DTDP(100μg/mL)，孵育1，2，4h后，把培养基吸出来，用PBS洗5遍，每孔加入100μL的Hoechst33342细胞核染色液，15min后置于荧光显微镜下观察细胞对载体的摄取情况。
结果如图9和图10所示，HepG-2细胞表面是高表达整合素受体的，而7702细胞表面是低表达的，可以通过这两种细胞对载体的摄取来考察RGD的靶向性。加入载体孵育4h后，通过merge荧光图谱可以看到HepG-2细胞摄取带有绿色荧光的载体(箭头)相对于7702细胞摄取的多很多，由于RGD肽能特异性识别HepG-2细胞，提高了载体的靶向性。
5、载药性能
(1)阿霉素标准曲线
称取6mg盐酸阿霉素，分别溶于6mL蒸馏水中，超声至溶解，得到1mg/mL阿霉素溶液，配制浓度为0、2、4、6、8、10、20、40μg/mL的标准溶液，取浓度为10μg/mL的标准液于紫外可见分光光度计下进行全波长扫描，观察其特征吸收峰，如图11。选择波长为480nm的特征峰对其进行定量分析。分别测不同浓度阿霉素标准溶液在480nm处的吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图12。
(2)负载阿霉素药物
采用实施例1的制备方法，载体RGD-GO-PEG-DTDP、活化剂(EDC，NHS)、阿霉素(DOX)以不同的质量比制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系(RGD-GO-PEG-S-S-DOX)，将制得的RGD-GO-PEG-S-S-DOX于12500r/min离心40min，于紫外可见分光光度计测定上清液阿霉素浓度，计算阿霉素负载量。由阿霉素标准曲线计算出未载上游离的阿霉素含量和载药率。载药率的计算公式如下：
结果：DOX上的氨基通过与载体RGD-GO-PEG-DTDP上的DTDP一端的羧基进行酰胺缩合，载体RGD-GO-PEG-DTDP通过化学键结合DOX具有较高的载药量，载体RGD-GO-PEG-DTDP：活化剂EDC和NHS：DOX的质量比为1:2～4:3～3.5时，载药量可达37.75％～47.81％，如图13-14。
(3)体外释药试验
根据药典配制pH为5.50、7.40的PBS磷酸缓冲溶液，然后分别配制高浓度10mM谷胱甘肽pH7.40的PBS溶液，高浓度10mM谷胱甘肽pH5.50的PBS溶液和低浓度10μM谷胱甘肽pH7.40的PBS溶液；分别各取45mL置于250mL烧杯中。随后将RGD-GO-PEG-S-S-DOX装入3个透析袋中，每袋的体积为5mL，在恒温加热磁力搅拌器中模拟人体体温37℃的进行搅拌，间隔不同时间(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、25h)，取5mL透析外液，同时补充5mL新外液，维持透析外液体积恒定，采用紫外分光光度计测定不同时间段透析外液中DOX的含量，计算DOX的累积释药率，计算公式如下：
式中，Er为DOX药物的累积释放量；Ve为每次PBS的置换体积；V0为初始加入DOX释放介质总体积；Ci为第i次置换取样的释放DOX的浓度；mdrug为氧化石墨烯所载DOX的总质量；n为置换PBS次数。
结果：在模拟肿瘤环境体外进行释药，谷胱甘肽浓度为10mM的pH5.50PBS缓冲溶液下，释药率可达80％～90％。如图15。
5、光热性能
配制不同浓度的载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液(0、0.78、1.56、3.126、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)，分别取2mL置于离心管中，取2mL培养基作为对照组，用808nm近红外激光仪，功率密度为8W/cm2，垂直照射，然后于1min，5min测溶液的温度，观察温度变化。
结果：载体RGD-GO-PEG-DTDP具有良好的光热性能，用808nm近红外激光照射仪对载体进行照射5min，功率为8W/cm2，载体浓度为0μg/mL，温度为32℃，载体浓度为0.78μg/mL时，温度达到42℃，能够诱导肿瘤细胞热损伤及加速肿瘤细胞凋亡。如图16。
6、载药体系的体外抗癌活性
用MTT法检测抗癌活性。
实验分组：空白对照组(单纯的细胞培养液)；阴性对照组(只含细胞，不添加任何其他药物)；阳性对照组(DOX终浓度：25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.195μg/mL、0μg/mL)；药物组(RGD-GO-PEG-S-S-DOX的终浓度以载上DOX浓度为准，与DOX阳性对照组浓度一致)。
把细胞消化接种96孔板后(5×103个/孔)，培养细胞24h，给予药物刺激48h后，把每孔的药液吸出，用PBS洗涤，再加入MTT，继续培养4h后，吸出每孔中的MTT液，加入150μL的DMSO，放在摇床上避光震荡摇匀15min，用连续酶标仪进行OD值的测量。
结果：载药体系的体外抗癌活性显著，载药体系在抑制人肿瘤细胞Hep-G2生长的药物中的应用上，浓度为12.5μg/mL时，培养48h后，抑制率达80％以上，如图17。
7、载体和载药体系联合热疗的抗癌活性
实验分组：空白对照组(单纯的细胞培养液)；阴性对照组(只含细胞，不添加任何其他药物。)；载体组(载体RGD-GO-PEG-DTDP浓度：100μg/mL、25μg/mL、6.25μg/mL、1.56μg/mL、0μg/mL)；药物组(DOX浓度：25μg/mL、6.25μg/mL、1.56μg/mL、0.39μg/mL、0μg/mL；RGD-GO-PEG-S-S-DOX：浓度以载上DOX浓度为准，同DOX浓度。)；单一热疗对照组(只含有细胞)；载体+热疗组；药物+热疗组。
把细胞消化接种96孔板后(5×103个/孔)，培养细胞24h，设置空白对照组(不含任何细胞)、阴性对照组(只含有细胞)、载体组、药物组、单一热疗对照组、载体+热疗组、药物+热疗组，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔，置于细胞培养箱中孵育24h，然后把每孔的药液吸出，再添加新的培养基，对单一热疗对照组，载体+热疗组和药物+热疗组细胞进行808nm近红外照射(热疗条件：8W/cm2，5min)，继续培养24h后，每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，放入细胞培养箱中孵育4h，然后小心吸取每孔中的培养液，加入150μL的DMSO，放在摇床上避光震荡摇匀15min，用连续酶标仪进行OD值的测量。计算细胞相对抑制率。结果显示，联合热疗对癌细胞有较强的抑制作用。还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系联合光热疗法抗癌活性显著。在浓度为1.56μg/mL时，载药体系未联合光热疗法，肿瘤细胞Hep-G2的抑制率为55％～65％；载药体系联合热疗法，肿瘤细胞Hep-G2的抑制率为78％～84％。如图18-19。
采用实施2、实施例3进行相同的表征和性能试验，均能得到相同的效果。
Claims (10)
1.一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体，其特征在于，以纳米氧化石墨烯、RGD肽、氨基化聚乙二醇和3,3’-二硫代二丙酸为原料，利用羧基和氨基在活化剂1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺条件下酰胺缩合得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP。
2.根据权利要求1所述的还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体，其特征在于，所述氨基化聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基。
3.一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将纳米氧化石墨烯溶于水中，超声分散均匀，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1～2h后，加入RGD肽的磷酸盐溶液，搅拌反应12～24h后，加入氨基化聚乙二醇的水溶液，继续搅拌反应12～24h，将所得溶液用透析袋透析3～5天，得到RGD-GO-PEG溶液；
S2.将1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入二甲基亚砜中，超声分散，然后加入3,3’-二硫代二丙酸，超声20～30min，搅拌反应30～60min；
S3.将步骤S2制得的溶液缓慢滴加到步骤S1制得的RGD-GO-PEG溶液中，搅拌反应24h，然后高速离心，用蒸馏水洗涤，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中纳米氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、RGD肽、氨基化聚乙二醇的质量比为8～12:80～120:80～120:5～10:100～150；所述氨基化聚乙二醇为六臂聚乙二醇氨基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3’-二硫代二丙酸的质量比为5～6:2～4:2～3。
6.权利要求3～5任一项所述的制备方法制得的还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP在制备抗癌药物方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用于负载阿霉素制备还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX。
8.一种还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系的制备方法，其特征在于，采用权利要求3～5任一项所述的制备方法制得的还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP于蒸馏水进行重悬，超声分散，得到还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP溶液；向所得溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，超声10～20min，然后滴加阿霉素的磷酸盐PBS溶液，室温下震荡反应24h，制得还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系RGD-GO-PEG-S-S-DOX。
9.根据权利要求8所述的还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系的制备方法，其特征在于，所述还原响应靶向纳米氧化石墨烯药物载体RGD-GO-PEG-DTDP：1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺：阿霉素的质量比为1:2～4:3～3.5；所述1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1。
10.根据权利要求8所述的还原响应靶向纳米氧化石墨烯载药体系的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐PBS溶液的pH＝5.50。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111012922A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-04-17 | 江南大学附属医院（无锡市第四人民医院） | 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 |
| CN111265494A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-12 | 四川大学 | 具有肿瘤放化疗协同增敏效应的载药微球及其制备方法 |
| CN111821436A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-10-27 | 电子科技大学 | 肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其构建方法 |
| CN112011329A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-01 | 青岛大学 | 具有靶向、释药和检测功能的金属离子配位薄层硼纳米片载体探针的制备方法 |
| CN112370530A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-02-19 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种乳铁蛋白修饰的聚乙二醇化氧化石墨烯负载葛根素纳米平台及其制备方法与应用 |
| CN114010846A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-02-08 | 中山大学附属口腔医院 | 一种生物玻璃水凝胶载药平台及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140294983A1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-10-02 | Bbs Nanotechnology Ltd. | Stable nanocomposition comprising doxorubicin, process for the preparation thereof, its use and pharmaceutical compositions containing it |
| CN104436210A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-03-25 | 上海交通大学 | 一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法 |
| CN108126207A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-06-08 | 广西中医药大学 | 氧化石墨烯靶向药物载体材料及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-11-20 CN CN201811385576.9A patent/CN109718384A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140294983A1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-10-02 | Bbs Nanotechnology Ltd. | Stable nanocomposition comprising doxorubicin, process for the preparation thereof, its use and pharmaceutical compositions containing it |
| CN104436210A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-03-25 | 上海交通大学 | 一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法 |
| CN108126207A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-06-08 | 广西中医药大学 | 氧化石墨烯靶向药物载体材料及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHAO HAN ET AL.: "Hypericin-functionalized graphene oxide for enhanced mitochondria-targeitng and synergistic anticancer effect", 《ACTA BIOMATERIALIA》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111012922A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-04-17 | 江南大学附属医院（无锡市第四人民医院） | 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 |
| CN111012922B (zh) * | 2019-12-06 | 2022-11-08 | 江南大学附属医院（无锡市第四人民医院） | 一种靶向、控释治疗结直肠癌药物及其制备方法 |
| CN111265494A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-12 | 四川大学 | 具有肿瘤放化疗协同增敏效应的载药微球及其制备方法 |
| CN111265494B (zh) * | 2020-03-16 | 2021-09-21 | 四川大学 | 具有肿瘤放化疗协同增敏效应的载药微球及其制备方法 |
| CN111821436A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-10-27 | 电子科技大学 | 肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其构建方法 |
| CN111821436B (zh) * | 2020-08-04 | 2021-10-08 | 电子科技大学 | 肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其构建方法 |
| CN112011329A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-01 | 青岛大学 | 具有靶向、释药和检测功能的金属离子配位薄层硼纳米片载体探针的制备方法 |
| CN112011329B (zh) * | 2020-09-10 | 2023-03-24 | 青岛大学 | 具有靶向、释药和检测功能的金属离子配位薄层硼纳米片载体探针的制备方法 |
| CN112370530A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-02-19 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种乳铁蛋白修饰的聚乙二醇化氧化石墨烯负载葛根素纳米平台及其制备方法与应用 |
| CN114010846A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-02-08 | 中山大学附属口腔医院 | 一种生物玻璃水凝胶载药平台及其制备方法和应用 |
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