CN104436210A - 一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法，首先将氧化石墨烯表面羧基化，利用羧基聚乙二醇胺对其进行修饰以提高生物相容性；通过由活化剂介导的羧胺缩合反应，将含有氨基的肿瘤靶向分子以化学键接枝在氧化石墨烯表面；利用π-π共轭作用，羧基氧化石墨烯搭载含有π键的疏水性抗肿瘤药物分子。羧基氧化石墨烯纳米粒子本身在近红外区具有吸光特性，可将吸收的光转化为热，从而制备出具有光热、靶向和载药性能的多功能氧化石墨烯纳米材料。与现有方法相比，多功能氧化石墨烯纳米材料生物相容性良好，可大量制备，载药方法简单并且对疏水性药物有较高的载药量。

Description

一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米载药系统及其制备方法，具体涉及一种抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统及其制备方法，属于材料和生物医药技术领域。

背景技术

纳米技术的出现和迅速发展为肿瘤的治疗提供了新的研究方向，尤其是多功能纳米粒子，可将光热治疗与载药和靶向相结合形成高效且副作用小的治疗方案。以纳米粒子载药能够提高水溶性较差药物的溶解性，并能够以细胞或组织特异性的方式靶向载药(Angew.Chem.2011,123,7723-7728)，还可通过紧密的上皮或内皮屏障药物跨胞转运，甚至可以同时搭载多种药物并实现转运大分子药物到达细胞内作用位点(Nat.Rev.Cancer 2005,5,161-171)。

氧化石墨烯具有比表面积大，细胞毒性低，较好的水溶性及低生产成本等优点，使其能够成为一种新型具有生物相容性的纳米材料而应用于生物医学领域。此外，氧化石墨烯在近红外区均有吸收，可将吸收的光转化为热升高局部温度，而人体组织对于近红外700-1000nm波长的光线吸收性极低，光线能够穿透皮肤和骨骼而不损伤人体组织，这一特点使氧化石墨烯纳米粒子适合作为诱导剂用于肿瘤光热治疗(ACSNano 2013,7,6735-6746)。

经检索，公开号为CN103893128A的中国发明专利，公开了“一种肿瘤治疗复合纳米材料及其制备”，提供了一种以氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料，或氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料与磁性纳米材料、上转换发光纳米材料、贵金属纳米材料、量子点和荧光材料进行复合形成的复合材料为载体的多功能(载药、靶向、光热)抗肿瘤方案。其中，氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料为TiO₂，ZrO₂和ZnO，这三种纳米粒子的细胞毒性目前尚不确定。

公开号为CN102294035A的中国发明专利，公开了“一种双重靶向抗恶性肿瘤纳米载药系统及其制备方法”，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，并通过化学方法在磁性纳米粒子核包覆一层多官能基团修饰的SiO₂层。抗恶性肿瘤药物通过双臂偶联剂或三臂偶联剂或者双臂偶联剂和三臂偶联剂的结合连接在多官能基团修饰的SiO₂层上。该方法虽然提高了载药量，但仅是将载药与靶向相结合，抗肿瘤治疗的效率低。

因此，本领域迫切需要一种生物相容性高、细胞毒性低、副作用小、载药量大、并且能将靶向和光热相结合的多功能载药纳米粒子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种光热、载药和靶向为一体的多功能抗恶性肿瘤氧化石墨烯纳米载药系统。

本发明通过以下技术方案实现：制备羧基化的氧化石墨烯纳米粒子，为提高其生物相容性，利用羧基聚乙二醇胺对其进行修饰，并通过π-π共轭作用搭载一种或多种抗肿瘤药物，简化了纳米粒子载药的步骤。此外，通过活化剂介导的羧胺反应使得肿瘤靶向分子结合在羧基氧化石墨烯表面，羧基氧化石墨烯纳米粒子在近红外区具有吸光特性，可将光转换为热。

本发明的第一方面，提供了一种抗肿瘤纳米载药系统，包括：具有光热作用的羧基氧化石墨烯纳米粒子；搭载于羧基氧化石墨烯纳米粒子表面的抗肿瘤药物；连接在羧基氧化石墨烯纳米粒子表面的肿瘤靶向分子。

优选地，抗肿瘤药物分子为蟾毒灵、多西他赛、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、平阳霉素中的一种或任意多种的组合。

优选地，肿瘤靶向分子为含有氨基的配体，例如，叶酸(FA)、肿瘤特异性抗体、氨基半乳糖的一种或任意多种的组合。

本发明的第二方面，提供了上述抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：

(1)对氧化石墨烯进行羧基化，得到羧基氧化石墨烯；

(2)将羧基氧化石墨烯分散在介质中形成分散液；利用活化剂介导的羧胺反应，用羧基聚乙二醇胺对羧基氧化石墨烯进行修饰；

(3)利用活化剂介导的羧胺反应，使肿瘤靶向分子连接在羧基氧化石墨烯表面；

(4)通过π-π共轭作用，使羧基氧化石墨烯搭载一种或多种抗肿瘤药物。

优选地，氧化石墨烯羧基化过程是在惰性气体氛围内进行的。

优选地，氧化石墨烯羧基化过程中，所使用的氢氧化钠浓度为1×10^-4-5×10^-4mM，氯乙酸钠的浓度为0.05-0.5mg/mL。

优选地，分散液中羧基氧化石墨烯经过超声粉碎后的水合粒径为8-60nm，分散液浓度为1.5-8mg/mL。

优选地，活化剂是1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；EDC的浓度为15-40mg/mL，NHS的浓度为10-25mg/mL。

优选地，羧基聚乙二醇胺中聚乙二醇的相对分子质量为2000-25000。

优选地，羧基氧化石墨烯与羧基聚乙二醇胺的质量比为1/5-4/5。

优选地，抗肿瘤药物的浓度为2-8mM，体积为羧基氧化石墨烯分散液的1/10-1/6。

本发明的第三方面，提供了上述抗肿瘤纳米载药系统在抗肿瘤方面的应用方法。

优选地，肿瘤包括：肺肿瘤、肝脏肿瘤、胃脾肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤细胞或前列腺肿瘤。

优选地，应用方法还包括对肿瘤进行红外光照射，红外光的波长为960nm，功率密度为2.5Wcm^-2。

优选地，氧化石墨烯纳米粒子在水溶液或生理溶液(如磷酸盐缓冲液、血清、生理盐水)中的水合粒径范围为6-80nm，更有选地为≥30nm。

优选地，氧化石墨烯纳米粒子分散在细胞全培养基中，其浓度为30-160μg/mL。

优选地，氧化石墨烯纳米粒子具有低的细胞毒性和良好的生物相容性。

本发明的技术效果：以羧基聚乙二醇胺修饰的羧基氧化石墨烯纳米粒子为载体，构成一个将光热、载药和靶向相结合的抗肿瘤应用方案；该方案抗肿瘤效果好，毒副作用小，为抗恶性肿瘤提供了新途径。

附图说明

图1为本发明多功能氧化石墨烯纳米载药系统的制备流程图；

图2为本发明一个较佳实施例制备的氧化石墨烯的紫外可见近红外吸收光谱图；

图3为荧光显微镜观察的对照组与实验组前列腺癌DU145细胞形态图，其中图a和图b分别为对照组的明场和暗场，图c和图d分别为实验组的明场和暗场。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

第1步：羧基氧化石墨烯纳米粒子的制备

惰性气体氛围中，向10mL浓度为3mg/mL石墨烯水溶液中加入400μL氢氧化钠稀溶液(2.5×10^-6M)，超声2h后，加入1mg氯乙酸钠固体，继续超声1h后，再搅拌24h。用稀盐酸调节反应液的pH值至中性，然后利用透析除杂，真空干燥得到羧基氧化石墨烯纳米粒子。

第2步：羧基聚乙二醇胺修饰羧基氧化石墨烯纳米粒子

取第1步制备的羧基氧化石墨烯纳米粒子15mg，分散在5mL超纯水中，向分散液中加入115mg的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)和67.5mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)固体，搅拌30min后，向混合液中加入11.25mg羧基聚乙二醇胺固体，进行羧基活化，继续搅拌24h。将反应液进行透析，除去过量的反应物，真空冷冻干燥得到羧基聚乙二醇胺修饰的氧化石墨烯纳米粒子。

第3步：具有靶向功能的羧基氧化石墨烯纳米粒子的制备

取第2步制备的羧基聚乙二醇胺修饰的氧化石墨烯纳米粒子12mg，分散在4mL超纯水中，向分散液中加入能够与前列腺肿瘤特异性结合的端基为氨基的A10肿瘤特异性抗体(2.25mg)，搅拌24h。肿瘤靶向分子也可选用叶酸、氨基半乳糖等。通过酸胺缩合反应将氨基A10适配体接枝在石墨烯表面和部分羧基聚乙二醇胺链端。将反应液进行透析，除去过量的反应物，真空冷冻干燥得到具有靶向功能的氧化石墨烯纳米粒子。

第4步：羧基氧化石墨烯载药纳米粒子的制备

取第3步制备的具有靶向功能的氧化石墨烯纳米粒子6mg，分散在2mL超纯水中，向分散液中加入0.2mL含有蟾毒灵和多西他赛的二甲基亚砜溶液(3mM)，搅拌24h。将反应液进行离心以除去未溶解和未吸附的固体药物，离心后进行真空冷冻干燥得到多功能氧化石墨烯纳米材料，具有载药靶向和光热性质。

第5步：氧化石墨烯纳米载药系统对前列腺肿瘤DU145细胞的荧光显微分析

取第4步制备的多功能氧化石墨烯载药纳米粒子分散在含有10％胎牛血清的F-12培养基中，终浓度为40μg/mL。

将处于对数生长期的前列腺肿瘤DU145细胞按5000个/孔的密度接种于96孔板，共培养10孔，每孔均加入150μL F-12全培养基，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养24h后吸弃培养皿中的培养液，用100μL PBS冲洗2次。然后向其中5孔加入150μL正常F-12全培养基作为对照组，另外5孔加入150μL含多功能氧化石墨烯纳米粒子的F-12全培养基作为实验组。利用近红外激光960nm，以2.5W/cm²功率分别照射对照组和实验组10min。激光照射结束后，将细胞放入5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养2h后取出，吸弃培养皿中的培养液，用100μL PBS冲洗2次。然后向每孔中加入150μL碘化丙啶染色溶液(4μM)，其中碘化丙啶染色液使用PBS配制。将两组细胞放入培养箱中孵育15分钟。荧光显微镜观察两组细胞形态变化及染色情况。

染色结果如图3所示，其中图a和图b分别为对照组的明场和暗场，图a表明对照组细胞贴壁且保持多边形的正常形态，对应图b暗场中极少量细胞被碘化丙啶染色。图c和图d分别为实验组的明场和暗场，图c表明实验组的细胞大部分脱壁并且形态变圆甚至细胞结构被破坏，对应图d暗场中多数细胞的细胞核被碘化丙啶染色。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤纳米载药系统，其特征在于，所述纳米载药系统包括：具有光热作用的羧基氧化石墨烯纳米粒子；搭载于所述羧基氧化石墨烯纳米粒子表面的抗肿瘤药物；连接在所述羧基氧化石墨烯纳米粒子表面的肿瘤靶向分子。

2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤纳米载药系统，其特征在于，所述抗肿瘤药物为蟾毒灵、多西他赛、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、平阳霉素中的一种或任意多种的组合。

3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤纳米载药系统，其特征在于，所述肿瘤靶向分子为叶酸、肿瘤特异性抗体、氨基半乳糖的一种或任意多种的组合。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对氧化石墨烯进行羧基化，得到羧基氧化石墨烯；

(2)将所述羧基氧化石墨烯分散在介质中形成分散液；利用活化剂介导的羧胺反应，用羧基聚乙二醇胺对所述羧基氧化石墨烯进行修饰；

(3)利用活化剂介导的羧胺反应，使所述肿瘤靶向分子连接在所述羧基氧化石墨烯表面；

(4)通过π-π共轭作用，使所述羧基氧化石墨烯搭载一种或多种抗肿瘤药物。

5.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述羧基氧化石墨烯的粒径为8-60nm，所述分散液浓度为1.5-8mg/mL。

6.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述活化剂是1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；所述1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺的浓度为15-40mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10-25mg/mL。

7.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述羧基聚乙二醇胺中聚乙二醇的相对分子质量为2000-25000。

8.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述羧基氧化石墨烯与所述羧基聚乙二醇胺的质量比为1/5-4/5。

9.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物的浓度为2-8mM，所述抗肿瘤药物体积为所述分散液的1/10-1/6。

10.根据权利要求1-3任一项所述的一种抗肿瘤纳米载药系统在抗肿瘤方面的应用方法，其特征在于，所述肿瘤包括：肺肿瘤、肝脏肿瘤、胃脾肿瘤、淋巴肿瘤、乳腺肿瘤细胞或前列腺肿瘤。