CN107375928B - 一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，步骤如下：以氧化石墨烯作为载体，通过水热法将MoS2负载到氧化石墨烯上，进而进行PEG修饰，得到氧化石墨烯‑MoS2复合物载体。本发明首次采用了氧化石墨烯和MoS2的复合物作为光热治疗的药物载体，制备方法简单便捷且条件温和；制备的GO‑MoS2载药复合物具有良好的光热转换特性；有更高的药物负载比例，≧80％。所述GO‑MoS2载药复合物在NIR激光的存在下，在1.8W/cm2的激光功率下，其药物释放率为78％；GO‑MoS2载药复合物相比于传统光热治疗的纳米药物载体，两种材料之间存在协同作用，有更高的光热转换率。

Description

一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法及应用。
背景技术
癌症作为威胁人类生命健康的一类重大疾病，长期以来一直是治愈率低而复发、死亡率高。从统计数据上来看，我国癌症的新发病例从2010年至2015年以来，呈现出明显的上升趋势，每年新增病例30万例左右，且死亡病例数也逐年上升，2015年为281.4万例。全球癌症的自2008年以来也呈上升趋势，2012年其病例数为1400万，预计2035年病例数将达到2400万。而且近年来由于人们生活压力大、作息饮食无规律、接触致癌因子机会更多等原因，癌症新发病例也呈现了一定的低龄化趋势。手术、放疗、化疗作为目前癌症治疗的主要手段和方式。而这些方式都存在很大的风险，容易给病人带来大的创伤及并发症，同时在杀死癌细胞的同时也容易对正常细胞造成较大损害。
光热治疗是近些年较为新型的一种理想化的肿瘤细胞治疗手段，其原理为：采用外部光源(一般是近红外光)照射注射入人体内部的特殊材料，其通过将光能转化为热能使周围的温度升高到42℃以上，由于癌细胞对高温的耐受能力相对于正常细胞更弱，所以通过组织的升温可以使癌细胞的细胞结构被破坏，进而达到杀死癌细胞的作用。光热治疗的优点也较为明显：1)治疗手段为非侵入式的；2)对患者损伤小；3)操作便捷，治疗过程时间短(几分钟到十几分钟)；4)可进行一些不易手术的器官内部的治疗。而应用于光热治疗的材料在具有良好光热转换率的同时，多为无毒、易于功能化的材料。目前，光热治疗已有不少相关的研究，较多地，研究者们采用氧化石墨烯作为光热治疗的纳米药物载体，且已取得了较为显著的实验结果。
从现今的研究来看，氧化石墨烯(简称：GO)由于其具有二维片层的结构，表面积很大，常用作载药的研究，而且其在近红外光区有较强的吸收，所以将其应用于光热治疗十分有发展前景。同时，MoS2也如氧化石墨烯一样，具有二维片层结构且在近红外光区也有较强的吸收，也可用作光热治疗的药物载体的研究。其次，由于血红蛋白和水对808nm的激光吸收较小，所以其对人体的伤害更小，将808nm的激光应用于光热治疗具有显著前景。
专利公布号为CN 106075440 A的研究中，研究者将生物素化纳米微泡、Cy7荧光标记的生物素化抗GPC3抗体和还原性氧化石墨烯(RGO)偶联得到了一种肝癌靶向光热治疗剂，平均粒径为(316±31)nm，其可以通过超声靶向微泡破坏技术介导RGO靶向投递。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法。该方法第一次将氧化石墨烯和MoS2两种具有相似结构、可用作光热治疗的材料结合到了一起，以发挥出两者的协同作用，提高复合物载体的光热性能；将MoS2负载到GO上的实验操作方便简单，为一步水热法，在制备MoS2纳米片的同时将其负载到GO基底上；载体的制备过程反应条件较为温和，药品试剂均容易获得；当载体浓度大于等于50μg/ml时，仅需功率为2.0W/cm2的808nm激光照射3min，癌细胞的相对存活率就仅为30％左右，相比于大部分研究中的5min、10min甚至更长的照射时间既省时又节能；药物载体的药物负载率高(药物负载率＝负载的药物量/药物载体总质量)，≧80％。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述制备方法制得的肿瘤靶向光热疗法纳米载体的应用。
为解决上述第一个技术问题，发明一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，步骤如下：以氧化石墨烯作为载体，通过水热法将MoS2负载到氧化石墨烯上，进而进行聚乙二醇(简称：PEG)修饰，得到一种尺寸更小分散性更好的复合物。然后将实验所采用的药物DOX负载到该复合物上而得到具有光热转换特性的载药复合物。
作为技术方案的进一步改进：更具体地，本发明一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
S1、取钼酸铵0.13-0.53g、硫化钠0.58-2.30g，分别溶于20-30ml水中，得到钼酸铵和硫化钠溶液；取1-3wt％的氧化石墨烯溶胶2-5ml，稀释到100ml，得氧化石墨烯溶液；将钼酸铵溶液加入到氧化石墨烯溶液中，磁力搅拌20-40min，再缓慢加入硫化钠溶液，并逐滴加入3-7mol/L的盐酸8-12ml，反应0.5-2.5h；
S2、将步骤S1反应后的反应液加入1.6-2.4g L-半胱氨酸，调节pH至4.0-5.0，于180-220℃下反应20-30h；
S3、待步骤S2的反应液冷却后，于3500-7000rpm下离心洗涤4-6min，重复4-6次，弃去上清液，得样品A；
S4、取样品A，加入过量NaOH，于40-55℃下水浴反应2-4h，然后用盐酸调节pH到0.8-1.2，于10000-12000rpm下离心洗涤4-5次，弃去上清液；得样品B；
S5、取5ml样品B，加入20-50mg PEG修饰剂后超声，然后加入5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)，继续超声20-60min，再次加入3-5mg EDC，超声20-60min；然后磁力搅拌过夜，于3500-7000rpm下离心洗涤4-5次，弃去上清液，制得肿瘤靶向光热疗法纳米载体(简称：GO-MoS2复合物)。
作为技术方案的进一步改进，所述PEG修饰剂包括六臂氨基聚乙二醇(简称：6arm-PEG-NH2)、双端氨基聚乙二醇(简称：NH2-PEG-NH2)和八臂氨基聚乙二醇(简称：8arm-PEG-NH2)中的一种或多种；优选地，PEG修饰剂选自六臂氨基聚乙二醇。
作为技术方案的进一步改进：所述六臂氨基聚乙二醇分子量为10000-20000；优选的，所述六臂氨基聚乙二醇分子量为15000。
为解决上述第二个技术问题，本发明肿瘤靶向光热疗法纳米载体在负载肿瘤靶向光热疗法药物上的应用。
作为技术方案的进一步改进：本发明所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体负载药物的方法，包括如下步骤：取2ml 0.1-1.0mg/ml肿瘤靶向光热疗法纳米载体的样品，并加入2ml0.1-1.0mg/ml的阿霉素盐酸盐(简称：DOX)溶液，超声0.5-1.5h后磁力搅拌过夜，于3500-7000rpm下超滤离心洗涤4-5次，弃去超滤液；加少量水收集产品，即得具有光热转换特性的GO-MoS2载药复合物。
优选地，所述肿瘤的细胞为Hela细胞。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
1.本发明首次采用了氧化石墨烯和MoS2的复合物作为光热治疗的药物载体，制备方法较为简单便捷且条件温和。
2.本发明制备得到GO-MoS2载药复合物像其他应用于光热治疗的材料一样，具有良好的光热转换特性；相比于其他材料，其有更高的药物负载比例(药物负载率＝负载的药物量/负载的药物量+载体的质量)，≧80％。
3.本发明制备得到GO-MoS2载药复合物在NIR激光的存在下具有较高的药物释放率，在1.8W/cm2的激光功率下，其药物释放率为78％。
4.本发明制备得到GO-MoS2载药复合物相比于传统光热治疗的纳米药物载体，由于其为两种光热治疗材料的复合物，两种材料之间存在一定的协同作用，使其有更高的光热转换率，也就意味着更好的光热治疗效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明
图1：GO-MoS2在PEG修饰前(a)后(b)的AFM照片；
图2：GO-MoS2在PEG修饰前(a)后(b)的TEM照片；
图3：药物载体(40μg/ml)在不同强度激光下的升温曲线；
图4：载体在不同pH条件下的载药率曲线；
图5：载药复合物在不同pH条件下的药物释放率曲线；
图6：不同激光功率下载药复合物的药物释放曲线；
图7：有无激光条件下药物载体(GO-MoS2)的细胞毒性；
图8：有无激光条件下载药复合物(GM-DOX)的细胞毒性；
图9：有无激光条件下DOX的细胞毒性。
图10：实施例4不同PEG修饰剂修饰前后样品在水中的分散情况效果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备GO-MoS2复合物：取钼酸铵0.265g、硫化钠1.152g，分别溶于25ml水中，得到钼酸铵和硫化钠溶液；取2.5ml(质量浓度为1％)的氧化石墨烯溶胶，稀释到100ml，得GO溶液；将钼酸铵溶液加入到GO溶液中，磁力搅拌30min，再缓慢加入硫化钠溶液，并逐滴加入5mol/L的盐酸10ml，反应1h；
S2、然后向反应液中加入2g L-半胱氨酸，调节pH至4.5，放入水热釜中于200℃下反应24h；
S3、待反应液冷却后，于3500rpm下离心洗涤5min(重复6次)，弃去上清液；得样品A；
S4、修饰GO-MoS2复合物前的预处理：取样品A，加入过量NaOH，于55℃下水浴反应4h，然后用盐酸调节pH到1左右，于10000rpm下离心洗涤5次，弃去上清液；得样品B；将样品B稀释20倍后，将其滴到0.5*0.5cm的硅片上，进行AFM的制样；将其滴到铜网上，进行TEM的制样，待其自然干燥后即可进行原子力显微镜的观测；
S5、GO-MoS2复合物的PEG化：取5ml样品B，加入25mg 6arm-PEG15k-NH2超声15min，然后加入5mg EDC，继续超声30min，再次加入5mg EDC，超声20min；然后磁力搅拌过夜，于3500rpm下离心洗涤5次，弃去上清液，制得肿瘤靶向光热疗法纳米载体(简称：GO-MoS2复合物)。采取上步同样的方式进行AFM和TEM的制样，并进行观测。
DOX的负载：取2ml 0.2mg/ml PEG修饰后的GO-MoS2复合物，并加入2ml 1(也可是0.8，0.5，0.2，0.1)mg/ml的DOX溶液，超声1h后磁力搅拌过夜，于3500rpm下超滤离心洗涤5次，将超滤液收集起来，用紫外分光光度计测定490nm下的吸收值，带入DOX标准曲线可以算出超滤液中的药物含量，进而计算得出药物的负载量。加少量水收集产品，即得具有光热转换特性的GO-MoS2载药复合物。另外，配置特定pH(7.4或5.5)的体系，分别在2、4、6、8、12、24、72h后取样3ml，测定490nm下的吸收值，根据药物的标准曲线可以计算出药物在该时间范围内的释放率。
细胞实验：分别配置10-100μg/ml的PEG修饰之后的GO-MoS2复合物和载药量在1-15μg/ml的载药复合物，各加入20μl到96孔板中(3个孔为一组)，对照组加入等量的PBS(每个孔板中的细胞数量应控制在7000-8000)。探究不同浓度样品在有无近红外光下的细胞毒性(每孔照射时间为3min，激光功率为2.0W/cm2)，细胞毒性采取CCK-8进行测定。
实施例2
重复实施例1，不同之处仅在于：在制备GO-MoS2复合物的过程中，调节硫化钠的加入量为0.58g或2.30g，其余步骤与实施例1相同，可以制得MoS2负载率高低不同的样品。
实施例3
重复实施例1，不同之处仅在于：在制备GO-MoS2复合物的过程中，采用通过改良的Hammers法自制得到的氧化石墨烯粉末代替氧化石墨烯溶胶，其余步骤与实施例1相同，也可制得GO-MoS2复合物，可以用于比较不同原料对载体细胞毒性的影响。
实施例4
重复实施例1，不同之处仅在于：在GO-MoS2复合物的PEG化的过程中，采用NH2-PEG-NH2和8arm-PEG-NH2代替6arm-PEG15k-NH2，其余步骤与实施例1相同，可以制得水分散性不同的药物载体。图10显示了GO-MoS2复合物：a.修饰前；b.NH2-PEG-NH2修饰后；c.6arm-PEG15k-NH2修饰后；d.8arm-PEG-NH2修饰后的分散情况效果图。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一种肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：以氧化石墨烯作为载体，通过水热法将MoS2负载到氧化石墨烯上，进而进行PEG修饰，得到氧化石墨烯-MoS2复合物载体；
包括如下具体步骤：
S1、取钼酸铵0.265g、硫化钠1.152g，分别溶于25ml水中，得到钼酸铵和硫化钠溶液；取1wt％的氧化石墨烯溶胶2.5ml，稀释到100ml，得氧化石墨烯溶液；将钼酸铵溶液加入到氧化石墨烯溶液中，磁力搅拌30min，再缓慢加入硫化钠溶液，并逐滴加入5mol/L的盐酸10ml，反应1h；
S2、将步骤S1反应后的反应液加入2g L-半胱氨酸，调节pH至4.5，于200℃下反应24h；
S3、待步骤S2的反应液冷却后，于3500rpm下离心洗涤5min，重复6次，弃去上清液，得样品A；
S4、取样品A，加入过量NaOH，于55℃下水浴反应4h，然后用盐酸调节pH到1，于10000rpm下离心洗涤5次，弃去上清液；得样品B；
S5、取5ml样品B，加入25mg PEG修饰剂后超声，然后加入5mg EDC，继续超声30min，再次加入5mg EDC，超声20min；然后磁力搅拌过夜，于3500rpm下离心洗涤5次，弃去上清液，制得肿瘤靶向光热疗法纳米载体。
2.根据权利要求1所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，其特征在于：所述PEG修饰剂包括六臂氨基聚乙二醇、双端氨基聚乙二醇和八臂氨基聚乙二醇中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，其特征在于：所述PEG修饰剂选自六臂氨基聚乙二醇。
4.根据权利要求3所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，其特征在于：所述六臂氨基聚乙二醇分子量为10000-20000。
5.根据权利要求4所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体的制备方法，其特征在于：所述六臂氨基聚乙二醇分子量为15000。
6.如权利要求1-5中任一所述肿瘤靶向光热疗法纳米载体在制备负载肿瘤靶向光热疗法药物上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：制备肿瘤靶向光热疗法纳米药物的方法，包括如下步骤：取2ml 0.1-1.0mg/ml肿瘤靶向光热疗法纳米载体的样品，加入2ml 0.1-1.0mg/ml的阿霉素盐酸盐溶液，超声0.5-1.5h后磁力搅拌过夜，于3500-7000rpm下超滤离心洗涤4-5次，弃去超滤液；加少量水收集产品，即得具有光热转换特性的GO-MoS2载药复合物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤的细胞为Hela细胞。
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