CN105999283A - 一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺‑透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法：PLA‑PEG‑COOH溶液逐滴加入到LAP溶液中，搅拌，活化，然后滴加到PEI溶液中，得到LAP‑PLA‑PEG‑PEI，然后加入氯金酸和NaBH4，反应得LAP‑PLA‑PEG‑PEI‑(Au0)50；将活化的HA溶液滴加到LAP‑PLA‑PEG‑PEI‑(Au0)50水溶液中，搅拌，反应，然后加入DOX，搅拌反应即得。本发明成本低，方法简单，条件温和，易于操作，具有良好的应用前景。本发明的纳米材料负载DOX作为纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果。

Description

一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于载药纳米材料的制备领域，特别涉及一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法。
背景技术
癌症被认为是21世纪人类面临的重大难题之一。在使用化学药物治疗肿瘤的过程中，抗癌药物存在水溶性差、在病灶部位保留时间短以及不能特异性识别肿瘤细胞等问题对人体产生强烈的毒副作用，而且无法有效实现药物对肿瘤的杀伤效果。因此，发展一种具有肿瘤靶向作用的载体材料实现药物的负载、可控释放与靶向治疗是目前纳米医学的研究热点。
粘土类纳米颗粒，如锂皂石(Laponite，LAP)，不仅具有良好的生物相容性，还能够高效负载药物并实现药物的控制释放，在药物输送领域展现了独特的优势(Wu,Y.L.；Guo,R..；Shi,X.Y.；et a1.J.Mater.Chem.B2014,2,7410-7418.)。尽管这些文献报道的纳米粒子体系能够有效地应用于癌症的治疗，但都是一种纳米粒子只能适用于癌症治疗，没有涉及癌症的诊断功能。因此，制备一种新型、高效、多功能的纳米医学平台适用成像和化学治疗的诊疗一体化中的应用。
支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，具有支化的三维结构，表面具有大量带正电荷的氨基，为其进一步化学修饰提供了条件。PEI与其它高分子聚合物相比，它具有良好的热稳定性，在空气中低于300℃并不分解。特别是近年来发展的高分子修饰纳米材料的兴起，更是赋予其独特理化性质，拓展其应用领域。在纳米颗粒合成和修饰方面，PEI不仅可以作为稳定剂防止纳米颗粒的聚集，还可以作为还原剂制备纳米颗粒，而且PEI丰富的氨基数量就使得其包覆的纳米颗粒均可进一步功能化(Shi,X.Y.；Zhou,B..；Zheng,L.；et a1.ACS Appl.Mater.Interfaces2014,6,17190-9.)。因此，PEI是介导合成和修饰多种纳米颗粒优良的载体。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，将其修饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性，同时能延长药物缓释周期以及增加Au的加载量。透明质酸(HA)，是一种具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎动物组织和体液的主要成分。此外，HA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体分子特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体分子的特异性结合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
查阅国内外相关文献或专利，合成负载阿霉素(DOX)的聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒用于肿瘤靶向治疗与CT成像的研究尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，本发明成本低，方法简单，条件温和，易于操作，具有良好的应用前景。本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA负载DOX作为纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果。
本发明的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方
法，包括：
(1)将聚乳酸—聚乙二醇PLA-PEG-COOH溶于溶剂中，然后逐滴加入锂皂石LAP的水溶液，常温搅拌反应1-2h，透析，得到LAP-PLA-PEG-COOH；
(2)将LAP-PLA-PEG-COOH的水溶液中加入EDC进行活化2-4h，然后加入到聚乙烯亚胺PEI水溶液，搅拌2-3d，透析，得到LAP-PLA-PEG-PEI；
(3)氯金酸HAuCl4·4H2O溶于水中得到氯金酸水溶液，然后将LAP-PLA-PEG-PEI的水溶液加入氯金酸水溶液，搅拌15-30min，然后加入硼氢化钠溶液，搅拌反应1-4h，透析，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50；
(4)将透明质酸HA溶于水中，加入EDC进行活化2-4h后，加入到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50水溶液中，搅拌反应2-3d，离心，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50–HA；
(5)将LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50–HA的水溶液加入阿霉素水溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤，分散，即得负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX。
所述步骤(1)中PLA-PEG-COOH(购买于济南岱罡生物工程有限公司)，其中PEG的分子量为3000-5000，PLA的分子量为3000。
所述步骤(1)中溶剂为体积比为1:1的丙酮和水的混合溶液。
步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:2-4。
步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:3。
所述步骤(1)中透析具体为：采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
步骤(2)中EDC与LAP-PLA-PEG的摩尔比为10-12:1，LAP-PLA-PEG-COOH与PEI的摩尔比是15-20:1。
步骤(2)中EDC与LAP-PLA-PEG的摩尔比为10:1，LAP-PLA-PEG-COOH与PEI的摩尔比是20:1。
所述步骤(2)中透析具体为：采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为50000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
步骤(3)中HAuCl4·4H2O和LAP-PLA-PEG-PEI的摩尔比为50-60:1，NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比为2-5:1；硼氢化钠溶液的溶剂为冰水。
HAuCl4·4H2O和LAP-PLA-PEG-PEI的摩尔比为50:1。
步骤(4)中EDC与HA的摩尔比为10-12:1，LAP与HA的质量比是3-4:1。
步骤(4)中EDC与HA的摩尔比为10:1，LAP与HA的质量比是3.5:1。
步骤(5)中LAP与DOX的质量比2-4:1。
步骤(5)中LAP与DOX的质量比3:1。
所述步骤(5)中搅拌速度为100-150r/min；离心的速率为8000-10000r/min，离心的时间为5min。
本发明中使用PEG可以增加该材料的体内循环时间，并增加后续包裹纳米金的量，达到更加灵敏的CT造影效果。
本发明中氯金酸溶液加入后，搅拌20-40min，使氯金酸分子与聚乙烯亚胺修饰的锂皂石混合，利用氯金酸分子与聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石表面氨基的亲和力使得其进入其内部空腔，再以强还原剂NaBH4快速还原，得到聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石包裹的金纳米颗粒，很好地防止了金纳米颗粒的聚集。HAuCl4·4H2O：NaBH4：LAP-PLA-PEG-PEI摩尔比为50：250：1(NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比≥3：1)，既保证纳米金的胶体稳定性，又有效提高纳米金的含量。在加入硼氢化钠之时，应将NaBH4溶液迅速滴加到AuCl4 -与锂皂石络合物溶液中，快速还原得到产物LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50。
本发明中透明质酸(HA)是一种具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎动物组织和体液的主要成分。此外，HA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
锂皂石(Laponite，LAP)属于粘土类纳米颗粒，具有良好的生物相容性，并且被证实可以高效负载药物，是一种具有广泛应用前景的药物载体。LAP经过修饰可以得到聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石纳米颗粒LAP-PLA-PEG-PEI，它继承了LAP作为药物载体的全部优良性质，并且便于负载及稳定金纳米颗粒和进一步修饰，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50。然而，LAP-PLA-PEG-PEI本身没有对肿瘤的主动靶向效果，因此，将靶向分子连接到LAP-PLA-PEG-PEI表面，得到具有主动靶向效果的多功能锂皂石纳米颗粒用于药物和金纳米颗粒负载，是改善抗肿瘤药物载体LAP-PLA-PEG-PEI的有效途径。本发明将HA连接到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50表面，得到的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA不仅可以通过透明质酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时将材料的表面电荷转变为负电荷，降低材料毒性，提高材料稳定性，改善药物释放特性。本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50载体用于抗肿瘤药物负载和检测，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物和诊断分子探针的负载与靶向输送。
本发明使用UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、TGA(热重分析)、Zeta表面电势测量、FTIR(傅里叶变换红外光谱仪)测试等方法表征本发明制备的聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石纳米颗粒，同时用CCK8试剂盒、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验载药的锂皂石纳米颗粒对肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合的毒性与靶向性，具体测试结果如下：
(1)表面电势和水合粒径测量
修饰前后粒子的粒径以及表面电势均通过动态光散射进行测定，结果如表1所示。经聚乳酸-聚乙二醇修饰后，锂皂石的表面电势从-33.7mV变到-15.6mV，测试结果表明，锂皂石表面已经成功修饰了LAP-PLA-PEG。在表面进一步修饰了PEI之后，所得到的LAP-PLA-PEG-PEI表面电势变成34.9±0.802mV。在修饰了靶向分子HA之后，表面电势进一步降低到-18.5±0.208mV。因此，通过修饰前后的电势变化也可以证明成功地合成了LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA纳米材料。表面修饰后锂皂石的较小且具有较好的分散性，因此，仍是一种良好的载体材料。
表1LAP、LAP-PLA-PEG、LAP-PLA-PEG-PEI、LM-PEG-FA的水合直径和表面电势
(2)热重分析
在附图1所示的热重测试结果中，分析图中从200℃到800℃重量损失可知，与LAP相比，LAP-PLA-PEG-COOH和LAP-PLA-PEG-PEI在升温过程中分别损失了总质量的72.8％和78.6％。这一结果证明PLA-PEG和PEI均已成功修饰在LAP表面。
(3)紫外-可见光谱测试
在附图2所示的紫外-可见光谱测试结果中，本发明中制备得到的功能化锂皂石的表面等离子体共振(SPR)峰位于523nm，参见说明书附图3。这表明本发明中制备得到了金纳米颗粒。这一结果也证实FA已被成功修饰到锂皂石表面。在负载DOX之后，材料在480nm附近均显示出一个明显的吸收峰。根据文献报道，这个吸收峰为DOX的紫外特征吸收峰。因此，表面修饰的锂皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿瘤药物DOX。通过紫外定量分析，在投料比为LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA：DOX＝3：1的条件下，LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA的载药效率为91％.
(4)TEM测试结果
TEM测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布，参见说明书附图3。金纳米颗粒平均直径约4.6nm，尺寸分布较窄，具有良好的单分散性。
(5)体外释放结果
附图4为LAP-PLA-PEG-(Au0)50-PEI-HA/DOX的体外累积释放曲线。在48小时中，DOX在pH＝5.0的弱酸性环境中从LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX中累计释放了35±1.22％，比在pH＝7.4的中性环境中累计释放量(12.7±0.939％)高。这说明基于锂皂石的载药体系均具有pH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低。
(6)稳定性测试结果
稳定性测试结果表明：发明中制备得到的功能化锂皂石包裹的金纳米颗粒在不同温度，不同pH中具有良好的稳定性，无沉淀产生，参见说明书附图5。这表明本发明中制备的材料稳定性好。
(7)CCK8实验
CCK8测试结果表明：本发明中制备得到的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX孵化癌细胞24h后，在一定浓度范围内促进了癌细胞的凋亡，且较纯DOX而言，对癌细胞的疗效更好，起到药物治疗作用，且不含药载体材料不存在药物毒性，参见说明书附图6。
(8)细胞吞噬实验
为了证实LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的靶向作用，选择CD44受体表达的人源宫颈癌细胞HeLa细胞作为模型，采用流式细胞术分析细胞吞噬材料后产生的荧光效果。
利用流式细胞仪对HeLa细胞吞噬药物后产生的荧光效果进行了检测。附图7为DOX浓度为2.5、5、7.5、10和15μg/mL，药物和细胞共培养4小时之后细胞由于吞噬药物产生荧光的结果。可以看出，经过4小时共培养，HeLa细胞对于LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的吞噬效果显示出强烈的增强，其平均荧光值与阻断组材料平均荧光值高。实验结果证明本发明报道的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX可以通过HA的靶向作用有效提高肿瘤细胞对DOX的吞噬，从而增强DOX的抗肿瘤活性。
(9)细胞内分布实验
为了更直观的观察药物在细胞内的分布，采用激光扫描共聚焦显微镜考察了细胞与药物共培养4小时之后细胞内荧光分布情况。附图8为DOX浓度10ppm条件下HeLa细胞内荧光分布结果。可以看出本发明报道的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX可以通过HA的靶向作用提高肿瘤细胞对DOX的吞噬作用。
(10)体外X—射线衰减性能
体外X—射线衰减性能测试结果表明，负载阿霉素(DOX)的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒表现出优异的X—射线衰减系数。参见附图9。
(11)体外材料靶向HeLa细胞的CT成像
CT扫描结果表明相同金浓度下LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX复合纳米颗粒与HeLa细胞共培养后处理的细胞悬浮液的CT信号比阻断材料强，证明负载阿霉素(DOX)的聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒对HeLa细胞具有特异性靶向作用。参见附图10。
(12)体内肿瘤生长抑制研究
体内肿瘤生长测量表明，与生理盐水组相比，注射DOX，LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HA blocking，和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的实验组中裸鼠肿瘤生长明显受到抑制，而且靶向组的抑制效果优于阻断组，证明负载阿霉素(DOX)的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒对HeLa细胞具有特异性靶向作用。参见附图11。
(13)免疫组化分析
免疫组化分析表明，经过DOX处理后的裸鼠脏器，尽管肝，脾，肾没有显示出明显的损伤，但是心和肺部分出现明显的大面积坏死(完全粉色不含蓝色区域)。这个结果可以证明DOX在目前的注射剂量与注射频率下，对心和肺造成损伤。然而在LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HA blocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX处理的裸鼠心和肺中并没有发现大面积坏死区域，证明本章所研究的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX在相同的注射剂量与注射频率下，对心和肺的损伤比纯DOX明显减小。参见附图12。
综合以上实验结果可以认为，本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX可以明显提高肿瘤细胞对DOX的摄取，减少DOX对正常组织细胞的毒副作用，改善了DOX的抗癌效果，具有良好的应用前景。
本发明药物载体负载DOX得到的LAP-PLA-PEG-(Au0)50-PEI-HA/DOX纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果，用于癌细胞的靶向治疗。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作。所制备的材料有望用于体内肿瘤CT诊断，具有良好的诊断应用前景。制备得到的负载阿霉素(DOX)的聚乙烯亚胺—透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒具有良好的靶向及药物疗效，为新型纳米药物的开发打下了良好的基础。
有益效果
(1)本发明的PEI-FI-(PEG-HA)负载DOX得到的载药纳米颗粒具有良好的水溶性和生物相容性，较好的药物缓释效果与pH响应性释放特性，对高CD44受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的靶向治疗；
(2)本发明制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，易于操作，具有产业化实施的前景。
附图说明
图1为LAP，LAP-PLA-PEG-COOH和LAP-PLA-PEG-PEI的热重分析图谱；
图2为LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的紫外吸收光谱图；
图3为相关材料的TEM照片，其中(a)为LAP，(b)为LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX(插图为金纳米颗粒的晶格)，(c)为(b)的粒径分布图，(d)为(b)的能谱图；
图4为在不同pH条件下DOX从LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX中释放的累积释放曲线；
图5为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX在(a)不同温度和(b)不同pH的UV-Vis谱图；
图6为用CCK8法测试得到的HeLa细胞经过LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA、free DOX和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX处理24h后的细胞活力；
图7为流式细胞术测试得到经LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HA blocking处理4h后，HeLa对DOX的吞噬情况(纵坐标为细胞内吞DOX后的平均荧光强度，与吞噬量成正比，*p＜0.05，**p＜0.005，***p<0.001)；
图8为HeLa细胞经生理盐水NS(a)、LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HAblocking(b)和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX(c)处理4h后细胞内荧光分布，其中材料中DOX浓度均为10μg/mL，细胞核用DAPI染成蓝色；其中标尺均为20μm；
图9为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的X-射线衰减系数比较；(a)为CT成像图片，(b)为测得的X—射线衰减强度结果；
图10为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX与阻断材料的细胞CT成像效果和CT值的比较；(a)为CT成像图片，(b)为测得的X-射线衰减强度结果；
图11 HeLa移植瘤体积变化图，对实验组裸鼠在第0，7和14天进行瘤内注射，注射剂量为4mg DOX/kg，相对肿瘤体积根据初始肿瘤大小归一化，(n＝5)；
图12经过NS(a)、DOX(b)、LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HA blocking(c)和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX(d)不同治疗的裸鼠的心肝脾肺肾五大主要脏器的H&E染色组织切片照片，照片由相差显微镜拍摄，图中比例尺为100μm；
图13为本发明制备原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)在50mL PLA-PEG-COOH的丙酮与水的混合溶液(6mg/mL)中，缓慢滴加入10mLLAP的水溶液(10mg/mL)，搅拌反应1小时。反应结束后，将得到的溶液全部转移到截留分析量大小为8000-14000的透析袋中。将透析袋放入装有2L去离子水的烧杯中透析，透析持续2-4天，每天换水3-4次。透析结束后，将透析袋内产品转移到100mL玻璃瓶内4℃保存，即得到聚乙二醇修饰的LAP-PLA-PEG-COOH。
(2)取上述30mL LAP-PLA-PEG-COOH的水溶液(3mg/mL)，加入2mL EDC的水溶液(8.42mg/mL)，搅拌反应3小时。然后逐滴滴加到10.98mL PEI的水的溶液(1mg/mL)，快速搅拌反应3天。反应结束后，将得到的溶液全部转移到截留分析量大小为50000的透析袋中。将透析袋放入装有2L去离子水的烧杯中透析，透析持续2-4天，每天换水3-4次。透析结束后，将透析袋内产品转移到100mL玻璃瓶内4℃保存，即得到聚乙二醇修饰的LAP-PLA-PEG-PEI。
(3)取上述30mL LAP-PLA-PEG-PEI的水溶液(2mg/mL)，边搅拌边逐滴滴加118μL氯金酸溶液(30mg/mL)，搅拌30min后，加入1.624mg的NaBH4溶液(H2O:CH3OH(体积比)＝2:1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应3h，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50。取2mL的透明质酸水溶液(3.1mg/mL)，然后逐滴加入243μL EDC的水溶液(8.42mg/ml)，搅拌反应3小时后，逐滴加入到上述LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50溶液中，快速搅拌反应3天。反应结束后，将溶液分别转移到15mL离心管中，在转速为8000rpm条件下离心(5min)，得到的沉淀用去离子水洗涤3次后溶于10mL的水中，加入7.23mL浓度为1mg/mL的DOX水溶液，在避光的条件下磁力搅拌反应24小时，反应结束后，将溶液分别转移到15mL离心管中，在转速为8000rpm条件下离心(5min)，得到的沉淀用去离子水洗涤3次，即可得到载药纳米颗粒LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX。
实施例2
以紫外可见吸收光谱图对材料的稳定性进行分析，取0.5mg/mL实施例1制备的功能化的树状大分子材料，溶剂为蒸馏水，置于4℃，37℃，50℃的温度条件下和pH＝5，6，7，8的条件下，测其紫外可见吸收光谱。
实施例3
取实施例1所得产品以蒸馏水为溶剂，配制金浓度为0.04M的母液。之后梯度稀释出0.02、0.01、0.005、0.0025和0.005M的样品。同时，以临床用碘海醇为对照材料，以蒸馏水稀释出相应碘浓度的样品。之后，对这两组材料进行CT成像测试。
实施例4
取培养好的HeLa细胞种于6孔板中，按照200万细胞/孔的密度接种，每孔体积2mL。培养过夜后，加入上述两种各稀释梯度的样品，与细胞共培养4h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为10、20、40、80、150μM。以PBS缓冲液作为空白对照，在实验对比组中加入5μL HA溶液([HA]＝500μM)。胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在200μLPBS缓冲液中。之后，对这两组材料进行CT成像测试。
实施例5
将实施例1制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX分别用pH＝7.0和pH＝5.4的缓冲液溶解成浓度为1mg/mL的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，36，48小时时间点取样。每次取透析袋外液体1mL，测量其480nm处吸光度值，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1mL。用此方法得到体外不同pH条件下DOX从LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX中释放的释放曲线。
实施例6
配制DOX浓度分别为12.5、25.0、50.0、75.0、100.0μg/mL的纯DOX、LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的无菌生理盐水(NS)溶液(材料加入培养液中，其浓度要稀释10倍)，紫外照射过夜杀菌。收集对数生长期HeLa细胞，按照1.0×104cells/孔接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换180μL培养液，并加20μL含不同DOX浓度的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX、纯DOX或LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA的NS溶液或纯NS(对照组)，每组设5个平行样。将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃条件下培养24小时。然后按20μL/孔加入CCK8溶液，避光条件下37℃恒温静止培养3小时，然后用酶标仪测量在450nm处紫外吸收值，并根据此值计算细胞的存活率。
实施例7
配制DOX浓度分别为25、50、75、80.0、100.0、150.0μg/mL的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX无菌NS溶液，及500μM的高浓度HA溶液。紫外照射过夜杀菌，收集对数期HeLa细胞，按照2.0×105cells/孔接种在12孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900μL培养液，并添加100μL含不同DOX浓度的LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX或纯DOX的NS溶液或NS(对照组)，在实验对比组中加入5μL HA溶液([HA]＝500μM)。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。倒去培养液，用PBS洗涤3次，加入100μL胰酶消化约3分钟后，立即加入1mL左右PBS吹打并收集细胞，转移到10mL离心管中1000rpm离心5分钟，继续用1mL PBS重悬。以荧光分辨率作为参数，将滤网过滤重悬的细胞液作为样品加入到流式细胞仪中进行检测，得到细胞对药物的吞噬结果。
实施例8
将大小合适的处理过的圆形盖玻片以每孔1片的密度放入12孔板中，每孔加入1.0mL培养液浸泡过夜。弃掉浸泡培养液后，收集对数生长期HeLa细胞，按照4.0×104cells/孔接种在圆形载玻片上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900μL培养液，并添加100μL含LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的NS溶液或NS(对照组)，在实验对比组中加入5μLHA([HA]＝500μM)溶液。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。弃掉培养液，用无菌PBS洗1-2遍，每孔加2.5％戊二醛的PBS溶液800L，静置于4℃条件下固定30分钟。弃掉戊二醛溶液，用无菌PBS洗1-2遍，加DAPI(1ug/ml)，覆盖细胞即可，静置于37℃染色15分钟。将DAPI液吸出，用无菌PBS洗3遍，在载玻片上滴加一滴荧光封闭剂，将盖玻片从12孔板中勾出，将有细胞的一面压到载玻片上，用激光扫描共焦显微镜观察细胞形态及细胞内荧光分布。
实施例9
取实施例1所得产品以蒸馏水为溶剂，配制金浓度为20mM的母液。之后梯度稀释出20、10、5、2.5和1mM的样品，然后用CT成像仪测定复合纳米颗粒的X射线衰减特性,并测量各个图片的CT信号值。扫描参数为:X射线管电压100KV，X射线管电流80mA，层厚0.625mm。
实施例10
取实施例1所得产品以PBS缓冲液为溶剂，用无菌PBS缓冲液配制成1500μM的母液。之后梯度稀释为100、200、400、800nM的样品溶液。另以同样方案并且添加透明质酸阻断分子作为对照材料。取培养好的HeLa细胞种于6孔板中，按照200万细胞/孔的密度接种，每孔体积2mL。培养过夜后，加入上述两种各稀释梯度的样品，与细胞共培养4h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为10、20、40、80、150nM。以NS缓冲液作为空白对照。胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在200μLNS缓冲液中。之后，对这两组材料进行CT成像测试。
实施例11
取老鼠的肿瘤体积达到100-300mm3的时候开始实验(大约在注射肿瘤细胞四周后)，并将实验开始的时间记为第0天。在第0天，将100μL含有DOX，LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX，或者LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX的生理盐水溶液(DOX的最终浓度为1mg/mL)通过瘤内注射到各组裸鼠体内。同时，未治疗组的裸鼠注射100μL生理盐水(安慰剂)，并以此作为空白对照。在第7天和第14天分别重复注射。实验过程中，每三天用游标卡尺测量肿瘤大小，并记录裸鼠体重。同时，长期观察以记录每组裸鼠的存活时间。肿瘤体积，相对肿瘤体积，以及相对体重可以用下面的公式(1)-(3)分别计算
肿瘤体积(V)＝a×b2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
V0为肿瘤在开始治疗时的体积大小
相对体重＝M/M0 (3)
M0为裸鼠在开始治疗时的体重
实施例12
为了确定材料的生物安全性，采用H&E染色法对裸鼠主要组织器官进行免疫组化分析。实验用裸鼠分为4组，分别经过生理盐水，DOX，LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX+HAblocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX处理，其处理方法同例11所述。在第21天，杀死实验鼠并将主要脏器(心，肝，脾，肺，肾和肿瘤)取出，浸泡在10％中性福尔马林溶液中保存。将获取的脏器包埋于石蜡中，切割为厚度约4μm的切片，并按照标准步骤，用苏木精和伊红染色。用Leica DM IL LED相差显微镜观察裸鼠的主要组织器官切片，分析经过不同治疗的裸鼠的器官坏死情况。

Claims (10)

1.一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将聚乳酸—聚乙二醇PLA-PEG-COOH溶于溶剂中，然后逐滴加入锂皂石LAP的水溶液，常温搅拌反应1-2h，透析，得到LAP-PLA-PEG-COOH；
(2)将LAP-PLA-PEG-COOH的水溶液中加入EDC进行活化2-4h，然后加入到聚乙烯亚胺PEI水溶液，搅拌2-3d，透析，得到LAP-PLA-PEG-PEI；
(3)氯金酸HAuCl4·4H2O溶于水中得到氯金酸水溶液，然后将LAP-PLA-PEG-PEI的水溶液加入氯金酸水溶液，搅拌15-30min，然后加入硼氢化钠溶液，搅拌反应1-4h，透析，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50；
(4)将透明质酸HA溶于水中，加入EDC进行活化2-4h后，加入到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50水溶液中，搅拌反应2-3d，离心，得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50–HA；
(5)将LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50–HA的水溶液加入阿霉素水溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤，分散，即得负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒LAP-PLA-PEG-PEI-(Au0)50-HA/DOX。
2.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶剂为体积比为1:1的丙酮和水的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:2-4。
4.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中透析具体为：采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
5.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中EDC与LAP-PLA-PEG的摩尔比为10-12:1，LAP-PLA-PEG-COOH与PEI的摩尔比是15-20:1。
6.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中透析具体为：采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为50000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
7.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中HAuCl4·4H2O和LAP-PLA-PEG-PEI的摩尔比为50-60:1，NaBH4与HAuCl4·4H2O的摩尔比为2-5:1；硼氢化钠溶液的溶剂为冰水。
8.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(4)中EDC与HA的摩尔比为10-12:1，LAP与HA的质量比是3-4:1。
9.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(5)中LAP与DOX的质量比2-4:1。
10.根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中搅拌速度为100-150r/min；离心的速率为8000-10000r/min，离心的时间为5min。
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