CN108434121B - 一种双层核壳结构分子载体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种双层核壳结构分子载体，其特征在于以改性的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3为内核，其外表面包覆介孔二氧化硅，此双层结构称之为WCMSNs。本分子载体不仅可以同时进行磁共振成像、光热烧死肿瘤细胞，而且可以负载各种药物或者靶向分子，从而在磁共振成像和光热治疗的基础上进行药物治疗或者靶向定位。

Description

一种双层核壳结构分子载体
技术领域
本发明涉及医学材料及生物材料技术领域，尤其是涉及一种双层核壳结构分子载体。
背景技术
核壳是由一种纳米材料通过化学键或其他作用力将另一种纳米材料包覆起来形成的纳米尺度的有序组装结构。核壳结构由于其独特的结构特性，整合了内外两种材料的性质，并互相补充各自的不足，是近几年形貌决定性质的一个重要研究方向，在催化、光催化、电池、气体存储及分离方面有着广泛的应用前景。
核壳结构纳米粒子已经在生物医学领域的诸多方面实现了应用，具有很多潜在的应用价值。在生物医学领域，核壳结构纳米粒子主要被用于控制药物运输、生物体成像、细胞标记、生物传感器以及再生医学等方面。近年来，随着药物控制释放技术的日臻成熟，药物运输技术也得到了极大的发展，传统非控制性药物治疗的现状有望得到改变。但是现有的核壳结构材料功能比较单一，只能输送药物或磁性分子，自身并没有治疗方面的生理功能，材料利用率低，
目前，临床常用的X射线钼靶摄片、超声、CT或MRI，属于形态学成像，即基于肿瘤解剖结构改变来观察病灶。即便是MR弥散加权成像和灌注成像，也只是通过检测水分子运动变化、组织微循环状态等功能信息，间接达到诊断、鉴别诊断和观察疗效的目的。为了能获得更加全面的生物学信息以指导治疗方案的制定，美国哈佛大学Weissleder于1999年首次提出分子影像学(Molecular Imaging，MI)得到了广泛关注，发展迅速。
安全无辐射、高组织分辨率、高空间分辨率及高组织穿透力的磁共振成像，已成为癌症影像诊断的热点。然而磁共振成像敏感性尚不够高，如果能够提高磁共振成像对比剂或探针的T1弛豫率，那么将提升磁共振成像的敏感性，为癌症的影像学诊断及治疗效果监测提供更有效的帮助。因此，具有磁共振成像功能的核壳材料是一个较好的载体材料发展方向。但是目前尚未开发出能够与常规外壳介孔材料较好亲和的造影剂或对比剂。
考虑到耐化疗及耐放疗的肿瘤细胞对热治疗是十分敏感的，因此基于分子探针介导的癌症治疗方式，光热治疗无疑是最优的手段之一。通过局部的激光照射，光热转换分子探针可以在瘤区产生高温“烧死”肿瘤细胞，而对正常的组织器官副作用极小。常见的光热转换分子探针，如金纳米棒和硫化铜纳米颗粒等，虽然光热转换效率高，但是其不具备良好的造影性能。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种双层核壳结构分子载体。本分子载体不仅可以同时进行磁共振成像、光热烧死肿瘤细胞，而且可以负载各种药物或者靶向分子，从而在磁共振成像和光热治疗的基础上进行药物治疗或者靶向定位。
本发明的技术方案如下：
一种双层核壳结构分子载体，以改性的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3为内核，其外表面包覆介孔二氧化硅，此双层结构称之为WCMSNs。
所述钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3的制备方法为高温热解法，具体步骤为：
(1)将油酸、十八烯和GdCl3·6H2O粉末混合，通氩气后升温至150～170℃搅拌，获得淡黄色澄清液，然后停止加热使体系自然降至室温；
(2)缓慢滴加含Na2WO4·2H2O的氨水溶液，在室温下密封搅拌，溶液呈黄白色；
(3)接下来通氩气以清除体系内空气，40～60℃保持50～80min后，在80～85℃下保持60～70分钟，然后在110～130℃下保持50～60min除去氨水；
(4)除完之后，接好冷凝管，体系升温至260～280℃，并保持40～50min，然后自然降至室温；
(5)离心后丢弃上液，然后加入环己烷并超声分散，再加入酒精，超声分散，离心收集后丢弃上液，得到钨酸钆钠纳米棒的环己烷溶液，经提取即得到钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3。
改性钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3的方法为：
将钨酸钆钠纳米棒的环己烷溶液加入到去离子水中，然后滴加浓盐酸，密封搅拌，钨酸钆钠纳米棒便从上层的环己烷转移到去离子水中；离心收集，用去离子水清洗并超声分散、干燥，得到改性后的钨酸钆钠纳米棒。
优选的，可以对改性后的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3进行微波处理，然后再包覆介孔二氧化硅；所述微波的频率为2450MHz，处理时间为5～10s。
包覆介孔二氧化硅的方法为：
(1)以CTAC为表面活性剂，与TEA一起溶于去离子水中，室温下搅拌混合均匀；
(2)随后，加入改性的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3，继续搅拌1～2h；然后将整个体系转移到70～85℃水浴中，立即逐滴加入TEOS，反应完毕后，自然冷却至室温；
(3)离心收集，先用乙醇清洗，再将其溶于NaCl的甲醇溶液中，室温下搅拌；此过程反复进行，直至CTAC完全除去为止，即得介孔氧化硅包覆的改性钨酸钆钠纳米棒即WCMSNs。
本申请还提供了所述双层核壳结构分子载体的应用方法，在所述介孔二氧化硅包覆层的孔道及外表面修饰药物分子或探针分子。
所述药物或探针分子包括并不限于小分子类、肽类、蛋白类、磁性分子、核酸类物质。优选的，所述药物或探针分子包括并不限于阿霉素DOX、丝裂霉素、替拉扎明TPZ、多柔比星、紫杉醇、CD44单克隆抗体重链。
上述英文缩写的解释如下：
CTAC：十六烷基三甲基氯化铵为表面活性剂；
TEA：三乙醇胺；
TEOS：正硅酸乙酯；
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
NHS：N-羟基丁二酰亚胺；
APTES：3-氨丙基三乙氧基硅烷。
本发明有益的技术效果在于：
本发明的技术思路是：先采用改进的热解法合成NaxGdWO3纳米棒，并对其进行亲水改性；随后，采用水相生长法，在其外表面均匀包覆一层介孔硅；最后，通过化学键或者其他作用力，在介孔二氧化硅的孔道及表面负载药物、肽分子、蛋白质分子或者磁性分子、靶向分子等功能性物质。
掺杂有Gd3+的钨青铜(NaxGdWO3)具有良好的T1成像性能，其驰豫率明显优于商用钆喷葡胺(Gd-DTPA)，可达32mM-1·s-1。同时，它也是一种良好的光热转换剂，可以用于肿瘤的光热治疗。与化疗和光动力治疗相比，光热治疗无疑是更优的肿瘤治疗选择。光热治疗无氧气依赖(更适用于肿瘤的乏氧环境)，可以在瘤区迅速的升温，尤其对耐放化疗的肿瘤有很好的疗效。
本申请NaxGdWO3为功能内核，在外表面包覆介孔二氧化硅层，提高该无机纳米晶体的生物相容性的同时，进一步提高了T1弛豫率，并使其具备装载药物的潜力。另一方面，介孔硅层为后续的分子探针靶向修饰提供了一个广阔的平台。介孔硅层可以装载多种药物，不仅可以提高药物的利用率，还能解决疏水性药物无法静脉注射的问题。因此，该体系具有光热治疗联合药物治疗的潜能。例如，CD44在多种乳腺癌表面高表达，并与乳腺癌的侵袭与转移相关，如果将CD44单抗重链修饰于探针表面，赋予探针主动靶向乳腺癌的能力，同时还可以抑制乳腺癌的侵袭和转移。
热解法合成的钨酸钆钠纳米棒是亲油性的，为了在其表面包覆介孔二氧化硅，需对钨酸钆钠纳米棒进行亲水改性。本申请发现浓盐酸亲水改性的效果最好；但是包覆率还有提高的空间，即进行短时微波处理可以在不破坏钨酸钆钠纳米棒表面大量的氧空位的情况下，对钨酸钆钠纳米棒的表面电荷进行重排，使其在表面活性剂的存在下极大的提高与介孔二氧化硅的吸附性，从而使得介孔二氧化硅包覆钨酸钆钠纳米棒达到可工业化应用的程度。先用浓盐酸处理钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3，再进行微波改性，可以使后续的介孔二氧化硅吸附率提高；同样的制备方法下，进行微波改性比不进行微波改性后，钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3表面能够吸附的介孔二氧化硅的量高了20-30％。
如上所述，本发明的核壳结构提高了磁共振成像的敏感性，还赋予了局部光热治疗功能，负载功能性物质以后可以兼具靶向、磁性、药物治疗等潜能。
附图说明
图1(a)为NaxGdWO3纳米棒的XRD图；(b)为WCMSNs纳米棒的小角XRD图；(c)为CD44-WCMSNs纳米棒的FITR图。
图2为CD44-WCMSNs纳米棒的TEM图。
图3为CD44-WCMSNs及Gd-DTPA水溶液的T1-MRI成像图。
图4为CD44-WCMSNs及Gd-DTPA的T1弛豫率。
图5为WCMSNs纳米棒在抗CD44Fab改性前(a)后(b)与不同细胞(n＝8)共培养24小时后细胞的存活率。
图6为相同浓度纳米探针(100μg/mL)与细胞共培养1h后的共聚焦图片：(a)CD44-WCMSNs；(b)WCMSNs；(c)CD44抗体封闭&CD44-WCMSNs。
图7为CD44-WCMSNs尾静脉注入昆明鼠(n＝5)30天内体重增长曲线。
图8为CD44-WCMSNs尾静脉注入昆明鼠体内后各主要器官的H&E染色切片。
图9为CD44-WCMSNs(尾静脉注射3小时后)在乳腺癌荷瘤鼠体内主要器官的分布图。
图10为CD44-WCMSNs纳米棒对细胞(n＝8)的热疗效果评价(MTT法)。
图11(a)为CD44-WCMSNs纳米棒瘤内注射前后乳腺癌荷瘤鼠的T1-MR成像；(b)为CD44-WCMSNs纳米棒尾静脉注射前后乳腺癌荷瘤鼠瘤区的的T1信号改变。
图12为CD44-WCMSNs纳米棒对乳腺癌荷瘤鼠的光热成像。
图13为肿瘤经过不同治疗后的荷瘤鼠的肿瘤体积增长曲线。
图14为经不同治疗后的乳腺癌荷瘤鼠体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：制备核壳结构靶向分子探针
一、制备NaxGdWO3纳米棒
采用改进的高温热解法，制备NaxGdWO3纳米棒，制备过程如下：向三口烧瓶中加入10mL油酸，30mL十八烯0.2mmol和GdCl3·6H2O(74.34mg)粉末，通5min氩气，缓慢升温至160℃搅拌1h。获得淡黄色澄清液，然后停止加热使体系自然降至室温。缓慢滴加5mL氨水溶液(含659.72mg Na2WO4·2H2O)，在室温下密封搅拌3h，溶液呈黄白色，接下来通氩气5min以清除体系内空气，50℃保持1h，80℃下保持1h，120℃下保持1h除去氨水。
除完之后，接好冷凝管，体系开始升温，将最后的温度稳定在280℃，并保持40min，然后自然降至室温。产物清洗过程：离心(13000r/min，10min)后丢弃上液，然后加入10mL环己烷并超声分散，再加入5mL酒精，超声约5min，离心收集(13000r/min，10min)后丢弃上液。重复3次。收集最后的产物分散在20ml环己烷中备用。
二、亲水改性
采用盐酸改性法，将NaxGdWO3从油相转入水相。首先，将2.5mL NaxGdWO3的环己烷溶液，加入到5mL去离子水中。随后，滴加20μL浓盐酸，密封搅拌2h后，NaxGdWO3便从上层的环己烷转移到去离子水中。离心收集，整个过程用去离子水清洗并超声分散，重复三次。最后，将亲水改性后的ligand-free NaxGdWO3样品分散在10mL去离子水中。
三、ligand-freeNaxGdWO3表面包裹介孔氧化硅
以CTAC为表面活性剂。首先，2g CTAC和0.02g TEA溶于20mL去离子水中，室温下搅拌1.5h。随后，加入10mL的步骤二得到的ligand-free NaxGdWO3离子水溶液，继续搅拌1.5h。然后，将整个体系转移到80℃水浴中，立即逐滴加入200μL TEOS，反应1h后，自然冷却至室温。离心收集，整个过程先用乙醇反复清洗3遍，再将其溶于质量分数为1wt％的NaCl甲醇溶液中，室温下搅拌3h。此过程反复持续3遍，直至CTAC完全除去为止，最后烘干，即可得到将产物NaxGdWO3@mSiO2(WCMSNs)。
四、产品表征
NaxGdWO3纳米棒XRD图中所有峰型和NaxWO3标准卡片(JCPDS NO.70-2022)相吻合(图1(a))，表明合成的NaxGdWO3为三斜相，具有良好的结晶性。如图2中TEM图像所示，所合成的WCMSNs为棒状型，长140nm，宽80nm左右。根据小角XRD图(图1(b))可知WCMSNs含有介孔结构。
实施例2：微波改性法制备核壳结构靶向分子探针
按照实施例1的制备方法，在第二步亲水改性中，NaxGdWO3从上层的环己烷转移到去离子水中后，离心收集，整个过程用去离子水清洗并超声分散，重复三次。然后进行干燥，获得NaxGdWO3纳米棒粉末。然后在微波发生器中，以2450MHz的频率处理8s，再分散在10mL去离子水中。微波处理时，NaxGdWO3纳米棒粉末的厚度不超过1cm。后续操作同实施例1。
测试例1：磁共振成像性能
采用德国SIEMENS公司1.5T磁共振成像仪(Magnetom Aera)，头部相控阵线圈，扫描序列为冠状位maplt T1mapping序列：重复时间(repetition time，TR)15ms、回波时间(echo time，TE)1.83ms、T1estimate 1000ms，1500ms，2000ms，2500ms，3000ms，3500ms、层厚3mm、视野(field of view，FOV)160*160mm。
将实施例1制备得到的产物NaxGdWO3@mSiO2(WCMSNs)分散于去离子水中，不同Gd3+浓度(0.023，0.0115，0.00575，0.0029，0.0014mmol/L)的WCMSNs水溶液装在ep管中，ep管需浸没在去离子水中，行maplt T1mapping扫描，拟合不同浓度WCMSNs及CD44-WCMSNs水溶液的T1值，计算T1驰豫率r1值。
材料水溶液的T1-MRI成像显示，随着浓度的升高，材料水溶液的T1-MRI信号逐步增强。经计算，样品的r1值最大可达50.07mM-1·s-1(图3、图4)，是商用钆喷葡胺(Gd-DTPA)的11倍以上，证实该材料在体外有良好的磁共振T1对比剂性能。
测试例2：在核壳结构上修饰抗体CD44重链
一、制备方法：
将实施例1的产物NaxGdWO3@mSiO2(WCMSNs)分散至10mL去离子水中，然后通过共价键嫁接CD44抗体重链。
具体方法为：首先，将38mg EDC、57mg NHS和200μg抗CD44Fab溶解于8mL去离子水中，搅拌5分钟后，加入45μL APTES，继续反应24h。然后，逐滴加入2mLWCMSNs的去离子水溶液，继续反应24h后，用去离子水清洗三遍，最后，将产物CD44-WCMSNs分散在5mL去离子水中。
采用TEM-2010型透射电镜(TEM，加速电压200KV)观察样品的形貌。如图2所示。
样品元素分析在TEM附带的X射线能谱仪(EDXA)上获得。粉末XRD衍射图在RigakuD/Max-2550V型X射线衍射仪上测得(40kV，40mA，配备石墨-单频铜靶Kα辐射，λ＝0.15406nm)。借助Nicolet 7000-C型傅立叶红外光谱仪(FT–IR)分析测试，可以获得样品的傅立叶转换-红外图谱，用于分析表面官能团信息。
如图1(c)中所示，Si-O-Si(1084cm-1)及Si-OH(950cm-1)与介孔二氧化硅层相关，C＝O(1557cm-1)的存在证实CD44抗体重链已经共价键结合在氧化硅的表面。
二、细胞水平生物安全性能
选用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)及人宫颈癌细胞(HeLa)评价材料的细胞毒性。以上细胞使用含有10％胎牛血清(FBS)和1％青/链霉素的DMEM培养基。细胞在含有5％CO2的培养箱中维持在37℃进行孵育。
采用经典的MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法评价材料对细胞存活率的影响。具体步骤如下：首先倒掉培养皿中残液，并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，然后加入1mL胰酶并置入细胞培养箱中保持1min，取出后加入1mL胎牛血清终止胰酶消化，离心后用含有胎牛血清的培养基吹打开细胞并接种96孔板(104细胞/孔)。在细胞培养箱中培养24h后，用排枪吸出96孔板中的培养基，加入含不同浓度样品(0、13、50、100、250、500μg/ml)的培养基溶液(n＝8)并继续培养24h。吸出旧培养液，用PBS冲洗3次，在每个孔中加入100μL含MTT的DMEM溶液(5mg溶解于10mL DMEM溶液，其中不含FBS)，并继续培养4h后吸尽残余培养液，用排枪每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶液。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使甲瓒结晶物溶解。用酶标仪检测各孔OD值(检测波长490nm)计算细胞存活率。
MTT实验结果显示(图5)，材料与细胞共培养24h后，抗CD44Fab修饰前，WCMSNs在浓度较高时(0.5mg/mL)，对两种细胞均有一定程度的细胞毒性。抗CD44Fab修饰后，两种细胞的存活率均在90％以上，说明CD44-WCMSNs具有良好的生物相容性。
三、材料靶向性能
首先在WCMSNs上共价键结合FITC，使其能在980nm激光下发出绿色荧光，便于观察(方法同1.3.4)。本实验分别进行靶向组材料(CD44-WCMSNs)和非靶向组材料(WCMSNs)实验。在共聚焦培养皿中接种状态良好的MDA-MB-231细胞(大约104个/皿)，并培养24h以使其充分贴壁，倒掉残液并加入分散在培养基中的纳米颗粒(浓度0.3mg/mL)，共培养1h。倒掉旧的培养基，PBS冲洗三次，加入500μL DAPI(4'-6-Diamidino-2-phenylindole，1～2μg/mL)工作液，共培养15min以染色细胞核。倒去残液，PBS漂洗两次，再滴入多聚甲醛(1mL)，在配有980nm激光器的Olympus IX81共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)下进行荧光拍照。经DAPI染色的细胞核在358nm激发下，发蓝光。材料在490nm激光器激发下，FITC发出黄绿光。为了进一步验证抗CD44Fab介导的细胞吞噬机制，加入靶向材料之前，先用455μg/ml自由抗CD44Fab进行螯合0.5h后，去掉上层残液，加入CD44-WCMSNs(0.3mg/mL)和455μg/ml抗CD44Fab，共培养1h，后续DAPI实验及共聚焦拍摄步骤同上。
CD44-WCMSNs与WCMSNs被MDA-MB-231细胞吞噬的情况如图6所示，靶向探针CD44-WCMSNs被细胞吞噬量较高，而非靶向的WCMSNs吞噬量明显较低。抗体封闭实验结果显示靶向探针被吞噬的量明显降低，证实CD44-WCMSNs具有靶向乳腺癌细胞的能力。
四、活体生物安全性能
所用Balb/c裸鼠和昆明鼠均由无锡市人民医院临床研究中心暨江苏省器官移植重点实验室的SPF动物中心提供，麻醉方式为戊巴比妥钠麻醉剂腹腔注射。
将MDA-MB-231细胞悬液(2*107)分散在200μL DMEM溶液中，通过皮下注射的方式注入老鼠上肢根部及下肢根部。当移植瘤形成后，随机取5个肿瘤进行常规病理及免疫组化鉴定。当移植的肿瘤大小长到0.5cm时(10-15天)，即可进行后续试验。
将CD44-WCMSNs(2mg Gd3+/Kg，200μL)通过尾静脉注入实验组昆明鼠体内(n＝5)，观察其与对照组昆明鼠在30天内体重、活动习性等变化。在不同时间点(3天，15天，30天)取昆明鼠血液进行血常规及血生化检测，血常规指标包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积分布宽度(RDW)、血细胞压积(HCT)等。肝功能指标包括天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和血清碱性磷酸酶(AKP)，肾功能指标包括血尿素氮(BUN)和肌氨酸酐(CRE)。并取心肝脾肺肾行H&E染色，观察材料对活体各主要器官结构与功能的影响。
CD44-WCMSNs经尾静脉注入昆明鼠体内，30天内实验组与对照组昆明鼠的生活习性及体重均无明显差异(图7)。如图8所示，实验组与对照组昆明鼠的主要脏器(心，肝，脾，肺和肾)H&E染色无明显差异，证实CD44-WCMSNs纳米棒对主要器官组织没有明显的毒副作用。
进一步血液指标评价：(红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积分布宽度(RDW)、血细胞压积(HCT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血清碱性磷酸酶(AKP)、血尿素氮(BUN)、肌氨酸酐(CRE))亦未见明显异常，说明CD44-WCMSNs对血液系统及肝肾功能无明显影响。上述实验表明，CD44-WCMSNs具有良好的生物相容性。
五、活体生物适应性情况检测
将CD44-WCMSNs(2mg Gd3+/Kg)通过尾静脉注入荷瘤鼠体内(n＝4)，3小时后取心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，用王水溶解后，用ICP测定各组织中Gd3+的含量，观察材料在各组织中的分布。乳腺癌荷瘤鼠经尾静脉注射材料3小时后，其心、肝、脾、肺、肾及肿瘤中均显示有材料的存在。如图9所示，每克肿瘤组织中约含Gd3+0.33mg，证实材料在瘤区有明显富集。
采用德国SIEMENS公司3.0T磁共振成像仪(Magnetom Trio Tim)，3cm的小动物线圈，扫描序列为横断面T1WI Turbo IR序列：重复时间(repetition time，TR)2500ms、回波时间(echo time，TE)、反转时间(inversion time,TI)700ms，翻转角度(flip angle，FA)150°、层厚1mm、视野(field of view，FOV)33*40mm。
将乳腺癌荷瘤鼠分为瘤内注射及尾静脉注射两组(n＝5)，每只鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂(15mg/ml)0.1ml，待其麻醉平稳后，先行T1WI序列扫描。扫描结束后，瘤内注射组将CD44–WCMSNs(0.25mg Gd3+/Kg，20μL)原位注入MDA-MB-231移植瘤内，再进行T1WITurbo IR序列扫描。尾静脉注射组将CD44–WCMSNs(2mg Gd3+/Kg，200μL)经尾静脉注入荷瘤鼠体内，在注射后30min，1h，2h，3h，8h行T1WI Turbo IR序列扫描。
选用MDA-MB-231乳腺癌细胞，评估了CD44-WCMSNs纳米探针对肿瘤细胞的杀伤作用。如图10所示，CD44-WCMSNs组在980nm激光(1.5W/cm2)照射5min后，细胞的存活率明显降低至40％，与对照组相比p值<0.001，具有统计学差异。而仅有材料组和仅有激光照射组的细胞存活率均接近100％，与对照组相比p值均大于0.05，无显著差异。
MR成像如图11(a)所示，瘤内注射剂量为0.25mg Gd3+/Kg，肿瘤病灶区即可观察到明显的MRI增强信号，注射后瘤区T1信号值为为129.43，是注射前的2.2倍。而采用尾静脉注射时，在较低的注射剂量下(2mg Gd3+/Kg)，可见瘤区T1信号值由1100左右升高至1300多，是原先的1.23倍(图11(b))。
将乳腺癌荷瘤鼠分为对照组及实验组两组(n＝5)，每只鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂(15mg/ml)0.1ml，待其麻醉平稳后，两组分别瘤内注射PBS溶液20μL(对照组)及0.25mgGd3+/Kg浓度的CD44–WCMSNs溶液20μL(实验组)。注射后，用980nm近红外光持续照射瘤区5min(功率密度为1.5W/cm2，距离2cm)，并利用FLIRTM A325SC camera测量5min内肿瘤区域温度变化并行光热成像。
光热成像结果如图12所示，瘤内注射CD44-WCMSNs纳米棒(0.25mgGd3+/Kg)的小鼠肿瘤区，经在980nm激光照射，1min内温度由34.7℃迅速升高到45.6℃，并在5min后达到51℃；而没有注射纳米材料的肿瘤，则在同样NIR照射下，温度只是略微升高，证实了肿瘤区的高温确实是由光热制剂产生的。
六、活体治疗情况检测
为了评价CD44-WCMSNs纳米棒对荷瘤鼠的光热治疗效果，通过瘤内注射CD44-WCMSNs并结合980nm光照进行光热治疗效果评估。将荷瘤鼠分为4组(n＝5)：①空白对照组，②NIR照射组，③CD44-WCMSNs(0.25mg Gd3+/Kg)瘤内注射，④CD44-WCMSNs(0.25mg Gd3+/Kg)瘤内注射+NIR照射。NIR照射为980nm激光连续照射5min(功率密度为1.5W/cm2，距离2cm)。测量18天内4组荷瘤鼠的肿瘤的体积，并观察荷瘤鼠的体重和生活习性。
通过测量18天肿瘤的体积，评价CD44-WCMSNs纳米棒对荷瘤鼠的光热治疗效果。如图13所示，没有进行任何处理的对照组，仅进行NIR照射和仅注入CD44-WCMSNs纳米棒组，其肿瘤成线性生长；进行光热治疗组肿瘤体积逐渐缩小，最终完全消失。同样，数码照片显示，经光热治疗的荷瘤鼠在第8天已结痂，第18天时肿瘤已完全消灭。18天内各组荷瘤鼠无异常活动，各组荷瘤鼠的体重变化趋势也保持一致，表明光热治疗技术不会对荷瘤鼠产生明显的毒副作用(图14)。
测试例3：微波改性法制备的CD44-WCMSNs的生理性能
按照测试例3的方法，将实施例2制备得到的产物NaxGdWO3@mSiO2(WCMSNs)通过共价键嫁接CD44抗体重链，得到微波改性后的CD44-WCMSNs(2mg Gd3+/Kg)，然后通过尾静脉注入荷瘤鼠体内(n＝4)，3小时后取心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，用王水溶解后，用ICP测定各组织中Gd3+的含量，观察材料在各组织中的分布。与图9相对的，乳腺癌荷瘤鼠经尾静脉注射材料3小时后，其肝、脾、肺、肾中的含量均下降10％左右；每克肿瘤组织中约含Gd3+由0.33mg提升到1.62mg，大大提高了材料在瘤区的富集程度。
在光热成像实验中，瘤内注射实施例2制备得到的微波改性后的CD44-WCMSNs纳米棒(0.25mg Gd3+/Kg)的小鼠肿瘤区，经在980nm激光照射，30秒内温度即可升至50℃；温度在50℃保持的时间为测试例4的三倍以上，这表明微波改性CD44-WCMSNs纳米棒在生物体内不仅富集程度高，而且稳定性更好。
在活体治疗情况检测中，采用实施例2制备得到的微波改性后的CD44–WCMSNs纳米棒代替CD44-WCMSNs纳米棒，12天内肿瘤组织就完全消失，且不会对荷瘤鼠产生明显的毒副作用。

Claims (6)

1.一种双层核壳结构分子载体，其特征在于以改性的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3为内核，其外表面包覆介孔二氧化硅，此双层结构称之为WCMSNs；
所述改性钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3的方法为：
(1)将油酸、十八烯和GdCl3·6H2O粉末混合，通氩气后升温至150～170℃搅拌，获得淡黄色澄清液，然后停止加热使体系自然降至室温；
(2)缓慢滴加含Na2WO4·2H2O的氨水溶液，在室温下密封搅拌，溶液呈黄白色；
(3)接下来通氩气以清除体系内空气，40～60℃保持50～80min后，在80～85℃下保持60～70分钟，然后在110～130℃下保持50～60min除去氨水；
(4)除完之后，接好冷凝管，体系升温至260～280℃，并保持40～50min，然后自然降至室温；
(5)离心后丢弃上液，然后加入环己烷并超声分散，再加入酒精，超声分散，离心收集后丢弃上液，得到钨酸钆钠纳米棒的环己烷溶液，经提取即得到钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3；
(6)将钨酸钆钠纳米棒的环己烷溶液加入到去离子水中，然后滴加浓盐酸，密封搅拌，钨酸钆钠纳米棒便从上层的环己烷转移到去离子水中；离心收集，用去离子水清洗并超声分散、干燥，得到改性后的钨酸钆钠纳米棒。
2.根据权利要求1所述的分子载体，其特征在于对改性后的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3进行微波处理，然后再包覆介孔二氧化硅；所述微波的频率为2450MHz，处理时间为5～10s。
3.根据权利要求1所述的分子载体，其特征在于包覆介孔二氧化硅的方法为：
(1)以十六烷基三甲基氯化铵为表面活性剂，与三乙醇胺一起溶于去离子水中，室温下搅拌混合均匀；
(2)随后，加入改性的钨酸钆钠纳米棒NaxGdWO3，继续搅拌1～2h；然后将整个体系转移到70～85℃水浴中，立即逐滴加入正硅酸乙酯，反应完毕后，自然冷却至室温；
(3)离心收集，先用乙醇清洗，再将其溶于NaCl的甲醇溶液中，室温下搅拌；此过程反复进行，直至十六烷基三甲基氯化铵完全除去为止，即得介孔氧化硅包覆的改性钨酸钆钠纳米棒即WCMSNs。
4.一种权利要求1所述的双层核壳结构分子载体在制备药物中的用途，其特征在于在所述介孔二氧化硅包覆层的孔道及外表面修饰药物分子或探针分子。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物或探针分子包括小分子类、肽类、蛋白类、磁性分子或核酸类物质。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物或探针分子包括阿霉素、丝裂霉素、替拉扎明、多柔比星、紫杉醇或CD44单克隆抗体重链。
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