CN109718197A - 一种磁性可注射水凝胶、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水凝胶制备技术领域，尤其涉及一种磁性可注射水凝胶、制备方法及应用，公开了一种磁性可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：制备浓度为50～80mg/mL的丝素蛋白水溶液并于4℃下保存，制备水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液；将丝素蛋白水溶液稀释至浓度为30mg/mL，然后向其中加入水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液，用移液枪吹打至均匀，形成混合溶液；对混合溶液在冰浴条件下进行超声破碎；将超声破碎后的混合溶液转移到容器中，静置凝胶化得到磁性可注射水凝胶；本发明制备方法简单，制备的磁性可注射水凝胶具有良好的生物相容性和较高的磁热升温效果，同时具有优异的核磁成像能力，效果稳定。

Description

一种磁性可注射水凝胶、制备方法及应用

技术领域

本发明属于水凝胶制备技术领域，尤其涉及一种磁性可注射水凝胶、制备方法及应用。

背景技术

当今，乳腺癌是对女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7～10％。根据国家癌症中心统计的数据显示，全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位。因此研究乳腺癌诊断和治疗的新技术和新方法是肿瘤临床医学领域重要的研究方向。

热疗被认为是肿瘤消退最有效的治疗方法之一，是一种利用物理能量在人体组织中所产生的热效应，并根据肿瘤细胞和正常细胞对热的敏感性不同而杀死肿瘤细胞的疗法。将磁性纳米材料注射到肿瘤组织中，在外加交变磁场作用下产生能量并均匀释放给肿瘤组织。由于肿瘤组织中血液供给不足，使得肿瘤细胞中热量扩散较慢，导致局部温度升高，从而杀死肿瘤细胞。

主要的热疗方式有放射治疗、微波、高强度聚焦超声，但由于这些方法存在消融效率低和不完全消融的缺点，容易导致肿瘤组织或细胞的残留，最终致使肿瘤复发。而以功能纳米粒子为基础的光热治疗由于较高的光热转化率也能诱导细胞凋亡或死亡，但受光穿透深度的影响，也限制了其在临床治疗的进一步转化。基于将电磁能转化为热能的磁热疗法可以作为一种替代的消融策略来实现肿瘤的切除，这种方法不受穿透深度的限制，通常作为能量转化媒介的是一些磁性纳米颗粒，在外部磁场的作用下，磁性纳米颗粒具有较高的热转化效率。

磁热疗法具有无创或者微创、安全性能较好的特点，但目前其巨大潜能尚未得到充分开发与应用，主要原因是与磁热疗法相关的研究未深入，比如用于磁热疗法的材料选择难以确定，以往用于生物体内热疗的磁性纳米颗粒材料生物相容性较差，对生物体有一定的毒性。因此为了推进磁热疗法的发展开发一种生物相容性好的磁性纳米材料是目前急需解决的问题。

蚕丝蛋白是一种天然的蛋白质纤维，具有较好的生物安全性、相容性、稳定性和优良的综合力学性能，而且丝蛋白在自然界中存在广泛，来源丰富，成本低廉。这种天然纤维可以在一定条件下经再生制备各种宏观尺度上的蛋白质材料，如凝胶、膜、多孔支架等，且已广泛应用于医学、生物技术、日用化工等各个领域，但丝素蛋白用于磁性纳米材料还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：现有磁热疗法用的磁性纳米材料生物相容性差，提供了一种磁性可注射水凝胶、制备方法及应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明包括一种磁性可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备质量体积浓度为50～80mg/mL的丝素蛋白水溶液并置于4℃冰箱中保存，制备水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液；

(2)将步骤(1)的丝素蛋白水溶液稀释至质量体积浓度为30mg/mL，然后向其中加入水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液，吹打至均匀，形成混合溶液；

(3)对混合溶液在冰浴条件下进行超声破碎；

(4)将超声破碎后的混合溶液转移到容器中，静置凝胶化得到磁性可注射水凝胶。

所述步骤(2)中用移液枪进行吹打。

所述丝素蛋白水溶液的制备方法为：

首先使用碳酸钠对蚕茧进行脱胶并烘干；

然后放在容器中，使用溴化锂溶液溶解，得到高浓度的蚕丝蛋白溶液；

将溶好的高浓度蚕丝蛋白水溶液使用透析法提纯；

最后测定制备的丝素蛋白水溶液浓度。

所述水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液的制备方法为：

首先通过高温油相法合成四氧化三铁纳米颗粒；

然后经过转相得到水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液；

以测得的Fe浓度计算水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液浓度。

水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液质量体积浓度为8～10mg/mL。

所述的步骤(2)中丝素蛋白水溶液的稀释剂为去离子水。

所述的步骤(2)中，向丝素蛋白水溶液中加入水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液时，使四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL。

所述的步骤(3)中超声破碎在超声破碎机中进行。

一种使用磁性可注射水凝胶的制备方法制备得到的磁性可注射水凝胶。

一种磁性可注射水凝胶在制备杀伤癌细胞药物中的应用。

本发明公开的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，将丝素蛋白水溶液与水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液混合后，先用移液枪对混合液进行吹打，使四氧化三铁纳米颗粒在丝素蛋白水溶液中温和地分散开来，避免剧烈混合导致丝素蛋白变性，再进行超声，超声不仅起到破碎作用，而且促使丝素蛋白的无规则卷曲结构向β折叠形式转变，将磁性纳米颗粒均匀渗入包封在丝素蛋白网络结构内部，丝素蛋白是一种天然的蛋白质纤维，具有较好的生物安全性、相容性、稳定性和优良的综合力学性能，磁性四氧化三铁纳米颗粒具有较高的磁热转化效率和优异的核磁成像能力，在超声破碎作用下将磁性四氧化三铁均匀分散于丝素蛋白网络结构中，形成的具有磁性的可注射水凝胶，具有较好的生物相容性，较高的磁热转化效率，优异的核磁成像能力，可以起到抑制肿瘤生长和指导肿瘤治疗的作用，形成的具有磁性的可注射水凝胶具有孔道结构，与气凝胶相比，该孔道三维网络结构使本发明水凝胶具有特殊的含水微环境，在力学性能方面可塑性强，在剪切力的作用下可注射的效果。将四氧化三铁经过转相制成水相四氧化三铁，提高了丝素蛋白水溶液与四氧化三铁纳米颗粒的相容性，提高了磁性可注射水凝胶的均匀性及效果稳定性。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明制备方法简单，制备的磁性可注射水凝胶具有良好的生物相容性和较高的磁热升温效果，同时具有优异的核磁成像能力，效果稳定。

附图说明

图1为实施例1所合成的四氧化三铁纳米颗粒的TEM照片；

图2为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶在真空冻干后的高倍率TEM照片；

图3为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶在真空冻干后的高倍率SEM照片；

图4为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶真空冻干后的XRD谱图；

图5为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的磁热升温数据图；

图6为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的磁热红外成像图；

图7为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的细胞安全性测试数据图；

图8为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的细胞磁热杀伤数据图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

制备本发明的磁性可注射水凝胶需要的原料为水相四氧化三铁纳米颗粒和丝素蛋白水溶液，本实施例制备水相四氧化三铁纳米颗粒和丝素蛋白水溶液，步骤如下：

水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液的制备：

通过高温油相法合成四氧化三铁纳米颗粒，得到油相的四氧化三铁颗粒；经过转相得到水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液，以ICP测得的Fe浓度计算其浓度，得到水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液质量体积浓度为8mg/mL。

丝素蛋白水溶液的制备：

(1)使用无水碳酸钠粉末和去离子水配制2.12g/L的碳酸钠水溶液，在加热器上煮沸，溶液沸腾后加入5g家蚕蚕茧，在沸水中脱胶30分钟，将脱胶后的沸水倒去，加去离子水反复洗涤5次，20分钟更换一次，烘干，烘干时间为2天；

(2)将烘干的蚕茧放在小玻璃瓶中，加入20mL9.3mol/L的溴化锂溶液，放在60℃水浴锅中水浴4小时，过程中轻轻摇晃瓶身，使蚕丝完全均匀溶解，得到高浓度的蚕丝蛋白溶液；

(3)将溶好的高浓度蚕丝蛋白溶液放入透析袋中提纯，透析使用的透析袋分子量为3500，外界低浓度体系为去离子水，透析时间为3天，过程中需要更换6～7次去离子水；

(4)测定制备的蚕丝蛋白水溶液浓度，质量体积浓度为50mg/mL。

图1为实施例1所合成的四氧化三铁纳米颗粒的透射电镜照片(TEM)，从图中可以看出所合成的四氧化三铁纳米颗粒的形状为立方体，直径约22nm。

实施例2

本实施例制备磁性可注射水凝胶，制备步骤如下：

(1)用去离子水将实施例1制备的丝素蛋白水溶液的浓度调整为30mg/mL后，取2mL分别放入标记为1、2、3、4的4个塑料离心管中，向每个塑料离心管中加入四氧化三铁纳米颗粒水溶液，其中每个离心管中加入的四氧化三铁纳米颗粒的质量如表1，使四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比分别为0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，然后用移液枪吹打至肉眼观察均匀，得到混合溶液；

(2)将步骤(1)得到的4组混合溶液固定在冰浴的烧杯中，依次放入超声破碎机进行超声破碎，使用的破碎杆型号为ψ6，时间为10分钟；

(3)将破碎好的4组混合溶液依次转移分装到1mL注射器中，做好1、2、3、4组标记，竖直静置凝胶化得到磁性可注射水凝胶，放入4℃冰箱中存储。

表1各离心管中丝素蛋白水溶液与四氧化三铁纳米颗粒的加入量

塑料离心管编号	丝素蛋白水溶液的体积(mL)	四氧化三铁纳米颗粒的质量(mg)
			1	2	0
2	2	1
			3	2	2
4	2	4

图2为实施例2所合成的四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL磁性可注射水凝胶在真空冻干后的高倍率透射电镜(TEM)，从图中可以清晰地看出四氧化三铁颗粒(小立方块)被包封在蚕丝蛋白凝胶网络结构内。

图3为实施例2所合成的四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL磁性可注射水凝胶在真空冻干后的高倍率扫描电镜(SEM)照片，从图中可以看出凝胶具有孔道结构，该孔道三维网络结构使水凝胶具有特殊的含水微环境，在力学性能方面可塑性强，在剪切力的作用下可注射。

图4为实施例2所合成的四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL磁性可注射水凝胶真空冻干后的XRD测试结果，通过将峰与JADE标准卡片对比分析后得出，峰与磁铁矿(JCPDS编号19-0629)匹配，证实了磁性可注射水凝胶中存在氧化铁。

实施例3

本实验例对实施例2制备的磁性可注射水凝胶进行磁热升温效果测试。

(1)将实施例2的1、2、3、4组样品取出500μL，分别装在小塑料离心管盖中；

(2)搭好红外热像仪装置，将磁热装置磁场强度调好，磁场强度为25KA/m。将步骤(1)

中的4组样品分别进行磁热测试，每次测试10分钟，并每隔0.5分钟记录一次温度数据；

(3)数据处理，处理结果见图5，图5中SH、MSH1、MSH2、MSH3分别对应实施例2中

的1、2、3、4组样品。

从图5中可以看出随着四氧化三铁纳米颗粒加入量的增加，磁性可注射水凝胶所升到的温度也越高，始末温度的变化也越大。可见本发明所得的磁性可注射水凝胶在外界交变磁场下的磁热升温效果可通过改变四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液质量体积比来调节，四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL时得到的磁性可注射水凝剂具有良好的磁热升温效果。

图6为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的磁热红外成像图，从图中看红外热成像图与磁热升温数据相匹配。

实施例4

本实施例对实施例2制备的磁性可注射水凝胶进行细胞实验。

1、细胞安全性实验：

(1)在96孔板培养4T1细胞爬片，一共5个小组，每个小组5个孔(5平行)，每个孔加入100μL培养基，培养时间为24小时；

(2)待细胞培养好后，在其中4个小组分别加入实施例2中得到的1、2、3、4组样品，第5组为对照组，加入后共孵育24小时后，用酶标仪进行测试，测试结果见图7，其中SH、MSH1、MSH2、MSH3分别对应实施例2中的1、2、3、4组样品，control为对照组。

2、细胞磁热杀伤实验：

(1)在48孔板培养4T1细胞爬片，一共5个小组，每个小组4个孔(4平行)，每个孔加入200μL培养基，培养时间为24小时，培养好后，将爬片转移到5个1mL小培养皿中(记为1、2、3、4、5号)，每个小培养皿放4个细胞爬片；

(2)将实施例2中的1、2、3、4组样品分别对应标号各注射100μL加入小培养皿中，第5组为对照组，加入后共孵育3小时；

(3)共孵育结束后，搭好红外热像仪装置，对5组细胞爬片分别进行磁热测试，将磁热装置磁场强度调好，磁场强度为25KA/m，磁热时间为12分钟；

(4)磁热结束后，再共孵育24小时，用酶标仪进行测试，测试结果见图8。

图7为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的细胞安全性测试数据图，从图中可以看出未加四氧化三铁纳米颗粒的蚕丝蛋白水凝胶和磁性可注射水凝胶对4T1细胞都是无毒的，具有较高的生物安全性。

图8为实施例2所合成的磁性可注射水凝胶的细胞磁热杀伤数据图，从图中可以看出随着四氧化三铁纳米颗粒加入量的增加，对4T1细胞杀伤效果呈现增强趋势，其中四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL时，磁性可注射水凝胶对细胞的杀伤效果最好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备丝素蛋白水溶液及水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液；

(2)将步骤(1)的丝素蛋白水溶液稀释至质量体积浓度为30mg/mL后，向其中加入水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液，吹打至均匀形成混合溶液；

(3)对混合溶液在冰浴条件下进行超声破碎；

(4)将超声破碎后的混合溶液转移到容器中，静置凝胶化得到磁性可注射水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的丝素蛋白水溶液质量体积浓度为50～80mg/mL，所述的丝素蛋白水溶液置于4℃冰箱中保存。

3.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中用移液枪进行吹打。

4.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白水溶液的制备方法为：

首先使用碳酸钠对蚕茧进行脱胶并烘干；

然后放在容器中，使用溴化锂溶液溶解，得到高浓度的丝素蛋白溶液；

将溶好的高浓度丝素蛋白水溶液使用透析法提纯；

最后测定制备的丝素蛋白水溶液浓度。

5.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液的制备方法为：

首先通过高温油相法合成四氧化三铁纳米颗粒；

然后经过转相得到水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液；

以测得的Fe浓度计算水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液浓度；

所述的水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液质量体积浓度为8～10mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中丝素蛋白水溶液的稀释剂为去离子水。

7.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，水相四氧化三铁纳米颗粒水溶液中的四氧化三铁纳米颗粒与丝素蛋白水溶液的质量体积比为2mg/mL。

8.根据权利要求1所述的一种磁性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中超声破碎在超声破碎机中进行。

9.一种使用如权利要求1～8所述的磁性可注射水凝胶的制备方法制备得到的磁性可注射水凝胶。

10.一种如权利要求9所述的磁性可注射水凝胶在制备杀伤癌细胞药物中的应用。