CN107365378B

CN107365378B - 类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107365378B
Application number: CN201610318098.4A
Authority: CN
Inventors: 高卫平; 孙蒙蒙
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Zhongshan Huazi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2036-05-13
Also published as: CN107365378A

Abstract

本发明公开了类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料及其制备方法与应用。本发明公开的纳米材料，为类弹性蛋白多肽修饰纳米颗粒得到的材料；类弹性蛋白多肽具有肿瘤微环境响应性，是如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)在蛋白质P的氨基酸序列中插入半胱氨酸残基或所述含有半胱氨酸残基的多肽得到的具有相同功能的蛋白质，所述蛋白质P为将序列1的第17‑21位所示的多肽进行30‑100次重复得到的蛋白质；纳米颗粒具有表面等离子共振效应，为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒或金‑银复合纳米颗粒。实验证明，本发明的纳米材料具有较高的光热转化率和非常好的肿瘤抑制作用，可以用来治疗肿瘤。

Description

类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域中类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤光热治疗(photothermal therapy,PTT)作为一种利用局部过高热杀伤肿瘤的方法，研究由来已久，可用于近红外激光热疗的纳米材料种类繁多。包括：有机化合物如ICG，高分子如聚吡咯，碳纳米材料(碳纳米管、C₆₀)等共轭效应的纳米体系；无机类如金纳米材料(金纳米壳、金纳米棒、金纳米星)、钯纳米颗粒等。这些纳米材料本身具有近红外吸收特性，可直接用于光热治疗。但它们或具有毒性，或反应过程复杂不可控，难以临床应用。

金纳米颗粒(gold nanoparticles,GNPs)是一种广泛用于临床检测与治疗研究的纳米材料，具有良好的热传导特性，易于合成、可辅助CT成像，临床未见副作用。由于其表面的独特电子分布特性，GNPs彼此靠近后会产生表面等离子体共振效应(surface plasmonresonance,SPR)，导致吸收峰向近红外区移动，可将近红外区激光转化为热，从而用于肿瘤光热治疗。目前研究多利用高分子修饰GNPs进而组装为光热治疗纳米材料，所用高分子包括利用亲疏水作用组装的嵌段高分子或高分子混合物；利用微环境刺激下变构、自组装的pH响应性高分子；利用碱基互补配对自组装的DNA分子；或者直接在纳米凝胶内部原位合成GNPs得到的胶束。然而，这些GNPs胶束很不稳定，尤其是在体内复杂的环境中，当高分子间相互作用力不足以稳定高密度的GNPs时，胶束极易瓦解。同时，高分子合成复杂、成本高，分子量不可控，在质量控制中存在很大弊端。而且，其生物相容性、安全性也有待商榷。

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)来源于弹性蛋白的疏水结构域，由五肽重复单元构成：(XGVPG)，其中X为除脯氨酸(Pro)外的任意氨基酸。ELP具有温度响应特性，其相转变过程可逆：当温度升高时，ELP由无规卷曲转变为螺旋构象，同时释放其结合的水分子，聚集沉淀；当温度降低时，ELP分子结构舒展，恢复可溶状态。

因此，研发合成简单、无毒、无免疫原性、生物相容的智能光热转化纳米材料，对于肿瘤光热治疗尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米材料，其名称为ELP-GNPs，为类弹性蛋白多肽修饰纳米颗粒得到的材料；所述类弹性蛋白多肽具有肿瘤微环境响应性；所述纳米颗粒具有表面等离子共振效应。

上述纳米材料中，所述肿瘤微环境响应性可为温度响应性、pH响应性或肿瘤基质金属蛋白酶响应性。

上述纳米材料中，所述纳米颗粒在组装/聚集后具有近红外光热转化性能。

上述纳米材料中，所述类弹性蛋白多肽其名称为ELP，可为如下A1)-A6)中的任一种：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第17-316位的蛋白质；

A3)将序列表中序列1所示或序列1的第17-316位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A4)在序列1的第17-316位的氨基酸序列中插入半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的多肽得到的具有相同功能的蛋白质；

A5)在蛋白质P的氨基酸序列中插入半胱氨酸残基或所述含有半胱氨酸残基的多肽得到的具有相同功能的蛋白质，所述蛋白质P为将序列1的第17-21位所示的多肽进行30-100次重复得到的蛋白质；

A6)在A1)或A2)或A3)或A4)或A5)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，序列1由318个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的ELP，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的ELP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的ELP的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述A3)包括在序列1的第17-316位的氨基酸序列的N端或/和C端连接半胱氨酸残基或所述含有半胱氨酸残基的多肽得到的蛋白质。

上述A4)中，所述蛋白质P中的序列1的第17-21位所示的多肽重复次数可以根据具体需要进行确定，如60次。

上述A4)包括在所述蛋白质P的N端或/和C端连接半胱氨酸残基或所述含有半胱氨酸残基的多肽得到的蛋白质。

上述纳米材料中，半胱氨酸残基或所述含有半胱氨酸残基的多肽具有巯基活性。所述含有半胱氨酸残基的多肽可为含有功能性半胱氨酸与组氨酸标签的多肽，如序列1的第1-7位所示的多肽。

上述纳米材料中，所述纳米颗粒可为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒或金-银复合纳米颗粒。

上述纳米材料可按照如下纳米材料的制备方法制备。

为解决上述技术问题，本发明还提供了纳米材料的制备方法，所述方法包括：将ELP与纳米颗粒进行反应得到所述纳米材料；ELP与所述纳米颗粒中Au的摩尔比可为77.5：1。

上述纳米材料的制备方法中，ELP的用量满足使所述纳米颗粒均可被ELP修饰的条件，即与所述纳米颗粒的用量相比，ELP的用量是过量的。

上述纳米材料的制备方法中，所述反应的温度可为低于ELP相转变温度的任一温度环境，如4℃。所述反应可在无光环境中进行。所述反应的时间具体可为6-24小时(如12小时)。

上述纳米材料的制备方法中，所述纳米颗粒可为任意具有SPR效应的等离子纳米颗粒，如金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒或金-银复合纳米颗粒。

上述纳米材料的制备方法还可包括对得到的纳米材料进行洗涤的过程。所述洗涤可用PBS进行。

上述纳米材料的制备方法中，ELP可通过在生物细胞表达ELP的编码基因得到。ELP在所述生物细胞中得到表达后还可通过反相转变循环技术(ITC)进行纯化。所述生物细胞可为细菌，如大肠杆菌。

上述纳米材料的制备方法还可包括在ELP与所述纳米颗粒进行反应前将ELP用三(2-羧乙基)膦进行预处理。

上述纳米材料的制备方法中，所述预处理包括将ELP与三(2-羧乙基)膦进行孵育。所述孵育可在液体环境中进行。所述孵育的时间可为15-45min，如30min。所述孵育可在0-10℃下进行，如4℃。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于制备ELP-GNPs的成套试剂，所述成套试剂包括M1和M2：

M1、ELP或与ELP相关的生物材料；所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码ELP的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

M2、纳米颗粒或用于制备所述纳米颗粒的物质。

上述成套试剂还可仅由上述M1和M2组成。

上述成套试剂中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的核酸分子：

b1)编码序列是序列表中序列2的的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ELP的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码ELP的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2由954个核苷酸组成，编码序列1所示的ELP。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ELP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ELP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ELP且具有ELP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述成套试剂中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述成套试剂中，B2)所述的含有编码ELP的核酸分子的表达盒(ELP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ELP的DNA，该DNA不但可包括启动ELP基因转录的启动子，还可包括终止ELP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的载体构建含有所述ELP基因表达盒的重组载体。

上述成套试剂中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为文献(McDaniel et al.Recursive Directional Ligation by PlasmidReconstruction Allows Rapid and Seamless Cloning of Oligomeric Genes，Biomacromolecules)中的pET-24a(+)。

B3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码ELP的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pET-24-ELP，pET-24-ELP为利用PRe-RDL的方法(McDaniel et al.RecursiveDirectional Ligation by Plasmid Reconstruction Allows Rapid and SeamlessCloning of Oligomeric Genes，Biomacromolecules)在所述pET-24a(+)中插入序列2所示的DNA片段得到的重组载体，pET-24-ELP能表达序列1所示的ELP。

上述成套试剂中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌具体可为大肠杆菌。

上述成套试剂中，所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入所述微生物中得到的表达ELP的重组微生物，如将所述pET-24-ELP导入大肠杆菌中得到的重组菌。

上述成套试剂中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

上述成套试剂中，所述纳米颗粒可为任意具有SPR效应的等离子纳米颗粒，如金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒或金-银复合纳米颗粒。

上述成套试剂中，所述用于制备所述纳米颗粒的物质可由四氯金酸或水合四氯金酸以及制备所述纳米颗粒的其他试剂组成。所述用于制备所述纳米颗粒的物质也可仅为四氯金酸或水合四氯金酸。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于治疗肿瘤的系统，所述系统包括H1和H2，所述H1为ELP-GNPs，所述H2为能发射近红外光的仪器。

所述系统也可仅由所述H1和所述H2组成。所述能发射近红外光的仪器可为能发射近红外激光的仪器，如激光仪。所述近红外激光具体可为808nm激光。

为解决上述技术问题，本发明还提供了用于治疗肿瘤的药物，所述药物包括ELP-GNPs。

上述药物中，所述药物可仅由所述纳米材料作为其活性成分，还可以所述纳米材料与其他具有抗肿瘤的物质共同作为其活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了ELP或所述生物材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、ELP-GNPs在制备治疗肿瘤产品中的应用；

X2、ELP-GNPs在治疗肿瘤中的应用；

X3、所述纳米材料的制备方法在制备治疗肿瘤产品中的应用；

X4、所述成套试剂在制备治疗肿瘤产品中的应用；

X5、所述系统在治疗肿瘤中的应用；

X6、所述药物在治疗肿瘤中的应用；

X7、ELP在制备治疗肿瘤产品中的应用；

X8、ELP在治疗肿瘤中的应用；

X9、所述生物材料在制备治疗肿瘤产品中的应用；

X10、所述生物材料在治疗肿瘤中的应用。

上述应用中，所述治疗肿瘤产品可为治疗肿瘤的药物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了肿瘤的治疗方法，所述方法包括：将ELP-GNPs置入肿瘤中，用近红外激光照射所述肿瘤，实现对肿瘤的治疗。

上述肿瘤的治疗方法中，所述近红外激光具体可为808nm激光。所述用近红外激光照射所述肿瘤具体可采用可发射所述近红外激光的激光器进行照射，条件具体可为1.5W/cm²～2.5W/cm²。照射的时间可为1min～10min，如3min～7min。

上述肿瘤的治疗方法中，所述用近红外激光照射所述肿瘤可在将ELP-GNPs置入所述肿瘤2min-1.5h进行，如20-60min，具体可为45min。

所述将ELP-GNPs置入肿瘤中可将ELP-GNPs悬浮液置入所述肿瘤中。所述ELP-GNPs为将ELP-GNPs悬浮于PBS或生理盐水中得到的液体。所述ELP-GNPs悬浮液中ELP-GNPs的浓度以金来计，所述ELP-GNPs悬浮液的浓度为30-300mg Au/L，如60-180mg Au/L，具体可为90mg Au/L、105mg Au/L或120mg Au/L。

本发明中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

实验证明，实验证明，本发明的ELP-GNPs在激光作用下具有杀伤肿瘤细胞的作用，对肿瘤具有很好的治疗效果：单独的ELP-GNPs或激光无法杀伤细胞；当ELP-GNPs与激光共同作用时，激光光斑范围内的肿瘤细胞可被全部杀伤；ELP-GNPs与激光共同作用的动物肿瘤逐渐减小，在第9天完全消失，在治疗后36天的持续观察中动物全部存活，肿瘤不再复发。本发明的ELP-GNPs细胞无毒性，没有明显的副作用，并且ELP-GNPs可以代谢性降解，ELP-GNPs在肿瘤光热治疗后可逐步扩散，经肝、肾排出体外。在激光作用下，ELP-GNPs浓度达到60mg Au/L时对肿瘤细胞开始产生杀伤效果，ELP-GNPs浓度在60、90、105、120和180mg Au/L时的细胞存活率分别为39.03％±12.32％、18.22％±12.72％、4.32％±7.47％、1％±3％和0，达到180mg Au/L时可杀死全部肿瘤细胞。

本发明的ELP-GNPs(T_t<37℃)，体温环境即自发组装为光热治疗增敏剂，ELP-GNPs无毒、无免疫原性；不仅具有温度响应的智能性，而且提高了光热转化效率；同时纳米材料在肿瘤内部充分分散、保留，提高了材料的利用度；进而为肿瘤光热治疗的临床应用坚实的技术基础。本发明的温度响应性ELP-GNPs纳米材料具有较高的光热转化率和非常好的肿瘤抑制作用，与现有技术中光热治疗纳米材料相比表现出更加优异的功效。因此，可以利用ELP-GNPs治疗肿瘤。

附图说明

图1为ELP纯化前后的SDS-PAGE结果。其中，泳道Marker为蛋白标样，泳道1为细胞裂解液，泳道2为超声破碎后上清液(即上清液1)，泳道3为ITC上清液(即ELP溶液)，泳道4为ITC沉淀。

图2为DLS分析ELP、GNPs、ELP-GNPs的水合半径的结果。

图3为DLS分析ELP-GNPs的温度响应聚集前后的水合半径。

图4为ELP-GNPs的相转变温度与浓度的相关性。

图5显示了TEM表征ELP-GNPs的聚集情况。

图6显示了Vis-UV分析ELP-GNPs聚集后吸收谱图变化。

图7显示了升温曲线分析ELP-GNPs的光热转化效果。

图8显示了ELP-GNPs的光热转化效率。

图9显示了ELP-GNPs在激光作用下光热杀伤肿瘤细胞效果。其中，白色虚线为激光束的照射界限；i、ii均为未加ELP-GNPs和PEG-GNPs的结果，i为未加ELP-GNPs和PEG-GNPs并且未用激光处理的结果，ii为只用激光处理的结果；iii、iv为ELP-GNPs的结果，iii为只加ELP-GNPs的结果，iv为ELP-GNPs结合激光作用结果；v和vi均为PEG-GNPs的结果，v为只加PEG-GNPs的结果，vi为PEG-GNPs结合激光作用结果。

图10显示了ELP-GNPs光热杀伤肿瘤细胞与浓度的相关性。

图11显示了ELP-GNPs纳米颗粒的细胞毒性测试结果。

图12显示了光声成像分析ELP-GNPs瘤内注射后原位组装情况，其中，i为ELP-GNPs，ii为PEG-GNPs。

图13显示了ELP-GNPs瘤内注射后CT成像效果。其中Blank组表示未注射ELP-GNPs和PEG-GNPs的肿瘤小鼠模型的CT成像结果。

图14显示了光热成像表征ELP-GNPs瘤内注射后光热转化效果。

图15显示了ELP-GNPs抑制肿瘤生长情况。其中，ELP-GNPs/Laser表示ELP-GNPs光热治疗组，PEG-GNPs/Laser表示PEG-GNPs光热治疗组，PBS/Laser表示PBS光热治疗组。

图16显示了小鼠光热治疗后的生存曲线。其中，ELP-GNPs/Laser表示ELP-GNPs光热治疗组，PEG-GNPs/Laser表示PEG-GNPs光热治疗组，PBS/Laser表示PBS光热治疗组。

图17显示了小鼠光热治疗后肿瘤生长实物图。其中，Laser表示光热治疗，No-laser没有进行光热治疗。

图18显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。其中，ELP-GNPs/Laser表示ELP-GNPs光热治疗组，PEG-GNPs/Laser表示PEG-GNPs光热治疗组，PBS/Laser表示PBS光热治疗组。

图19显示了小鼠光热治疗30天后ELP-GNPs在心脏、肝、肾等器官的分布情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料(ELP-GNPs)的制备

本实施例提供的类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料，其名称为ELP-GNPs，为类弹性蛋白多肽修饰的金纳米颗粒；类弹性蛋白多肽名称为ELP，ELP的氨基酸序列如序列表中序列1所示，ELP中的重复单元为序列1的第17-21位氨基酸，ELP中的重复单元工重复60次。

一、类弹性蛋白多肽(ELP)的制备

1、重组载体的制备：利用PRe-RDL的方法(McDaniel et al.RecursiveDirectional Ligation by Plasmid Reconstruction Allows Rapid and SeamlessCloning of Oligomeric Genes，Biomacromolecules)在pET-24a(+)(McDaniel etal.Recursive Directional Ligation by Plasmid Reconstruction Allows Rapid andSeamless Cloning of Oligomeric Genes，Biomacromolecules)中插入序列2所示的DNA片段，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-24-ELP。

2、重组菌的制备：将pET-24-ELP导入大肠杆菌(Escherichia coli BL21)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-pET-24-ELP。

3、蛋白表达：将BL21-pET-24-ELP接种在50mL LB培养基中(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm条件下过夜震荡培养。接着转接入1L TB培养基当中(盛在2.5L的摇瓶中，卡那霉素浓度为100μg/mL)，37℃，250rpm扩大培养，当培养液的OD₆₀₀达到约0.6-0.8时，将培养温度降为25℃，并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使IPTG在培养液中的浓度为0.35mM，25℃，250rpm培养16h，得到蛋白诱导培养液。

4、蛋白纯化：通过反相转变循环技术(ITC)纯化ELP，具体步骤如下：

将蛋白诱导培养液转入离心管中，4000rpm离心15min回收菌体。用30mL 4℃预冷的PBS溶液均匀重悬菌体，利用超声仪在4℃破碎菌体，破碎菌体在4℃条件下，超声条件为4℃，300W，工作7s，间歇7s，共进行30min，得到细胞裂解液，将细胞裂解液在4℃条件下，12500rpm下离心15min，弃沉淀，收集上清液，将该上清液命名为上清液1。向上清液1中加入10％(w/v)聚乙烯亚胺水溶液(3mL/1L菌液)，混合均匀后，在4℃条件下，12500rpm离心15min，弃沉淀，收集上清液，将该上清液命名为上清液2。

将上清液2进行ITC纯化：首先向上清液2中加入固体NaCl使NaCl的浓度为5M(在40℃水浴中使NaCl充分溶解)，接着12500rpm离心15min弃上清液，回收沉淀，将沉淀用4℃预冷的超纯水充分溶解，再4℃离心(12500rpm)15min，弃沉淀(该沉淀为ITC沉淀)，得到的上清液即为ITC纯化产物，即ELP溶液。ELP溶液的浓度通过BCA法测定，纯度利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试。SDS-PAGE分析样品由含有5％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液配制，浓度为1mg/mL，10μL样品装载到预制的12％SDS-PAGE凝胶中，垂直电泳80～100V电压下运行90min(电泳液为：25mM Tris、250mM Glycine、0.1％SDS)。凝胶用0.3M CuCl₂溶液染色处理后观察条带组成及位置。

图1为ELP纯化前后的SDS-PAGE结果。其中，泳道Marker为蛋白标样，泳道1为细胞裂解液，泳道2为超声破碎后上清液(即上清液1)，泳道3为ITC上清液(即ELP溶液)，泳道4为ITC沉淀。结果表明，大肠杆菌表达的ELP经ITC纯化后得到高纯度的ELP。

二、类弹性蛋白多肽温度响应性纳米材料(ELP-GNPs)的制备

利用水热法合成GNPs：准确称取45mg HAuCl₄·3H₂O(Aldrich，520918，CAS:16861-25-4)溶解于250mL去离子水中，得到HAuCl₄溶液，将HAuCl₄溶液装在500mL干净的锥形瓶内，在磁力搅拌器上搅拌并加热至沸腾。另外，称取150mg柠檬酸钠固体溶于1mL去离子水中，得到柠檬酸钠溶液，将柠檬酸钠溶液在金属浴上加热至95℃。待HAuCl₄溶液沸腾后，将95℃的柠檬酸钠溶液迅速加入HAuCl₄溶液中，并剧烈搅拌，持续煮沸5min。反应结束后，将容器迅速放入冰浴冷却至室温，得到GNPs溶液。

向步骤一得到的ELP溶液中加入1mM的三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)，4℃孵育30min，得到预处理ELP溶液；将预处理ELP溶液缓慢滴加至GNPs溶液中至ELP多肽的浓度为1μM，低温(4℃)、避光反应过夜(该反应过程中ELP是过量的)。第二天将反应后的样品转入离心管中，在4℃条件下，14000rpm离心30min分离过量的ELP分子及其他杂质成分，弃上清液，得到的沉淀中含有用ELP修饰GNPs的纳米材料，将该纳米材料命名为ELP-GNPs，将得到的沉淀利用4℃预冷的PBS重悬。利用4℃预冷的PBS反复洗涤三次，最后再用4℃预冷的PBS进行重悬，即得到纯化的ELP-GNPs分散液(以下简称ELP-GNPs分散液)。

三、ELP-GNPs的物理化学表征

1、利用Malvern Zetasizer Nano-zs90的动态光散射(DLS)法测定ELP、GNPs和ELP-GNPs的水合半径。将步骤一的ELP以及步骤二的GNPs和ELP-GNPs分别稀释在去离子水中，在20℃条件下测试。经DLS测试，ELP的水合半径为4.8nm，GNPs的水合半径为9.7nm，ELP-GNPs的水合半径为30nm(图2)。

2、利用Malvern Zetasizer Nano-zs90的梯度升温程序，通过动态光散射(DLS)法测定ELP-GNPs的相转变温度(T_t)。将步骤二的ELP-GNPs分散在PBS中，设置温度梯度为15-30℃，每2℃测一次水合半径；在22-24℃间增加梯度，每0.2℃测定一次。图3显示了DLS分析ELP-GNPs的温度响应聚集前后的水合半径。在22.2℃条件下，ELP-GNPs开始聚集，粒径增大，且聚集过程发生在很窄的温度范围内。图4显示了ELP-GNPs的相转变温度与浓度的相关性，在较大的浓度范围内，其相转变温度均维持在23℃左右。

3、ELP-GNPs在温度响应性聚集前后的形貌特征通过透射电镜(TEM)表征。将步骤二的ELP-GNPs分散在去离子水中，分别在20℃(T<T_t)、30℃(T>T_t)条件下孵育，取20μL分别吸附到300目铜网上。图5显示了TEM表征ELP-GNPs的聚集情况。T<T_t条件下，ELP-GNPs纳米颗粒分散度很好；T>T_t条件下，ELP-GNPs纳米颗粒聚集、组装为较大颗粒。

4、通过

M3Microplate Reader(Molecular Devices)的紫外-可见光吸收谱测定ELP-GNPs在低于、高于相转变温度条件下的吸收谱图。将步骤二的ELP-GNPs分散在PBS中，分别在20℃(T<T_t)、30℃(T>T_t)条件下，测定300～900nm的吸收值，每10nm读取一次。图6显示了Vis-UV分析ELP-GNPs聚集后吸收谱图变化，聚集后的样品在近红外区产生明显吸收。

四、ELP-GNPs的光热转化性能

1、ELP-GNPs的光热转化效果通过激光照射下样品的温度变化表征。将步骤二的ELP-GNPs分散在PBS中(Au的浓度为180μg/mL)后置于比色皿中，在30℃环境中孵育10min。利用一束808nm、1.5W/cm²的激光照射ELP-GNPs样品，同时通过温度计每10s读取样品温度，持续4min，用PBS和PEG-GNPs分散液作为对照。PEG-GNPs分散液按照如下方法制备：

向去离子水中加入PEG1000和TCEP，得到PEG1000溶液，PEG1000溶液中TCEP浓度为1mM。将PEG1000溶液于4℃孵育30min，得到预处理PEG1000溶液；将预处理PEG1000溶液缓慢滴加至步骤二的GNPs溶液中，室温(20℃)、避光反应过夜。第二天将反应后的样品转入离心管中，在20℃条件下，14000rpm离心30min分离过量的PEG1000分子及其他杂质成分，弃上清液，得到的沉淀中含有用PEG1000修饰GNPs的纳米材料，将该纳米材料命名为PEG-GNPs，将得到的沉淀利用PBS重悬。利用PBS反复洗涤三次，最后再用PBS进行重悬，即得到纯化的PEG-GNPs分散液(简称PEG-GNPs分散液)。

图7显示了升温曲线分析ELP-GNPs的光热转化效果。PBS温度几乎不变，PEG-GNPs在激光作用后温度升高了5.5℃，而ELP-GNPs在4min内升高了43.6℃。表明，ELP-GNPs具有很好的光热转化性能。

2、ELP-GNPs的光热转化效率通过激光作用下升温、关闭激光后降温过程计算。将1mL步骤二的ELP-GNPs分散在PBS中(ELP-GNPs的浓度为180μg Au/mL)得到的ELP-GNPs分散液置于比色皿中，30℃孵育10min后，用一束808nm、1.5W/cm²的激光照射ELP-GNPs样品，当温度不再升高后关闭激光，ELP-GNPs样品不断恢复至初始温度。利用温度计持续记录整个过程温度变化，每10s读取一次温度值。用步骤1的PEG-GNPs和PEG-GNRs作为对照。其中，PEG-GNRs通过如下方法合成：利用金种法制备GNRs：将0.25mL的HAuCl₄水溶液(0.01M)与10mL的溴化十六烷基三甲铵(CTAB,0.1M)溶液混合，向其中加入0.6mL的4℃预冷的NaBH₄溶液(0.01M)，轻轻混合2min。得到的金种溶液在室温静置2h后可供使用。制备GNRs时，先将2mL 0.01M的HAuCl₄溶液、0.4mL 0.01M的AgNO₃溶液与40mL 0.1M的CTAB溶液混合，接着利用0.8mL的HCl(1.0M)调溶液pH＝1～2，再加入0.32mL的抗坏血酸溶液(0.1M)，最后加入0.096mL上述金种溶液，将溶液轻轻混合10s，再室温静置6h即得到GNRs。GNRs溶液先在14500rpm离心15min以去除CTAB，沉淀用去离子水溶解并加入HS-PEG^1k溶液至终浓度为1μM，室温、避光反应12h后，离心分离过量的HS-PEG^1k及其他杂质，利用PBS溶液分散沉淀即得到PEG-GNRs。

样品的光热转化效率通过如下公式计算：

其中，h为传热系数，S为比色皿底表面积,T_Surr为初始温度,T_max为样品在激光作用过程的最高温度，I为激光功率(1.5W/cm²),A₈₀₈为样品在808nm的吸收值。Q_Dis代表比色皿及溶剂本身的热量消散，τ_s代表时间常数,m和C_p分别代表溶剂(PBS)的质量(1g)及热容(4.2J/g)。

图8显示了ELP-GNPs的光热转化效率。相同条件下，ELP-GNPs样品的光热转化效率为30％，高于PEG-GNPs样品(光热转化效率为21％)和PEG-GNRs样品(光热转化效率为26％)。

实施例2、ELP-GNPs具有光热治疗杀伤肿瘤细胞的作用

选择转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的人源C8161黑色素瘤细胞(C8161-GFP细胞)(Jolanta M Topczewska等，Embryonic and tumorigenicpathways converge via Nodal signaling:role in melanoma aggressiveness，NATUREMEDICINE，VOLUME 12，NUMBER 8，AUGUST 2006)进行测试，通过荧光染色、MTT方法测试ELP-GNPs光热治疗杀伤肿瘤细胞的效果。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

将复苏的C8161-GFP细胞在培养基1(培养基1为向DMEM/F-12培养基中加入FBS、盘尼西林和链霉素得到的FBS质量百分比浓度为10％FBS、盘尼西林浓度为200U/mL、链霉素浓度为200μg/mL培养基)中，5％CO₂、37℃环境中培养，得到C8161-GFP细胞悬液。在直径35mm的培养皿中接种1mL的C8161-GFP细胞悬液(10⁵个细胞)，5％CO₂、37℃环境中培养一天使细胞充分贴壁，用PBS进行清洗，然后向培养皿中加入1mL用培养基1重悬实施例1的ELP-GNPs得到的ELP-GNPs悬浮液(ELP-GNPs的浓度为180μg Au/mL)，5％CO₂、37℃环境中培养3h。ELP-GNPs充分聚集后，利用一束2.5W/cm²的808nm激光束照射细胞3min，光热治疗后将细胞放回培养箱内，5％CO₂、37℃环境中培养30min后，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料染色10min，PBS冲洗3次后，利用激光共聚焦显微镜观测激光作用区域的细胞活性。用实施例1的PEG-GNPs作为对照，分别用不使用激光束和不加ELP-GNPs/PEG-GNPs作为阴性对照。

图9显示了ELP-GNPs在激光作用下光热杀伤肿瘤细胞效果。结果显示，单独的ELP-GNPs或激光无法杀伤细胞；PEG-GNPs在有、无激光作用下均无法杀伤肿瘤细胞；仅当ELP-GNPs与激光共同作用时，光斑范围内的肿瘤细胞被全部杀伤。

利用MTT实验表征ELP-GNPs的光热杀伤效果与浓度的相关性，具体方法如下：在96孔板内接种C8161-GFP细胞悬液(50μL/孔，4000个细胞/孔，C8161-GFP细胞悬液由培养基1重悬C8161-GFP细胞得到)并培养至贴壁，实验前吸去培养基。利用培养基1梯度稀释实施例1的ELP-GNPs，分别得到浓度分别为0、30、60、90、105、120和180mg Au/L的ELP-GNPs悬液。各取不同浓度的ELP-GNPs悬液100μL加至C8161-GFP贴壁的96孔培养板中，设阴性对照(不含ELP-GNPs的培养基1)和空白对照(只含培养基1)，37℃，5％CO₂培养3h。上述实验同时进行两组实验，其中一组(无激光作用组)实验的每孔中直接加MTT溶解液(Promega)20μL/孔，37℃，5％CO₂培养3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值；另一组(激光作用组)实验利用808nm激光(2.5W/cm²)照射每个样品孔，照射时间为3min，激光作用后再向每孔中加入MTT溶解液，20μL/孔，37℃，5％CO₂培养3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，并计算细胞存活率，细胞存活率＝100％×各处理组吸收值/阴性对照吸收值。图10显示了ELP-GNPs光热杀伤肿瘤细胞与浓度的相关性。在检测的浓度范围内，单独ELP-GNPs样品对肿瘤细胞无杀伤效果。在激光作用下，ELP-GNPs浓度达到60mg Au/L时开始产生杀伤效果，ELP-GNPs浓度在60、90、105、120和180mg Au/L时的细胞存活率分别为39.03％±12.32％、18.22％±12.72％、4.32％±7.47％、1％±3％和0，达到180mg Au/L时可杀死全部肿瘤细胞。

实施例3、ELP-GNPs的细胞毒性

选用小鼠3T3胚胎成纤维细胞(3T3细胞)(中国科学院细胞库，GNM 3)及人类微血管内皮细胞(HMEC-1细胞)(美国模式培养物保藏所，ATCC-CRL-3243)，利用MTT实验测试ELP-GNPs样品的毒性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

在96孔板内接种3T3细胞悬液(50μL/孔，5000个细胞/孔，3T3细胞悬液由培养基2重悬3T3细胞得到，培养基2为向DMEM培养基中加入FBS、盘尼西林和链霉素得到的FBS质量百分比浓度为10％FBS、盘尼西林浓度为100U/mL、链霉素浓度为100μg/mL培养基)并培养至贴壁，实验前吸去培养基。利用培养基2梯度稀释实施例1的ELP-GNPs，分别得到浓度分别为0、30、60、90、105、120、180和300mg Au/L的ELP-GNPs悬液。各取不同浓度的ELP-GNPs悬液100μL加至3T3贴壁的96孔培养板中，设阴性对照(不含ELP-GNPs的全细胞孔)和空白对照(只含培养基2)，37℃，5％CO₂培养24h。向每孔中直接加MTT溶解液，20μL/孔，37℃，5％CO₂培养3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，并计算细胞存活率，细胞存活率＝100％×实验组吸收值/阴性对照吸收值。

按照上述方法，将3T3细胞替换为HMEC-1细胞，并将培养基2替换为培养基3(培养基3为向RPMI-1640培养基中加入FBS、盘尼西林和链霉素得到的FBS质量百分比浓度为10％FBS、盘尼西林浓度为100U/mL、链霉素浓度为100μg/mL培养基)，其他步骤均不变，计算细胞存活率，检测ELP-GNPs对HMEC-1细胞的毒性(图11)。

图11显示了ELP-GNPs纳米颗粒的细胞毒性测试结果。在0～300mg Au/L的浓度范围内，ELP-GNPs样品对两种细胞(3T3细胞和HMEC-1细胞)均无毒性。

实施例4、裸鼠模型测试ELP-GNPs在肿瘤内自发聚集效果

利用实施例2的C8161-GFP细胞悬液注射到雌性无胸腺(nude)裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，CAnN.Cg-Foxn1^nu/Crl近交系，品系代码：401)背部皮下，构建肿瘤小鼠模型。将C8161-GFP细胞在实施例2的培养基1中培养一段时间后，用胰蛋白酶消化，经PBS洗涤，重悬于DMEM/F-12培养基中得到单细胞悬液，取0.2mL单细胞悬液(5×10⁶个细胞)接种于裸鼠右侧背部皮下。培养15天后形成约150mm³大小的实体瘤肿块，得到肿瘤小鼠模型。将肿瘤小鼠模型随机分为两组，一组为ELP-GNPs组，一组为PEG-GNPs组。

用PBS重悬实施例1的ELP-GNPs，得到ELP-GNPs悬液，ELP-GNPs悬液中ELP-GNPs的浓度为180mg Au/L。向ELP-GNPs组裸鼠肿瘤中注射100μL ELP-GNPs悬液，注射后利用光声成像系统动态分析材料在肿瘤内部的温度响应性聚集情况。用PBS重悬实施例1的PEG-GNPs，得到PEG-GNPs悬液，PEG-GNPs悬液中PEG-GNPs的浓度为180mg Au/L。向PEG-GNPs组裸鼠肿瘤中注射100μL PEG-GNPs悬液，注射后利用光声成像系统动态分析材料在肿瘤内部的温度响应性聚集情况。

图12显示了光声成像分析ELP-GNPs瘤内注射后原位组装情况。肿瘤注射ELP-GNPs后2min即产生明显光声信号，随着时间延长，光声信号逐渐增强，45min后达到最强，随后逐渐减弱。PEG-GNPs组由于不发生温度响应性聚集，检测不到光声信号变化。说明ELP-GNPs在肿瘤内温度响应性聚集过程发生十分迅速，在45min后聚集效果最好，光声信号是PEG-GNPs组的6.6倍，为最佳光热治疗时间。

利用CT成像检测肿瘤内部的金信号。瘤内分别注射60μg ELP-GNPs、PEG-GNPs，45min后进行CT检测。图13显示了ELP-GNPs瘤内注射后CT成像效果，可明显观测到肿瘤在注射材料后产生明显的CT信号。

实施例5、裸鼠模型测试ELP-GNPs样品体内光热治疗肿瘤效果

利用实施例2的C8161-GFP细胞构建裸鼠皮下肿瘤模型来评价ELP-GNPs的光热治疗肿瘤效果，实验重复三次，每次重复使用的具体步骤如下：

按实施例4中的方法，构建肿瘤小鼠模型，将肿瘤小鼠模型随机平均分成6组，每组5-8只，这6组分别为ELP-GNPs光热治疗组(8只)、PEG-GNPs光热治疗组(5只)、PBS光热治疗组(5只)，以及ELP-GNPs组(5只)、PEG-GNPs组(5只)、PBS组(5只)。用PBS重悬实施例1的ELP-GNPs，得到ELP-GNPs悬液，ELP-GNPs悬液中ELP-GNPs的浓度为180mg Au/L。用PBS重悬实施例1的PEG-GNPs，得到PEG-GNPs悬液，PEG-GNPs悬液中PEG-GNPs的浓度为180mg Au/L。

通过瘤内注射将药物注射入肿瘤内，剂量为18μg Au/只小鼠，ELP-GNPs光热治疗组和ELP-GNPs组均注射100μL ELP-GNPs悬液，PEG-GNPs光热治疗组和PEG-GNPs组均注射100μL PEG-GNPs悬液，PBS光热治疗组和PBS组均注射100μL PBS。注射后45min对ELP-GNPs光热治疗组、PEG-GNPs光热治疗组和PBS光热治疗组分别进行光热治疗，用1.5W/cm²(808nm激光)的激光束持续照射肿瘤治疗7min(将注射当天记为第0天)，并利用红外相机实时记录肿瘤处温度变化情况。

图14显示了光热成像表征ELP-GNPs瘤内注射后光热转化效果。在ELP-GNPs光热治疗组的光热治疗中，小鼠肿瘤处温度迅速升高，10s内即上升了28℃，治疗7min后局部最高温度可达到65.9℃，足以杀伤肿瘤。而作为对照组，PEG-GNPs光热治疗组及PBS光热治疗组在激光作用7min后，肿瘤局部最高温度仅升高到42.6℃和41.2℃，不足以破坏肿瘤组织。

光热治疗后每2-3天观察裸鼠生存状态以及肿瘤生长情况，动态测量裸鼠体重和肿瘤体积随时间的变化(表2)。当小鼠肿瘤生长超过1200mm³或体重下降超过15％，小鼠即安乐处死。图15显示了ELP-GNPs抑制肿瘤生长情况。图16显示了小鼠光热治疗后的生存曲线。图17显示了小鼠光热治疗后肿瘤生长实物图。

表2、各组裸鼠肿瘤体积变化(mm³)

ELP-GNPs光热治疗组的小鼠肿瘤逐渐减小，在第9天完全消失，在治疗后36天的持续观察中小鼠全部存活，肿瘤不再复发。而其他5组的小鼠肿瘤并未减小，肿瘤持续生长，在治疗后的6-18天内相继死亡。说明单独的ELP-GNPs、单独激光作用、或PEG-GNP的光热治疗，都不能有效抑制肿瘤生长。相反，ELP-GNPs的光热治疗能够有效地抑制了肿瘤的生长，具有非常好的抗肿瘤活性。

裸鼠在试验周期内体重略无明显降低，表明ELP-GNPs没有明显的副作用。图18与表3显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。

表3、各组裸鼠体重变化(g)

实施例6、ELP-GNPs光热治疗后体内代谢情况

按实施例4中的方法，构建肿瘤小鼠模型，并按照实施例5中ELP-GNPs光热治疗组肿瘤治疗方法治疗肿瘤，通过治疗30天后纳米材料在各组织器官中的分布判断ELP-GNPs在体内的代谢情况。分别在第1天和第30天各处死一只裸鼠，收集主要器官或组织，如心脏(心)、肾脏(肾)、肝脏(肝)、脾脏(脾)、肺、胰腺(胰)、肌肉组织(肌肉)、小肠(肠)及肿瘤。器官或组织中Au浓度通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定。具体实施方法为：取出的器官立即用4℃预冷的生理盐水洗去血液及其他组织液，再吸干表面多余生理盐水，在干燥箱内干燥器官。干燥的器官称重后加入王水(HNO₃与HCl的物质的量比为1:3)在100℃水浴加热消解2h，定容至10mL，利用电耦合等离子体质谱仪测定Au的浓度。

图19显示了小鼠光热治疗30天后ELP-GNPs在心脏、肝、肾等器官的分布情况。在光热治疗第1天，几乎全部金都停留在肿瘤中；第30天，肿瘤消失后残留的疤痕中仅检测到注射量的34％，相应地在肝脏、肾脏、肌肉中金的含量明显提高。说明ELP-GNPs在肿瘤光热治疗后可逐步扩散，经肝、肾排出体外，表明ELP-GNPs可以代谢性降解。