CN107456576B - 一种光热抗菌剂多肽/Au/Fe3O4的制备方法及应用 - Google Patents

一种光热抗菌剂多肽/Au/Fe3O4的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光热抗菌剂多肽/Au/Fe3O4的制备方法及应用，属于材料制备领域。制备步骤主要包括：（1）制备Fe3O4 NPs；（2）制备Au/Fe3O4核壳复合材料；（3）制备Peptide/Au/Fe3O4核壳壳复合材料；（4）光热杀菌。本发明通过使用Fe3O4作为核心，使得该复合材料在具备较好光热效果的同时，可以通过强磁铁很容易的将该材料回收并再利用，大大的提高了其利用率，节约了能源。其次，由于外层具有细菌选择性的多肽的存在，该复合材料可以更好的靶向杀菌，从而降低对周围正常细胞的伤害。

Description

一种光热抗菌剂多肽/Au/Fe3O4的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种光热抗菌的制备方法及应用，特指将四氧化三铁(Fe3O4)，金(Au)以及多肽(多肽)复合，制备具有细菌选择性的多肽/金/四氧化三铁(多肽/Au/Fe3O4)纳米复合材料，并应用于在近红外(NIR)光照射下进行光热杀菌，属于材料制备领域。
背景技术
近些年来，随着抗生素的大量使用，致使许多细菌对众多的抗生素产生了耐药性，从而导致对细菌感染的治疗越来越棘手。目前，现存的抗生素对一些耐药细菌不起作用，而新型抗生素的研制需要大量的时间和成本。此外，其它抗菌方法如杀菌剂氯气、银、强氧化剂的使用，低温等离子体技术和光催化降解等，由于自身存在的缺点和潜在危害限制其在活体内 (In vivo)抗菌感染的应用研究。以此，新型抗菌方法的研究是一个重要课题。
光热治疗法(Photothermal therapy，PTT)又称为光热分解(Photothermolysis)，作为治疗肿瘤细胞新方法得到了广泛的关注和研究。它是利用具有较高光热转换效率的光热剂，在易穿透组织的近红外(NIR)光照射下，将光能转化为热能通过细胞热消融途径来实现不可逆细胞破坏的一种治疗方法。而对于光热治疗法的研究，其重点在于光热剂的研究。目前，大量研究人员正致力于各种光热剂的研究。
Fe3O4纳米粒子(NPs)由于其特殊的磁性和低毒性而受到越来越多的关注。它已广泛应用于生物医学和生物医学，包括磁热疗法，体内磁共振成像(MRI)，生物分离，靶向递送等。同样，由于其有吸引力的电子，光学和催化性能，Au纳米粒子已被广泛应用于非常敏感的生物检测，和癌细胞光热消融中。Fe3O4与Au NPs的组合为磁性响应，等离子体激发特性和生物相容性的集合提供了开发有意思的高级复合材料的可能性。
因此制备Au/Fe3O4核壳材料并应用于光热抗菌具有重要的意义。而同时将具有细菌选择性的多肽修饰在复合材料的表面，就能更好的靶向杀菌，减少正常细胞的死亡。
发明内容
本发明制备了多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合材料，并应用于在近红外光照射下光热杀菌。由于Fe3O4的存在，该复合材料在具备较好光热效果的同时，可以通过强磁铁很容易的将该材料回收并再利用，大大的提高了其利用率，节约了能源。其次，由于外层具有细菌选择性的多肽的存在，该复合材料可以更好的靶向杀菌，从而降低对周围正常细胞的伤害。
本发明采用的技术方案是：
一种多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合光热剂的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤1、制备Fe3O4NPs：四氧化三铁纳米颗粒通过高温还原分解法制得，具体步骤如下：称取乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)加入到三颈烧瓶中，然后量取二苄醚，油胺，乙醇一起加入到该烧瓶中，然后在110℃下搅拌1h进行脱水。随后将温度升高到300℃，继续搅拌2h。结束后自然冷却至室温，然后8000rpm离心得到黑色产物，利用强磁铁对产物进行己烷，乙醇，水各洗涤三次。然后放置于60℃烘箱干燥12h。
步骤2、制备Au/Fe3O4核壳复合材料：称取步骤1中所制备的Fe3O4NPs在冰浴中重新分散到蒸馏水中，得到浓度为250μg/mL的分散液。然后加入的氯金酸(HAuCl4)溶液，同时加入的碳酸钠(Na2CO3)溶液，搅拌10-15min。接着加入硼氢化钠(NaBH4)溶液，继续搅拌10-15min。最后利用强磁铁，用蒸馏水对产物进行多次洗涤，然后放置于60℃烘箱干燥12h。
步骤3、制备多肽/Au/Fe3O4核壳壳复合材料：首先将对细菌具有很好选择性的多肽溶解到三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，TBS)缓冲溶液中，得到浓度为0.1mg/mL的多肽溶液。然后称取步骤2中制备的Au/Fe3O4分散到该溶液中。最后利用磁铁用TBS缓冲溶液对产物多肽/Au/Fe3O4进行洗涤。
步骤1中，乙酰丙酮铁与二苄醚的摩尔比为1:25，二苄醚，油胺和乙醇的体积比为1:1:5。
步骤2中，氯金酸溶液的浓度为5mg/mL，碳酸钠溶液的浓度为21.2mg/mL，硼氢化钠溶液的浓度为0.5mg/mL。
步骤2中，Fe3O4NPs和氯金酸的质量比为5:3。氯金酸溶液，碳酸钠溶液和硼氢化钠溶液的体积比为6:1:5。
步骤3中，细菌为大肠杆菌(E.coil O157:H7)，多肽的氨基酸序列为GLHTSATNLYLHGGGC(如SEQ ID NO.1)。多肽与Au/Fe3O4的质量比为1:10。
一种多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合光热剂的应用，用于光热杀菌，按照下述步骤进行：称取多肽/Au/Fe3O4分散到蒸馏水中，并将其稀释成100-500μg/mL的溶液。将体积比为1： 50的吸光度为0.1(OD＝0.1)的菌液和多肽/Au/Fe3O4分散液混合，然后静置30-40min后用一定功率的近红外光照射一段时间。将光照后的菌液用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μL 稀释后的悬浮液涂到Luria Bertani(LB)固体培养基上，在37℃培养箱中培养12h，计算菌落数，以此计算杀菌率。
所用近红外光的波长为808nm。
所用近红外光的功率为2-5W/cm2。
近红外光照射的时长为100-300s。
上述的技术方案中所述的乙酰丙酮铁，其作用是提供Fe3+。
上述的技术方案中所述的二苄醚，其作用是分散剂。
上述的技术方案中所述的油胺，其作用是还原剂。
上述的技术方案中所述的氯金酸溶液，其作用是提供Au3+。
上述的技术方案中所述的硼氢化钠溶液，其作用是还原剂。
本发明制备了多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合材料，并应用于在近红外光照射下光热杀菌。其优点在于，由于Fe3O4的存在，该复合材料在具备较好光热效果的同时，可以通过强磁铁很容易的将该材料回收并再利用，大大的提高了其利用率，节约了能源。其次，由于外层具有细菌选择性的多肽的存在，该复合材料可以更好的靶向杀菌，从而降低对周围正常细胞的伤害。
具体实施方式
上述技术方案所制备的多肽/Au/Fe3O4核壳壳复合材料，应用于光热杀菌，下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)制备Fe3O4NPs：四氧化三铁纳米颗粒通过高温还原分解法制得，具体步骤如下：称取0.706g乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)加入到三颈烧瓶中，然后量取10mL二苄醚，10mL油胺，50mL乙醇一起加入到该烧瓶中，然后在110℃下搅拌1h进行脱水。随后将温度升高到 300℃，继续搅拌2h。结束后自然冷却至室温，然后8000rpm离心得到黑色产物，利用强磁铁对产物进行己烷，乙醇，水各洗涤三次。然后放置于60℃烘箱干燥12h。
(2)制备Au/Fe3O4核壳复合材料：称取步骤1中所制备的Fe3O4NPs 0.01g在冰浴中重新分散到40mL蒸馏水中，然后加入0.6mL的氯金酸(HAuCl4)溶液，同时加入0.2mL 的碳酸钠(Na2CO3)溶液，搅拌10min。接着加入1mL硼氢化钠(NaBH4)溶液，继续搅拌10min。最后利用强磁铁，用蒸馏水对产物进行多次洗涤，然后放置于60℃烘箱干燥12h。
(3)制备多肽/Au/Fe3O4核壳壳复合材料：首先将1mg对细菌具有很好选择性的多肽溶解到10mL三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，TBS)缓冲溶液中。然后称取0.01g步骤2 中制备的Au/Fe3O4分散到该溶液中。最后利用磁铁用TBS缓冲溶液对产物多肽/Au/Fe3O4进行洗涤。
(4)光热杀菌：称取0.001g多肽/Au/Fe3O4分散到1mL蒸馏水中，并将其稀释成100-300 μg/mL的溶液。取20μL吸光度为0.1(OD＝0.1)的菌液加到1mL浓度为100μg/mL的多肽/Au/Fe3O4分散液中，混合后静置30min后用功率为2W/cm2的近红外光照射100s。将光照后的菌液用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μL稀释后的悬浮液涂到Luria Bertani(LB) 固体培养基上，在37℃培养箱中培养12h，计算菌落数，以此计算杀菌率。所得杀菌效率见表1。
实施例2
同实施例1，仅改变实施例1步骤(2)中所加入的1.2，2.4mL。即最终Fe3O4与HAuCl4的质量比为5:1.5和5:6。最终杀菌率见表1。结果表明，随着Au的量的增加，多肽/Au/Fe3O4的光热效率随之有所提高，最终的杀菌率提高。
表1不同Au的量对多肽/Au/Fe3O4的杀菌效率的影响
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>与HAuCl<sub>4</sub>的质量比 杀菌效率(％)
5:1.5 73
5:3 78
5:6 85
实施例3
同实施例1，仅改变实施例1步骤(4)中多肽/Au/Fe3O4的浓度为200，300μg/mL。最终光热杀菌率见表2。结果表明，随着多肽/Au/Fe3O4浓度的增加，其最终的光热杀菌效率随之上升。
表2不同多肽/Au/Fe3O4的浓度对其杀菌效率的影响
多肽/Au/Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>的浓度(μg/mL) 杀菌效率(％)
100 73
200 80
300 89
实施例4
同实施例1，仅改变实施例1步骤(4)中所用近红外光的功率为3，4，5W/cm2。通过改变照射功率来研究其光热抗菌效果。所得杀菌效率见表3。结果表明，随着功率的增加，多肽/Au/Fe3O4的光热杀菌效率逐渐提高。
表3不同照射功率对多肽/Au/Fe3O4的杀菌效率的影响
照射功率(W) 杀菌效率(％)
2 73
3 77
4 85
5 92
实施例5
同实施例1，仅改变实施例1步骤(4)中的照射时长为200，300s。通过延长照射时间来研究其光热抗菌效果。所得杀菌效率见表4。结果表明，随着照射时间的延长，多肽 /Au/Fe3O4的光热杀菌效率随之逐渐提高。
表4不同照射时间对多肽/Au/Fe3O4的杀菌效率的影响
Figure BDA0001364981080000051
SEQUENCE LISTING
<110>江苏大学
<120>一种光热抗菌剂多肽/Au/Fe3O4的制备方法及应用
<160>1
<170> Patent In version 3.3
<210>SEQ ID NO.1
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<400>1
Gly Leu His Thr Ser Ala Thr Asn Leu Thr Leu His Gly Gly Gly Cys
1 5 10 15

Claims (2)

1.一种多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合光热剂的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1、制备Fe3O4 NPs：四氧化三铁纳米颗粒通过高温还原分解法制得，具体步骤如下：称取乙酰丙酮铁（Fe(acac)3）加入到三颈烧瓶中，然后量取二苄醚，油胺，乙醇一起加入到该烧瓶中，然后在110℃下搅拌1h进行脱水；随后将温度升高到300℃，继续搅拌2h；结束后自然冷却至室温，然后8000rpm离心得到黑色产物，利用强磁铁对产物进行己烷，乙醇，水各洗涤三次；然后放置于60℃烘箱干燥12h；步骤2、制备Au/Fe3O4核壳复合材料：称取步骤1中所制备的Fe3O4 NPs 在冰浴中重新分散到蒸馏水中，得到浓度为250μg/mL的分散液；然后加入氯金酸（HAuCl4）溶液，同时加入碳酸钠（Na2CO3）溶液，搅拌10-15min；接着加入硼氢化钠（NaBH4）溶液，继续搅拌10-15min；最后利用强磁铁，用蒸馏水对产物进行多次洗涤，然后放置于60℃烘箱干燥12h；步骤3、制备多肽/Au/Fe3O4核壳壳复合材料：首先将对细菌具有很好选择性的多肽溶解到三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl，TBS）缓冲溶液中，得到浓度为0.1mg/mL的多肽溶液；然后称取0.01g步骤2中制备的Au/Fe3O4分散到该溶液中；最后利用磁铁用TBS缓冲溶液对产物多肽/Au/Fe3O4进行洗涤；
乙酰丙酮铁与二苄醚的摩尔比为1:25，二苄醚，油胺和乙醇的体积比为1:1:5；
氯金酸溶液的浓度为5 mg/mL，碳酸钠溶液的浓度为21.2 mg/mL，硼氢化钠溶液的浓度为0.5 mg/mL；
Fe3O4 NPs和氯金酸的质量比为5:3；氯金酸，碳酸钠和硼氢化钠溶液的体积比为6:1:5；
细菌为大肠杆菌E.coil O157:H7，多肽的氨基酸序列为GLHTSATNLYLHGGGC（如SEQ IDNO.1）；多肽与Au/Fe3O4的质量比为1:10。
2.根据权利要求1所述的一种多肽/Au/Fe3O4核壳壳纳米复合光热剂的制备方法所得的纳米复合光热剂的应用，用于光热杀菌，其特征在于按照下述步骤进行：称取多肽/Au/Fe3O4分散到蒸馏水中，并将其稀释成100-500μ g/mL的溶液；将体积比为1：50的吸光度为0.1的菌液和多肽/Au/Fe3O4分散液混合，然后静置30-40min后用一定功率的近红外光照射一段时间；将光照后的菌液用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100 μL稀释后的悬浮液涂到LuriaBertani（LB）固体培养基上，在37 ℃培养箱中培养12 h，计算菌落数，以此计算杀菌率；
所用近红外光的波长为808nm；
所用近红外光的功率为2-5W/cm2；
近红外光照射的时长为100-300s。
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