CN106692991A - 一种具有双加热和显像功能的靶向纳米磁粒及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程和纳米医学，本发明提供了一种可用于肿瘤热疗的具有双加热和显像功能的靶向纳米磁粒，并提供了一种上述纳米磁粒的制备方法和制药用途。该方法是制备四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子作为核心，选用金(Au)作为纳米磁粒壳层；并在其表面吸附靶向EGFR单克隆抗体尼妥珠单抗(Nimotuzumab)，构建的新型Fe3O4@Au‑尼妥珠单抗(Fe3O4@Au‑Nimotuzumab)复合纳米磁粒，具有肿瘤分子靶向性，并可利用Fe3O4的超顺磁性在磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)下显像示踪、Fe3O4的磁感应性进行磁热疗，Au的光敏感性对肿瘤细胞进行近红外热疗进而将其同时作为肿瘤热疗的磁感应剂、光敏感剂和阴性造影剂。

Description

一种具有双加热和显像功能的靶向纳米磁粒及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及生物医学工程和纳米医学领域，具体涉及构建的新型Fe3O4@Au-尼妥珠单抗(即Fe3O4@Au-Nimotuzumab)靶向复合纳米磁粒，在肿瘤热疗中的应用。
背景技术
磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,纳米磁粒)诱导的肿瘤组织热疗是一种极具潜力的治疗手段，已在多种体外实验的动物模型中被评估，取得可喜的结果，目前已经进入Ⅰ期临床试验。热疗是一个治疗程序，其原理是促进人体组织温度升高，以改变细胞结构和功能，即温度增加到41℃至42℃之间时，可以诱导肿瘤细胞死亡。因为肿瘤细胞比周围正常细胞对温度突然升高的耐受性差。温度的升高引起许多酶和结构蛋白质在细胞内的运作，进而改变细胞的增殖和分化，诱发细胞凋亡。一般认为热疗触发的细胞膜改变导致跨膜转运的减少并且破坏膜电位平衡。而且温度升高可以影响核酸的合成并抑制修复酶，促进DNA结构变异。热疗所需的高温可以通过不同的热源获得，如电磁辐射波(热疗用射频或微波)、超声波或电诱导热疗。这些技术显示出了良好的效果，然而这些传统方法的主要问题是如何达到热疗温度均匀分布到肿瘤深部区域。从某种意义上说，治疗失败源于一些肿瘤区域温度升高不足，使肿瘤复发。同时过热也可导致癌旁组织损伤。目前磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia,MFH)技术已经部分解决了这些问题。MFH的原理，是在肿瘤内注射磁流体，随后将肿瘤置于交变磁场(alternating magnetic field,AMF)下，促使肿瘤区域温度升高。应用磁性材料提高热疗疗效开始于20世纪50年代中后期Gilchrist等的研究。随后，许多研究评估了在不同肿瘤中的治疗。然而，这些初步的研究结果直到20世纪90年代初才在学术界广泛使用，而且目前这一领域也仅有少数临床研究。因此，为更好地应用于人体治疗，有关物理条件、毒性程度和疗效的更详细研究是必要的。目前，MFH是一种非侵入性的极具前景的技术，能有效地对深部和难以触及的组织进行热疗。MFH可以特异性的靶向肿瘤组织，其温度分布均匀且热传导率高，并减少健康组织的损害。
除纳米磁粒外，纳米金(nanogo1d)作为热疗用光敏感剂，也越来越受到学术界广泛的关注。纳米金即指金纳米粒子，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性、高吸收截面和高光热转化效率，经过静脉注射后，能够富集在肿瘤部位，经近红外光(near-infrared,NIR)照射后，通过吸收近红外激光能量，能迅速升温“热死”肿瘤细胞。此外，纳米金还具有良好的生物相容性，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。作为现代四大标记技术之一的纳米金标记技术(nanogold labelling techique)，实质上是蛋白质等高分子被吸附到金纳米粒子表面的包被过程。球形的金纳米粒子对蛋白质有很强的吸附功能，吸附机理可能是金纳米粒子表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，因此金纳米粒子又是理想的药物载体。
表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)介导的信号通路在肿瘤生长、侵袭及转移中发挥重要作用，与肿瘤恶性程度及不良预后密切相关，是肿瘤治疗的重要靶点。尼妥珠单抗(Nimotuzumab)是在第一代人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗基础上开发的新一代IgGl型抗EGFR单克隆抗体，人源化程度达95％，免疫原性大大降低，安全性明显提高，并且在人体内的血清半衰期延长。临床前研究、临床研究表明，尼妥珠单抗在头颈部鳞状细胞癌、鼻咽癌和胶质瘤等实体瘤均显示出较高的抗肿瘤活性及肿瘤组织特异性，同时具有耐受性好、皮疹发生率低等优点。
EGFR单抗对肿瘤细胞的靶向性取决于其与受体的亲和力常数(Kd)。尼妥珠单抗的Kd为4.5l×10-8mol/L，这种中度亲和力既可有效靶向肿瘤细胞，阻断配体与EGFR的结合，稳定受体构象不被二聚化，还可使皮肤等正常组织较低水平地摄取尼妥珠单抗。因此，尼妥珠单抗在发挥相似的最大抗肿瘤效应的同时，还允许低剂量的正常EGFR保持活性，有助于降低不良反应发生率。由此可见，尼妥珠单抗的靶向性是分子水平的，是靶向性很好的药物，能够赋予载体更好的靶向性。
发明内容
为解决现有技术中的难题，既能赋予Fe3O4@Au更好的靶向性，使其进入肿瘤细胞，而非正常细胞进行热疗；又能利用Fe3O4的超顺磁性在磁共振成像(Magnetic ResonanceImaging，MRI)下显像示踪、Fe3O4的磁感应性进行磁热疗，Au的光敏感性对肿瘤细胞进行近红外热疗进而将其同时作为肿瘤热疗的磁感应剂、光敏感剂和阴性造影剂。本发明提供了一种具有双加热和显像功能的靶向复合纳米磁粒，技术方案如下：
本发明涉及一种具有双加热和显像功能的靶向复合纳米磁粒，其特征在于，由Fe3O4纳米粒子和Au复合而成的、具有核壳结构、并吸附单克隆抗体尼妥珠单抗，以形成Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒。
优选的，所述的靶向复合纳米磁粒，其特征在于，是以Fe3O4纳米粒子作为核心，以Au作为纳米磁粒壳层，具有核壳结构、并在该纳米磁粒的表面吸附单克隆抗体尼妥珠单抗，以形成Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒。
另一方面，本发明还涉及一种上述靶向复合纳米磁粒的制备方法，其特征在于，
1)Fe3O4纳米磁粒的制备：取0.01～0.1mol/L的FeCl3、FeCl2溶液，按摩尔比Fe3+:Fe2+＝5:3将二者混合，去离子水分别配制10ml 1mol/L的柠檬酸三钠溶液和50ml 1mol/L的氢氧化铵溶液，取混合液0.01～0.1倍量的0.1～1mol/L柠檬酸三钠以及0.01～0.5倍量的0.1～1mol/L氢氧化铵混合液快速加入氮气保护下的上述混合液中，溶液中迅速出现黑色沉淀物，继续搅拌30～60min后停止。于60℃～80℃水浴恒温30～60min进行熟化，然后用磁铁吸住烧瓶底部，倾去上层废液，用去离子水反复冲洗生成物，至其溶液PH＝7，将生成物真空干燥，既得Fe3O4纳米磁粒；
2)Fe3O4@Au复合纳米磁粒的制备：用去氧处理后的去离子水和上述Fe3O4纳米磁粒配制为浓度0.01～0.1mol/l的混悬液，超声处理5min以上，功率为600W，将上述混悬液与0.1～1mol/l的柠檬酸三钠溶液，按照体积比1：1～1：2混合搅拌10～30min，然后，再按照体积比1：5～1：10向上述混合液中加入去离子水稀释，将所得混合液与质量体积浓度为0.1～1％金氯酸溶液按照体积比20：1～10：1混合后加热，边加热边搅拌，缓慢加入1～10:1倍量的0.1～2mol/l的盐酸羟胺溶液，直至混合液颜色由淡黄变为金胶体的特征红色后，停止加热；再利用磁铁将磁性纳米颗粒从上述液体中分离出，然后用HCl洗涤3次以上，并用去离子水清洗1～3次，真空干燥后，即得到Fe3O4@Au复合纳米磁粒；
3)制备Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒：称取少量上述Fe3O4@Au复合纳米磁粒，用去离子水配置成0.1～1g/L Fe3O4@Au复合纳米磁粒混悬液，取上述混悬液1～5ml,并用0.01～0.1mol/l的HCl溶液调节其pH至9.0～10.0，加入1～5mg/ml的尼妥珠单抗注射液4～20μl，置于空气中震荡，于37℃、200r/min的速度充分混合上述混悬液并反应2～4h，再加入20～100μl的质量分数为1％的牛血清蛋白(BSA)溶液，反应30min～1h，然后用磁铁分离20～60min，小心移去上清液，沉淀用1～5ml质量分数为1％的牛血清蛋白(BSA)溶液溶解摇匀后，于4℃下保存备用，即得Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒。
此外，本发明还涉及上述靶向复合纳米磁粒的用途：
一方面，本发明涉及一种上述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
一方面，本发明涉及一种上述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备显像示踪药物中的应用；优选的，所述的用途为用于制备肿瘤活体追踪药物。
一方面，本发明涉及一种上述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备辅助肿瘤热疗药物中的应用；
优选的，所述的用途为用作肿瘤热疗的磁感应剂、光敏感剂或阴性造影剂；
优选的，所述的用途为在制备辅助肿瘤热疗的控温及恒温药物中的应用；
优选的，所述的用途为在制备辅助肿瘤光热转换的近红外光谱技术热疗药物中的应用；
优选的，所述的用途为在制备辅助双热疗药物中的应用；进一步优选的，所述的双热疗技术为磁流体热疗联合近红外光谱技术热疗技术。
有益效果
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.采用柠檬酸盐-金氯酸还原法来制备颗粒的金壳层，简化Fe3O4@Au复合纳米磁粒的构建工艺。先用化学共沉淀法合成水相分散的Fe3O4纳米磁粒，然后再以这些纳米磁粒为晶种，在其表面用金氯酸的柠檬酸盐还原法生成金壳层。早在1951年，Turkevitch就最先报道了以较小的金纳米颗粒为种子，用氢氧化亚胺与金氯酸反应来制备粒径较大的金纳米颗粒。最近的研究表明，通过改变晶种与金属的比率，金纳米颗粒的粒径可控制在5～40纳米范围，尺寸分布相对误差在10-15％。在避免二次成核方面，逐步的颗粒放大方法要比一次性晶种生长法更有效。只要反应试剂和条件选择恰当，同质生长金纳米颗粒的晶种调制法对异质生长Fe3O4@Au核壳结构纳米颗粒也同样有效。我们采用柠檬酸钠与金氯酸反应的方法，在晶种Fe3O4纳米磁粒表面异质生长金壳层，将制备得到的纳米磁粒分散在HAuCl4溶液中，加热煮沸，利用还原剂对Au3+进行还原，还原的Au原子会以Fe3O4为种子，在其表面沉积并生长。由于非均匀成核所需动力要低于均匀成核的动力要低于均匀成核，因此，Au原子优先在Fe3O4上成核。从单分散颗粒形成的机理可知:控制实验条件，可以使成核与长大分两个阶段进行，经典的Frens方法制备金溶胶是均匀成核的过程，金核的形成往往需要一定诱导期，当溶液中金的浓度低于其成核浓度，但又高于饱和浓度的时候，不会形成新的金核，而是在己有种子的情况下以相同的速度慢慢长大，因此控制种子的量和HAuCl4的量，能够控制复合粒子的大小和表面包覆量。
本发明制备的Fe3O4@Au复合纳米磁粒大小均匀、圆形、平均直径分别为30nm、壳层平均厚度5nm，分散性好、具有较好的稳定性,磁响应性和光学性质；并具有良好的生物相容性。
2.尼妥珠单抗在Fe3O4@Au复合纳米磁粒上的吸附能力较好。为了最大程度保持尼妥珠单抗固定后的抗体活性，我们选择采用吸附法将尼妥珠单抗固定在Fe3O4@Au复合纳米磁粒的Au壳层上。借鉴胶体金标记蛋白技术，金纳米粒子对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。这种结合目前认为是金表面负电荷和抗体正电荷基团因静电作用而吸附,并形成Au-S等稳定化学键而形成了牢固结合。该Fe3O4@Au复合纳米磁粒，平均粒径30nm，且表面带有较强负电荷，可以有效地固定IgG单克隆抗体尼妥珠单抗。由于盐类成分能影响金胶体对抗体的吸附，并可使溶胶聚沉，利用这一特性，我们选择尼妥珠单抗的最佳吸附量，结果显示40-100μg/mL的尼妥珠单抗能稳定Fe3O4@Au复合纳米磁粒混悬液，说明此范围质量浓度下尼妥珠单抗和Fe3O4@Au复合纳米磁粒比例合适。我们利用常见的酶免疫吸附法,研究了Fe3O4@Au复合纳米磁粒和尼妥珠单抗的吸附情况。
Fe3O4@Au复合纳米磁粒不仅能与抗体结合，而且可通过磁性分离形成沉淀。因此，在Fe3O4@Au复合纳米磁粒吸附尼妥珠单抗的溶液中加入酶标羊抗人IgG的二抗，然后磁性分离，可将Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒-酶标羊抗人IgG复合物从溶液中分离。清液中的物质为未和尼妥珠单抗结合并保留下来的酶标抗体，加入底物显色液，就可正常显色。如果同时以同浓度的尼妥珠单抗溶液和酶标羊抗人IgG反应，加入底物显色液，显色后测定其OD值，通过两次OD值得对比，可得到Fe3O4@Au复合纳米磁粒对尼妥珠单抗对抗体Fc端的吸附率。结果表明Fe3O4@Au复合纳米磁粒对尼妥珠单抗Fc端的吸附效率在90％以上(如表1所示)，说明Fe3O4@Au复合纳米磁粒对尼妥珠单抗的吸附效果比较优良。该过程方法简单,利用了磁性分离和酶标抗体的显色能力,通过免疫酶吸附技术进行测定,获得了较理想的结果。采用激光粒度分析、zeta电位测定、UV-Vis光谱和磁滞回线等对Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒进行表征。激光粒度分析Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的平均直径为50nm，单峰状，粒径分布窄，与Fe3O4@Au的平均直径30nm相比略有增大，这可能是由于Fe3O4@Au表面吸附尼妥珠单抗，形成一层蛋白质层，造成Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒在水相中粒径增大。在pH 7.4中性环境中，Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的zeta电位值为正电荷，说明尼妥珠单抗牢固吸附在Fe3O4@Au复合纳米磁粒表面，将粒子表面电荷转变为正电荷。UV-Vis光谱显示可以看出Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的最大光吸收峰较Fe3O4@Au复合纳米磁粒的最大光吸收峰，出现明显的红移现象，这表明抗体很好的吸附在金表面。Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的磁滞回线接近为重合“S”型曲线，与Fe3O@Au复合纳米磁粒相似，其矫顽力及剩磁很低，具有良好的超顺磁性。
3.具有较强的肿瘤活体追踪能力。该Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒，可以作为特异性的靶向肿瘤EGFR受体，同时其磁学性能表现为超顺磁性，且具有良好的生物相容性。Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的超顺磁性可使磁共振成像(即MRI)的靶区信号明显降低而产生负性对比剂效应，从而可以在MRI上对靶细胞进行观察、示踪。利用自制备的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒在MRI的成像特点我们评价了其对胶质瘤细胞的特异性靶向作用。结果显示，Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后在T2WI和T2 *WI上信号强度均明显降低，Fe3O4@Au复合纳米磁粒和尼妥珠单抗与U251细胞共孵育后在T2WI和T2 *WI上信号强度无明显降低。表明Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒对U251细胞具有良好的靶向性，相对于Fe3O4@Au复合纳米磁粒，其可以更多的进入U251细胞，造成T2WI和T2 *WI信号明显降低。
同时，我们建立了裸鼠胶质瘤移植瘤模型，进行在体MRI靶向性评价。在体MRI结果显示，尾静脉注射Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒后肿瘤组织不同时间点的T2WI、T2 *WI强度及信号变化率均有明显下降，其中T2 *WI最为明显，具有统计学差异，这可能是由于T2 *WI对磁化率的差异更敏感，铁引起的磁敏感效应更大。而Fe3O4@Au复合纳米磁粒+尼妥珠单抗在注射后2h和8h两个时间点的信号亦有轻度下降，但下降幅度较Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒小，且持续时间短，Fe3O4@Au复合纳米磁粒注射后24h的信号强度即恢复至平扫水平，而Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒注射后24h的信号强度仍然维持在较低水平，表明通过尼妥珠单抗介导靶向性和胞吞作用，且效果较非复合纳米磁粒具有显著性差异，即取得了预料不到的技术效果。Fe3O4@Au复合纳米磁粒主要聚集在胶质瘤U251细胞内，没有被单核-吞噬细胞系统吞噬降解，这与体外U251细胞MRI结果相一致。
4.辅助肿瘤热疗的控温及恒温。Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒具有超顺磁性，在一定磁场下能快速均匀吸收电磁能而升温。体外升温恒温实验发现其在230kHZ的AMF作用下，在最初的30min内升温急剧，30min～45min升温平缓，50min后温度几乎不再上升而恒定。这是因为在体外升温实验中Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的浓度、AMF磁场的强度较低，并且存在着产热和散热的平衡，即以一定的浓度存在于某介质当中的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒吸收电磁波所产生的热量与散发到介质及环境中的热量存在着一个动态的平衡过程。为此，我们可以利用不同浓度的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗磁流体在一定磁场强度下的升温恒温特性，实现肿瘤热疗的控温(调节磁流体的浓度)及恒温。
5.辅助肿瘤光热转换的近红外光谱技术(即NIR)热疗。Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒，其吸收光谱较Au纳米粒子出现了明显的红移。利用其光学特性，我们采用功率为2.5W的808nm NIR分别对其进行照射60min。在最初的15min内升温急剧，30min后温度几乎不再上升而恒定。这是因为在体外升温实验中Fe3O4@Au复合纳米磁粒的浓度较低，并且存在着产热和散热的平衡。同时我们认为温度快速升高是由于NIR照射区域较小，热量还未传递到周围的环境中去，引起的局域温度升高过快造成的。而且不同浓度的混悬液照射后的温度梯度也不同，浓度越大温度升高越快。由于肿瘤细胞在42℃左右即可被杀死，制备的Fe3O4@Au复合纳米磁粒可以在利用光热转换的NIR热疗中得到应用。
6.磁流体热疗(MFH)联合近红外光谱技术(NIR)热疗。通过分别进行Fe3O4@Au靶向复合纳米磁粒在AMF和NIR作用下进行升温恒温试验，利用Fe3O4@Au靶向复合纳米磁粒在AMF作用下升温速度慢、达到热平衡时间长、但恒定温度高的特点；而其在NIR作用下升温速度快、达到热平衡时间短、但恒定温度低的特点。因此我们将二者联合应用进行升温恒温试验。结果显示，当AMF强度一定并且NIR激光照射功率一定时，在二者同时作用下，开始15分钟内温度可以迅速上升，20min后温度几乎不再上升而保持稳定。这可能是由于Fe3O44@Au复合纳米磁粒在AMF和NIR照射开始阶段，其Au层对吸收NIR，可以快速的将光能转化为热能，使周围环境温度迅速升高；而其核心Fe3O4可以持续吸收AMF的电磁波，将电磁能量转化为热能，使周围环境温度继续升高，且在较高温度达到热平衡。Fe3O4@Au复合纳米磁粒的这种升温恒温特点，具有很好的临床应用前景，可以缩短单纯MFH的治疗时间，并且可以获得更好的治疗效果。
附图说明
图1为Fe3O4@Au-Nimotuzumab复合纳米磁粒透射电镜图(100000)
图2为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒平均粒径分布图
图3为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒zeta电位图
图4曲线d为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒吸收光谱
图5为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒的磁滞回线
图6为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后在MRI T2WI上图像
图7为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育T2WI弛豫时间
图8为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI图像
图9为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI弛豫时间
图10为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒在交变磁场作用下体外热动力学试验结果
图11为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒在近红外光作用下体外热动力学试验结果
图12为Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒在交变磁场和近红外光联合作用下体外热动力学试验结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步具体说明。
1.主要试剂
1)三氯化铁(FeCl3.6H2O，A.R)：中国医药上海化学试剂采购供应站
2)氯化亚铁(FeCl2.4H2O，A.R)：中国医药上海化学试剂采购供应站
3)氨水(NH3.H2O,A.R):上海化学试剂有限公司
4)盐酸(HCL A.R)：南京化学试剂一厂
5)氢氧化钾(KOH,A.R)：上海凌峰化学试剂有限公司
6)氢氧化钠(NaOH A.R)：上海化学试剂有限公司
7)无水乙醇：分析纯，南京化学试剂一厂
8)异丙醇：分析纯，南京化学试剂一厂
9)氯仿：分析纯，中国宝应化学试剂厂
10)无水乙醚：分析纯，南京化学试剂一厂
11)盐酸羟胺：分析纯，中国医药上海化学试剂采购供应站
12)氯金酸(AuCl3.HCL.4H2O，A.R)：中国医药上海化学试剂采购供应站
13)柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O，A.R):中国医药上海化学试剂采购供应站
14)HEPES：AMRESCO，美国
15)胎牛血清(BSA)：杭州四季青生物工程公司，56℃水浴30分钟灭活
16)PBS：准确称取Na2HPO478.248g和NaH2PO430.592g置于大烧杯中，加双蒸水350ml，搅拌均匀，定容至400ml，即得20×PBS储存液，用时稀释成1×PBS
17)DMEM培养基：GIBCO BD公司，美国
18)0.25％胰蛋白酶：AMRESCO，称取胰蛋白酶0.25g,先用D-Hanks液调成糊状，然后再用其定容至100ml，磁力搅拌30分钟，使其完全溶解，用5.6％NaHCO3调pH值为7.2-7.6，过滤除菌，分装后-20℃储存备用
19)碳酸氢钠(NaHCO3A.R)：用双蒸水配成5.6％溶液，微孔滤膜过滤除菌
20)25％戊二醛：生化试剂，中国医药(集团)上海化学试剂公司。用0.2M pH7.2的PBS配成4％戊二醛溶液，4℃保存
21)尼妥珠单抗注射液(每瓶含50mg尼妥珠单抗、4.5mg磷酸二氢钠、18.0mg磷酸氢二钠、86.0mg氯化钠、2.0mg聚山梨醇酯80,50mg/瓶(10mL))，百泰生物药业有限公司
2.主要仪器
1)SB3200型超声波仪：BRANSON，上海
2)SL1001型电子天平：上海民桥电子仪器厂
3)JA1003型电子天平：上海天平仪器厂
4)SHZ-22水浴恒温震荡器：江苏太仓医疗器械厂
5)微量加样器：Eppendorf，美国
6)ZFQ-B型全自动蒸汽发生器：山东新华医疗器械股份有限公司
7)高速冷冻离心机：TA—2R(上海离心机械研究所)
8)免疫酶联检测仪：Multiskan MK3-353,美国
9)668型真空干燥箱：江苏东台县电器厂
10)振动磁强计:PPMS-9,Quantum Design,美国
11)数字温度计：TM902C，深圳市经腾威实业有限公司
12)SPG-06A高频磁感应加热设备：频率：230kHZ，输出交变加热电流：5A～30A,深圳双平高频加热器厂
13)752棱光紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司
14)808nm近红外半导体激光器：MDL-III-808,中国科学院长春光机所
15)7.0Tesla Mcrio-MR成像仪：PharmaScan，德国Bruker公司
3.细胞和动物
1)U251细胞株(人胶质瘤细胞)：购自中科院上海细胞研究所
2)Babl/c nu/nu裸小鼠：5～7周龄，雌雄各半，SPF级，购自中科院上海莱克斯实验动物中心，许可证号：SCXK(沪)2002-0010
实施例一、Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4@Au复合纳米磁粒的制备
1.Fe3O4纳米磁粒的制备
采用改良的化学共沉淀方法，用分析纯FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O分别用去氧处理后的去离子水配制成0.1mol/L的FeCl3溶液和FeCl2溶液，按摩尔比Fe3+:Fe2+＝5:3将100ml0.1mol/L的FeCl3溶液和60ml 0.1mol/L的FeCl2溶液混合于烧瓶中，再用去氧处理后的去离子水分别配制10ml 1mol/L的柠檬酸三钠溶液和50ml 1mol/L的氢氧化铵溶液，将柠檬酸三钠和氢氧化铵混合液快速加入氮气保护下正剧烈磁力搅拌着的FeCl3和FeCl2混合液，溶液中迅速出现黑色沉淀物，继续搅拌30min后停止。于80℃水浴恒温30min进行熟化，然后用强磁铁吸住烧瓶底部，倾去上层废液，用去离子水反复冲洗生成物，至其溶液PH＝7，将生成物真空干燥备用。
2.Fe3O4@Au复合纳米磁粒的制备
用去氧处理后的去离子水溶解Fe3O4纳米磁粒至0.01mol/L，超声处理5分钟，取20ml与20ml的0.1mol/L柠檬酸三钠溶液混合搅拌10分钟。再用去离子水稀释混合液至200ml，加入浓度为0.1％金氯酸溶液10ml，开始加热该溶液(配回流冷凝管)至沸后，逐次加入1mol/L盐酸羟胺1ml，继续加热并搅拌，溶液颜色随即由淡黄变为棕色，最后变为金胶体的特征红色，停止加热。利用永久磁铁将磁性纳米颗粒从溶液中分离出，用lmol/1盐酸反复洗涤，以除去未包裹或包裹不完全的多余的Fe3O4纳米磁粒，并用去离子水清洗3次，即得到Fe3O4@Au复合纳米磁粒，真空干燥备用。
实施例二、Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒的制备和表征
1.Fe3O4@Au复合纳米磁粒对Nimotuzumab的吸附
取1g/L Fe3O4@Au复合纳米磁粒混悬液5mL,用0.1mol/L的HCL溶液调节pH＝9.0,加入5mg/mL的Nimotuzumab 20μL,置于空气震荡，于37℃、200转/分左右的速度充分反应混合2h。再加入100μL质量分数1％的BSA溶液反应30min,磁性分离20min。小心移取上清液,沉淀用1mL 1％的BSA溶液溶解,摇匀后4℃下保存备用。
2.吸附免疫反应和吸附效果的测定
取100μL的Fe3O4@Au-Nimotuzumab混悬液,加入1mL酶标羊抗人Fc段二抗溶液(分别为500、1 000、2000、4000、8000、16000倍的酶标抗体稀溶液,pH＝7.4),37℃水浴反应60min。4℃左右磁性分离60min,取上清液100μL加入100μL邻苯二胺(OPD)底物溶液避光反应10min,加入50μL 2mol/L的硫酸溶液中止反应,在酶标仪中492nm波长下测定OD值。对照实验中,将Fe3O4@Au表面的活性位点以BSA溶液完全封闭,然后加入Nimotuzumab溶液,从而获得Fe3O4@Au-BSA,Nimotuzumab混合溶液。同样取100uL该混合溶液,加入1mL酶标羊抗人Fc段二抗(分别为500、1 000、2000、4000、8000、16000倍的酶标抗体稀溶液,pH＝7.4),步骤同上。
表1Fe3O4@Au对Nimotuzumab单抗Fc的吸附率
3.电镜形态学检测
取少量自制备的Fe3O4@Au-Nimotuzumab混悬液，滴有膜铜网，制得电镜样品，透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)和扫描电子显微镜(scanningelectron microscopy，SEM)下观察。它们近似圆形，电子密度高，大小均一,呈散在分布。(图1)
4.粒径及zeta电位分析
应用ZETA SIZER3000激光粒度分析仪进行粒径、Zeta电位测定，应用动态光散射软件进行数据处理，记录平均粒径及表面电位。Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒的平均直径为51.4nm，单峰状，粒径分布窄(图2)。在pH 7.4中性环境中，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒的zeta电位值为38.6±6.1mV(图3)。
5.光学性能检测
应用752棱光紫外可见分光光度计测定紫外-可见光(UV-vis)吸收光谱。Fe3O4@Au溶液在612nm处有最大的光吸收峰,而Fe3O4@Au-Nimotuzumab溶液的最大光吸收峰在630nm,相同的稀释倍数下,不仅Fe3O4@Au-Nimotuzumab的吸收峰值有所降低,而且出现明显的红移现象。这表明Nimotuzumab很好的吸附在纳米金表面。(图4)
6.磁学性能检测
振动样品磁强计(vibration sample magnetometer，VSM)进行体外磁响应性测定。磁滞回线表明，在300K温度，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒磁化强度均随外加磁场强度的增大而增大，但最终都趋于饱和；当外加磁场强度逐渐降低至0时，其磁化强度也同样趋近于0；反方向施加磁场，则反向趋于饱和。其磁滞回线接近为重合“S”型曲线，其矫顽力及剩磁很低，具有良好的超顺磁性。(图5)
7.稳定性检测
Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒分别用生理盐水制备为磁流体后观察其外观形态、悬浮稳定性，然后4℃避光放置，然后每日观察，持续2个月，进行观察比较。制备的Fe3O4纳米磁粒配制为磁流体后4℃、24h后均出现轻度沉降分层，上层为无色清亮液体，下层为黑色液体，境界清楚。予振荡或超声悬浮1min后，立即重悬为均匀黑色液体，呈胶体状。而Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒配制为磁流体后4℃、1w后才出现轻度沉降分层，说明本实验制备的Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁流体具有较好的悬浮稳定性。
实施例三、Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒体外靶向性评价
1.Fe3O4@Au、Nimotuzumab以及Fe3O4@Au-Nimotuzumab标记U251细胞的体外观察
人胶质瘤细胞株U251接种于含10％小牛血清的高糖DMEM培养液中，在37℃，饱和湿度5％CO2的培养箱中培养，每2-3天传代一次，使细胞处于贴壁状态。倒置显微镜下观察U251细胞均质而透明，成扁平不规则的多边形，单层密集排列，细胞大小、形态表现出多样性，以梭形细胞及有相对较大的细胞核的多角形细胞较为多见，胞质丰富，细胞核异型性明显，核大小不一，细胞核与细胞质的比例较大，核染色质增加，核仁增大。分别以0.05mg/mL的Fe3O4@Au、Nimotuzumab和Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒体标记U251细胞。对比实验显示，U251细胞内吞对Nimotuzumab无内吞作用；对Fe3O4@Au-Nimotuzumab显著强于Fe3O4@Au，其中复合纳米磁粒较多，背景干净，细胞外无颗粒聚集。这个实验充分说明了，Fe3O4@Au-Nimotuzumab的抗肿瘤效果显著强于Fe3O4@Au，并且是由于形成了靶向复合纳米磁粒而导致的、预料不到的技术效果。
2.标记U251细胞的的体外MRI
取对数生长期的U251细胞接种于6孔板中，每孔约含细胞1×106，24h细胞贴壁后，分为A，B和C三组，分别将浓度为0.05mg/mL的Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒(A组)、Fe3O4@Au(B组)和Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒+Nimotuzumab(0.05mg/mL)(C组)与U251细胞共孵育24h后，用0.25％胰蛋白酶消化后收集、离心，重悬于0.5ml，1％琼脂糖的Eppendof管中，另取1个Eppendof管内为琼脂糖作为对照。MRI采用7.0Tesla Micro-MR仪(Bruker，PharmaScan 7.0)，内径3.0cm的体线圈，T2加权自旋回波成像序列，具体参数如下：视野(FOV)5cm×5cm；层厚1mm；矩阵256×256；TR2000ms，TE 36ms。测量信号强度及信号范围，给出时间-信号衰减图形。体外MRI显示，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后(A组)在T2WI上信号强度与对照组相比明显降低；Fe3O4@Au复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后(B组)在T2WI上信号强度无明显降低；Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒+Nimotuzumab与U251细胞共孵育后(C组)在T2WI上信号强亦无明显降低。其中，图6表示：Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后在MRI T2WI上图像(A)，Fe3O4@Au复合纳米磁粒与U251细胞共孵育后在MRI T2WI上图像(B)，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒和Nimotuzumab与U251细胞共孵育后在MRI T2WI上图像(C)，琼脂糖为对照；图7表示：Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒与U251细胞共孵育T2WI弛豫时间(A)，Fe3O4@Au复合纳米磁粒与U251细胞共孵育T2WI弛豫时间(B)，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒和Nimotuzumab与U251细胞共孵育(C)(*与对照组相比，P＜0.05))
实施例四、Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒体内靶向性评价
1.裸鼠胶质瘤移植瘤模型制作
取对数生长期的人胶质瘤U251细胞，用0.25％胰酶消化离心后，以生理盐水调整好浓度以2×106细胞数量注入裸鼠右下肢皮下。每个部位0.15mL，注射点距进针点1cm，均形成皮丘，经2-3周于接种部位肿瘤开始生长，经4周肿瘤直径达0.5cm左右始用于试验。
2.Fe3O4@Au-Nimotuzumab复合纳米磁粒靶向胶质瘤的MRI
按分组要求，将12只裸鼠随机分成A和B三组，每组6只，A组经尾静脉注射Fe3O4@Au-Nimotuzumab复合纳米磁粒，B组经尾静脉注射Fe3O4@Au复合纳米磁粒，纳米磁粒浓度为0.05mg/mL，注射剂量均为10mg/kg。在注射前及注射后2h、8h、24h分别进行7.0Tesla超高场强实验动物MR系统成像，观察不同时间点肿瘤的信号变化，成像序列包括SE-T1WI、SE-T2WI、GRE-T2 *WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。在体MRI结果显示，A组注射Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒后肿瘤组织不同时间点的T2WI、T2 *WI强度及信号变化率均有明显下降，具有统计学差异。而B组Fe3O4@Au复合纳米磁粒在注射后2h和8h两个时间点的信号亦有轻度下降，但下降幅度较A组小，且持续时间短。B组在注射后24h的信号强度即恢复至平扫水平，而A组注射后24h的信号强度仍然维持在较低水平。图8表示：Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI图像(A)，Fe3O4@Au复合纳米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI图像(B)(白色箭头指向移植瘤)；图9表示：Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒注射后不同时间点裸鼠移植瘤MRI T2*WI弛豫时间(A)，Fe3O4@Au复合纳米磁粒注射后不同时间点裸鼠移植瘤MRI T2*WI弛豫时间(B)(*与0时间点相比，P＜0.05)。
实施例五、Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒热动力学试验
(1)将Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成浓度分别为1.0g/L的纳米磁流体，取5ml入25mm平底试管中，置于频率230KHz，输出电流30A的SPG-06A高频磁感应加热设备平板线圈上加热1h，起始室温25℃，试管底距高频磁感应加热线圈中心0.5cm，每隔5min用TM902C数字测温仪测温1次，以时间为横坐标,温度为纵坐标绘制Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒升温曲线。当磁场强度一定时，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒在磁场作用下，温度可以上升至42.5℃，在作用前30min内升温迅速、30～45min升温平缓、50min后温度几乎不再上升而恒定。(图10)
(2)将Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成浓度分别为1.0g/L的纳米磁流体,取5ml入25mm平底试管中，应用输出功率为2.5W的808nm近红外半导体激光器照射1小时，起始室温25℃，每隔5分钟用TM902C数字测温仪测温1次，以时间为横坐标,温度为纵坐标绘制Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒升温曲线。当近红外(NIR)的激光照射功率一定时，Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒在激光照射下，温度可以上升达41.3℃，在作用前15min内升温迅速、30min后温度几乎不再上升而恒定。(图11)
(3)将Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向复合纳米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成浓度分别为1.0g/L的纳米磁流体,取5ml入25mm平底试管中，置于频率230KHz，输出电流30A的高频磁感应加热设备平板线圈上加热，同时应用输出功率为2.5W的808nm近红外半导体激光器照射，起始室温25℃，时间1小时，每隔5min用TM902C数字测温仪测温1次，以时间为横坐标，温度为纵坐标绘制Fe3O4@Au复合纳米磁粒升温曲线。当磁场强度一定并且近红外激光照射功率一定时，在AMF和NIR同时作用下，开始15分钟内温度可以迅速上升至45.5℃，20min后温度几乎不再上升而保持稳定。(图12)。

Claims (10)

1.一种具有双加热和显像功能的靶向复合纳米磁粒，其特征在于，由Fe3O4纳米粒子和Au复合而成的、具有核壳结构、并吸附单克隆抗体尼妥珠单抗，以形成Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒。
2.根据权利要求1所述的靶向复合纳米磁粒，其特征在于，是以Fe3O4纳米粒子作为核心，以Au作为纳米磁粒壳层，具有核壳结构、并在该纳米磁粒的表面吸附单克隆抗体尼妥珠单抗，以形成Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒。
3.一种权利要求1或2所述的靶向复合纳米磁粒的制备方法，其特征在于，
1)Fe3O4纳米磁粒的制备：取0.01～0.1mol/L的FeCl3、FeCl2溶液，按摩尔比Fe3+:Fe2+＝5:3将二者混合，去离子水分别配制10ml的1mol/L的柠檬酸三钠溶液和50ml 1mol/L的氢氧化铵溶液，取混合液0.01～0.1倍量的0.1～1mol/L柠檬酸三钠以及0.01～0.5倍量的0.1～1mol/L氢氧化铵混合液快速加入氮气保护下的上述混合液中，溶液中迅速出现黑色沉淀物，继续搅拌30～60min后停止。于60℃～80℃水浴恒温30～60min进行熟化，然后用磁铁吸住烧瓶底部，倾去上层废液，用去离子水反复冲洗生成物，至其溶液pH＝7，将生成物真空干燥，既得Fe3O4纳米磁粒；
2)Fe3O4@Au复合纳米磁粒的制备：用去氧处理后的去离子水和上述Fe3O4纳米磁粒配制为浓度0.01～0.1mol/l的混悬液，超声处理5min以上，功率为600W，将上述混悬液与0.1～1mol/l的柠檬酸三钠溶液，按照体积比1：1～1：2混合搅拌10～30min，然后，再按照体积比1：5～1：10向上述混合液中加入去离子水稀释，将所得混合液与质量体积浓度为0.1～1％金氯酸溶液按照体积比20：1～10：1混合后加热，边加热边搅拌，缓慢加入1～10:1倍量的0.1～2mol/l的盐酸羟胺溶液，直至混合液颜色由淡黄变为金胶体的特征红色后，停止加热；再利用磁铁将磁性纳米颗粒从上述液体中分离出，然后用HCl洗涤3次以上，并用去离子水清洗1～3次，真空干燥后，即得到Fe3O4@Au复合纳米磁粒；
3)制备Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒：称取少量上述Fe3O4@Au复合纳米磁粒，用去离子水配置成0.1～1g/L Fe3O4@Au复合纳米磁粒混悬液，取上述混悬液1～5ml,并用0.01～0.1mol/l的HCl溶液调节其pH至9.0～10.0，加入1～5mg/ml的尼妥珠单抗注射液4～20μl，置于空气中震荡，于37℃、200r/min的速度充分混合上述混悬液并反应2～4h，再加入20～100μl的质量分数为1％的牛血清蛋白溶液，反应30min～1h，然后用磁铁分离20～60min，小心移去上清液，沉淀用1～5ml质量分数为1％的牛血清蛋白溶液溶解摇匀后，于4℃下保存备用，即得Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒。
4.一种权利要求1或2所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
5.一种权利要求1或2所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备显像示踪药物中的应用；优选的，所述的用途为用于制备肿瘤活体追踪药物。
6.一种权利要求1或2所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备辅助肿瘤热疗药物中的应用。
7.一种权利要6所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备辅助肿瘤热疗控温及恒温药物中的应用。
8.一种权利要6所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备辅助肿瘤光热转换的近红外光谱技术热疗药物中的应用。
9.一种权利要6所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，在制备辅助双热疗药物中的应用；进一步优选的，所述的双热疗技术为磁流体热疗联合近红外光谱技术热疗技术。
10.一种权利要求6所述的Fe3O4@Au-尼妥珠单抗靶向复合纳米磁粒的用途，其特征在于，用作肿瘤热疗的磁感应剂、光敏感剂或阴性造影剂。
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