CN103623406A - 一种具有双加热功能的纳米磁粒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种具有双加热功能的纳米磁粒及制备方法,该方法是制备四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子作为核心,利用其磁感应性靶向肿瘤细胞,并进行磁热疗;选用金作为纳米磁粒壳层,利用其光敏感性对肿瘤细胞进行近红外热疗;构建的新型Fe3O4Au复合纳米磁粒,可以同时作为肿瘤热疗的磁感应剂和光敏感剂。本发明制得的复合纳米颗粒输注入肿瘤动物模型中,在活体动物模型上,进行磁热疗和光热疗,该纳米磁粒对肿瘤的治疗明显优于单一治疗方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域,具体涉及一种具有双加热功能的纳米磁粒及其制备方法。
背景技术
磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles, MNPs) 诱导的肿瘤组织热疗是一种极具潜力的治疗手段,已在多种体外实验的动物模型中被评估,取得可喜的结果,目前已经进入Ⅰ期临床试验。热疗是一个治疗程序,其原理是促进人体组织温度升高,以改变细胞结构和功能,即温度增加到41℃至42℃之间时,可以诱导肿瘤细胞死亡。因为肿瘤细胞比周围正常细胞对温度突然升高的耐受性差。温度的升高引起许多酶和结构蛋白质在细胞内的运作,进而改变细胞的增殖和分化,诱发细胞凋亡。一般认为热疗触发的细胞膜改变导致跨膜转运的减少并且破坏膜电位平衡。而且温度升高可以影响核酸的合成并抑制修复酶,促进DNA结构变异。热疗所需的高温可以通过不同的热源获得,如电磁辐射波(热疗用射频或微波)、超声波或电诱导热疗。这些技术显示出了良好的效果,然而这些传统方法的主要问题是如何达到热疗温度均匀分布到肿瘤深部区域。从某种意义上说,治疗失败源于一些肿瘤区域温度升高不足,使肿瘤复发。同时过热也可导致癌旁组织损伤。目前磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia, MFH)技术已经部分解决了这些问题。应用磁性材料提高热疗疗效开始于20世纪50年代中后期Gilchrist等的研究。随后,许多研究评估了在不同肿瘤中的治疗。然而,这些初步的研究结果直到20世纪90年代初才在学术界广泛使用,而且目前这一领域也仅有少数临床研究。因此,为更好地应用于人体治疗,有关物理条件、毒性程度和疗效的更详细研究是必要的。MFH的原理,是在肿瘤内注射磁流体,随后将肿瘤置于交变磁场(alternating magnetic field, AMF)下,促使肿瘤区域温度升高。目前,MFH是一种非侵入性的极具前景的技术,能有效地对深部和难以触及的组织进行热疗。MFH可以特异性的靶向肿瘤组织,其温度分布均匀且热传导率高,并减少健康组织的损害。除纳米磁粒外,纳米金(nanogo1d)作为热疗用光敏感剂,也越来越受到学术界广泛的关注。纳米金即指金纳米粒子,其直径在1~100nm,具有高电子密度、介电特性、高吸收截面和高光热转化效率,经过静脉注射后,能够富集在肿瘤部位,经近红外光(near-infrared, NIR)照射后,通过吸收近红外激光能量,能迅速升温“热死”肿瘤细胞。其还具有良好的生物相容性,能与多种生物大分子结合,且不影响其生物活性。作为现代四大标记技术之一的纳米金标记技术(nanogold labelling techique),实质上是蛋白质等高分子被吸附到金纳米粒子表面的包被过程。球形的金纳米粒子对蛋白质有很强的吸附功能,吸附机理可能是金纳米粒子表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合,而且吸附后不会使生物分子变性,因此金纳米粒子又是理想的药物载体。
综上所述:磁感应热疗、光热疗等在基础研究领域均显示了良好的应用前景,但作用仍显得较为单一。在肿瘤联合治疗原则的指导下,可否以磁性纳米颗粒同时在外加交变磁场和近红外光作用下,使纳米颗粒加热升温进行热疗;从而将磁热疗和光热治疗技术有机结合起来协同杀灭肿瘤细胞,有待进一步研究。
发明内容
技术问题:本发明提供了一种可用于胶质瘤热疗的具有双加热功能的纳米磁粒,同时提供了一种上述具有双加热功能的纳米磁粒的制备方法。
技术方案:本发明方法制备的纳米磁粒,是由Fe3O4和Au复合而成的具有核壳结构的复合纳米磁粒。本发明的具有双加热功能的复合纳米磁粒的制备方法,包括以下步骤:
用去氧处理后的去离子水和Fe3O4 纳米磁粒配制为浓度0.01~0.1mol/L的溶液,超声处理5分钟以上,将上述溶液与0.1~1mol/L的柠檬酸三钠溶液,按照体积比1:1至1:2混合搅拌,再按照体积比1:5~1:10加入去离子水稀释混合液,将上述混合液与质量体积浓度为0.1~1%金氯酸溶液,按照体积比20:1~10:1混合,然后用配冷凝回流管加热至沸后,一边加热搅拌,一边加入盐酸羟胺溶液,直至溶液颜色由淡黄变为金胶体的特征红色后,停止加热;利用磁性将磁性纳米颗粒从溶液中分离出,用盐酸反复洗涤3次以上,并用去离子水清洗后,即得到Fe3O4Au复合纳米磁粒。
本发明的具有双加热功能的复合纳米磁粒,是按照上述方法制备得到的。
有益效果:本发明与现有技术相比,具有以下优点:
金氯酸的柠檬酸盐还原法是制备水相分散的金纳米颗粒的最经典方法。我们选择柠檬酸盐-金氯酸还原法来制备颗粒的金壳层,简化Fe3O4Au复合纳米磁粒的构建工艺。先用化学共沉淀法合成水相分散的Fe3O4 纳米磁粒,然后再以这些纳米磁粒为晶种,在其表面用金氯酸的柠檬酸盐还原法生成金壳层。早在 1951 年,Turkevitch 就最先报道了以较小的金纳米颗粒为种子,用氢氧化亚胺与金氯酸反应来制备粒径较大的金纳米颗粒。最近的研究表明,通过改变晶种与金属的比率,金纳米颗粒的粒径可控制在5~40纳米范围,尺寸分布相对误差在10-15%。在避免二次成核方面,逐步的颗粒放大方法要比一次性晶种生长法更有效。只要反应试剂和条件选择恰当,同质生长金纳米颗粒的晶种调制法对异质生长Fe3O4Au核壳结构纳米颗粒也同样有效。我们采用柠檬酸钠与金氯酸反应的方法,在晶种Fe3O4纳米磁粒表面异质生长金壳层,将制备得到的纳米磁粒分散在HAuCl4溶液中,加热煮沸,利用还原剂对Au3+进行还原,还原的Au原子会以Fe3O4为种子,在其表面沉积并生长。由于非均匀成核所需动力要低于均匀成核的动力要低于均匀成核,因此,Au原子优先在Fe3O4上成核。从单分散颗粒形成的机理可知:控制实验条件,可以使成核与长大分两个阶段进行,经典的Frens方法制备金溶胶是均匀成核的过程,金核的形成往往需要一定诱导期,当溶液中金的浓度低于其成核浓度,但又高于饱和浓度的时候,不会形成新的金核,而是在己有种子的情况下以相同的速度慢慢长大,因此控制种子的量和HAuCl4的量,能够控制复合粒子的大小和表面包覆量。
在合成Fe3O4Au核壳粒子的实验过程中,加入的HAuCl4溶液的浓度对产物的影响很大,我们分别考察了加入不同浓度的HAuCl4溶液对Au包裹层形成的影响,发现当加入的 HAuC14.溶液浓度较大时,溶液最初变为红色,底部有紫红色沉淀,放置一段时间后,溶液变为无色透明,但容器底部覆盖一层紫红色沉淀。这是因为HAuCl4,溶液浓度过大,溶液中还原的金浓度高于临界成核浓度,大部分Au原子没有在Fe3O4种子表面沉积,而是自发成核,形成了较大的Au颗粒,在自然状态下就能沉淀。产物置于磁力板上,发现红色沉淀没有被吸附,说明紫红色沉淀物为Au颗粒,因此,在该条件下不能发生Au在Fe3O4表面的有效包覆。当加入的HAuCl4溶液浓度为1%时,随着HAuCl4和还原剂的逐次加入和被还原,体系的颜色从亮黄色逐渐变为酒红色,溶液澄清透明,底部没有出现上述的红色沉淀。放置一段时间后,溶液仍然是酒红色,且无沉淀产生。说明Au原子已经有效地包裹到Fe3O4种子表面。当HAuCl4溶液浓度较小时,随着HAuCl4和还原剂的逐次加入和被还原,体系虽然澄清透明,但只呈现很浅的紫色,底部逐渐出现少量黑色的沉淀。原因是HAuCl4的浓度太低,没有把Fe3O4种子包裹好,被部分Au包裹的Fe3O4粒子由于静电力的作用沉降下来。因此本课题组采用0.1%-1% HAuCl4溶液用于合成实验。
在合成Fe3O4Au纳米磁粒的过程中,我们探究了 0.01 mol/L Fe3O4纳米磁粒种子悬液的量为10mL-30mL时,得到的现象和结果,从而确定Fe3O4种子悬液与HAuCl4溶液的比例。实验发现,反应一开始加入的悬液的量较少时,加入盐酸氢氨溶液后反应体系很快变为紫色,然后慢慢变为紫红,最终为紫红色透明溶液,产物静置半小时后有少量团聚现象出现。将该产物置一于小试管中,架在磁体上方,半小时后观察,发现有少量磁性粒子析出,但是溶液的紫红色并未褪去。可以判定这是由于种子量太少,大量的游离Au原子没有沉积位点而发生自成核现象生成纳米金,而生成的纳米金在磁场作用下不发生沉降,所以溶液的颜色还是紫红色。当一开始加入的悬液的量适当时,反应发生后,溶液的颜色从亮黄色逐渐变红,最终呈现酒红色。将溶液单独静置半小时后,并没有出现沉淀,溶液的颜色仍然是酒红色。将该产物置于一小试管中,架在磁体上方,半小时后观察,发现有大量磁性粒子析出,溶液的酒红色完全褪去,溶液变为无色。我们认为,溶液中的金都进行了有效包覆,没有发生自成核现象生成纳米金,且单独静置没沉淀出现,说明溶液的分散性较好。当一开始加入的悬液的量较大时,反应发生后溶液颜色慢慢变成紫红色,但是很快有大量黑色粒子沉降,溶液颜色变得无色。我们认为,是由于种子悬液的量太大,导致种子未能全部被包裹,从而相互吸附沉降。
本发明制备的Fe3O4Au复合纳米磁粒大小均匀、圆形、平均直径分别为35nm、壳层平均厚度4nm,分散性好、具有较好的稳定性, 磁响应性和光学性质;并具有良好的生物相容性;Fe3O4Au复合纳米磁粒介导的MFH和NIR热疗在体外具有显著抑制胶质瘤U251细胞增殖及诱导其凋亡作用,在体内具有显著增加肿瘤的质量及体积抑制率的作用,显示了优于用单一治疗方法的疗效。
附图说明
图1为Fe3O4Au复合纳米磁粒透射电镜图。
图2为Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au吸收光谱示意图。
图3为Fe3O4Au复合纳米磁粒在交变磁场作用下体外热动力学试验结果示意图。
图4为Fe3O4Au复合纳米磁粒在近红外光作用下体外热动力学试验结果示意图。
图5为Fe3O4Au复合纳米磁粒在交变磁场和近红外光联合作用下体外热动力学试验结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步具体说明。
1.主要试剂
1)三氯化铁(FeCl3.6H2O,A.R):中国医药上海化学试剂采购供应站
2)氯化亚铁(FeCl2.4H2O,A.R):中国医药上海化学试剂采购供应站
3)氨水(NH3.H2O, A.R):上海化学试剂有限公司
4) 盐酸(HCL A.R): 南京化学试剂一厂
5)氢氧化钾(KOH, A.R):上海凌峰化学试剂有限公司
6)氢氧化钠(NaOH A.R):上海化学试剂有限公司
7)无水乙醇:分析纯,南京化学试剂一厂
8)异丙醇:分析纯,南京化学试剂一厂
9)氯仿:分析纯,中国宝应化学试剂厂
10)无水乙醚:分析纯,南京化学试剂一厂
11)盐酸羟胺:分析纯,中国医药上海化学试剂采购供应站
12)氯金酸(AuCl3.HCL. 4H2O,A.R):中国医药上海化学试剂采购供应站
13) 柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O,A.R): 中国医药上海化学试剂采购供应站
2. Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au复合纳米磁粒的制备
2.1 Fe3O4纳米磁粒的制备
采用自行设计的设备,应用改良的化学共沉淀方法,用分析纯FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O分别用去氧处理后的去离子水配制成0.1mol/L的FeCl3溶液和FeCl2溶液,按摩尔比Fe3+: Fe2+=5:3 将100ml 0.1mol/L 的FeCl3溶液和60ml 0.1mol/L的FeCl2溶液混合于烧瓶中,再用去氧处理后的去离子水分别配制10ml 1mol/L的柠檬酸三钠溶液和50ml 1mol/L的氢氧化铵溶液,将柠檬酸三钠和氢氧化铵混合液快速加入氮气保护下正剧烈磁力搅拌着的FeCl3和FeCl2混合液,溶液中迅速出现黑色沉淀物,继续搅拌30min 后停止。于80℃水浴恒温30min 进行熟化,然后用强磁铁吸住烧瓶底部,倾去上层废液,用去离子水反复冲洗生成物,至其溶液PH=7,将生成物真空干燥备用。
2.2 具有双加热功能的纳米磁粒的制备
实施例1:用去氧处理后的去离子水溶解Fe3O4 纳米磁粒至0.01mol/L,超声处理5分钟,取20ml与20ml的0.1mol/L柠檬酸三钠溶液混合搅拌10分钟。再用去离子水稀释混合液至200ml,加入浓度为0.1%金氯酸溶液10 ml,开始加热该溶液(配冷凝回流管)至沸后,逐次加入1mol/L盐酸羟胺1ml,继续加热并搅拌,溶液颜色随即由淡黄变为棕色,最后变为金胶体的特征红色,停止加热。利用永久磁铁将磁性纳米颗粒从溶液中分离出,用lmol/1盐酸反复洗涤,以除去未包裹或包裹不完全的多余的Fe3O4 纳米磁粒,并用去离子水清洗3 次,即得到Fe3O4Au复合纳米磁粒,真空干燥备用。
实施例2:用去氧处理后的去离子水溶解Fe3O4 纳米磁粒至0.05mol/L,超声处理5分钟以上,取20ml与30ml的0.5mol/L柠檬酸三钠溶液混合搅拌10分钟以上。再用去离子水稀释混合液至300ml,加入浓度为0.5%金氯酸溶液20 ml,开始加热该溶液(配冷凝回流管)至沸后,逐次加入1mol/L盐酸羟胺1ml,继续加热并搅拌,溶液颜色随即由淡黄变为棕色,最后变为金胶体的特征红色,停止加热。利用永久磁铁将磁性纳米颗粒从溶液中分离出,用lmol/1盐酸反复洗涤,以除去未包裹或包裹不完全的多余的Fe3O4 纳米磁粒,并用去离子水清洗3 次,即得到Fe3O4Au复合纳米磁粒,真空干燥备用。
实施例3:用去氧处理后的去离子水溶解Fe3O4 纳米磁粒至0.1mol/L,超声处理5分钟以上,取20ml与40ml 的1mol/L柠檬酸三钠溶液混合搅拌10分钟以上。再用去离子水稀释混合液至400ml,加入浓度为1%金氯酸溶液40 ml,开始加热该溶液(配冷凝回流管)至沸后,逐次加入1mol/L盐酸羟胺1ml,继续加热并搅拌,溶液颜色随即由淡黄变为棕色,最后变为金胶体的特征红色,停止加热。利用永久磁铁将磁性纳米颗粒从溶液中分离出,用lmol/1盐酸反复洗涤,以除去未包裹或包裹不完全的多余的Fe3O4 纳米磁粒,并用去离子水清洗3 次,即得到Fe3O4Au复合纳米磁粒,真空干燥备用。
2.3 Fe3O4Au复合纳米磁粒表征
2.3.1 电镜形态学检测
取出少量自制备的Fe3O4Au核壳型纳米磁粒,加无水乙醇超声分散15min,滴有膜铜网,制得电镜样品,透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)下观察。它们近似圆形,电子密度高,大小均一, 呈散在分布。
2.3.2 能谱仪(energy dispersive spectrometer,EDS)表征分析
将Fe3O4Au复合纳米磁粒用无水乙醇淋洗数次(3~5次)后,超声30min,悬浮在去离子水中,取适量悬液滴铜网。在SEM视野下任意选几个视野,用能谱仪对其成份进行分析。
2.3.3粒径及zeta电位分析
分别取2mL Fe3O4 纳米磁粒和Fe3O4Au复合纳米磁粒溶液,调节PH=7.4,置于比色皿中,应用ZETA SIZER3000激光粒度分析仪进行粒径、Zeta电位测定,应用动态光散射软件进行数据处理,记录平均粒径及表面电位。
2.3.4磁学性能检测
a.振动样品磁强计(vibration sample magnetometer,VSM)进行体外磁响应性测定, 对Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au核壳型纳米磁粒冷冻干燥粉末,在磁场范围-5000Oe~+5000 Oe内,于300 K温度测定样品的磁性能。磁滞回线表明,在300 K温度,Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au复合纳米磁粒磁化强度均随外加磁场强度的增大而增大,但最终都趋于饱和;当外加磁场强度逐渐降低至0 时,其磁化强度也同样趋近于0;反方向施加磁场,则反向趋于饱和。其磁滞回线接近为重合“S”型曲线,说明其矫顽力及剩磁很低,具有良好的超顺磁性。Fe3O4纳米磁粒饱和磁化强度(Ms)值为75.5emu/克,而Fe3O4Au复合纳米磁粒为51.8emu/克。
b. 将制备的Fe3O4Au复合纳米磁粒 1g/L的混悬液50ml置于玻璃培养皿中,放置在磁分离平板上,观察其聚沉情况。
2.3.5光学性能检测
分别取2mL Fe3O4 纳米磁粒和Fe3O4Au复合纳米磁粒置于比色皿中,应用752棱光紫外可见分光光度计测定紫外-可见光(UV-vis)吸收光谱。Fe3O4MNP的紫外吸收在900-300纳米波长范围内随着波长减小而增加,无明显吸收峰(图2曲线a),而Fe3O4Au复合MNPs的紫外吸收光谱在612nm出现明显的吸收峰(图2曲线b)。
2.3.6 X-射线衍射分析(x-ray diffraction,XRD)
取适量的自制备的Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au 复合纳米磁粒粉末进行XRD检测,测试条件:Cu靶Kα(λ=0.154nm),管压30kV,管流40mA。
2.3.7 稳定性检测
Fe3O4纳米磁粒和Fe3O4Au核壳型纳米磁粒分别用生理盐水制备为磁流体后观察其外观形态、悬浮稳定性,然后4℃避光放置,然后每日观察,持续2个月,进行观察比较。
2.4 Fe3O4Au复合纳米磁粒热动力学试验
a. 将Fe3O4Au复合纳米磁粒用0.9 %NaCl 溶液配制成浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L的纳米磁流体,各取5ml入25mm 平底试管中,分别置于频率230KHz,输出电流30A 的SPG-06A 高频磁感应加热设备平板线圈上加热1h,起始室温25℃,试管底距高频磁感应加热线圈中心0.5cm , 每隔5min 用TM902C数字测温仪测温1次,以时间为横坐标,温度为纵坐标绘制Fe3O4Au复合纳米磁粒升温曲线。当磁场强度一定时,Fe3O4 Au复合纳米磁粒在磁场作用下,温度可以上升至39.5℃,42.5℃,44℃,46℃,47.5℃不等,其升温能力与磁流体浓度成正相关,浓度越大升温能力越强、温度上升越高,但具有共同的规律:在作用前30min内升温迅速、30~45min升温平缓、50min后温度几乎不再上升而恒定在某一水平(图3)。
b. 将Fe3O4Au复合纳米磁粒用0.9 %NaCl 溶液配制成浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L的纳米磁流体, 各取5ml 入25mm 平底试管中,分别应用输出功率为2.5W的808nm近红外半导体激光器照射1小时,起始室温25℃,每隔5分钟用TM902C数字测温仪测温1次,以时间为横坐标,温度为纵坐标绘制Fe3O4Au复合纳米磁粒升温曲线。当近红外(NIR)的激光照射功率一定时,Fe3O4Au复合纳米磁粒在激光照射下,温度可以上升达38.2℃,41.3℃,42.4℃,43.5℃,45.1℃不等,其升温能力与磁流体浓度成正相关,浓度越大升温能力越强、温度上升越高,而且具有共同的规律:在作用前15min内升温迅速、30min后温度几乎不再上升而恒定在某一水平(图4)。
c. 将Fe3O4Au复合纳米磁粒用0.9 %NaCl溶液配制成浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L的纳米磁流体, 各取5ml 入25mm 平底试管中,各取5ml 入25mm平底试管中, 分别置于频率230KHz,输出电流30A 的高频磁感应加热设备平板线圈上加热,同时应用输出功率为2.5W的808nm近红外半导体激光器照射,起始室温25℃,时间1小时,每隔5min用TM902C数字测温仪测温1 次,以时间为横坐标,温度为纵坐标绘制Fe3O4Au复合纳米磁粒升温曲线。当磁场强度一定并且近红外激光照射功率一定时,在AMF和NIR同时作用下,开始15分钟内温度可以迅速上升至41.2℃,44℃,46℃,47.1℃,48.3℃不等,20min后温度几乎不再上升而保持稳定在42.3℃-51.4℃(图5)。
Claims (2)
1.一种具有双加热功能的纳米磁粒的制备方法,其特征在于,该方法包括下述步骤:
用去氧处理后的去离子水和Fe3O4 纳米磁粒配制为浓度0.01~0.1mol/L的溶液,超声处理5分钟以上,将上述溶液与0.1~1mol/L的柠檬酸三钠溶液,按照体积比1:1至1:2混合搅拌,再按照体积比1:5~1:10加入去离子水稀释混合液,将上述混合液与质量体积浓度为0.1~1%金氯酸溶液,按照体积比20:1~10:1混合,然后用配冷凝回流管加热至沸后,一边加热搅拌,一边加入盐酸羟胺溶液,直至溶液颜色由淡黄变为金胶体的特征红色后,停止加热;利用磁性将磁性纳米颗粒从溶液中分离出,用盐酸反复洗涤3次以上,并用去离子水清洗后,即得到Fe3O4Au复合纳米磁粒。
2.一种具有双加热功能的纳米磁粒,其特征在于,该纳米磁粒是按照权利要求1所述方法制备得到的。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140312 |