CN113813381A - 一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成方法及其光热催化协同杀菌应用 - Google Patents

一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成方法及其光热催化协同杀菌应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成及其催化光热协同抗菌的应用。取溶菌酶纤维溶液和氯化铜溶液，反应15‑30min；将溶液放到50‑70℃水浴锅中，滴加硫化钠溶液，反应2‑3h；得到溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料。本发明以溶菌酶负载硫化铜纳米酶LNFs@CuS为催化剂与光热剂，在亚硝酸钠和抗坏血酸的反应体系中，作为催化剂加速反应的进行，快速产生大量一氧化氮，通过一氧化氮进行杀菌；同时在近红外光NIR照射下，通过热消融途径使细菌死亡的方法。

Description

一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成方法及其光热 催化协同杀菌应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成及其催化光热协同抗菌的应用。
背景技术
纳米酶是指纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。自从2007年纳米酶发现以来，纳米酶在研究领域中迅速崛起，在抗菌领域的应用也被逐渐发掘出来。与抗生素抗菌的原理不同，纳米酶利用酶促反应产生的抗菌因子，可以达到高效杀死细菌的效果；纳米酶可结合光热治疗法(PTT)进行协同抗菌，在NIR的作用下，通过热消融机制杀死细菌，以上两种抗菌方法均不易产生细菌耐药性，同时光热疗法产生的热效应，能够进一步增强催化反应效率，更好的达到杀菌效果，是一种拥有广阔研究前景的新型催化光热协同抗菌技术。因此，研究开发催化光热协同抗菌技术对我国抗菌技术的发展与保障国民健康安全有着重要意义。
在催化光热协同抗菌过程中，催化起着主导作用，光热起着协同抗菌和增强催化抗菌的效果。多数科研工作者在抗菌领域的研究存在着杀菌方法较为单一，材料与细菌相互作用较弱等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中光热转换效率不高、与细菌相互作用弱的、易使细菌产生耐药性等缺陷，提供一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料并将其用于光热催化协同抗菌；本发明通过在溶菌酶纤维上负载CuS纳米颗粒，具有良好的催化效率，高光热转换效率，与细菌有强相互作用，具有良好的生物相容性，能够快速杀死细菌。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶(LNFs@CuS)复合材料，CuS纳米颗粒均匀修饰溶菌酶纤维表面，具体制备方法如下：
取溶菌酶纤维溶液，加入氯化铜溶液，反应15-30min；将溶液放到50-70℃水浴锅中，滴加硫化钠溶液，反应2-3h。
其中，溶菌酶纤维溶液、氯化铜溶液和硫化钠溶液的体积比1：1：1；所述溶菌酶纤维浓度为5mg/ml，所述氯化铜溶液浓度为0.51mg/ml，所述硫化钠溶液浓度为0.72mg/ml。进一步地，所述的溶菌酶纤维，其制备方法如下：
配置浓度为1M的盐酸溶液10ml，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液。配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1ml，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液。取0.01g溶菌酶，加入4500ul A溶液和500ul B溶液溶解。在油浴锅中70℃搅拌5h。反应完成后12000rpm离心洗涤两次，每次20min。
本发明还提供一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶(LNFs@CuS)复合材料催化光热协同杀菌的方法，按照下述步骤进行：
将细菌悬浮液置于亚硝酸钠、抗坏血酸和LNFs@CuS纳米酶反应体系中，静置一会后，在近红外光照射下，照射一段时间，用磷酸盐缓冲液稀释，取稀释后的悬浮液放到LuriaBertani固体培养基，在37℃恒温培养箱中培养18-24h后，计算菌落数。
进一步地，所述的细菌悬浮液与LNFs@CuS纳米酶的体积比例为1：3；亚硝酸钠、抗坏血酸与LNFs@CuS纳米酶的体积比例为1：1：1。
进一步地，LNFs@CuS纳米酶的浓度为50-200μg/ml，亚硝酸钠浓度为5-10mM，抗坏血酸浓度为5-10mM，细菌悬浮液浓度为108个/mL。
进一步地，所述的近红外光照射的条件为：功率为0-2W，照射0-10min，近红外光波长为980nm。
所述的稀释为稀释10000倍。
所述细菌为绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌中的一种。
与现有技术相比较，本发明所具备的有益效果如下：
本发明所合成的纳米酶用量少，催化转化率高，光热转换效率高，与细菌相互作用强，可在短时间内杀死细菌。
抗生素的滥用导致细菌产生耐药性。本发明所制得的LNFs@CuS纳米酶，CuS纳米颗粒均匀的分散在溶菌酶纤维上(如附图1所示)；同时溶菌酶纤维作为生物模板，与细菌有良好的相互作用，能够黏附细菌(如附图2所示)；在亚硝酸钠和抗坏血酸的反应体系下可以催化产生一氧化氮，利用一氧化氮的独特特性进行杀菌；同时硫化铜纳米颗粒作为一种光热剂，有着优异的光热转换效率，在近红外光的照射下，产生热效应，利用光热效果杀死细菌；同时热效应能够增强催化效果，通过催化光热协同杀菌，不引起细菌耐药性，是一种绿色高效的抗菌新方法。
附图说明
图1为LNFs@CuS纳米酶的TEM图。
图2为LNFs@CuS纳米酶与金黄色葡萄球菌作用的TEM图。
图3为不同浓度的LNFs@CuS纳米酶光热杀菌效果图。
图4为不同浓度LNFs@CuS纳米酶催化杀菌效果图。
图5为不同杀菌类型的杀菌效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明技术作进一步描述。
实施例1:
溶菌酶纤维的制备：
配置浓度为1M的盐酸溶液10ml，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液。配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1ml，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液。取0.01g溶菌酶，加入4500ul A溶液和500ul B溶液溶解。在油浴锅中70℃搅拌5h。反应完成后12000rpm离心洗涤两次，每次20min。
LNFs@CuS纳米酶复合材料的制备：
取2ml溶菌酶纤维溶液，加入氯化铜溶液，反应20min；将溶液放到60℃水浴锅中，滴加硫化钠溶液，反应2h。
其中，所述溶菌酶纤维浓度为5mg/ml，所述氯化铜溶液浓度为0.51mg/ml，所述硫化钠溶液浓度为0.72mg/ml。
LNFs@CuS纳米酶催化光热协同杀菌：
将20ul大肠杆菌悬浮液置于60ul亚硝酸钠溶液、60ul抗坏血酸溶液和60ul溶菌酶负载硫化铜纳米酶组成的反应体系中，在功率为1W的波长为980nm的近红外光照射下照射10min后，用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，取100ul稀释后的悬浮液放到Luria Bertani固体培养基，在37℃培养24h，计算菌落数。
其中，所述亚硝酸钠溶液浓度为2.07mg/ml，所述抗坏血酸溶液浓度为5.28mg/ml，所述LNFs@CuS纳米酶浓度为150ug/ml。
实施例2:
同实施例1，改变合成过程中的CuS负载量，使最终反应体系中的LNFs@CuS纳米酶浓度为分别为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml。在催化反应体系中，反应10min，所得的细菌存活率见表1。结果表明，随着硫化铜负载量的增加，LNFs@CuS的杀菌效率增加，证明随着活性中心浓度的增加，催化效果增强，杀菌效率越强。
表1不同浓度LNFs@CuS对催化杀菌影响
LNFs@CuS浓度(ug/ml) 细菌存活率(％)
25 80.3
50 49.6
100 23.3
200 0
实施例3:
同实施例1，仅改变反应体系中的亚硝酸钠溶液和抗坏血酸溶液的浓度，使得最终反应体系中的浓度为2.5mM、5mM、7.5mM、10mM。在催化反应体系中，反应10min，所得的细菌存活率见表2。结果表明，随着反应体系中的亚硝酸钠溶液和抗坏血酸溶液的浓度的增加，杀菌效率增加。
表2不同亚硝酸钠和抗坏血酸浓度对催化杀菌影响
反应体系浓度(mM) 细菌存活率(％)
2.5 70.6
5 49.6
7.5 21.5
10 0
实施例4:
同实施例1,仅改变杀菌步骤中LNFs@CuS纳米酶浓度,使最终反应浓度浓度分别为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml。进行光热杀菌，所得的细菌存活率见表3。由此可见，随着LNFs@CuS纳米酶浓度升高，光热杀菌效率逐渐升高，可归因于，光热剂浓度越高所产生的热量越高。
表3不同浓度LNFs@CuS对光热杀菌影响
LNFs@CuS浓度(ug/ml) 细菌存活率(％)
25 78.8
50 55.3
100 20.5
200 0
实施例5:
同实施例1，仅改变LNFs@CuS纳米酶光热杀菌步骤中近红外光辐射功率分别为0、0.5、1、2W，所得的细菌存活率见表4。由此可见，随着近红外光辐射功率的升高，光热杀菌效率逐渐升高，可归因于，较高的辐射功率有利于光热剂产生较高的热。
表4不同近红外光辐射功率对光热杀菌影响
辐射功率(W) 细菌存活率(％)
0 100
0.5 78.4
1 55.3
2 0
实施例6:
同实施例1，在最终反应条件下，LNFs@CuS浓度为50ug/ml，通过催化、光热协同杀菌方法进行杀菌，所得细菌存活率见表5。由此可见，光热对催化杀菌有着增强作用。
表5不同杀菌类型的杀菌效果
杀菌类型 细菌存活率(％)
催化杀菌 49.6
光热杀菌 55.3
催化光热协同杀菌 0
实施例7:
同实施例1，仅改变溶菌酶负载硫化铜纳米酶协同杀菌步骤中细菌分别为绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌，所得的细菌存活率见表5。由此可见，在同一条件下，LNFs@CuS均能杀死多种细菌。
表6不同类型细菌杀菌效果
细菌类型 细菌存活率(％)
金黄色葡萄球菌 0
绿脓杆菌 0
大肠杆菌 0
沙门氏菌 0
图1为LNFs@CuS纳米酶的TEM图，说明CuS纳米颗粒大小较为均一，比较均匀的负载在溶菌酶纤维上。
图2为LNFs@CuS纳米酶与金黄色葡萄球菌作用的TEM图，说明LNFs@CuS与细菌有良好的相互作用。
图3为不同浓度的LNFs@CuS纳米酶光热杀菌效果图，说明LNFs@CuS纳米酶浓度大于50ug/ml时，杀菌效果较好，细菌存活率小于50％。
图4为不同浓度LNFs@CuS纳米酶催化杀菌效果图，说明LNFs@CuS纳米酶浓度大于50ug/ml时，杀菌效果较好，细菌存活率小于50％。
图5为不同杀菌类型的杀菌效果，说明催化杀菌与光热杀菌协同时，可以完全杀死细菌。

Claims (10)

1.一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料，其特征在于，CuS纳米颗粒均匀修饰溶菌酶纤维表面，即LNFs@CuS。
2.如权利要求1所述的一种溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料的合成方法，其特征在于，步骤为：取溶菌酶纤维溶液，加入氯化铜溶液，反应15-30min；将溶液放到50-70℃水浴锅中，滴加硫化钠溶液，反应2-3h。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述溶菌酶纤维溶液、氯化铜溶液和硫化钠溶液的体积比1：1：1；所述溶菌酶纤维浓度为5mg/ml，所述氯化铜溶液浓度为0.51mg/ml，所述硫化钠溶液浓度为0.72mg/ml。
4.如权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，所述的溶菌酶纤维是通过如下步骤制备的：
配置浓度为1M的盐酸溶液10ml，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液；配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1ml，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液；取0.01g溶菌酶，加入4500ul A溶液和500ul B溶液溶解；在油浴锅中70℃搅拌5h；反应完成后12000rpm离心洗涤两次，每次20min。
5.将权利要求1所述的溶菌酶负载硫化铜纳米酶复合材料用于催化光热协同杀菌的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，催化光热协同杀菌的步骤为：
将细菌悬浮液置于亚硝酸钠、抗坏血酸和LNFs@CuS纳米酶反应体系中，静置一会后，在近红外光照射下，照射一段时间，用磷酸盐缓冲液稀释，取稀释后的悬浮液放到LuriaBertani固体培养基，在恒温培养箱中培养后，计算菌落数。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的细菌悬浮液与LNFs@CuS纳米酶的体积比例为1：3；亚硝酸钠、抗坏血酸与LNFs@CuS纳米酶的体积比例为1：1：1；LNFs@CuS纳米酶的浓度为50-200μg/ml，亚硝酸钠浓度为5-10mM，抗坏血酸浓度为5-10mM，细菌悬浮液浓度为108个/mL。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的近红外光照射的条件为：功率为0-2W，照射0-10min，近红外光波长为980nm。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的稀释为稀释10000倍；培养的条件为：在37℃恒温培养箱中培养18-24h。
10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述细菌为绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌中的一种。
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