CN112516305A - 一种人类头发黑素小体衍生物的制备方法及其在抗菌和组织修复中的应用 - Google Patents

一种人类头发黑素小体衍生物的制备方法及其在抗菌和组织修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类头发黑素小体衍生物(HHMs)制备方法，包括：步骤1预处理：将人类头发破碎清洗干燥；步骤2水热反应：将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应；步骤3分离：将水热反应完成后得到的固体样品物料进行离心分离真空干燥，得到HHMs。一种人类头发黑素小体衍生物‑溶菌酶(HHMs‑Lyso)复合材料的制备方法：将制备的所述HHMs均匀分散至去离子水中，得到第一料液；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，得到HHMs‑Lyso。通过这个方法制备的HHMs，通过负载Lyso可以高效杀死MRSA，同时HHMs能促进组织修复。

Description

一种人类头发黑素小体衍生物的制备方法及其在抗菌和组织 修复中的应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种人类头发黑素小体衍生物制备方法及其在抗菌和组织修复中的应用。
背景技术
细菌感染相关的疾病对全球医疗的威胁越来越大，它是全球发病率和死亡率的主要因素。例如，每年大约有1500万人死于细菌感染和随之而来的并发症。此外，长期滥用抗生素已经以惊人的速度推动抗生素耐药细菌的快速进化，增长和传播，与抗药性细菌相关的感染迅速出现，导致巨大的公共医疗和经济负担。特别是，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株在慢性或复发性感染中的流行率不断上升，这将对全球医疗是一大挑战，因为MRSA对临床可用的抗生素具有高水平的耐受性，并且常规抗生素对MRSA无效。此外，与MRSA相关的死亡人数超过由肝炎，HIV/AIDS和流感引起的死亡人数。在没有新疗法的情况下，到2050年，由于无法治愈感染的死亡率预计将上升10倍以上。尽管新型有效抗生素可显着降低细菌感染引起的死亡率，但新抗生素的开发往往需要数年甚至更多时间才能在临床实践中使用，而细菌通常只需要数周就能产生抗生素抗性。因此，开发有效的抗菌疗法是首要任务，以便安全和迅速地消除耐药性细菌感染，包括MRSA感染。
通常，细菌感染发生在受损组织的恢复、修复或重建，创伤，急性疾病或慢性疾病中，这也对全球健康构成巨大威胁。从人口统计学的角度来看，全世界每年有超过1.14亿带有外科手术伤口的患者需要伤口修复装置。其中，2014年全球伤口护理市场总量达到156亿美元，预计到2019年将增加到183亿美元。因此，为了改善患者治疗效果，迫切需要制定更快速有效消除细菌，同时促进组织修复的策略，最好是非手术干预的疗法。
最近，利用外源性激发的治疗，包括基于近红外(NIR)光照射的光热疗法(PTT)，已广泛应用于生物医学。光热效应引发的局部热量将有效地破坏细菌膜，并通过高温导致细菌死亡。通过物理热的作用，PTT具有的广谱抗菌效率，并且在相对较短时间的处理后可以快速有效地杀死细菌。同时，PTT的NIR光显示出优异的组织穿透能力和对健康组织的最小损伤。因此，利用NIR光照射的PTT具有消除耐药性细菌感染的潜在优势，包括快速MRSA的清除。
然而，在促进组织重建的同时，没有适当的PTT材料来对抗MRSA。大自然拥有丰富的杰出材料，这些材料已经发展了数十亿年，已成为科学家和工程师的持续灵感源泉。从天然材料中获得的天然生物相容性聚合物，如角蛋白，胶原蛋白，黑色素，明胶，壳聚糖和海藻酸盐，被认为是安全有效地治疗体内各种疾病的最有前景的物质。其中，角蛋白，作为一种纤维结构蛋白，可以从毛发，指甲，上皮细胞等中提取。胶原蛋白占人体干重约25％，占体内所有蛋白质约三分之一。这些天然聚合物引起了人们应用于对损伤组织修复的极大兴趣。然而，组织修复的细胞机制仍然知之甚少。对这些机制的深入理解将为新型生物材料的发展铺平道路。
长期滥用抗生素已经以惊人的速度推动抗生素耐药细菌的快速进化，增长和传播，与抗药性细菌相关的感染迅速出现，导致巨大的公共医疗和经济负担。尽管新型有效抗生素可显着降低细菌感染引起的死亡率，但新抗生素的开发往往需要数年甚至更多时间才能在临床实践中使用，而细菌通常只需要数周就能产生抗生素抗性。因此，开发有效的抗菌疗法是首要任务，以便安全和迅速地消除耐药性细菌感染，包括MRSA感染。
通常，细菌感染发生在受损组织的恢复、修复或重建，创伤，急性疾病或慢性疾病中，这也对全球健康构成巨大威胁。为了改善患者治疗效果，迫切需要制定更快速有效消除细菌，同时促进组织修复的策略，最好是非手术干预的疗法。然而，在促进组织重建的同时，没有适当的光热治疗(PTT)材料来对抗MRSA。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，一种人类头发黑素小体衍生物(HHMs)制备方法，该方法具有低成本、绿色环保、操作简单等优点。
本发明的另一个目的是，提供一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料的制备方法。
本发明的另一个目的是，提供一种人类头发黑素小体衍生物(HHMs)在抗菌和组织修复中的应用。
本发明的另一个目的是，提供一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料在抗菌和组织修复中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人类头发黑素小体衍生物(HHMs)制备方法，包括以下步骤：
步骤1，预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，超声清洗，干燥；
步骤2，水热反应：将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应，所述NaOH溶液浓度为0.1～5mol/L，溶液用量为所述人类头发质量的10～100倍，所述水热反应的温度为40～70℃，反应时间为1～24h；
步骤3，分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，分离得到的固体样品经过真空干燥，得到人类头发黑素小体衍生物(HHMs)。
上述技术方案中，所述步骤1，预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，去离子水超声清洗10～30min，重复洗涤2～5次，室温自然干燥。
上是技术方案中，所述水热反应是在高压水热釜中进行的。
上述技术方案中，所述步骤3，分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，离心分离后去除上清液，底部沉淀用去离子水超声清洗，清洗后再次离心分离；所述去离子水超声清洗及清洗后再次离心分离过程重复三次；
所述离心分离的转速为7000～15000pm，时间为10～40min，重复三次。
上述技术方案中，所述步骤3，所述真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为10～12h，得到人类头发黑素小体衍生物(HHMs)。
一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方法制备的所述人类头发黑素小体衍生物(HHMs)均匀分散至去离子水中，得到第一料液，所述第一料液中HHMs的浓度为300～3000ppm；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液，所述第二料液中溶菌酶的浓度为100～1000ppm；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，搅拌2～24h，搅拌温度25～40℃，得到200-2000ppm的人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶HHMs-Lyso。
本发明的优点和有益效果为：
使用简单的“低温碱热”方法(具体见“第四部分”)开发了由角蛋白和黑色素组成的人类头发黑素小体衍生物(HHMs)，该方法具有低成本、绿色环保、操作简单等优点。通过这个方法制备的HHMs，通过负载Lyso可以高效杀死MRSA，同时HHMs能促进组织修复。相比于其他的光热材料而言，HHMs具有高效的光热转换效率，同时具有优良的生物降解性和生物相容性。另外，HHMs可通过“蛋白质消化和吸收”信号通路调节胶原α链蛋白，从而加速组织修复，相关机理已经被详细研究。
患者经常面临抗生素抗性细菌感染和手术后长时间组织重建的挑战。该研究中，使用简单的“低温碱热”方法开发了由角蛋白和黑色素组成的人类头发黑素小体衍生物(HHMs)。这些天然衍生的可生物降解的纳米结构充当了外源性杀菌剂。通过“溶菌酶辅助光热”治疗，体外抗菌效果能达到97.90±2.19％，而对于小鼠感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)伤口来说，抗菌能达到96.83±3.38％。此外，通过体内定量蛋白质组学分析，HHMs通过“蛋白质消化和吸收”信号通路，可作为胶原α链蛋白的内源调节剂，以促进组织重建。在HHMs治疗后，体内伤口处细胞外基质(ECM)中13种胶原α链蛋白出现上调，表明来自HHMs的角蛋白在胶原依赖性调节过程中有重要作用，能显著增强伤口愈合。该研究揭示了天然物质-生物组织相互作用的关系是通过靶向细胞信号传导途径调节细胞-ECM相互作用来加速组织修复。这项工作提供了洞察组织修复中蛋白质水平的信号通路和相关潜在机制的新思路。
从人类头发中提取天然材料用于生物医用的研究还很少被研究报道。人类头发成分主要是黑色素和角蛋白，其中黑色素具有良好的生物相容性和优异的光热转换效率。而角蛋白也具有优异的生物相容性，它含有几种特定的肽结合序列，通过蛋白质-配体相互作用能形成特异性结合位点，改善细胞粘附和细胞生长。关于从人类头发中提取天然材料，如何最大限度保持它们的生物活性，发挥出更好的抗菌和组织修复功效，其提取方法有待进一步挖掘，从而得到理想的天然生物材料。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的HHMs的SEM图和成分图；
其中，A：为HHMs的低倍SEM图；A1：为图A的局部放大SEM图；A2：为图A1的局部放大SEM图；B：为HHMs中黑色素的分子结构；C：为HHMs中角蛋白的氨基酸成分组成。
图2是本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的HHMs和HHMs-Lyso的结构表征；
其中，A：为HHMs的Zeta电位图；B：为HHMs的TEM图；B1：为图B的局部放大TEM图；C：为HHMs-Lyso的TEM图；C1：为图C的局部放大TEM图；D：为HHMs中水合粒径示意图；E：H2O，HHMs和HHMs-Lyso的光学图片，其中包括典型的丁达尔效应；F：各种浓度(100,200,300,400,500,1000和2000ppm)Lyso的水溶液的UV吸收光谱(240-320nm)，以及281nm处Lyso对应的最大吸光度；G：通过281nm处的吸光度的相应值计算的标准线性关系。
图3是本发明实施例1制备的HHMs的光热性能测试；
其中，A：为不同浓度(10，20，50，100和200ppm)的HHMs水溶液的紫外到近红外吸收光谱(400-1000nm)；B：在不同功率密度(0.5，1.0和1.5W cm-2)下在808nm激光照射下分散的HHM的水溶液的光热升温曲线；C：在不同浓度(100，200和400ppm)下在808nm激光照射下分散的HHMs的水溶液的光热升温曲线；D：在808nm激光照射(1.0W cm-2)下200ppm HHMs循环加热的升温曲线(进行五次开/关循环)；E：计算HHMs在808nm处的光热转换效率(η)。
图4是本发明实施例1和实施例2制备的HHMs和HHMs-Lyso的体外的抗菌活性(Ctrl:Control)；
其中，A：HHMs和HHMs-Lyso的不同浓度(200和400ppm)，在黑暗中2小时(D2：黑暗2h)的抗菌活性；B：在808nm NIR光照射下，在不同浓度(200和400ppm)下HHMs和HHMs-Lyso的抗菌效率，在50℃保持10分钟(该处理标记为“L”：Light)；C：在0,1和2小时三个不同时间点，用808nm NIR光(50℃保持10分钟)照射HHMs-Lyso与细菌共混液，同时在2小时检测抗菌性；D：在不同处理下，包括D2，L+D2，D1+L+D1和D2+L，HHMs-Lyso(400ppm)对MRSA的抗菌活性；E：在L+D2处理中，200和400ppm浓度的HHMs和HHMs-Lyso的抗菌活性；误差棒表示平均值±标准偏差：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(t检验)。NS，无显着性差异(P>0.05)。
图5是本发明实施例1制备的HHMs用于细菌感染的组织修复，随时间变化(12天内)相应MRSA感染伤口面积的定量分析；误差棒表示平均值±标准偏差：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(t检验)。
图6是本发明实施例1制备的HHMs用于组织修复(无菌)，相应伤口随时间的相对定量分析(12天)；误差棒表示平均值±标准偏差：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(t检验)。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例一，
HHMs的制备方法，
预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，去离子水超声清洗15min，超声频率为100Hz，时间为15min，重复洗涤三次，室温自然干燥；
水热反应：在高压水热釜中，将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应，所述NaOH溶液浓度为0.5mol/L，溶液用量为所述人类头发质量的30倍，所述水热反应的温度为50℃，反应时间为12h；
分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，所述离心分离转速为9500pm，时间为15min。离心后去除上清液，用去离子水洗涤，再离心，重复三次。然后样品真空干燥，干燥温度为50℃，得到人类头发黑素小体衍生物(HHMs)；
一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料的制备方法，包括以下步骤：将上述技术方法制备的所述HHMs均匀分散至去离子水中，得到第一料液，所述第一料液中HHMs的浓度为3000ppm；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液，所述第二料液中溶菌酶的浓度为1000ppm；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，搅拌6h，搅拌温度25℃，得到2000ppm的HHMs-Lyso。反应结束后直接使用。
实施例二
确定HHMs通过静电相互作用负载溶菌酶(Lyso)的最大量：
具体地，将制备的4mg HHM粉末均匀分散在5mL去离子水中。同时，将4，8，16，32，64mg Lyso粉末溶解在5mL去离子水中，然后与上述HHMs溶液混合。将混合溶液在室温下搅拌6小时，并以9500rpm离心15分钟，得到上清液和HHMs-Lyso。用去离子水超声洗涤HHMs-Lyso并以9500rpm离心15分钟，重复三次。收集相应的上清液，使用UV-Vis分光光度计(UV-3600，Shimadu，JP)通过281nm处的分光光度计测量上清液中游离的Lyso含量。因此，通过初始Lyso含量和最终游离的Lyso含量可以计算出吸附在HHMs上Lyso负载量为1：0.63(HHM：Lyso，质量比)。
实施例三，
制备HHMs-Lyso复合材料：
将制备的30mg HHMs粉末均匀分散在10mL去离子水中。同时，将10mg Lyso粉末溶解在10mL去离子水中，然后与上述HHMs溶液混合，得到HHMs-Lyso溶液(2mg/mL)。将HHMs-Lyso溶液在室温下搅拌6小时，即配即用，不储存。
实施例四
HHMs的制备方法，
预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，去离子水超声清洗15min，超声频率为100Hz，时间为15min，重复洗涤三次，室温自然干燥；
水热反应：在高压水热釜中，将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应，所述NaOH溶液浓度为0.5mol/L，溶液用量为所述人类头发质量的30倍，所述水热反应的温度为70℃，反应时间为12h；
分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，所述离心分离转速为9500pm，时间为15min。离心后去除上清液，用去离子水洗涤，再离心，重复三次。然后样品真空干燥，干燥温度为50℃，得到人类头发黑素小体衍生物(HHMs)；
一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料的制备方法，包括以下步骤：将上述技术方法制备的所述HHMs均匀分散至去离子水中，得到第一料液，所述第一料液中HHMs的浓度为3000ppm；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液，所述第二料液中溶菌酶的浓度为1000ppm；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，搅拌6h，搅拌温度25℃，得到2000ppm的HHMs-Lyso。反应结束后直接使用。
实施例五
HHMs的制备方法，
预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，去离子水超声清洗15min，超声频率为100Hz，时间为15min，重复洗涤三次，室温自然干燥；
水热反应：在高压水热釜中，将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应，所述NaOH溶液浓度为0.5mol/L，溶液用量为所述人类头发质量的30倍，所述水热反应的温度为40℃，反应时间为12h；
分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，所述离心分离转速为9500pm，时间为15min。离心后去除上清液，用去离子水洗涤，再离心，重复三次。然后样品真空干燥，干燥温度为50℃，得到人类头发黑素小体衍生物(HHMs)；
一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶(HHMs-Lyso)复合材料的制备方法，包括以下步骤：将上述技术方法制备的所述HHMs均匀分散至去离子水中，得到第一料液，所述第一料液中HHMs的浓度为3000ppm；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液，所述第二料液中溶菌酶的浓度为1000ppm；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，搅拌6h，搅拌温度25℃，得到2000ppm的HHMs-Lyso。反应结束后直接使用。
实施例六，
制备HHMs-Lyso复合材料：
将制备的30mg HHMs粉末均匀分散在10mL去离子水中。同时，将10mg Lyso粉末溶解在10mL去离子水中，然后与上述HHMs溶液混合，得到HHMs-Lyso溶液(2mg/mL)。将HHMs-Lyso溶液在室温下搅拌6小时，即配即用，不储存。
实施例七，
制备HHMs-Lyso复合材料：
将制备的30mg HHMs粉末均匀分散在10mL去离子水中。同时，将10mg Lyso粉末溶解在10mL去离子水中，然后与上述HHMs溶液混合，得到HHMs-Lyso溶液(2mg/mL)。将HHMs-Lyso溶液在室温下搅拌24小时，即配即用，不储存。
对实施例1-3中制备的HHMs和HHMs-Lyso两种样品进行了一系列表征，其中材料表征包括：形貌、结构、成份；生物表征包括：抗菌性能和组织修复性能。
人类头发在微/纳米尺度上具有自然的分层结构，包括内层髓质、中间皮层和最外层角质层，其中有黑素小体是均匀镶嵌在中间皮质和内层髓质中的。如图1A所示，我们以人类头发为原料，采用50℃的“碱热”处理可以得到HHMs。图1A1为图1A的局部放大图，图1A2为图1A1的局部放大图。其中，桑葚形的HHMs具有～270nm的平均宽度和～700nm的平均长度。图1B展示了HHMs的示意图和HHM内的黑色素的分子结构式。人类黑色头发化学成分主要由结构角蛋白和功能性黑色素组成，其中黑色素颗粒均匀分布在角蛋白基质中。因此，HHMs是结构角蛋白和功能性黑色素的完美组合。一般来说，黑色素是一种天然存在的色素，不仅存在于头发中，还存在于人体的眼睛，皮肤中。图1E展示的是氨基酸分析仪测试的HHMs中氨基酸的种类和比例，其中17种氨基酸的含量范围为2％至18％。具体而言，17种氨基酸的含量从大到小依次为：谷氨酸(Glu，16.58±1.04％)，胱氨酸(Cys，9.33±0.20％)，天冬氨酸(Asp，7.47±0.10％)，丝氨酸(Ser，6.88±0.15％)，亮氨酸(Leu，6.19±0.35％)，甘氨酸(Gly，5.96±0.05％)，精氨酸(Arg，5.77±0.11％)，苯丙氨酸(Phe，5.71±0.16％)，脯氨酸(Pro，5.46±0.16％)，缬氨酸(Val，4.40±0.15％)，酪氨酸(Tyr，4.34±0.13％)，丙氨酸(Ala，4.34±0.03％)，异亮氨酸(Ile，3.46±0.27％)，蛋氨酸(Met，3.42±0.03％)，赖氨酸(Lys，2.55±0.14％)，苏氨酸(Thr，2.46±0.01％)和组氨酸(His，2.09±0.05％)。存在于HHMs内的角蛋白中的四种主要氨基酸是谷氨酸(Glu)，胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)。角蛋白含有几种有益的肽结合序列，包括Glu-Asp-Ser和Leu-Asp-Val，它们通过蛋白质-配体相互作用赋予角蛋白细胞粘附能力。
另外，HHM和Lyso之间的复合物可以通过静电相互作用制备。图2A中的Zeta电位测量显示带负电荷的HHM(-30.3±1.2mV)可吸收带正电荷的Lyso(20.1±1.5mV)以形成HHMs-Lyso复合物(4.2±0.3mV)。在Lyso加载后，HHM的表面电位从-30.3±1.2mV增加到4.2±0.3mV，因为带负电荷的HHM通过静电相互作用被带正电的Lyso中和部分电荷。
与纯HHMs(图2B和图2B1)相比，HHMs-Lyso的TEM图像(图2C和图2C1)表明修饰后Lyso明显附着在HHMs表面。如图2D所示，通过动态光散射(DLS)测量，HHMs-Lyso(804.6nm)的流体动力学平均尺寸大于的HHMs(570.0nm)的流体动力学平均尺寸，这可能归因于HHMs表面附着Lyso之后会导致HHMs出现部分团聚。图2E中的关学照片显示，所制备的HHM和HHMs-Lyso可以很好地分散在水中，其中HHM和HHMs-Lyso在水中具有典型丁达尔效应，表明它们散射光的能力。图2F展示了不同浓度(100，200，300，400，500，1000和2000ppm)的Lyso从240nm至320nm紫外吸收光谱，并且分散的Lyso的最大吸光度位于281nm。此外，在图2G中，不同Lyso浓度对应的281nm吸光度值表现出优异的线性依赖性(y＝1.30671x-0.00627，R2＝0.99477)。该标准线性关系可用于计算吸附于HHMs上的Lyso的量。设定不同的质量比(Lyso：HHMs＝1，2，4，8，16)以确定Lyso的最大加载量，其中HHM的量是恒定的并且Lyso的量变化。吸附的Lyso：HHMs的质量比为0.51-0.63，因此最大负载量为1：0.63(HHMs：Lyso，质量比)，1：0.33(HHMs：Lyso，质量比)被选择用于后续抗菌和组织修复研究。
值得注意的是，HHMs中内部黑色素具有许多有前景的功能。通常，黑色素是天然生物聚合物的主要成分，也广泛分布于人体内，具有良好的生物相容性。此外，黑色素优良的光热转换效率已经被报道。因此，这里HHMs的光热性能被表征(图3)。如图3A所示，HHMs溶液的紫外到近红外吸收曲线(400-1000nm)的强度以浓度依赖性方式逐渐增加。另外，在10分钟内，在808nm近红外激光照射下，HHMs溶液的温度以功率依赖性和浓度依赖性方式逐渐增加。具体地，在不同功率密度(0.5，1.0和1.5W cm-2)下，在10分钟内200ppm HHMs溶液的最高温度(图3B)分别增加至54.7℃，67.7℃和94.1℃。在1.0W cm-2功率下，不同浓度(100，200和400ppm)下，HHMs溶液在10分钟内的最高温度(图3C)分别增加至53.2℃，67.7℃和77.8℃。此外，图3D展示了HHMs优异光热可逆性和循环稳定性。在808nm近红外激光辐射下记录200ppm HHMs的循环温度变化，10分钟升温(激光打开)，然后自然冷却至室温20分钟(激光关闭)，以此进行五次激光开/关循环。HHMs的光热性能在五次开/关循环期间没有显示出显著差异，表明HHMs具有高稳定性和作为持久光热试剂潜力。在图3E中，通过时间常数(τs＝241.5)和最大稳态温度的结果定量计算HHM的光热转换效率(η)为(41.65％)，进一步表明HHM具有高光热转换效率，可以快速有效地将近红外能量转换为热能。
图4A显示不同浓度(200和400ppm)的HHM和HHMs-Lyso在黑暗2小时内具有低抗菌活性(小于30％)(D2表示黑暗2小时)。基于图3所示的HHMs的优异光热转换效率，在相对低功率密度的808nm近红外光照射下进行安全的光热治疗细菌感染。将50℃保持10分钟的这个处理标记为“L”。808nm近红外光照射产生的局部温度升高(50℃)可导致细菌蛋白质变性，以及不可逆转的细菌破坏，最终杀死细菌。在808nm NIR光照射下保持在50℃10分钟，材料对于MRSA展示出不同的抗菌效率。400ppm HHMs-Lyso抗菌率为84.96±5.63％；200ppmHHMs-Lyso抗菌率为75.72±1.61％；400ppm HHMs抗菌率为65.88±3.21％；200ppm HHMs抗菌率为61.85±6.77％。Lyso是一种抗菌糖苷水解酶，可以特异性攻击细菌的保护性细胞壁，广泛存在于禽蛋清和哺乳动物分泌物中(泪液，唾液，乳汁和粘液)。如图4B所示，单独使用Lyso杀菌经常受到稳定性差和酶重复性差的影响。HHMs改善Lyso稳定性和可重复使用性的方法是将Lyso固定在HHMs表面。
如图4C所示，在培养0,1和2小时后，利用808nm NIR光照射含400ppm HHMs-Lyso的细菌培养基，在特定时间点50℃保持10分钟。如图4D所示，与对照组相比，所有具有400ppmHHMs-Lyso的实验组对MRSA显示出明显的抗菌效率，。具体而言，D2组抗菌活性最低(抗菌率为25.61±10.18％)。L+D2组对MRSA的细菌杀伤效率为97.90±2.19％，高于D1+L+D1组(90.50±1.38％)和D2+L组(87.29±2.46％)，表明L+D2处理具有来自HHMs-Lyso的光热和Lyso协同的优化抗菌作用。此外，在L+D2组中，HHMs的抗菌活性(200ppm HHMs抗菌率为67.21±3.28％，400ppm HHMs为69.63±3.62％)低于HHMs-Lyso(200ppm HHMs-Lyso为93.06±3.06％，400ppm HHMs-Lyso为97.90±2.19％)，进一步表明光热和Lyso的协同抗菌作用。通过不同处理增强的细菌灭活效率可归因于“Lyso辅助光热”。也就是说，HHMs-Lyso的光热效应将有效地破坏细菌膜并增加其渗透性，导致Lyso效率的进一步增强以破坏细菌细胞壁并扰乱细菌的细胞内代谢途径。
在图5A中，细菌感染的伤口愈合过程的代表性照片展示出实验组和对照组之间显著差异。与对照组相比，HHMs和HHMs-Lyso组明显加速了伤口愈合，证明HHM和HHMs-Lyso可显着促进MRSA感染后伤口的愈合过程。在图5B中，上述伤口图像随时间变化的定量分析也证实了HHMs和HHMs-Lyso组伤口闭合率明显快于对照组。
首先，无细菌感染伤口愈合过程的代表性照片展示在图6A中。与对照组相比，HHMs组明显表现出加速的伤口闭合，证明HHMs可以显著促进伤口愈合。在图6B中，通过对图6A的伤口大小进行定量分析，进一步说明了HHMs组的伤口闭合速率比对照组快得多。HHMs改善体内组织修复的能力归因于HHMs的外部角蛋白，它能够参与调节细胞行为(包括细胞粘附，迁移和增殖)的中间过程。因此，通过HHMs角蛋白调节细胞与细胞外基质的相互作用为加速体内组织修复创造一个合适的环境。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人类头发黑素小体衍生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，超声清洗，干燥；
步骤2，水热反应：将经过预处理的人类头发在NaOH溶液中进行水热反应，所述NaOH溶液浓度为0.1～5mol/L，溶液用量为所述人类头发质量的10～100倍，所述水热反应的温度为40～70℃，反应时间为1～24h；
步骤3，分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，分离得到的固体样品经过真空干燥，得到人类头发黑素小体衍生物。
2.根据权利要求1所述的人类头发黑素小体衍生物制备方法，其特征在于，所述步骤1，预处理：将人类头发破碎至长度小于3cm，去离子水超声清洗10～30min，重复洗涤2～5次，室温自然干燥。
3.根据权利要求1所述的人类头发黑素小体衍生物制备方法，其特征在于，所述水热反应是在高压水热釜中进行的。
4.根据权利要求1所述的人类头发黑素小体衍生物制备方法，其特征在于，所述步骤3，分离：将水热反应完成后得到的物料进行离心分离，离心分离后去除上清液，底部沉淀用去离子水超声清洗，清洗后再次离心分离；所述去离子水超声清洗及清洗后再次离心分离过程重复三次；
所述离心分离的转速为7000～15000pm，时间为10～40min，重复三次。
5.根据权利要求1所述的人类头发黑素小体衍生物制备方法，其特征在于，所述步骤3，所述真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为10～12h，得到人类头发黑素小体衍生物。
6.一种根据权利要求1～5之一所述的方法制备的人类头发黑素小体衍生物在抗菌和组织修复中的应用。
7.一种人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将根据权利要求1～5之一所述方法制备的所述人类头发黑素小体衍生物均匀分散至去离子水中，得到第一料液，所述第一料液中人类头发黑素小体衍生物的浓度为300～3000ppm；将溶菌酶分散至去离子水中，得到第二料液，所述第二料液中溶菌酶的浓度为100～1000ppm；将所述第一料液与所述第二料液等体积混合，搅拌2～24h，搅拌温度25～40℃，得到人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶。
8.一种根据权利要求7所述的方法制备的人类头发黑素小体衍生物-溶菌酶复合材料在抗菌和组织修复中的应用。
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