CN107929091A - 一种高活性胶原蛋白的提取方法及其应用 - Google Patents
一种高活性胶原蛋白的提取方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高活性胶原蛋白的提取方法及其应用，属于生物技术和化妆品领域。本发明采用联合提取法提取胶原蛋白，缩短了提取时间、提高提取率、提高纯度、对环境无污染且最大程度保持了胶原蛋白的天然生物性状。在此基础上，本发明还提供一种鱼皮胶原蛋白抗皱精华液，不仅可以帮助调整肌肤角质，令角质整齐平滑，而且定向美白，激发面部细胞活力，多层次化解暗沉，抗氧化并均匀肤色，修护由紫外线或其他化妆品造成受损的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性胶原蛋白的提取方法及其应用，属于生物技术和化妆品领域。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。
胶原蛋白的应用非常广泛，可应用于生物技术方面的基础研究，例如细胞原代培养，加入胶原蛋白可以大大提高培养成功率和细胞产量；可应用于医用外敷，制成敷料可以促进伤口愈合，修复受损的机体组织；可应用于医疗产业，治疗运动损伤时与注射药品配伍使用，润滑关节；可应用于保健品，作为口服液使用，增强人体免疫力，起到抗衰美容的效果；可应用于再生医学，制成护肤品、化妆品，起到抗皱美白淡斑的效果。
畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径，但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用，现今正在逐步转向海洋生物中开发，而海洋动物容易受到重金属污染，捕捞受到限制。由于氨基酸组成和空间结构等方面的差异，使得水产动物尤其是其加工废弃物—皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点。
娃娃鱼专业名称叫大鲵，是水陆两栖动物，也是一种传统的名贵药用动物，具有广泛的药用价值。娃娃鱼生长在安静隐蔽的山洞里，生活环境干净优越无污染，皮肤上无鱼鳞。娃娃鱼的皮肤、肉、粘液、骨等各个器官和成分都可以用来入药，《本草纲目》和《草本拾遗》等药典中都提到娃娃鱼具有滋阴补气、益智、养血等功效，对于治疗疾病后虚弱、神经性疾病，贫血有很好的效果。研究表明，娃娃鱼皮肤中含有大量活性胶原蛋白以及表皮活性变白因子，具有嫩白容颜、抗皱的美容功效，这是普通鱼皮胶原蛋白所无法比拟的优势。娃娃鱼皮胶原蛋白对人体有很强的亲和力，几乎不产生排异性，还具有排毒功能。
一般陆生动物胶原蛋白含量为总蛋白含量的50-70％，深海鱼鱼皮胶原蛋白含量为总蛋白含量的80％，而娃娃鱼鱼皮胶原蛋白含量更高，是胶原蛋白的理想来源。来源于娃娃鱼鱼皮的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物和深海鱼类的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性、成分天然、分子小等特性，生物形状自然，不需要经过基因重组的过程，确保对肌肤对人体无任何毒副作用。
娃娃鱼皮提取的胶原蛋白可以制成化妆品精华，不但成分天然易吸收，且具有卓越的美容抗皱美白效果，滋养肌肤，补水保湿，增强皮肤弹性，对人体无毒副作用。
现有技术中，胶原蛋白的提取主要有热水提取法、酸碱提取法、盐提取法、酶提取法、超临界提取法，单一提取法都存在着自身的不足，其中热水法由于提取温度较高，得到的胶原蛋白大多数变性为明胶；碱法提取迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)；酸法提取能最大程度地保持其三股螺旋结构，但产品得率较低、提取时间较长，且酸碱法提取后的废液排放对环境会造成一定影响；盐提取法容易造成胶原蛋白提取不够充分，且脱脂效果不如人意；酶法提取的溶出率高并且能降低胶原的抗原性，提取时间短容易造成水解不够彻底，提取时间长容易造成蛋白酶切除了胶原蛋白的非螺旋端肽，可能会引起胶原蛋白结构部分发生变化；超临界提取法虽然脱脂效果好，但是对于酸溶性杂质容易去除不够充分，影响胶原蛋白的纯度。
发明内容
为了克服单一提取方法的不足以及提高胶原蛋白的提取率，本发明采用联合提取法提取胶原蛋白，缩短了提取时间、提高提取率、提高纯度、对环境无污染且最大程度保持了胶原蛋白的天然生物性状。并在此基础上，提供一种鱼皮胶原蛋白抗皱精华液，不仅可以帮助调整肌肤角质，令角质整齐平滑，而且定向美白，激发面部细胞活力，多层次化解暗沉，抗氧化并均匀肤色，修护由紫外线或其他化妆品造成受损的细胞。
本发明提出一种鱼皮胶原蛋白抗皱精华，该抗皱精华液含多种天然保湿原料提取液，对皮肤无刺激，易吸收，保湿效果好。
所述鱼皮胶原蛋白抗皱精华，按质量份计算，含有：
A组分8g，是鱼皮胶原蛋白冻干粉；
B组分：
使用时，将A组分和B组分进行混合均匀，成为本发明所制成的鱼皮胶原蛋白抗皱精华。该精华中含有鱼皮胶原蛋白，对皮肤起滋润和保湿的作用，可以软化角质层，有助于消除皱纹，还可以补充皮肤中损失的胶原蛋白。此外，还可以用于医学治疗烧伤烫伤、疤痕修复等皮肤疾病，抗衰老功效卓著。
在本发明的一种实施方式中，所述鱼皮胶原蛋白冻干粉是娃娃鱼鱼皮胶原蛋白冻干粉。
本发明还提供一种高活性胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:0.2-1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在500-1000瓦/升，超声波的处理时间为30-60分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5—8％)混合，搅拌均匀后浸泡10-15h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6-10％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5-9，浸泡6-12h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20-40，酶解温度为35-38℃，反应时间为6-12h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2压力达到预定的要求，CO2浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间10-20min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；
第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.4-0.9mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.4-0.8mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。超滤膜的截留分子量优选为大于2000kDa，小于3000kDa，例如截留分子量为2200、2500或2600kDa。采用超滤脱盐，效率比传统的透析脱盐更高，效果更好，在脱盐的同时对溶液进行浓缩，使后续胶原蛋白的冻干更容易进行。
其中，第6步中采用的冷冻干燥是将超滤液于冻干机上进行冻存，冻存条件是:预冻阶段:设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30-60min；升华阶段:真空干燥箱内压力控制在0.15-0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解吸阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从O℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。
在本发明的一种实施方式中，以娃娃鱼鱼皮为原料制备鱼皮胶原蛋白。
上述方法不使用有机溶剂，不加热因此不会破坏胶原蛋白的生物结构，不改变天然性状，提高了胶原蛋白的纯度，并且可以较好的保持胶原的三螺旋结构。所得产品洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白制品纯度达≥99.9％。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于2000kDa，分子量小，容易被肌肤吸收，口服也容易被人体消化。
本发明提供的鱼皮胶原蛋白，不但可以应用在化妆品中，而且可以调制成水溶液，作为保健品胶原蛋白口服液；也可以搭配干细胞提取物制成医用敷料；可以与注射药品配合使用，润滑受损的关节；可以应用在基础医学研究，尤其是细胞原代培养。
本发明的有益效果如下：
(1)鱼皮胶原蛋白的提取不使用有机溶剂，对环境无污染，不会造成溶剂残留，对皮肤造成副作用。采用酸+盐+酶解+超滤透析的联合提取方法，让胶原蛋白提取的纯度达到99％。
(2)鱼皮胶原蛋白天然高活性的成分，对皮肤无刺激。易吸收，美白抗皱效果持久，不会反弹。迅速提高肌肤的含水量，能够修复受损的皮肤细胞，帮助恢复活力。
附图说明
图1实施例1胶原蛋白冻干粉紫外吸收图谱
图2实施例1～3及对照例1～3所得胶原蛋白冻干粉在不同pH环境下的氮溶解指数
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域内的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他的实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：娃娃鱼鱼皮胶原蛋白的制备
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)娃娃鱼(人工养殖)鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在800瓦/升，超声波的处理时间为30分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20，所用木瓜蛋白酶的酶活性为335U/g，酶解温度为37℃，反应时间为6h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2压力达到预定的要求，CO2浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间15min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；
第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.6mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，将超滤液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。超滤膜的截留分子量2000kDa。
产品：洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于2000kDa。产率测定：100g鱼皮，最终提取出94g胶原蛋白。
实施例2：罗非鱼鱼皮胶原蛋白的制备
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)罗非鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:(0.2-1)，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在900瓦/升，超声波的处理时间为40分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20，木瓜蛋白酶的酶活性为335U/g，酶解温度为37℃，反应时间为6h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2浓度为0.85g/mL(P＝20.4MPa)，处理时间10min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；
第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.6mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，将超滤液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。超滤膜的截留分子量2000kDa。
产品：洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。产率测定，100g鱼皮，最终提取出73g胶原蛋白。
实施例3：鳕鱼鱼皮胶原蛋白的制备
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)鳕鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:0.2-1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在750瓦/升，超声波的处理时间为60分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6h，1500rpm，离心10min，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20，木瓜蛋白酶的酶活性为335U/g，酶解温度为37℃，反应时间为6h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2浓度为0.85g/mL(P＝20.4MPa)，处理时间15min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；
第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.6mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。超滤膜的截留分子量2000kDa。
产品：洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于2000kDa。产率测定，100g鱼皮，最终提取出79g胶原蛋白。
对照例1：与实施例1的区别在于：调整胶原蛋白的提取方式为，鱼皮搅拌，碱溶液浸泡，超声波破碎，酸溶液去腥，酶解，其他步骤相同。
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)娃娃鱼(人工养殖)鱼皮解冻之后，送进搅拌罐，边搅拌边加入氢氧化钙调节pH为12，浸泡4天，去除鱼皮表面的脂肪及杂蛋白，然后用清水浸泡、冲洗，洗至pH为中性，然后进行破碎处理，得到浆料；
第2步，第1步得到的浆料加入重量5倍的饮用水、山西老陈醋，将混合物进行超声波处理50分钟，山西老陈醋的加入量为浆料的1％，超声波强度控制在750瓦/升，得到第一产物；
第3步，将第一产物进行酶解，加入第一产物重量3％的木瓜蛋白酶(335U/g)，50℃酶解5h，再将温度升高至90℃，保温30min，进行灭酶处理，得到第二产物；
第4步，第二产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.6mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，将超滤液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉，超滤膜的截留分子量2000kDa。
产物：产率测定，100g鱼皮，最终提取出79g胶原蛋白。
对照例2：与实施例1的区别在于：使用氢氧化钠进行脱脂，而不是CO2超临界方法，其他步骤相同。
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)娃娃鱼(人工养殖)鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:1，将混合物进行粉碎和研磨，超声波强度控制在800瓦/升，超声波的处理时间为30分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，，搅拌均匀后浸泡15h，1500rpm，离心10min，去除上清。得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6h，1500rpm，离心10min，去除上清。得到第二沉淀；
第4步，去除脂类和碱溶性杂质：将第二沉淀与4wt％NaOH溶液混合，第二沉淀和碱溶液重量比为1:10，搅拌均匀后浸泡20h，离心，去上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合再加入第三沉淀重量2％的木瓜蛋白酶进行酶解，第三沉淀与水的重量比是1:20，酶解温度为37℃，反应时间为6h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NAOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第6步，精制处理：粗提物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，用0.6mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。超滤膜的截留分子量2000kDa。
产物：产率测定，100g鱼皮，最终提取出76g胶原蛋白。
对照例3：与实施例1的区别在于：在精制处理时，用透析代替超滤脱盐和浓缩，其他步骤相同。
第1步，组织破碎：将成年(体重2-3斤)娃娃鱼(人工养殖)鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:1，将混合物进行粉碎和研磨，的同时外加超声作用，超声波强度控制在800瓦/升，超声波的处理时间为30分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液(质量浓度5％)混合，浆料和氯化钠溶液重量比是1：5，搅拌均匀后浸泡15h，1500rpm，离心10min，去除上清。得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液(质量浓度是6％)混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5，浸泡6h，1500rpm，离心10min，去除上清。得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20，酶活性为335U/g，酶解温度为37℃，反应时间为6h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，用NaOH调节反应体系pH为碱性，即可终止酶反应，1500rpm，离心10min，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2压力达到预定的要求，CO2浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间15min，不仅最大程度降低油脂含量，还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原蛋白的纯度，保持了胶原的三螺旋结构；
第6步，精制处理：粗提物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.6mol/L，搅拌盐析。盐析后离心取沉淀，再用0.6mol/L的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐粒子。透析液冷冻干燥得到胶原蛋白冻干粉。
产物：产率测定，100g鱼皮，最终提取出80g胶原蛋白。
实施例1～3及对照例1～3制备过程及产品分析：
(1)得率测定
采用凯氏定氮法分别测定得到的粗提物(粗提物为实施例和对照例精制处理之前最后一步的产物)和精制鱼胶原蛋白中的蛋白质含量，折算为蛋白质量，计算蛋白纯度，采用如下公式计算：
蛋白纯度＝精制鱼胶蛋白中的蛋白质含量/精制鱼胶原蛋白重量(粗提物中的蛋白质含量粗提物重量)*100％
总回收率＝精制鱼胶蛋白中的蛋白质含量/样品鱼皮重量(提取蛋白所使用的鱼皮总重量)*100％
表1：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | |
| 总回收率％ | 94 | 73 | 79 | 79 | 76 | 80 |
| 蛋白纯度％ | 97.9 | 94.3 | 92.9 | 88.7 | 89.2 | 85.1 |
从上表1可以看出，娃娃鱼鱼皮的总回收率明显高于其他两种鱼类，蛋白纯度明显高于淡水鱼罗非鱼鱼皮和深海鱼鳕鱼鱼皮；对照例1相对于实施例1，胶原蛋白提取方法不同，使用氢氧化钙脱脂，老陈醋去除酸溶性杂质；对照例2相对于实施例1，未采用CO2超临界脱脂处理，而是采用了氢氧化钠；对照例3相对于实施例1，未使用超滤脱盐浓缩，而是采用了透析，费时费力，降低了蛋白纯度。
(2)紫外光谱分析
采用紫外光谱分析胶原蛋白冻干粉紫外吸收峰。用0.5M醋酸溶液溶解胶原蛋白样品，配制成浓度1mg/mL的胶原溶液。在室温下用紫外可见分光光度计测定吸光度。扫描波长范围200-400nm，波长精度1nm。
以上实施例和对照例制备得到的鱼胶原蛋白样品的最大吸收波长如下表2：
表2：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | |
| 最大吸收波长nm | 230 | 232 | 230 | 233 | 231 | 232 |
从上表2可以看出，最大吸收波长峰均在230nm处，符合I型胶原蛋白的特征紫外吸收。
(3)氨基酸组成分析
胶原蛋白冻干粉的氨基酸组成采用高效液相色谱法测定。
采用柱前衍生RP-HPLC法对胶原蛋白冻干粉中游离及总氨基酸进行测定。色谱条件UltimateAminoAcid氨基酸色谱专用柱(4.6mm×250mm,5μm)，柱温35℃，检测波长254nm。流动相A:乙腈-水(80∶20,V/V)；流动相B:醋酸钠缓冲溶液(pH6.5)-乙腈(93∶7,V/V)。线性梯度洗脱程序:0.01min,0％A；11min,7.0％A；13.9min,12.0％A；14min,15％A；29min,34.0％A；32min,70％A；35min,100％A；42min,100％A；45min,0％A；60min,0％A。流速1.0mL/min。
表3：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 | |
| 羟脯氨酸 | 88.1 | 65.1 | 61.3 | 88.3 | 88.9 | 88.5 |
| 门冬氨酸 | 53.2 | 35.2 | 38.5 | 53.6 | 53.7 | 53.4 |
| 苏氨酸 | 26.2 | 33.4 | 34.6 | 26.9 | 26.3 | 26.8 |
| 丝氨酸 | 52.1 | 23.4 | 21.3 | 52.3 | 52.4 | 52.7 |
| 谷氨酸 | 81.6 | 91.6 | 93.1 | 81.4 | 81.2 | 81.4 |
| 脯氨酸 | 83.4 | 59.7 | 55.6 | 83.7 | 83.1 | 83.9 |
| 甘氨酸 | 262.3 | 400.9 | 411.3 | 262.8 | 262.5 | 262.6 |
| 丙氨酸 | 93.4 | 144.2 | 137.8 | 93.1 | 93.3 | 93.2 |
| 色氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 缬氨酸 | 28.1 | 34.1 | 35.4 | 28.6 | 28.5 | 28.3 |
| 蛋氨酸 | 3.9 | 1.2 | 3.2 | 3.3 | 3.2 | 3.5 |
| 异亮氨酸 | 18.8 | 14.2 | 13.5 | 18.2 | 18.1 | 18.4 |
| 亮氨酸 | 45.8 | 6.7 | 2.5 | 45.3 | 45.5 | 45.1 |
| 络氨酸 | 35.9 | 13.5 | 15.6 | 35.6 | 35.3 | 35.5 |
| 苯丙氨酸 | 25.4 | 11.4 | 10.1 | 25.7 | 25.8 | 24.6 |
| 组氨酸 | 12.6 | 12.4 | 10.6 | 12.1 | 11.9 | 12.3 |
| 赖氨酸 | 34.7 | 11.3 | 12.5 | 34.4 | 34.6 | 34.2 |
| 精氨酸 | 54.5 | 31.7 | 33.1 | 54.7 | 55.7 | 55.6 |
| 总残基数 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 羟基化率％ | 51.4 | 52.2 | 52.4 | 51.3 | 51.7 | 51.3 |
羟基化率％＝羟脯胺酸残基数*100/(脯氨酸残基数+羟脯氨酸残基数)
从上表3可以看出，所有实施例与对照例所提取得到的胶原蛋白均符合胶原蛋白的氨基酸组成，而冷水鱼类的羟脯氨酸含量最低，低于暖水性鱼类，而又低于陆生动物，娃娃鱼鱼皮提取的胶原蛋白中羟脯氨酸含量接近人体胶原蛋白中羟脯氨酸含量，因此最容易被人体吸收。
(4)溶解性测定
氮溶解指数(NSI)可以被用来确定胶原蛋白冻干粉的溶解性。取1g胶原蛋白冻干粉溶解在100ml饮用水中，制成0.01g/mL胶原蛋白溶液，混匀后，静置10min，取上清液。采用全自动凯氏定氮仪测定上清液和胶原蛋白冻干粉样品中的氮含量。得到其在各pH下的水溶性蛋白含量。绘制出NSI-pH曲线，作为不同组分胶原蛋白肽在不同pH下的溶解性指标。
氮溶解指数NSI按照下列公式计算：
NSI(％)＝A/B*100％
其中，A为上清液中蛋白质含量(g/g)；B为样品中的总蛋白含量(g/g)。
不同pH条件下的溶解性如图2所示，从图2中可以看出，实施例1-3中制备的鱼胶原蛋白具有较好的溶解性，说明其中脂类杂质及其他不溶于水难溶于水的杂质含量少。
表4：溶解性数据
| pH | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 |
| 2 | 99.7 | 98.9 | 98.8 | 93.9 | 93.1 | 99.2 |
| 4 | 98.9 | 97.1 | 98.3 | 90.2 | 88.9 | 98.1 |
| 6 | 96.8 | 90.3 | 94.1 | 81.4 | 83.3 | 95.5 |
| 8 | 96.1 | 92.9 | 95.2 | 85.1 | 86.2 | 92.1 |
| 10 | 96.9 | 93.1 | 95.9 | 85.9 | 86.9 | 92.7 |
从表4中可以看出，实施例2使用的罗非鱼、实施例3使用的鳕鱼，所得到的胶原蛋白冻干粉溶解性相对实施例1胶原蛋白冻干粉略差。对照例1在脱脂处理中使用氢氧化钙，替代二氧化碳超临界处理，去除脂类和碱溶性杂质，使用老陈醋去除酸溶性杂质，导致脂肪去除不够完全彻底，残留不少脂肪在提取得到的蛋白中，因此溶解性较差。而对照例2使用氢氧化钠去除脂肪，导致脂肪去除不够完全彻底，从而导致溶解性较差。对照例3虽然使用了CO2超临界处理脱脂去除杂质，但是后续过程中采用了透析替代超滤，影响了蛋白质的溶解度。
(5)脂肪含量测定
采用氯仿-甲醇提取法测定胶原蛋白冻干粉的脂肪含量，结果如下：
表5：
| 脂肪含量 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 |
| ％ | 0.01 | 0.03 | 0.04 | 0.33 | 0.28 | 0.02 |
从表5中可以看出，采用上述工艺得到的娃娃鱼鱼胶原蛋白具有较低的脂肪含量，实施例1相对于对照例1、2来说，采用二氧化碳超临界处理，可以最大程度去除蛋白中的脂肪。
(6)重金属含量测定
卫生部颁布的《化妆品卫生规范》(2007年版)中列出了禁用物质清单，包括铅、汞、砷。明确铅限量为40mg/kg，汞限量为1mg/kg，砷限量为10mg/kg。
测定娃娃鱼鱼皮提取的胶原蛋白冻干粉与深海鱼(罗非鱼、鳕鱼)提取的胶原蛋白冻干粉重金属含量的区别。
铅、汞、砷的含量测定方法：铅采用火焰原子吸收分光光度法测定，汞采用原子荧光光谱法，砷采用氢化物原子荧光法测定。结果如下：
表6：
| 重金属含量(mg/kg) | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | 对照例3 |
| 铅 | 1.08 | 4.15 | 5.61 | 1.09 | 1.03 | 1.07 |
| 汞 | 0.23 | 0.98 | 1.23 | 0.22 | 0.21 | 0.27 |
| 砷 | 1.06 | 2.39 | 2.02 | 1.09 | 1.05 | 1.02 |
从表6中可以看出，以罗非鱼和鳕鱼为代表的深海鱼重金属含量明显高于淡水鱼娃娃鱼，娃娃鱼的重金属均未超标。可以安全应用于人体肌肤。
实施例4：美白抗皱精华液的制备
抗皱精华液100g主要包括A、B组分，其中：
A组分8g，包括胶原蛋白冻干粉。
B组分
使用时，将A组分和B组分进行混合均匀。混合成为本发明所制成的美白抗皱精华。成品精华的pH＝5.5-6.5，与人体肌肤pH接近，亲肤而无刺激。
B组分成分的优化选择。透明质酸(分子量130万kDa)具有卓越的保湿性能，可以优化细胞间的支撑结构，让肌肤自由呼吸，帮助胶原蛋白的生成，将1g透明质酸粉末溶解在99g去离子水中，混匀至无沉淀即可得到浓度1％的透明质酸溶液。白藜芦醇和熊果苷是有效的抗氧化剂，其中，白藜芦醇和胶原蛋白具有优异的协同作用，可以更好的发挥胶原蛋白的美白抗皱的作用，并且可以增加胶原蛋白的稳定性。
抗皱测试：选择495名来自无锡、苏州、常州、南京的志愿者进行了有效实验，采用双盲设计、对比实验进行对比考察。年龄在25-55岁之间，99人一组，随机分成甲、乙、丙、丁、戊共五组。
其中：
甲组使用空白精华，成分为100g去离子水，以下称为甲组精华；
乙组使用仅含有A组分的精华，成分为8gA组分+92g去离子水，其中A组分由实施例1制成，以下称为乙组精华；
丙组使用A组分和B组分的精华，其中A组分由实施例1制成，A组分8g，B组分成分与本发明相同，但质量分数有差异，具体为：
以下称为丙组精华；
丁组使用A组分和B组分的精华(即本发明所制成的美白抗皱精华)，其中A组分由实施例1制成，A组分8g，
B组分：
以下称为丁组精华；
戊组使用A组分和B组分的精华，其中A组分精华由对照例1制成，其他与丁组使用的精华成分相同，
A组分8g，
B组分：
以下称为戊组精华。
甲、乙、丙、丁、戊共五组均要求每人每天早晚使用一次本组精华，其他任何护肤品、化妆品均暂停使用。使用方法为一次取3滴涂抹于面部，轻轻打圈至完全吸收。
(1)对每位使用者进行跟踪调查，每周为一阶段测试一次，一共测试12周，测试部位为两侧脸颊和眼角。由技术人员使用MicroSkinII多功能皮肤镜像分析系统测定。
皮肤平均粗糙度(表7)：在测试使用12周后，丁组皮肤平均粗糙度相对于甲组的变化率为-17.28，皮肤平均粗糙程度相对起始值存在显著性差异(p＜0.05)。丁组的测定变化了明显高于其他组。
(2)皱纹平均深度(表8)：在测试使用12周后，丁组皱纹平均深度相对甲组的变化率为-40.98，使用12周后，皮肤平均深度相对起始值存在显著性差异(p＜0.05)。丁组的测定变化了明显高于其他组。
(3)美白测试(表9)，在使用精华液前和使用后12周内，利用Lab色度系统光谱光度计测量皮肤颜色的变化，连续测试3次，取平均值。皮肤色度L*值的变化情况见表9。通过表9可见，采用本发明的丁组，皮肤L*值的提高最好，因此，美白效果更好。
(4)五组精华稳定性对比：
在五个相同的刻度离心管中准确加入五组精华，各10ml，以4000r/min离心30min，弃上层溶液，准确称取沉淀物质量(湿重)，按以下公式计算离心稳定性M，作为精华稳定性评判指标。
M＝(1-m1/m2)*100％
上述公式中：M—离心稳定性，％；m1—沉淀物质量，g；m2—离心精华质量，g。
表10稳定性水平
| 稳定性 | 甲组精华(％) | 乙组精华(％) | 丙组精华(％) | 丁组精华(％) | 戊组精华(％) |
| M | 0 | 0.05 | 0.03 | 0.01 | 0.02 |
甲组精华只含有去离子水，因此离心后无沉淀；丁组精华使用本发明实施例1制成的胶原蛋白冻干粉，搭配合理质量分数的白藜芦醇和熊果苷，成品精华具有较好的稳定性；而戊组精华采用了对照例1制成的胶原蛋白冻干粉，稳定性差一些；丙组精华中的白藜芦醇含量有所减少，胶原蛋白的稳定性变差；乙组精华只含有胶原蛋白冻干粉，没有白藜芦醇、熊果苷等增加其稳定性，在离心后，出现了较多沉淀。
(5)五组精华防腐性能对比：
由于化妆品中常用的防腐剂会影响胶原蛋白的活性，增加精华对敏感肌肤的刺激，并且一定程度上会影响精华最终的美容效果，本发明制成的精华不添加防腐剂，成品装在消毒过的30ml带滴塞的棕色玻璃瓶中，30ml大约为600滴，每天用量为6滴，可用100天，取用后及时盖上滴塞，减少精华与空气的接触，本发明制成的精华可以保持6个月不滋生细菌霉菌等。不仅因为白藜芦醇和熊果苷是非常强效的抗氧化剂，柠檬酸钠也是非常安全天然的抗菌剂。
精华防腐性能测试，将新鲜制备的甲、乙、丙、丁、戊五组精华分别装在5个30ml棕色玻璃瓶中，附有滴塞。模拟客户使用产品，由同一个使用者，每天早晚各一次，打开五组精华滴塞，再盖回滴塞，观察精华澄清度，味道变化。(五组精华放置于同一避光干燥处)
其中，甲组精华在使用第13周出现浑浊；乙组精华在第14周出现浑浊，气味发生酸臭改变；丙组精华在第16周出现浑浊，气味发生酸臭改变；丁组精华在24周出现浑浊，气味发生酸臭改变；戊组精华在19周出现浑浊，气味发生酸臭改变。
因此，在都不添加防腐剂的情况下，使用了本发明制成的丁组精华具有最好的防腐性能，一瓶30ml精华使用时间为12-13周，可以最大程度保持活性成分的效果及精华的新鲜。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的。
Claims (10)
1.一种抗皱精华，其特征在于，含有鱼皮胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种抗皱精华，其特征在于，按质量份计算，含有：
A组分8g，是鱼皮胶原蛋白冻干粉；
B组分：
3.一种高活性鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液混合，搅拌均匀后浸泡一段时间，离心去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5-9，浸泡一段时间后离心去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20-40，酶解温度为35-38℃，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，离心取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂；
第6步，精制处理：第5步的产物盐析，盐析后离心取沉淀，溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。
4.根据权利要求3所述的一种高活性鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，第6步，超滤膜的截留分子量优选为大于2000kDa，小于3000kDa，包括截留分子量2200、2500或2600kDa。
5.根据权利要求3所述的一种高活性鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，
第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10:0.2-1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，超声波强度控制在500-1000瓦/升，超声波的处理时间为30-60分钟，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与氯化钠溶液混合，搅拌均匀后浸泡10-15h，离心，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除酸溶性杂质：将第一沉淀与柠檬酸溶液混合，第一沉淀与酸溶液重量比是1:5-9，浸泡6-12h，离心，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，酶解处理：第二沉淀与水混合再加入第二沉淀重量2-6％的木瓜蛋白酶进行酶解，第二沉淀与水的重量比是1:20-40，酶解温度为35-38℃，反应时间为6-12h，酶解过程中控制反应液pH在4.5-5.5，离心，取上清，得到粗提物；
第5步，脱脂处理，粗提物用二氧化碳超临界脱脂，粗提物加入到密封高压釜中，一边升温一边用高压泵充入CO2，温度达到40℃，CO2压力达到预定的要求，CO2浓度为0.8g/mL(P＝20MPa)，处理时间10-20min；
第6步，精制处理：第5步的产物加入固体氯化钠，使氯化钠浓度为0.4-0.9mol/L，搅拌盐析，盐析后离心取沉淀，用0.4-0.8mol/L的醋酸溶解，溶解液采用超滤脱盐和浓缩，超滤截留液冷冻干燥，即可得到白色无腥味的胶原蛋白冻干粉。
6.根据权利要求3～5任一所述的一种高活性鱼皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，
第6步中采用的冷冻干燥是将超滤液于冻干机上进行冻存，冻存条件是:预冻阶段：设置温度从室温20℃降至设定值-50℃，持续保持维持该温度30-60min；升华阶段:真空干燥箱内压力控制在0.15-0.22mbar，采用两次升华方式：第一次升华温度从-40℃升至-15℃，此过程保持在90min左右；第二次升华温度从-15℃升至0℃，这个过程持续时间在120min；解吸阶段：真空箱内压力控制在0.16～0.22mbar，温度在40min内从O℃升温至30℃，随后在30℃维持200min。
7.一种护肤品，其特征在于，含有权利要求1或2所述的抗皱精华。
8.一种鱼皮胶原蛋白，其特征在于，根据权利要求3～6任一所述方法制备得到。
9.含有权利要求8所述鱼皮胶原蛋白的保健品或者细胞原代培养基或者护肤品或者医疗用品。
10.一种医用敷料，其特征在于，含有权利要求8所述鱼皮胶原蛋白，或者含有权利要求8所述鱼皮胶原蛋白及干细胞提取物。
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