CN110393793A - 透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法及由该方法制备的透皮纤连蛋白冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，该透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.5‑6.8，得到第一溶液；将第一溶液加热至78‑82℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至‑8℃，控制降温速度以使得降温过程在55‑65min内完成；将冻结之后的第一产物降温至‑45℃至‑50℃，并保温110‑130min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；以及对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。
Description
技术领域
本发明是关于生物技术领域，特别是关于一种透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法及由该方法制备的透皮纤连蛋白冻干粉。
背景技术
纤连蛋白(fibronectin，Fn)是一种细胞外基质中的高分子量糖蛋白，主要以三种形式存在，即由肝细胞或内皮细胞生成的血浆纤连蛋白，由成纤维细胞、早期间充质细胞分泌合成的细胞纤连蛋白，以及胎盘、羊膜组织中的胎儿纤连蛋白。
现有技术CN102247603B公开了一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，一种具有良好的透皮给药能力的表皮生长因子融合蛋白，所述融合蛋白的应用，以及一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。本发明的促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，包括将所述表皮生长因子与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。本发明通过融合透皮增强短肽达到提高表皮生长因子蛋白透皮输运的能力，同时，此种融合透皮增强短肽的药物与传统药物活性相当，无毒性。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法及由该方法制备的透皮纤连蛋白冻干粉，其能够克服现有技术的缺点。
为实现上述目的，本发明提供了一种透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，该透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.5-6.8，得到第一溶液；将第一溶液加热至78-82℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在55-65min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-45℃至-50℃，并保温110-130min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；以及对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。
在一优选的实施方式中，其中，将第二产物进行升华处理至少包括两个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为0℃至12℃，保温时间140-160min，压力20-30bar。
在一优选的实施方式中，其中，将第二产物进行升华处理包括三个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为0℃至5℃，保温时间80-100min，压力20-30bar，第三阶段温度为10℃至15℃，保温时间150-160min，压力20-30bar。
在一优选的实施方式中，其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为-15℃至-10℃，保温时间250-350min，压力20-30bar，第三阶段温度为0℃至5℃，保温时间80-100min，压力20-30bar，第四阶段温度为10℃至15℃，保温时间150-160min，压力20-30bar。
在一优选的实施方式中，其特征在于：其中，对第三产物进行二次干燥处理至少包括两个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
在一优选的实施方式中，其中，对第三产物进行二次干燥处理至少包括三个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为40℃至45℃，保温时间45-55min，压力20-30bar，第三阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
在一优选的实施方式中，其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为40℃至45℃，保温时间45-55min，压力20-30bar，第三阶段温度为40℃至45℃，保温时间230-250min，压力0-5bar，第四阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
在一优选的实施方式中，含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.2-0.4％，甘露醇的质量百分数为4-6％，海藻糖的质量百分数为0.5-0.9％，纤连蛋白的质量百分数为8-11％，余量为水。
本发明还提供了一种透皮纤连蛋白冻干粉，其特征在于：透皮纤连蛋白冻干粉是由如前述的制备方法制备的。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明通过优化制备工艺，使得含有纤连蛋白的制品具有以下功效：1)抗敏舒缓、修复敏感肌肤，强化角质屏障。增强皮肤抵抗力。2)营养细胞，增加基底层内源性纤连蛋白表达，使皮肤细腻赋有弹性。3)激活皮肤免疫系统，提高皮肤免疫力，淡化痘印，修复晒后损伤。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法流程图。
图2是施用本发明实施例1的裸鼠皮肤表皮病理照片。
图3是施用本发明实施例1的裸鼠皮肤表皮病理照片。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
图1是根据本发明一实施方式的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法流程图。如图所示，本发明的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：
步骤101：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；
步骤102：将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.5-6.8，得到第一溶液；
步骤103：将第一溶液加热至78-82℃，并保温30min；
步骤104：当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；
步骤105：将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在55-65min内完成；
步骤106：将冻结之后的第一产物降温至-45℃至-50℃，并保温110-130min，得到第二产物；
步骤107：将第二产物进行升华处理，得到第三产物；以及
步骤108：对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。
实施例1
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.5，得到第一溶液；将第一溶液加热至78℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在55min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-45℃，并保温110min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃，保温时间50min，压力20bar，第二阶段温度为-15℃，保温时间250min，压力20bar，第三阶段温度为0℃，保温时间80min，压力20bar，第四阶段温度为10℃，保温时间150min，压力20bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为20℃，保温时间25min，压力20bar，第二阶段温度为40℃，保温时间45min，压力20bar，第三阶段温度为40℃，保温时间230min，压力0bar，第四阶段温度为35℃，保温时间110min，压力0bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.2％，甘露醇的质量百分数为4％，海藻糖的质量百分数为0.5％，纤连蛋白的质量百分数为8％，余量为水。
实施例2
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.8，得到第一溶液；将第一溶液加热至82℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在65min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-50℃，并保温130min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-40℃，保温时间60min，压力30bar，第二阶段温度为-10℃，保温时间350min，压力30bar，第三阶段温度为5℃，保温时间100min，压力30bar，第四阶段温度为15℃，保温时间160min，压力30bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为25℃，保温时间35min，压力30bar，第二阶段温度为45℃，保温时间55min，压力30bar，第三阶段温度为45℃，保温时间250min，压力5bar，第四阶段温度为40℃，保温时间130min，压力5bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.4％，甘露醇的质量百分数为6％，海藻糖的质量百分数为0.9％，纤连蛋白的质量百分数为11％，余量为水。
实施例3
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.7，得到第一溶液；将第一溶液加热至80℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在60min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-47℃，并保温120min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-38℃，保温时间55min，压力25bar，第二阶段温度为-12℃，保温时间300min，压力25bar，第三阶段温度为3℃，保温时间90min，压力25bar，第四阶段温度为12℃，保温时间155min，压力25bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为23℃，保温时间30min，压力25bar，第二阶段温度为42℃，保温时间50min，压力25bar，第三阶段温度为42℃，保温时间240min，压力3bar，第四阶段温度为37℃，保温时间120min，压力2bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.3％，甘露醇的质量百分数为5％，海藻糖的质量百分数为0.6％，纤连蛋白的质量百分数为10％，余量为水。
对比例1
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至7，得到第一溶液；将第一溶液加热至85℃，并保温40min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-10℃，控制降温速度以使得降温过程在40min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-60℃，并保温150min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-38℃，保温时间55min，压力25bar，第二阶段温度为-12℃，保温时间300min，压力25bar，第三阶段温度为3℃，保温时间90min，压力25bar，第四阶段温度为12℃，保温时间155min，压力25bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为23℃，保温时间30min，压力25bar，第二阶段温度为42℃，保温时间50min，压力25bar，第三阶段温度为42℃，保温时间240min，压力3bar，第四阶段温度为37℃，保温时间120min，压力2bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.3％，甘露醇的质量百分数为5％，海藻糖的质量百分数为0.6％，纤连蛋白的质量百分数为10％，余量为水。
对比例2
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.7，得到第一溶液；将第一溶液加热至80℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在60min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-47℃，并保温120min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-45℃，保温时间65min，压力40bar，第二阶段温度为-20℃，保温时间400min，压力40bar，第三阶段温度为10℃，保温时间120min，压力40bar，第四阶段温度为20℃，保温时间170min，压力35bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为23℃，保温时间30min，压力25bar，第二阶段温度为42℃，保温时间50min，压力25bar，第三阶段温度为42℃，保温时间240min，压力3bar，第四阶段温度为37℃，保温时间120min，压力2bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.3％，甘露醇的质量百分数为5％，海藻糖的质量百分数为0.6％，纤连蛋白的质量百分数为10％，余量为水。
对比例3
透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；将柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.7，得到第一溶液；将第一溶液加热至80℃，并保温30min；当温度降至40℃以下后，向第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；将含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在60min内完成；将冻结之后的第一产物降温至-47℃，并保温120min，得到第二产物；将第二产物进行升华处理，得到第三产物；对第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。其中，将第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-38℃，保温时间55min，压力25bar，第二阶段温度为-12℃，保温时间300min，压力25bar，第三阶段温度为3℃，保温时间90min，压力25bar，第四阶段温度为12℃，保温时间155min，压力25bar。其中，对第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为30℃，保温时间40min，压力35bar，第二阶段温度为50℃，保温时间60min，压力35bar，第三阶段温度为50℃，保温时间300min，压力10bar，第四阶段温度为45℃，保温时间140min，压力10bar。含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.3％，甘露醇的质量百分数为5％，海藻糖的质量百分数为0.6％，纤连蛋白的质量百分数为10％，余量为水。
实验：选取6只(8-10周)大小雄性裸鼠，先在裸鼠左右二侧皮肤3cm*3cm试验部位，用胶带连续粘贴快速撕下数次，直到皮肤出现小血点，停止粘撕。模型组和正常组即刻剖取试验部位的皮肤组织，做病理切片镜检拍照；各个样品组分别涂抹样品(分别涂覆实施例1-3以及对比例1-3的冻干粉配制的样品)，每天涂抹一次，连续涂抹四天后，将动物处死解剖取试验部位的皮肤组织，做病理切片镜检拍照；对照组不涂抹任何样品，四天后，将动物处死解剖取试验部位的皮肤组织，做病理切片镜检拍照。
| 镜检观察 | |
| 实施例1 | 皮肤表皮角质层有明显恢复 |
| 实施例2 | 皮肤表皮角质层有明显恢复 |
| 实施例3 | 皮肤表皮角质层有明显恢复 |
| 对比例1 | 皮肤表皮角质层未见有明显恢复 |
| 对比例2 | 皮肤表皮角质层损伤，角质层脱落 |
| 对比例3 | 皮肤表皮角质层正常但是未恢复 |
综上所述，本发明通过优化制备工艺，使得含有纤连蛋白的制品具有以下功效：1)抗敏舒缓、修复敏感肌肤，强化角质屏障。增强皮肤抵抗力。2)营养细胞，增加基底层内源性纤连蛋白表达，使皮肤细腻赋有弹性。3)激活皮肤免疫系统，提高皮肤免疫力，淡化痘印，修复晒后损伤。
以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形和替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.一种透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：所述透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：
称取一定量的柠檬酸钠、甘露醇、海藻糖；
将所述柠檬酸钠、甘露醇以及海藻糖加水溶解后调节pH至6.5-6.8，得到第一溶液；
将所述第一溶液加热至78-82℃，并保温30min；
当温度降至40℃以下后，向所述第一溶液中缓慢加入经过滤的纤连蛋白溶液，均匀搅拌，避免产生泡沫，得到含有纤连蛋白的液体；
将所述含有纤连蛋白的液体进行冻结，得到第一产物，其中，所述冻结具体为：将含有纤连蛋白的液体的温度降至-8℃，控制降温速度以使得降温过程在55-65min内完成；
将冻结之后的第一产物降温至-45℃至-50℃，并保温110-130min，得到第二产物；
将所述第二产物进行升华处理，得到第三产物；以及
对所述第三产物进行二次干燥处理，得到透皮纤连蛋白冻干粉。
2.如权利要求1所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其中，所述将所述第二产物进行升华处理至少包括两个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为0℃至12℃，保温时间140-160min，压力20-30bar。
3.如权利要求2所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其中，所述将所述第二产物进行升华处理包括三个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为0℃至5℃，保温时间80-100min，压力20-30bar，第三阶段温度为10℃至15℃，保温时间150-160min，压力20-30bar。
4.如权利要求3所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其中，所述将所述第二产物进行升华处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为-35℃至-40℃，保温时间50-60min，压力20-30bar，第二阶段温度为-15℃至-10℃，保温时间250-350min，压力20-30bar，第三阶段温度为0℃至5℃，保温时间80-100min，压力20-30bar，第四阶段温度为10℃至15℃，保温时间150-160min，压力20-30bar。
5.如权利要求4所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其特征在于：其中，对所述第三产物进行二次干燥处理至少包括两个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
6.如权利要求5所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其特征在于：其中，对所述第三产物进行二次干燥处理至少包括三个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为40℃至45℃，保温时间45-55min，压力20-30bar，第三阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
7.如权利要求6所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其特征在于：其中，对所述第三产物进行二次干燥处理包括四个阶段，其中，第一阶段温度为20℃至25℃，保温时间25-35min，压力20-30bar，第二阶段温度为40℃至45℃，保温时间45-55min，压力20-30bar，第三阶段温度为40℃至45℃，保温时间230-250min，压力0-5bar，第四阶段温度为35℃至40℃，保温时间110-130min，压力0-5bar。
8.如权利要求7所述的透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法，其特征在于：其特征在于：含有纤连蛋白的液体中，柠檬酸钠的质量百分数为0.2-0.4％，甘露醇的质量百分数为4-6％，海藻糖的质量百分数为0.5-0.9％，纤连蛋白的质量百分数为8-11％，余量为水。
9.一种透皮纤连蛋白冻干粉，其特征在于：所述透皮纤连蛋白冻干粉是由如权利要求1-8之一所述的制备方法制备的。
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