CN106986944A - 重组三元融合胶原蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组三元融合胶原蛋白及其应用，属于基因工程领域。所述重组三元融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为25～35%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽。相比传统的类人胶原蛋更容易被人体所吸收，本发明提供的融合胶原蛋白吸收更快，更彻底，同时还能促进人体新陈代谢，促进创伤愈合与组织修复，祛黄，嫩肤，改善黄褐斑、雀斑等色素沉着、皱纹及肤色效果，是一种功效全面突破性新型融合胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种融合胶原蛋白，更具体的说，涉及一种重组三元融合胶原蛋白及其应用。
背景技术
胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色，为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量庞大的最佳生物医药材料，广泛应用于生医材料、化妆品和食品工程等领域。负载有生长因子的胶原蛋白海绵兼有组织修复、促进创伤愈合、祛黄、嫩肤等功效。但是目前获取的胶原蛋白成熟的工艺是采用动物组织提取的方式，存在哺乳动物牛组织及鸟类动物鸡组织中提取的胶原蛋白易带病毒，继而传染并危害人的健康。
乳糖酸（Bionic Acid）秉承了果酸的独有功效，但性质及其温和，具卓越的保湿，抗氧化和皮肤修复功效。其抗氧化功能被医学界广泛采用，甚至被用于保存移植器官。乳糖酸配方的功效和性质使其不仅适用于敏感性肌肤，更成为全球皮肤科医生在各种微创美容术后修复患者皮肤的首选产品。
本发明提供的重组三元融合胶原蛋白是三种物质通过融合发酵重组而成的一种蛋白，采用国际领先的重组融合复配技术，强化细胞生物活性，保持原有特性并提升优化，这三种物质分别为人源胶原蛋白，3GF生长因子及新一代乳糖酸，它们的高效融合可提高成长再生修复机能的诱导潜能，比单一物质的成长潜能高得多。重组三元融合胶原蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，应用于组织工程，药学以及美容护肤领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供重组三元融合胶原蛋白（以下称为重组3M融合胶原蛋白），该蛋白由三种物质：类人胶原蛋白、3GF生长因子、新型乳糖酸的融合发酵而组成的一种蛋白，可以提高成长再生修复的诱导潜能。
所述重组3M融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为25～35%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述连接肽的通式是（GGSS）n，n=1～4的整数。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述3GF成长因子为表皮细胞生长因子EGF、胰岛素成长因子IGF 、成纤维细胞成长因子FGF和角化细胞生长因子KGF中的任意三种。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述新型乳糖酸的主要成分为葡萄糖酸内酯和乳糖酸，以重量份计，葡糖酸内脂1～10份、乳糖酸1～250份。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述重组类人胶原蛋白由以下方法制备得到：
1）重组类人胶原蛋白的工程菌的构建；
2）工程菌的发酵培养；
3）重组类人胶原蛋白的诱导及表达；
4）重组类人胶原蛋白的提纯。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤1），所述重组类人胶原蛋白的工程菌的构建如下：
a、将编码类人胶原蛋白的DNA片段抽提出来，并由编码3GF成长因子序列进行修饰后，再特定重复，然后进行连接，DNA重组；
b、将上述重组DNA转入到大肠杆菌。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤2），所述工程菌的发酵培养基为：酵母菌15～28g/L，葡糖糖18～36g/L，NaHPO4 3.0～9.3g/L，(NH4)2SO4 4.0～5.0 g/L，FeCl3 0.5～2.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.15～0.28 g/L，ZnSO4 0.15～0.26 g/L。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤2），所述工程菌的发酵培养条件为：培养温度33.5～34.5℃，pH7.0溶氧DO 20%，空气流量为1.3～3，5VVM，搅拌转速为500～900r/min，接种量6%，种子培养基、LB培养基、卡那霉素0.55mg/L、葡萄糖5.5g/L，以葡萄糖浓度控制1.6%为宜，用DO量控制在40%，但OD600的值为100时收获细胞。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤4），所述重组类人胶原蛋白的提纯如下：细胞经离心收集后经高压细胞匀浆，然后用缓冲液抽提，经过第一次乙酸缓冲液盐析后，进行离子树脂交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
进一步的，本发明还提供了上述重组3M融合胶原蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的重组3M融合胶原蛋白，相比传统的类人胶原蛋更容易被人体所吸收，吸收更快，更彻底，同时还能促进人体新陈代谢，促进创伤愈合与组织修复，祛黄，嫩肤，改善黄褐斑、雀斑等色素沉着、皱纹及肤色效果，是一种功效全面突破性新型融合胶原蛋白。
具体实施方式
本发明提供了一种重组三元融合胶原蛋白（以下称为重组3M融合胶原蛋白），该蛋白由三种物质：类人胶原蛋白、3GF生长因子、新型乳糖酸的融合发酵而组成的一种蛋白，可以提高成长再生修复的诱导潜能。
所述重组3M融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为25～35%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述连接肽的通式是（GGSS）n，n=1～4的整数，优选n=3。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述3GF成长因子为表皮细胞生长因子EGF、胰岛素成长因子IGF、成纤维细胞成长因子FGF和角化细胞生长因子KGF中的任意三种；所述新型乳糖酸的主要成分为葡萄糖酸内酯和乳糖酸，以重量份计，葡糖酸内脂1～10份、乳糖酸1～250份。此配比可以达到对皮肤无刺激的去除皮肤角质，改善黄褐斑、雀斑等色素沉着、皱纹及肤色效果。
其中，上述重组重组3M融合胶原蛋白中，所述重组类人胶原蛋白由以下方法制备得到：
1）重组类人胶原蛋白的工程菌的构建；
2）工程菌的发酵培养；
3）重组类人胶原蛋白的诱导及表达；
4）重组类人胶原蛋白的提纯。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤1），所述重组类人胶原蛋白的工程菌的构建如下：
a、将编码类人胶原蛋白的DNA片段抽提出来，并由编码3GF成长因子序列进行修饰后，再特定重复，然后进行连接，DNA重组；
b、将上述重组DNA转入到大肠杆菌。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤2），所述工程菌的发酵培养基为：酵母菌15～28g/L，葡糖糖18～36g/L，NaHPO4 3.0～9.3g/L，(NH4)2SO4 4.0～5.0 g/L，FeCl3 0.5～2.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.15～0.28 g/L，ZnSO4 0.15～0.26 g/L。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤2），所述工程菌的发酵培养条件为：培养温度33.5～34.5℃，pH7.0溶氧DO 20%，空气流量为1.3～3，5VVM，搅拌转速为500～900r/min，接种量6%，种子培养基、LB培养基、卡那霉素0.55mg/L、葡萄糖5.5g/L，以葡萄糖浓度控制1.6%为宜，用DO量控制在40%，但OD600的值为100时收获细胞。
其中，上述重组类人胶原蛋白的方法步骤4），所述重组类人胶原蛋白的提纯如下：细胞经离心收集后经高压细胞匀浆，然后用缓冲液抽提，经过第一次乙酸缓冲液盐析后，进行离子树脂交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
进一步的，本发明还提供了上述重组3M融合胶原蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。将上述重组3M融合胶原蛋白配以适当辅料通过一定工艺进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，应用于组织工程，药学以及美容护肤领域。
本发明重组3M融合胶原蛋白中：
类人胶原蛋白具备四个生物特性：1、能被生物吸收、2、被细胞粘附、3、形成新细胞上皮细胞、4、能被生物兼容。该胶原蛋白不仅具有动物体胶原蛋白原有功效，如：生物兼容性、生物吸收性、细胞粘附性、促新细胞形成和促上皮细胞形成，而且由于可形成三重复螺旋结构，赋予其新功能，如热可逆成胶原和在分子量及特性不变条件下的可加工性。而来自动物组织提取的胶原蛋白为三交叉螺旋结构，它不可能在不减少分子量的前提下重溶解。
新型乳糖酸秉承了果酸的独有功效，但性质及其温和，具卓越的保湿，抗氧化和皮肤修复功效。其抗氧化功能被医学界广泛采用，甚至被用于保存移植器官。乳糖酸配方的功效和性质使其不仅适用于敏感性肌肤，更成为全球皮肤科医生在各种微创美容术后修复患者皮肤的首选产品。
细胞生长因子是由机体细胞产生，能调节细胞分化增值和诱导细胞发挥功能，是高活性多功能的多肽、蛋白质或糖蛋白。EGF（表皮生长因子）作用于皮肤表皮层，其主要作用是促进皮肤表皮修复，激活细胞。FGF（成纤维细胞生长因子）作用于中胚层，神经外胚层，主要起深层修护，表皮修复，细胞重组、分化、激活等作用。RNA/DNA核糖核酸/脱氧核糖核酸作用于中胚层，有促进新生细胞生长的效用。
重组3M融合胶原蛋白由上述三种物质通过融合发酵重组而成，采用国际领先的重组融合复配技术，强化细胞生物活性，保持原有特性并提升优化，它们的高效融合可提高成长再生修复机能的诱导潜能，比单一物质的成长潜能高得多。相比传统的类人胶原蛋更容易被人体所吸收，吸收更快，更彻底，同时还能促进人体新陈代谢，促进创伤愈合与组织修复，祛黄，嫩肤，改善黄褐斑、雀斑等色素沉着、皱纹及肤色效果，是一种功效全面突破性新型融合胶原蛋白。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按常规条件。
实施例1
重组3M融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为30%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽；所述连接肽的通式是（GGSS）n，n=3。所述3GF成长因子为表皮细胞生长因子EGF、胰岛素成长因子IGF和成纤维细胞成长因子FGF；所述新型乳糖酸的主要成分为葡萄糖酸内酯和乳糖酸，以重量份计，葡糖酸内脂7份、乳糖酸80份。
所述重组类人胶原蛋白由以下方法制备得到：
1）重组类人胶原蛋白的工程菌的构建：a、将编码类人胶原蛋白的DNA片段抽提出来，并由编码3GF成长因子序列进行修饰后，再特定重复，然后进行连接，DNA重组；b、将上述重组DNA转入到大肠杆菌；
2）工程菌的发酵培养：所述工程菌的发酵培养基为：酵母菌18g/L，葡糖糖20g/L，NaHPO4 4.5 g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，FeCl3 1.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.15 g/L，ZnSO4 0.15g/L；
所述工程菌的发酵培养条件为：培养温度33.5℃，pH 7.0溶氧DO 20%，空气流量为1.3～3.5VVM，搅拌转速为800r/min，接种量6%，种子培养基、LB培养基、卡那霉素0.55mg/L、葡萄糖5.5g/L，以葡萄糖浓度控制1.6%为宜，用DO量控制在40%，但OD600的值为100时将培养温度调节到40℃诱导2.5h收获细胞；
3）重组类人胶原蛋白的诱导及表达；
4）重组类人胶原蛋白的提纯：细胞经离心收集后经高压细胞匀浆，然后用缓冲液抽提，经过第一次乙酸缓冲液盐析后，进行离子树脂交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
实施例2
重组3M融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为30%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽；所述连接肽的通式是（GGSS）n，n=3。所述3GF成长因子为表皮细胞生长因子EGF、胰岛素成长因子IGF和成纤维细胞成长因子FGF；所述新型乳糖酸的主要成分为葡萄糖酸内酯和乳糖酸，以重量份计，葡糖酸内脂10份、乳糖酸180份。
所述重组类人胶原蛋白由以下方法制备得到：
1）重组类人胶原蛋白的工程菌的构建：a、将编码类人胶原蛋白的DNA片段抽提出来，并由编码3GF成长因子序列进行修饰后，再特定重复，然后进行连接，DNA重组；b、将上述重组DNA转入到大肠杆菌；
2）工程菌的发酵培养：所述工程菌的发酵培养基为：酵母菌26g/L，葡糖糖30g/L，NaHPO4 8.2 g/L，(NH4)2SO4 5.0 g/L，FeCl3 2.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.25 g/L，ZnSO4 0.26g/L；
所述工程菌的发酵培养条件为：培养温度33.5℃，pH7.0溶氧DO 20%，空气流量为1.3～3.5VVM，搅拌转速为800r/min，接种量6%，种子培养基、LB培养基、卡那霉素0.55mg/L、葡萄糖5.5g/L，以葡萄糖浓度控制1.6%为宜，用DO量控制在40%，但OD600的值为100时将培养温度调节到40℃诱导2.5h收获细胞；
3）重组类人胶原蛋白的诱导及表达；
4）重组类人胶原蛋白的提纯：细胞经离心收集后经高压细胞匀浆，然后用缓冲液抽提，经过第一次乙酸缓冲液盐析后，进行离子树脂交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，所述重组三元融合胶原蛋白包括重组类人胶原蛋白和质量配比为25～35%的新型乳糖酸；所述重组类人胶原蛋白是由类人胶原蛋白与3GF成长因子融合形成，其包括类人胶原蛋白至少80%序列同源的第一区和与每一种人细胞生长因子的至少80%的序列同源第二区，第一区和第二区之间设有连接肽。
2.根据权利要求1所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，所述连接肽的通式是（GGSS）n，n=1～4的整数。
3.根据权利要求1所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，所述3GF成长因子为表皮细胞生长因子EGF、胰岛素成长因子IGF 、成纤维细胞成长因子FGF和角化细胞生长因子KGF中的任意三种。
4.根据权利要求1所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，所述新型乳糖酸的主要成分为葡萄糖酸内酯和乳糖酸，以重量份计，葡糖酸内脂1～10份、乳糖酸1～250份。
5.根据权利要求1所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，所述重组类人胶原蛋白由以下方法制备得到：
重组类人胶原蛋白的工程菌的构建；
工程菌的发酵培养；
重组类人胶原蛋白的诱导及表达；
重组类人胶原蛋白的提纯。
6.根据权利要求5所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，步骤1）中所述重组类人胶原蛋白的工程菌的构建如下：
a、将编码类人胶原蛋白的DNA片段抽提出来，并由编码3GF成长因子序列进行修饰后，再特定重复，然后进行连接，DNA重组；
b、将上述重组DNA转入到大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，步骤2）中所述工程菌的发酵培养基为：酵母菌15～28g/L，葡糖糖18～36g/L，NaHPO4 3.0～9.3g/L，(NH4)2SO44.0～5.0 g/L，FeCl3 0.5～2.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.15～0.28 g/L，ZnSO4 0.15～0.26 g/L。
8.根据权利要求5所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，步骤2）中所述工程菌的发酵培养条件为：培养温度33.5～34.5℃，pH7.0溶氧DO 20%，空气流量为1.3～3，5VVM，搅拌转速为500～900r/min，接种量6%，种子培养基、LB培养基、卡那霉素0.55mg/L、葡萄糖5.5g/L，以葡萄糖浓度控制1.6%为宜，用DO量控制在40%，但OD600的值为100时收获细胞。
9.根据权利要求5所述重组重组三元融合胶原蛋白，其特征在于，步骤4）中所述重组类人胶原蛋白的提纯如下：细胞经离心收集后经高压细胞匀浆，然后用缓冲液抽提，经过第一次乙酸缓冲液盐析后，进行离子树脂交换，再经金属离子螯合吸附，精制和除热源，精品去冷冻干燥。
10.权利要求1～9任一项重组3M融合胶原蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170728 |