CN104623642A - 天然(端肽)胎盘胶原组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含人胎盘端肽胶原的组合物、制备该组合物的方法、及其使用方法和包含该组合物的试剂盒。所述组合物、试剂盒和方法可用于例如填充或替代哺乳动物的组织。

Description

天然(端肽)胎盘胶原组合物

本申请是申请日为2007年10月09日、申请号为200780044801.6、名称为“天然(端肽)胎盘胶原组合物”的发明申请的分案。

1.在先相关申请

本申请要求于2006年10月6日提交的美国临时专利申请号60/850,131的权益，其通过全文引用并入本发明中。

2.发明领域

本发明涉及包含胶原，例如人胎盘胶原的组合物，制备该组合物的方法及其使用方法。

3.发明背景

胶原是在体内形成许多结构的蛋白质，所述组织包括腱、骨骼、牙齿和支持皮肤和内部器官的筋膜。胶原由三条链以三螺旋缠绕组成。其结构来源于三种氨基酸的重复。在螺旋中，每隔三个氨基酸就是甘氨酸，并且剩余的氨基酸中多数是脯氨酸或羟脯氨酸。

胶原已经在商业上和临床上经过一段时间的使用。目前，可以使用胶原替代或填充硬结缔组织或软结缔组织，例如皮肤、腱、软骨、骨和间质。固体胶原可以手术植入，且现在可获得可注射的胶原制剂用于更方便的施用。目前，一些可注射的胶原组合物是可商购的，包括 和

每种胶原组合物都具有特定的物理性质，所述性质可有利于或不利于其在特定技术中的使用。因此，本领域仍然需要具有其它物理性质的胶原组合物，从而扩展本领域熟练的执业医师可获得的组合物的选择。

4.发明概述

本发明部分地基于发现胶原组合物可用于例如填充或替代哺乳动物的组织。在某些实施方案中，所述胶原组合物是用来自组织来源的主要高产的胶原来制备的。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物表现出减少的污染，例如被细胞和/或其它蛋白质污染物所污染。在本发明的某些实施方案中，本发明的胶原组合物表现出有利的低毒性。在本发明的某些实施方案中，胶原组合物提供了用于端肽胶原组合物制备的有利来源。

一方面，本发明提供了包含碱处理、去垢剂处理的端肽胶原的组合物。已发现即使采用哺乳动物组织作为起始来源，此类组合物可以用相对较少的步骤很容易的制备。本发明中提供的某些组合物基本上不含细胞碎片、亚细胞碎片和/或污染蛋白质，例如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、细胞因子和生长因子。本发明中提供的某些组合物包含高胶原含量。在某些实施方案中，当与组合物中的蛋白质总量相比时，组合物包含至少90％胶原。在某些实施方案中，所述胶原组合物基本上不含层粘连蛋白和/或纤粘连蛋白(例如：所述组合物包含少于各占干重1％的层粘连蛋白和/或纤粘连蛋白，或者不含可检测的层粘连蛋白和/或纤粘连蛋白)。

另一方面，发明提供了本发明的胶原组合物，例如包含大量干细胞的，碱处理、去垢剂处理的端肽胶原。在多个实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、间充质干细胞、骨髓来源的干细胞、造血祖细胞(例如：来自外周血、胎儿血、胎盘血、脐带血、胎盘灌流液等的造血干细胞)、成体干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心脏干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞等。

在更特定的实施方案中，所述干细胞是胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34^-和/或CD200⁺。所述胎盘干细胞可以表达CD10、CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，并且缺少CD34、CD38或CD45的表达。所述胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。在另一特定的实施方案中，可以与本发明的组合物结合的干细胞是CD200⁺或HLA-G⁺。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200⁺和OCT-4⁺。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD73⁺和CD105⁺，并且，当处于胎盘细胞群中时，在允许胚样小体形成的条件下有利于形成一个或多个胚样小体。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4⁺，并且当处于胎盘细胞群中时，当在允许胚样小体形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样小体。

在与干细胞结合之前或之后，包含干细胞的组合物可以被制成任何形状。在一实施方案中，所述组合物成型为层状，例如干燥层状，具有两面，并且所述干细胞存在于所述面的至少一个上。在另一实施方案中，所述组合物被制成管状，并且所述干细胞至少存在于管的内侧面或外侧面。在另一特定的实施方案中，所述干细胞附着在组合物上。在任何上述实施方案的特定的实施方案中，当与组合物接触时，干细胞分泌IL-6、IL-8和/或MCP-1(单核细胞趋化性蛋白-1)。

另一方面，本发明提供了制备碱处理、去垢剂处理的端肽胶原的方法。虽然胎盘组织的来源可以是任何哺乳动物，但在一些实施方案中使用了人胎盘。所述胎盘组织可以来自胎盘的任何部分，包括羊膜(无论是溶解的或不溶的或两者都是的)、绒毛膜和脐带，或者来自完整的胎盘。在某些实施方案中，所述胎盘胶原从除去脐带后的完整人胎盘中制备。

在某些实施方案中，所述方法包括胎盘组织的渗透压冲击。虽然并非意在通过任何特定的操作理论来束缚，据信渗透压冲击可以裂解组织中的细胞，从而有助于除去细胞、细胞组分和血液组分。渗透压冲击步骤可以产生具有有利纯度的本发明的胶原组合物。可以在本领域技术人员已知的任何渗透压冲击条件下进行渗透压冲击。在特定的实施方案中，通过在水溶液中培养后在高盐条件下培养来进行渗透压冲击。根据本领域技术人员的判断可以重复进行培养。在某些实施方案中，重复两次或多次。

在渗透压冲击后，可以用去垢剂处理获得的胶原组合物。所述去垢剂可以是本领域技术人员已知的，能够溶解组织来源的蛋白质和脂类细胞组分的任何去垢剂。在某些实施方案中，所述去垢剂是离子型的，例如十二烷基硫酸钠或脱氧胆酸。在某些实施方案中，所述去垢剂是非离子型的，例如去垢剂或去垢剂。在某些实施方案中，所述去垢剂是两性离子的。在某些其它实施方案中，所述去垢剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些实施方案中，所述胶原组合物在对本领域技术人员显而易见的条件下与去垢剂接触，从而溶解组织来源的细胞或亚细胞组分。可以根据本领域技术人员的判断重复去垢剂处理。在某些实施方案中，重复两次或多次。

在某些实施方案中，可以在碱性条件下处理胶原组合物。例如，在某些实施方案中，所述胶原组合物可以与碱性溶液接触，例如氨水、氢氧化钾或氢氧化钠溶液。在某些实施方案中，在约0.5M氢氧化钠中培养胶原组合物一段时间，所述时间足以产生本发明的组合物。根据本领域技术人员的判断可以重复碱处理。在某些实施方案中，重复两次或多次。

在某些实施方案中，可以以任意顺序进行所述方法的步骤。在某些实施方案中，在任何去垢剂处理或碱性条件下处理前，进行至少一个渗透压冲击步骤。在某些实施方案中，在去垢剂处理前进行至少一个渗透压冲击步骤，其后进行碱处理。

在其它方面，本发明提供了通过向需要的哺乳动物施用本发明的胶原组合物，来填充或替代哺乳动物组织的方法。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。可以根据本领域技术人员已知的任何技术来施用胶原组合物。在某些实施方案中，通过注射来施用胶原组合物。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物的流变特性是有利的。在某些实施方案中，所述胶原组合物可以根据美国专利公开号2004/0048796中描述的方法作为胞外基质使用，其内容通过全文引用并入本发明中。

在另一方面，本发明提供了用于向需要的哺乳动物施用本发明的胶原组合物的试剂盒。所述试剂盒通常包括被置于包装内的本发明的胶原组合物以方便地向本领域熟练的医师分配。所述试剂盒还可以包括向哺乳动物施用本发明的胶原组合物的装置。所述装置可以是本领域技术人员已知的、用于施用胶原组合物的任何装置，例如注射器、注射器和针头、插管等。在某些实施方案中，所述装置采用本发明的胶原组合物预装填。

在另一方面，本发明提供了促进伤口愈合的方法，包括使伤口与本发明的胶原组合物接触，其中所述接触使与未接触组合物的伤口相比，伤口的外观产生了可检测的显著改善。在特定的实施方案中，所述方法还包括将所述伤口与大量的干细胞接触。在更特定的实施方案中，所述干细胞与所述伤口的接触与所述组合物与所述伤口的接触是分开的。在另一特定的实施方案中，所述组合物包含所述干细胞。在另一特定的实施方案中，所述组合物制成具有两面的层状，所述干细胞存在于所述面的至少一个上。在另一特定的实施方案中，所述干细胞附着在组合物上。在上述实施方案的特定的实施方案中，当与组合物接触时，干细胞分泌IL-6、IL-8和/或MCP-1(单核细胞趋化性蛋白-1)。在更特定的实施方案中，所述干细胞是胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34^-和/或CD200⁺。在另一特定的实施方案中，所述伤口是小腿溃疡。小腿溃疡可以是静脉小腿溃疡、动脉小腿溃疡、糖尿病小腿溃疡或褥疮小腿溃疡。在另一特定的实施方案中，所述组合物用作伤口填充剂。

在另一方面，本发明提供了制造组合物的方法，包括将本发明的胶原组合物与大量的干细胞接触。在一实施方案中，本方法包括允许至少一些所述大量的干细胞附着在所述组合物上。在另一实施方案中，本方法包括允许所述干细胞在所述组合物上增殖。在特定的实施方案中，本方法包括允许所述干细胞在所述组合物上增殖到汇合。在某些实施方案中，当与所述组合物接触时，所述干细胞产生可检测量的IL-6、IL-8和/或MCP-1。在另一特定的实施方案中，本方法包括在所述干细胞已经沉积了可检测量的至少一种胞外基质蛋白后，使组合物去细胞化。在更特定的实施方案中，所述胞外基质蛋白是胶原蛋白(例如：I、II、III或IV型)、纤粘连蛋白或弹性蛋白。

根据上文和下列章节中的详细描述，本发明的组合物、工艺、方法和试剂盒具有向需要的哺乳动物使用胶原组合物的用途。

5.附图说明

图1：流程图表示了分离胞外基质(ECM)的方法。

图2A：来自生长在胶原组合物上的胎盘干细胞的IL-6分泌，所述胶原组合物通过不同的方法制造。横座标：组合物类型和细胞在组合物上生长的时间的特定生长条件。纵座标：每毫升每1000ECM结合细胞的皮克。NC＝无细胞。Purecol＝纯化的胶原。TCPS＝组织培养聚苯乙烯。

图2B：来自生长在胶原组合物上的胎盘干细胞的IL-8分泌，所述胶原组合物通过不同的方法制造。横座标：组合物类型和细胞在组合物上生长的时间的特定生长条件。纵座标：每毫升每1000ECM结合细胞的皮克。NC＝无细胞。Purecol＝纯化的胶原。TCPS＝组织培养聚苯乙烯。

图2C：来自生长在胶原组合物上的胎盘干细胞的MCP-1分泌，所述胶原组合物通过不同的方法制造。横座标：组合物类型和细胞在组合物上生长的时间的特定生长条件。纵座标：每毫升每1000ECM结合细胞的皮克。NC＝无细胞。Purecol＝纯化的胶原。TCPS＝组织培养聚苯乙烯。

6.本发明的详细描述

6.1定义

如本发明中使用的，下列术语具有下列含义：

术语“胶原”指本领域技术人员已知的任何胶原。

术语“端肽胶原”指本领域技术人员识别的一类胶原类型，含有一个或多个端肽区域。

术语“非端肽胶原”指本领域技术人员识别的一类胶原类型，缺少一个或多个端肽区域。在某些实施方案中，可以通过下文详细讨论的蛋白酶消化除去端肽区域。

本发明中使用的“生物相容性”或“生物可相容性”指是生物学相容的性质，其不产生毒性、致伤性、或不在活组织中产生免疫应答或排斥。当在体内使用人工材料时，对未知材料的身体应答是首要的考虑，因此，材料的生物相容性是此类材料中重要的设计考虑。

本发明中使用的“无热原”指材料经过检测，发现含有少于或等于0.5EU/ml的热原，例如内毒素。1EU是根据参考对照，每毫升约0.1至0.2ng的内毒素。

术语“个体”指动物，例如哺乳动物，包括但不限于：灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，个体是人。

6.2本发明的实施方案

本发明涉及胶原组合物、制备胶原组合物的方法、包含胶原组合物的试剂盒及其使用方法。

6.2.1本发明的胶原组合物

在一实施方案中，本发明提供了用于例如填充或替代哺乳动物的组织的胶原组合物。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物具有有利的耐久性、可注射性和流变性质。在某些其它实施方案中，本发明提供了这样的胶原组合物，所述组合物具有空间填充性质，和例如有利于和支持与组合物接触的组织中的脉管生长。在某些其它实施方案中，本发明的组合物是空气干燥的或冷冻干燥的，并模铸成有用的构型。在某些其它实施方案中，本发明的组合物是不溶于水的。

在本发明的该方面中，所述胶原可以是本领域技术人员已知的任何胶原。在某些实施方案中，所述胶原是哺乳动物的胶原。在特定的实施方案中，所述胶原是人、牛、绵羊、羊、大鼠或袋鼠的胶原。在某些非哺乳动物的实施方案中，所述胶原是鱼胶原。虽然胶原可以来自任何这类来源，人胶原是特别的实例。

所述胶原可以来自来源的任何部分。有效的来源包括牛皮肤、小牛皮肤、大鼠尾、袋鼠尾和鱼皮。在特定的实施方案中，所述胶原是胎盘胶原，例如牛胎盘胶原、绵羊胎盘胶原或人胎盘胶原。一个实例是人胎盘胶原。

所述胶原可以是本领域技术人员已知的任何类型的胶原，或此类胶原的混合物。在某些实施方案中，所述胶原位于包含一种或多种类型的胶原的胶原组合物中。特定的胶原包括I型胶原、II型胶原、III型胶原和IV型胶原。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物包含特定量的这类胶原。特定的组合物包括主要量的I型胶原，同时也富含IV型胶原。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物包含介于1％和15％之间的IV型胶原，介于2％和13％之间的IV型胶原，介于3％和12％之间的IV型胶原或介于4％和11％之间的IV型胶原。与此同时，所述胶原组合物可以包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的I型胶原。例如，所述组合物可以包含介于70％和95％之间的I型胶原，介于74％和92％之间的I型胶原或介于80％和90％之间的I型胶原。本发明的相同的胶原组合物可以包含一定量的III型胶原，例如多达1％、多达2％、多达3％、多达4％、多达5％、多达6％或多达7％的III型胶原。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物包含介于2％和15％之间的IV型胶原，介于70％和95％之间的I型胶原和达6％的III型胶原。

在某些实施方案中，除胶原外，胶原组合物还包含一种或多种胞外基质蛋白或组分。在特定的实施方案中，所述胶原组合物包含纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或糖胺聚糖。在另一特定的实施方案中，所述胶原组合物包含不可检测的纤粘连蛋白，或不可检测的层粘连蛋白。在另一特定的实施方案中，所述胶原组合物包含可检测量的纤粘连蛋白和层粘连蛋白。在另一特定的实施方案中，所述胶原组合物包含占干重约5％或更多的弹性蛋白。在另一特定的实施方案中，所述胶原组合物包含占干重约10％或更多的弹性蛋白。在另一特定的实施方案中，所述胶原组合物包含占干重不超过5％的弹性蛋白。

本发明的这类胶原组合物可以通过本领域技术人员显而易见的任何工艺获得。下列章节中将详细描述特定的工艺。

在某些实施方案中，本发明的这一方面的胶原组合物是交联的。在某些实施方案中，胶原组合物可以是根据本领域技术人员已知的方法，与交联剂例如戊二醛交联的。此类方法专门描述在例如美国专利号4,852,640、5,428,022、5,660,692和5,008,116，以及McPherson等人，1986,JBiomedical Materials Res.20:79-92中，其内容通过全文引用的方式并入本发明中。

其它示例性的交联剂及其用于交联胶原的使用方法描述在美国专利号5,880,242和6,117,979中，以及在Zeeman等人，2000,J Biomed Mater Res.51(4):541-8，van Wachem等人，2000,J Biomed Mater Res.53(l):18-27，van Wachem等人，1999,J Biomed Mater Res.47(2):270-7，Zeeman等人，1999,J Biomed Mater Res.46(3):424-33，Zeeman等人，1999,Biomaterials20(10):921-31中，其内容通过全文引用的方式并入本发明中。

在其它实施方案中，本发明的胶原组合物是与1,4-丁二醇二环氧甘油醚交联的。在其它实施方案中，本发明的胶原组合物是与京尼平(genipin)交联的。京尼平是非毒性的、天然存在的交联剂。其可以从其母本化合物京尼平苷中获得，京尼平苷可以从栀子(Gardenia jasminoides)的果实中分离。京尼平也可以从Challenge Bioproducts Co.,Ltd.,7Alley 25,Lane 63,TzuChiang St.404 Taichung Taiwan R.O.C.,Tel 886-4-3600852处商购获得。京尼平作为交联剂的用途详细描述在美国专利申请公开号20030049301中，其通过全文引用的方式并入本发明中。

在其它实施方案中，胶原组合物可以与其它本领域技术人员已知的交联剂交联。在其它实施方案中，胶原组合物可以用本领域技术人员已知的任何酶-介导的交联技术进行交联。例如，本发明的胶原组合物可以通过转谷氨酰胺酶，根据本领域技术人员已知的方法进行交联。转谷氨酰胺酶催化胶原的谷氨酸和赖氨酸残基之间的酰胺交联键的形成。此类方法描述在例如Orban等人，2004,J.Biomedical Materials Res.68(4):756-62中，其通过全文引用并入本发明中。

本发明的胶原组合物可以与单交联剂或与交联剂的混合物交联。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物包含与戊二醛交联的碱处理的、去垢剂处理的人胎盘胶原。

6.3本发明的胶原组合物的制备工艺

另一方面，本发明提供了制备本发明的胶原组合物的方法。所述方法可用于例如制备上述本发明的胶原组合物。

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物是根据本发明描述的方法从人胎盘中制备的。从人胎盘制备胶原组合物的初始步骤详细描述在美国专利号5,428,022、5,660,692和5,008,116中，以及在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中，其通过全文引用并入本发明中。

胎盘组织，可以来自胎盘的任何部分，包括羊膜(不论是可溶的、不可溶的或是二者皆有)、绒毛膜、脐带或来自完整的胎盘。在某些实施方案中，胶原组合物是从无脐带的完整人胎盘中制备的。

胎盘囊由通过疏松结缔组织紧密连接的两层组成。已知是羊膜层和绒毛膜层。

羊膜层是两层中的最内层，与包围胎儿的羊水直接接触，二者共同形成羊膜囊。羊膜层是无血管的，并由覆盖在基膜上的单层柱状上皮排列而成，其测量厚度为30-60微米。绒毛膜是囊的外层，是高度细胞化的。脉管树来源于胎盘并沿绒毛膜层延伸至胎盘膜。绒毛膜层通过疏松结缔组织与羊膜层分隔并结合，两层测量为120-180微米。胎盘膜具有高度负载黏多醣的胶原基质，并且其被认为主要作为发育中的胎儿的保护性囊起作用。所述膜还维持了针对母体循环系统中存在的感染剂和免疫剂的屏障。胎盘膜同时具有主动和被动转运。大部分小分子和蛋白质可以自由的穿过，但是大型蛋白质例如IgM就不能穿过该基膜。

在特定的实施方案中，在新生儿分娩后尽可能快的采集本发明方法中使用的胎盘。在另一特定的实施方案中，在正常的健康婴儿剖腹产分娩后立刻采集胎盘。有利的，可以在无菌条件下采集胎盘。在某些实施方案中，在任何其它处理前，可以将胎盘自分娩时刻起储存48小时。在其它实施方案中，在任何其它处理前，胎盘自分娩时刻起储存了最多5天。

有利的，胎盘、脐带和脐带血可以从分娩室或出生室转移到另一个地点，例如实验室，用于进一步处理。可以在无菌的转移装置中转移胎盘，例如无菌袋或容器，任选的是隔热的。在某些实施方案中，胎盘储存在室温下直至进一步处理前。在其它实施方案中，冷冻胎盘直至进一步处理前，即储存在约2至8℃的温度下。在其它实施方案中，在进一步处理前，胎盘在无菌条件下储存达5天。在特定的实施方案中，如本领域技术人员已知的，在无菌条件下处理和加工胎盘。实验室可以装备HEPA过滤系统(根据超净室分级的定义，具有级别1000或更高)。在特定的实施方案中，在使用实验室来进行本发明的方法前，启动HEPA过滤系统至少1小时。

在某些实施方案中，胎盘是排尽血的，即完全除尽分娩后剩余的脐带血。在某些实施方案中，胎盘是70％放血的、80％放血的、90％放血的、95％放血的或99％放血的。

本发明涵盖了利用本领域技术人员已知的标准技术，在分娩前对预产妇进行可传播疾病的筛选，所述疾病包括但不限于HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其它已知污染胎盘组织的病毒性病原体。有利的，所述方法可用于按照联邦药品管理局制定的管理条例来筛选可传播的疾病。预产妇可以在分娩前一个月内，特别是分娩前两周内，在分娩前一周内，或在分娩时进行筛选(例如：采集用于诊断目的的血样)。仅仅采用从上述病原体的检测阴性或无反应的母亲供体中收集的组织用于生产本发明的胶原组合物。有利的，可以获得胎盘膜供体的完整的父系史、医疗史和社会史，包括例如详细的家族史。

在某些实施方案中，所述供体采用本领域技术人员已知的标准的血清学和细菌检测来筛选。可鉴别病原体的任何实验或诊断检测都包含在本发明方法的范围内，但优选的是结合了高精确度和高通量的检测。在特定的实施方案中，本发明涵盖了利用本领域技术人员已知的用于抗原和/或抗体的标准技术筛选供体。抗原和抗体的非限制性实例包括：抗体筛选(ATY)、丙氨酸氨基转移酶筛选(ALT)、肝炎核心抗体(核酸和ELISA)；乙肝表面抗原、丙肝病毒抗体、HIV-1和HIV-2、HTLV-1和HTLV-2、梅毒检测(RPR)、CMV抗体检测、和丙肝和HIV检测。使用的检测可以是本领域技术人员已知的基于核酸的检测或基于ELISA的检测。

本发明还涵盖了利用本领域技术人员已知的标准方法检测来自新生儿的脐带的血液(参见例如：Cotorruelo等人，2002,Clin.Lab.48(5 6):27181；Maine等人，2001,Expert Rev.MoI.Diagn.,1(1):1929；Nielsen等人，1987,J Clin.Microbiol.25(8):140610；其通过全文引用并入本发明中)。在一实施方案中，利用本领域技术人员已知的标准方法，对来自新生儿的脐带的血液检测其细菌病原体(包括但不限于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)和真菌。在特定的实施方案中，利用本领域技术人员已知的标准方法确定新生儿的脐带血液的血型和Rh因子。在另一实施方案中，利用本领域技术人员已知的标准方法，从新生儿的脐带血液中获得不同的CBC。在另一实施方案中，利用本领域技术人员已知的标准方法，从新生儿的脐带血液中获得好氧菌培养物。只有从具有正常限度内的CBC(例如：没有与正常水平的总异常或偏差)，血清学和细菌学检测阴性，以及感染性疾病和污染物测试阴性或无反应性的供体中收集的组织，才用于生产本发明的胶原组合物。

一旦获得人胎盘组织，就可以根据下列步骤进行处理，从而制备本发明的胶原组合物。虽然下列步骤是以时间顺序表示的，但是本领域技术人员可以认识到一些步骤的顺序可以互换而不超过本发明的范围。此外，根据本发明的理想的胶原组合物的性质，某些步骤表示为可任选的。通常认为对本领域技术人员显而易见的技术，例如蛋白质组合物的缓冲液交换、沉淀、离心、重悬、稀释和浓缩是不需要详细解释的。下文实施例中描述了示例性的制备过程。

胎盘的任何部分，或完整的胎盘，都可以在本发明的方法中使用。在某些实施方案中，从完整的胎盘制备胶原组合物。然而，在某些实施方案中，可以从胎盘的绒毛膜或羊膜部分获得胶原组合物。

在某些实施方案中，本发明涵盖了处理胎盘膜使脐带与胎盘分离，以及从绒毛膜分离羊膜。在特定的实施方案中，在切碎胎盘膜之前，从绒毛膜上分离羊膜。羊膜和绒毛膜的分离可以从胎盘膜的边缘开始进行。在另一实施方案中，利用钝性分离来分离羊膜和绒毛膜，例如用手指套。在羊膜从绒毛膜和胎盘上分离后，使用例如剪刀切断脐带柄，并与胎盘分离。在某些实施方案中，当在不撕裂组织的条件下就不能分离羊膜和绒毛膜时，本发明还涵盖了将羊膜和绒毛膜作为一片从胎盘上切离，然后再将其剥离。

羊膜、绒毛膜或完整的胎盘在用于本发明的方法之前是可以储存的。储存技术对本领域技术人员是显而易见的。示例性的储存技术描述在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中，其通过全文引用并入本发明中。

在本发明的某些方法中，胎盘组织是去细胞化的。胎盘组织可以根据本领域技术人员已知的任何技术去细胞化，例如在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中详细描述的，其通过全文引用并入本发明中。

在某些实施方案中，胎盘组织进行了渗透压冲击。渗透压冲击步骤可以产生具有有利纯度的本发明的胶原组合物。虽然并非意在被任何特定操作理论约束，据信渗透压冲击可以破坏组织中的细胞，从而有利于除去细胞、细胞组分和血液组分。根据本领域技术人员的判断，渗透压冲击可以是任何净化步骤的补充，或者可以是唯一的净化步骤。

可以采用本领域技术人员已知的任何渗透压冲击条件来进行渗透压冲击。此类条件包括，将组织培养在高渗透势、或者低渗透势、或者交替的高渗和低渗透势的溶液中。高渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何高渗透势溶液，例如包含NaCl(例如：0.2-1.0M)、KCl(例如：0.2-1.0或2.0M)、硫酸铵、单糖、二糖(例如：20％蔗糖)、亲水聚合物(例如：聚乙二醇)、甘油等中的一种或多种的溶液。在一些实施方案中，氯化钠溶液是至少0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M或2.5M NaCl。在一些实施方案中，氯化钠溶液是约0.25-5M，约0.5-4M，约0.75-3M，或约1.0-2.0M NaCl。

低渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何低渗透势溶液，例如水，如根据本领域技术人员已知的任何方法去离子化的水。在一些实施方案中，渗透压冲击溶液包含具有低于50mM NaCl的渗透势的水。

在某些实施方案中，渗透压冲击是在氯化钠溶液中之后再使用水溶液。在某些实施方案中，氯化钠溶液是至少0.5M NaCl。在某些实施方案中，氯化钠溶液是至少0.75M NaCl。在一些实施方案中，氯化钠溶液是至少1.0M NaCl。在一些实施方案中，氯化钠溶液是至少1.5M NaCl。在一些实施方案中，氯化钠溶液是至少2.0M NaCl。在一些实施方案中，在一次0.5M NaCl处理后再用水洗涤。在某些实施方案中，在两次0.5MNaCl处理后再用水洗涤。在一些实施方案中，在一次2M NaCl处理后再用水洗涤。根据本领域技术人员的判断可以重复这些顺序。

在一些实施方案中，从渗透压冲击所获得的胶原组合物可以用去垢剂来培养。虽然并非意在被任何操作理论约束，据信去垢剂可以破坏组合物中可能存在的细胞、细胞膜、亚细胞膜和细胞碎片。去垢剂可以是本领域技术人员已知的任何能够破坏细胞膜或亚细胞膜的去垢剂。在某些实施方案中，去垢剂是离子型的。例如，在某些实施方案中，去垢剂是脱氧胆酸盐或十二烷基硫酸钠。在下列有效的实例中，示例性的去垢剂处理使用脱氧胆酸。在某些实施方案中，去垢剂是两性离子型的。在某些实施方案中，去垢剂是非离子型的。例如，在某些实施方案中，去垢剂可以是去垢剂，例如或triton X去垢剂，例如triton X100。在本领域技术人员判断适合从组合物中除去不需要的组分的条件下，使胶原组合物接触去垢剂。下列有效的实例将提供示例性条件。

根据本领域技术人员的判断，可以在任何温度下进行去垢剂处理。在某些实施方案中，在约0-30℃，约5-25℃，约5-20℃，或约5-15℃下进行去垢剂处理。在某些实施方案中，在约0℃，约5℃，约10℃，约15℃，约20℃，约25℃或约30℃下进行去垢剂处理。在特定的实施方案中，在约5-15℃下进行去垢剂处理。

根据本领域技术人员的判断，去垢剂处理可以进行合适的时间。在某些实施方案中，去垢剂处理可以进行约1-24小时，约2-20小时，约5-15小时，约8-12小时，或约2-5小时。

在某些实施方案中，从去垢剂处理所获得的胶原组合物可以在碱性条件下培养。虽然并非意在被任何操作理论约束，据信碱处理可以除去可能污染组合物的病毒颗粒。在某些实施方案中，碱洗涤用于除去内毒素。碱性条件可以是本领域技术人员已知的任何碱性条件。特别是可以使用已知除去病毒颗粒的在任何pH的任何碱。用于碱处理的特定的碱包括生物相容性的碱、挥发性碱和本领域技术人员已知的、可以从胶原组合物中简单且安全的除去的碱。碱可以是浓度为例如0.2-1.0M，本领域技术人员已知的任何有机碱或无机碱。在某些实施方案中，碱选自氨水、氢氧化钾和氢氧化钠。在某些实施方案中，在氢氧化钠溶液中进行碱处理。氢氧化钠溶液可以是0.1M NaOH、0.25M NaOH、0.5M NaOH或1M NaOH。在特定的实施方案中，在0.1M或0.5M NaOH中进行碱处理。

根据本领域技术人员的判断，可以在任何温度下进行碱处理。在某些实施方案中，在约0-30℃，约5-25℃，约5-20℃，或约5-15℃下进行碱处理。在某些实施方案中，在约0℃，约5℃，约10℃，约15℃，约20℃，约25℃或约30℃下进行碱处理。在特定的实施方案中，在约5-15℃下进行碱处理。

根据本领域技术人员的判断，碱处理可以进行合适的时间。在某些实施方案中，碱处理可以进行约1-24小时，约2-20小时，约5-15小时，约8-12小时，或约2-5小时。

可以使用不同的去垢剂或NaOH洗涤步骤来产生多种不同的终ECM材料。例如，在某些实施方案中，可以用约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或约0.5M NaOH处理含有胶原的组织约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时。

在某些其它实施方案中，本发明的胶原组合物是不用碱处理生产的。当所述方法用于胎盘组织时，与使用包括碱处理的方法生产的胶原组合物相比，省略碱处理步骤将导致胶原组合物含有相对较多量的弹性蛋白、纤粘连蛋白和/或层粘连蛋白。

在某些实施方案中，胶原组合物可以被干燥。干燥有利于胶原组合物的储藏和包装。干燥还可以使细胞组分更易于从组合物中除去。此外，在任何上述步骤后，可以在后续步骤前干燥胶原组合物。可以根据对本领域技术人员显而易见的任何干燥技术进行干燥。美国专利公开号2004/0048796中描述了有效的干燥技术，其内容通过全文引用并入本发明中。示例性的干燥技术包括冷冻干燥、真空干燥、加热(例如低于约50℃)冷冻干燥，如下列有效实例中所示。

在某些实施方案中，可以在无菌条件下进行任何上述步骤。在特定的实施方案中，在无菌条件下进行碱处理和所有后续步骤。在其它实施方案中，根据本发明描述的方法制备的胶原组合物还可以根据本领域技术人员显而易见的技术来无菌化。

在某些实施方案中，本发明提供了包括上述的渗透压冲击、冷冻干燥、去垢剂处理、水洗涤、冷冻干燥、碱处理、水洗涤和冷冻干燥步骤的方法。在某些实施方案中，这些步骤是顺序进行的。在某些实施方案中，去垢剂是1％脱氧胆酸。在某些实施方案中，碱处理是0.5N NaOH处理4小时。在某些实施方案中，重复第一次水洗涤(共两次洗涤)。在某些实施方案中，第二次水洗涤重复两次(共三次水洗涤)。在某些实施方案中，去垢剂是1％脱氧胆酸，碱处理是0.5N NaOH处理4小时，重复第一次水洗涤(共两次洗涤)且第二次水洗涤重复两次(共三次水洗涤)。在某些实施方案中，此类方法可以提供包含约0.59％糖胺聚糖、约3.5％弹性蛋白、少量或无纤粘连蛋白，以及少量或无层粘连蛋白的组合物。

在某些实施方案中，本发明提供了包括上述的渗透压冲击、碱处理和水洗涤步骤的方法。在某些实施方案中，这些步骤是顺序进行的。在某些实施方案中，碱处理是0.5N NaOH处理4小时。在某些实施方案中，此类方法可以提供包含约0.28％至约0.38％糖胺聚糖、约3.2％至约4.7％弹性蛋白、少量或无纤粘连蛋白，以及少量或无层粘连蛋白的组合物。

在某些实施方案中，本发明提供了包括上述的渗透压冲击、去垢剂处理和水洗涤步骤的方法。在某些实施方案中，这些步骤是顺序进行的。在某些实施方案中，去垢剂是1％脱氧胆酸。在某些实施方案中，此类方法可以提供包含约0.4％糖胺聚糖、约12％弹性蛋白、约0.6％纤粘连蛋白，以及约0.16％层粘连蛋白的组合物。

6.3.1任选的其它处理

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物可用作无端肽(atelopeptide)胶原组合物的来源。无端肽胶原组合物可用于本领域技术人员显而易见的无端肽胶原的任何用途。

在此类实施方案中，胶原组合物可与能够从胶原中部分或完全除去端肽的酶接触。所述酶可以是本领域技术人员已知的、能够从胶原中除去端肽的任何蛋白水解酶。在某些实施方案中，所述酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。通常，所述酶在本领域技术人员已知的、适合除去端肽的条件下接触胶原组合物。

用除去端肽的酶处理胶原组合物的方法详细描述在美国专利号4,511,653、4,582,640、5,436,135和6,548,077中，其内容通过全文引用并入本发明中。通常，所述酶在本领域技术人员已知的、适合除去端肽的条件下接触胶原组合物。此类条件包括例如，在合适的pH、合适的酶浓度、在合适的溶液体积、合适的温度下，使酶与胶原组合物接触合适的时间。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物可以在低pH条件下与酶接触。在某些实施方案中，胶原组合物在pH约1-3或约2-3下接触胃蛋白酶。

在某些实施方案中，在升高的温度下使酶接触胶原组合物。虽然并非意在被任何操作理论约束，据信升高的温度可以提高最终胶原组合物中的I型胶原的产量。在某些实施方案中，胶原组合物在约在约15-40℃，约20-35℃，约25-30℃，约20-30℃或约23-27℃下与胃蛋白酶接触。在特定的实施方案中，胶原组合物在约23-27℃下与胃蛋白酶接触一段足以除去端肽的时间。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物与酶接触一段足以除去端肽的时间。在某些实施方案中，胶原组合物与胃蛋白酶接触至少5、10、15、20、25或30小时。在某些实施方案中，其与胃蛋白酶接触至少约5-30小时、约10-25小时、或约20-25小时。在某些实施方案中，其与胃蛋白酶接触约8、16、24或32小时。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物与适合除去端肽的量的酶接触。在某些实施方案中，约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g胃蛋白酶/kg冷冻胎盘与胶原组合物接触。在其它实施方案中，约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g胃蛋白酶/胎盘与胶原组合物接触。在某些实施方案中，胶原组合物与约0.1-10.0g/L、约0.5-5g/L、约1-2.5g/L或约0.5-1.5g/L胃蛋白酶接触。在某些实施方案中，胶原组合物与约0.1g/L、约0.2g/L、约0.5g/L、约1.0g/L、约2.0g/L、5g/L或10g/L胃蛋白酶接触。在特定的实施方案中，胶原组合物与约0.5-1.0g/L胃蛋白酶在pH约2-3的乙酸溶液中，在约23℃-27℃下接触约16-24小时。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物以合适的溶液体积:胎盘比与酶接触以除去端肽。观察到与胎盘的高体积比可以使胃蛋白酶的效果最大化。在某些实施方案中，每个胎盘使用约1、2、4或8倍体积的乙酸溶液。在特定的实施方案中，每个胎盘使用约2倍体积的乙酸溶液。

如果需要，本发明的胶原组合物还可以通过纤丝化(fibrillation)进一步处理。可以通过本领域技术人员已知的纤丝化胶原的任何技术来进行纤丝化。胶原组合物的纤丝化详细地描述在美国专利号4,511,653、4,582,640和5,436,135中，其内容通过全文引用并入本发明中。如果需要，在纤丝化前，可以根据标准技术浓缩胶原组合物。

当需要时，本发明的胶原组合物可以是交联的。在某些实施方案中，在交联前纤丝化胶原组合物。可以使用本领域技术人员已知的任何交联剂交联，例如上述章节中讨论的交联剂。在某些实施方案中，交联剂可以是戊二醛，可以根据本领域技术人员已知的戊二醛交联胶原的方法进行交联。在其它实施方案中，交联剂可以是1,4-丁二醇二环氧甘油醚或京尼平。在特定的实施方案中，交联剂是1,4-丁二醇二环氧甘油醚。

在某些实施方案中，为了例如改善稳定性，交联剂和胶原之间的共价键可被还原。可以通过将本发明的胶原组合物与本领域技术人员已知的任何还原剂接触，来实施还原作用。在某些实施方案中，还原剂是硼氢化钠、亚硫酸氢钠、β-巯基乙醇、巯基乙酸、巯乙胺、苄硫醇、甲苯硫酚、二硫苏糖醇或磷化氢例如三丁基氧化膦。硼氢化钠是有效的实例。在某些实施方案中，在用还原剂还原前，胶原是交联的。胶原组合物的还原作用和交联的胶原组合物详细地描述在美国专利号4,185,011、4,597,762、5,412,076和5,763,579中，其内容通过全文引用并入本发明中。

在某些实施方案中，胶原组合物还可以根据本领域技术人员已知的方法，通过机械剪切进一步加工。示例性的剪切技术描述在美国专利号4,642,117中，其内容通过全文引用并入本发明中。在某些实施方案中，用本领域技术人员已知的组织匀浆器剪切胶原组合物。

在某些实施方案中，可以采用步骤限制本发明的胶原组合物中的蛋白酶活性。添加剂例如金属离子螯合剂，如1,10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)创造了不适宜多种蛋白水解酶的环境。提供蛋白酶例如胶原酶的亚优化条件可以帮助保护胶原组合物免受降解。通过配制组合物以消除或限制溶液中可用的钙离子和锌离子的量，可以实现蛋白酶的亚优化条件。多种蛋白酶在存在钙离子和锌离子的条件下是活化的，而在缺少钙离子和锌离子的环境中则丧失其大部分活性。有利的，胶原组合物在选定的pH条件、钙离子和锌离子的可利用性降低、存在金属离子螯合剂以及使用胶原酶特异性蛋白水解抑制剂的条件下制备。例如，胶原组合物可以包括缓冲的水溶液，pH5.5至8，或pH7至8，不含钙离子和锌离子，并包括金属离子螯合剂如EDTA。此外，在处理胶原组合物的过程中，也可以控制温度和时间参数来限制蛋白酶活性。

6.4胶原组合物的表征

6.4.1生物化学特征

本领域已知的和本发明中示例的生物化学检测，可用于确定本发明的胶原组合物的生物化学组成。本发明涵盖了用于确定样品的总蛋白含量的生物化学检测，例如吸光值检测和比色检测。吸光值检测包括但不限于以下检测，所述检测是测量280nm的吸光值(参见例如：Layne,E,Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins,Methods in Enzymology 3:447-455,(1957)；Stoscheck,CM,Quantitation ofProtein,Methods in Enzymology 182:50-69,(1990)；其通过全文引用并入本发明中)；205nm的吸光值；和基于样品的消光系数的检测(参见例如：Scopes,RK,Analytical Biochemistry 59:277,(1974)；Stoscheck,CM.Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182:50-69,(1990)；其通过全文引用并入本发明中)。本发明涵盖了确定本发明的胶原组合物中特定蛋白质总含量的方法，包括但不限于胶原(例如：I型、III型、IV型胶原)、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤粘连蛋白和糖胺聚糖。

比色检测包括但不限于修饰的Lowry检测、双缩脲检测、Bradford检测、Bicinchoninic Acid(Smith)检测(参见例如：Stoscheck,CM,Quantitationof Protein,Methods in Enzymology 182:50-69(1990))。

在特定的实施方案中，利用Bradford染料结合检测(Bradford,M.,Analytical Biochemistry,72,248(1976)；其通过全文引用并入本发明中)来测量本发明的胶原组合物的总蛋白含量。本发明方法中使用的示例性Bradford检测可以包含以下：可以利用通过BIO-RAD,Hercules,CA,USA可获得的Bradford染料结合检测来进行的检测。蛋白质检测是基于染料考马斯亮蓝R-250对应不同蛋白质浓度的颜色改变。所述检测涉及通过(在595纳米)测量一系列已知浓度的人胶原标准来建立标准校准曲线。通过参照标准曲线，确定测试样本，例如：羊膜样本中的胶原浓度。以允许测量0.2-1.4mg/mL范围内的胶原浓度的标准形式进行检测，并且作为微测定，测量蛋白质浓度高达25μg。对于标准检测，将溶解在100mM柠檬酸(pH2.4)中的胶原，以0.1-1mg/mL浓度，总体积为0.1mL等分到1.5mL微离心管中。每一管添加1mL的考马斯蓝染料。涡旋样品并允许置于室温10分钟。测量595纳米(nm)的吸光值。对于微测定，将溶解在100mM柠檬酸(pH2.4)中的胶原，以总体积为0.1mL(2.5-30μg/mL)等分到96孔板的孔中。对于每个孔，加入10μL的染色试剂。在读板器测量595纳米(nm)的吸光值前，涡旋样品并在室温培养10分钟。对于本发明的胶原组合物，可以一式三份的检查测试样品。通过参照标准曲线来确定蛋白质浓度。以膜总干重的百分比计算蛋白质浓度。在约10％的误差界限内，每个膜的蛋白质含量是膜总干重的实质上95％或更多。水含量可以低于或在实验误差内(约10％)。

可以利用本领域技术人员已知的和本发明中示例的方法，来表征本发明的胶原组合物的总胶原含量的测量。在特定的实施方案中，本发明的胶原组合物的胶原含量才用由Biocolor Ltd,UK生产的定量染料检测试剂盒(SIRCOL)来测量。检测利用Sirius Red(或Direct Red 80)作为特异的胶原结合染料。结合胶原的染料在UV-Vis分光光度计中表现出540nm吸光值的浓度依赖性增加。所述检测涉及通过测量一系列已知浓度的牛胶原标准的吸光值，发展标准校正曲线。通过参照标准曲线，确定测试样品(例如羊膜样品)中的胶原浓度。在示例性检测中，胶原(1mg/mL)以5-100μg/100μL的浓度等分至1.5mL微离心管中。用水调节样品体积至100μL。在室温下向每个样品中添加1mL SIRCOL染料试剂。盖上样品管，在室温下机械振荡培养30分钟。然后，将样品在12,000×g离心15分钟，并用移液器除净液体。将每个管底的淡红色沉淀溶解在1mL的0.5M NaOH(氢氧化钠)中。使用Beckman DU-7400UV-VIS分光光度计测量样品在540nm的UV吸光值。用每个样品中胶原浓度对540nm的吸光值(OD)绘制标准校准曲线。为了确定实验误差，重复检测单次低浓度的胶原标准(10μg/100μL)。使用相同的规程检测膜样品，添加样品的总体积至100μL。

在其它实施方案中，使用本领域已知的和本发明示例的标准方法，例如可以使用ELISA检测来确定本发明的胶原组合物的胶原类型。确定本发明的胶原组合物中的胶原类型，例如：I、III和IV型胶原的示例性检测，包括使用由例如Anthrogen-CIA Collagen-I from Chondrex,Inc.,Redmond,WA,USA的试剂盒提供的夹心ELISA检测。对于III型和IV型研究，可以从Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA获得一抗(捕获抗体)和二抗(检测抗体)以及胶原标准。检测抗体是生物素标记的人I、III或IV型胶原，其与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶结合。与显色底物、尿素和H₂O₂的酶促反应产生黄色，其可以通过UV-Vis分光光度计在490nm检测。为了定量胶原类型的量，使用一系列已知浓度的人胶原标准样品建立标准校准曲线。通过参照标准曲线确定羊膜的测试样品中胶原的浓度。按照ELISA试剂盒的说明，进行检测操作。为了建立标准校准曲线，通过添加100μL试剂盒提供的100×-稀释的捕获抗体，用捕获抗体(抗人I型胶原抗体，未偶联的)来包被96孔板中的10-12个孔。在培养过夜后，用洗涤缓冲液洗涤孔三次，以除去未结合的抗体。然后，将人I型胶原按0-5μg/mL递增的浓度，以100μL的体积添加到孔中。在室温培养2小时后，用洗涤缓冲液洗涤孔三次，以除去未结合的胶原。然后，向孔内的抗体-胶原复合体添加100μL体积的生物素化I型胶原抗体，使其在室温下结合2小时。用洗涤缓冲液洗涤3次，洗去未结合的抗体。然后，通过添加试剂盒提供的200×稀释的酶样，使检测酶链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶与抗体-胶原-抗体复合物结合，允许在室温下培养1小时。重复洗涤96孔板(6次)，除去任何未结合的酶。向每个孔加入100μL体积的生色底物+尿素/H₂O₂。使反应在室温下进行30分钟。通过添加50μL的2.5N硫酸终止反应。测量490nm的吸光值。

在其它实施方案中，本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的总弹性蛋白含量的检测。测量本发明的胶原组合物的弹性蛋白含量的示例性检测可以包括由Biocolor ltd,UK生产的定量染料检测试剂盒(FASTIN)。该检测使用5,10,15,20-四苯基-21,23-卟吩(TPPS)作为特异性弹性蛋白结合染料(参见例如：Winkleman,J.(1962),Cancer Research,22,589-596；其通过全文引用并入本发明中)。在UV-Vis分光光度计中，与弹性蛋白结合的染料表现出513nm处吸光值的浓度依赖性增加。所述检测涉及通过测量一系列已知浓度的牛弹性蛋白标准的吸光值，来建立标准校正曲线。通过参照标准曲线，确定测试样品，例如羊膜样品中的弹性蛋白浓度。弹性蛋白(1mg/mL)以5-100μg/100μL的浓度被等分到1.5mL微离心管中。用水调节样品体积至100μL。在4℃下，向每个样品中添加1mL弹性蛋白沉淀试剂(三氯乙酸+精氨酸)，并在相同温度下储存过夜。在过夜沉淀步骤后，将样品在12,000×g离心15分钟，并用移液器除净液体。向每个样品中添加1mL的FASTIN染料试剂(TPPS)和100μL的90％饱和硫酸铵。盖上样品管，并使其在室温下培养，且机械振荡1小时。硫酸铵用作沉淀弹性蛋白-染料复合物。在1小时的混合步骤后，样品在12,000×g离心15分钟，并用移液器除净液体。将每个管底的棕色沉淀溶解在1mL的FASTIN解离试剂中，所述解离试剂是盐酸胍在I-丙醇中的溶液。使用Beckman DU-7400UV-VIS分光光度计测量样品在513nm的UV吸光值。用每个样品中弹性蛋白浓度对513nm的吸光值(OD)绘制标准校准曲线。为了确定检测中的实验误差，重复检测(n＝10)单次低浓度的弹性蛋白标准(10μg/100μL)。使用相同的方法来检测膜样品，所述样品被添加至总体积100μL。每个样品检测一式三份。

在其它实施方案中，本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的总糖胺聚糖(GAG)含量的检测。本发明的胶原组合物中存在的GAG含量，可以使用由Biocolor ltd,UK生产的定量染料检测试剂盒(BLYSCAN)来检测。该检测使用1,9-二甲基-亚甲基蓝作为特异性GAG结合染料。在UV-Vis分光光度计中，与GAG结合的染料表现出656nm处吸光值的浓度依赖性增加。所述检测涉及通过测量一系列已知浓度的牛GAG标准的吸光值，来建立标准校正曲线。通过参照标准曲线，确定羊膜的测试样品中的GAG浓度。将牛GAG(0.1mg/mL)以0.5-5μg/100μL的浓度等分到1.5mL微离心管中。用水调节样品体积至100μL。在室温下，向每个样品中添加1mL 1,9-二甲基-亚甲基蓝染料试剂。盖上样品管，使其在室温下培养，并机械振荡30分钟。然后，将样品在12,000×g离心15分钟，并用移液器除净液体。将每个管底的淡红色沉淀溶解在1mL的染料解离试剂中。使用Beckman DU-7400UV-VIS分光光度计测量样品在656nm的UV吸光值。用每个样品中GAG浓度对540nm的吸光值(OD)绘制标准校准曲线。为了确定检测中的实验误差，重复检测(n＝8)单次低浓度的GAG标准(1μg/100μL)。使用相同的方法来检测膜样品，将样品添加至总体积至100μL。每个样品检测一式三份。

在其它实施方案中，本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的总层粘连蛋白含量的检测。确定本发明的胶原组合物的总层粘连蛋白含量的示例性检测可以包括以下：可以使用由Takara Bio Inc.,Shiga,Japan提供的试剂盒(Cat#MKIO7)进行夹心ELISA检测。该试剂盒包括用一抗(捕获抗体)预包被的96孔板，所述一抗是抗人层粘连蛋白的小鼠单克隆抗体。试剂盒提供二抗(检测抗体)和人层粘连蛋白标准。检测抗体是过氧化物酶偶联的人层粘连蛋白抗体。与显色底物四甲基联苯胺和H₂O₂的酶促反应产生蓝色，其可以通过UV-Vis分光光度计在450nm检测。为了定量层粘连蛋白的量，使用一系列已知浓度的人层粘连蛋白标准样品(试剂盒提供)来建立标准校准曲线。参照标准曲线来确定羊膜的测试样品中层粘连蛋白的浓度。按照ELISA试剂盒的说明，进行检测操作。为了建立标准校准曲线，将人层粘连蛋白标准按5ng/mL至160ng/mL递增的浓度，以100μL最终体积添加到试剂盒提供的抗体预包被的96孔板的单个孔中。在室温培养1小时后，用洗涤缓冲液(含有0.05％的PBS)洗涤孔三次，以除去未结合的层粘连蛋白。然后，向孔内的抗体-层粘连蛋白复合体中添加100μL体积的过氧化物酶-偶联的层粘连蛋白抗体，使其在室温下结合1小时。重复洗涤(4×)96孔板，以除去任何未结合的酶/抗体偶联物。向每个孔中添加100μL体积的显色底物+H₂O₂。使反应在室温下进行30分钟。通过添加100μL的2.5N硫酸终止反应。测量450nm的吸光值。可溶性膜的样品以1000ng/mL的浓度进行测试。每个膜样品一式三份进行测试。如下文所示，层粘连蛋白浓度显示为总膜重的浓度。

在其它实施方案中，本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的总纤粘连蛋白含量的检测。确定本发明的胶原组合物的总纤粘连蛋白含量的示例性检测可以包括以下：可以使用由Takara Bio Inc.,Shiga,Japan提供的试剂盒(Cat#MK115)进行夹心ELISA检测。该试剂盒包括用一抗(捕获抗体)预包被的96孔板，所述一抗是抗人纤粘连蛋白的小鼠单克隆抗体。试剂盒提供二抗(检测抗体)和人纤粘连蛋白标准。检测抗体是与辣根过氧化物酶偶联的人纤粘连蛋白抗体。与显色底物四甲基联苯胺和H₂O₂的酶促反应产生蓝色，其可以通过UV-Vis分光光度计在450nm检测。为了定量纤粘连蛋白的量，使用一系列已知浓度的人纤粘连蛋白标准样品(试剂盒提供)建立标准校准曲线。通过参照标准曲线确定测试样品中纤粘连蛋白的浓度。按照ELISA试剂盒的说明，进行检测操作。为了建立标准校准曲线，将人纤粘连蛋白标准按12.5ng/mL至400ng/mL递增的浓度，以100μL的终体积添加到试剂盒提供的抗体预包被的96孔板的单个孔中。在室温培养1小时后，用洗涤缓冲液(含有0.05％的PBS)洗涤孔三次，以除去未结合的纤粘连蛋白。然后，向孔内的抗体-纤粘连蛋白复合体中添加100μL体积的过氧化物酶-偶联的纤粘连蛋白抗体，使其在室温下结合1小时。重复洗涤(4×)96孔板，以除去任何未结合的酶/抗体偶联物。向每个孔添加100μL体积的显色底物+H₂O₂。使反应在室温下进行30分钟。通过添加100μL的2.5N硫酸终止反应。测量450nm的吸光值。可溶性膜的样品在1000μg/mL的浓度下进行测试。每个膜样品测试一式三份。

6.4.2生物相容性研究

本发明的胶原组合物是生物来源的，含有大量胶原。然而，与来自动物来源(牛和猪)的胶原不同，人胶原是非免疫原性的。由于非免疫原性的人组织本质上与其它人组织是生物相容的，不需要实施某些标准的生物相容性检测(例如：皮肤刺激和过敏、急性系统性毒性)。本发明涵盖了确定本发明的胶原组合物的生物相容性的检测。本发明中使用的生物相容性指生物学相容的性质，其在活组织中不产生毒性、损伤性或免疫性应答或排斥。当在体内使用人工材料时，对未知材料的机体应答是主要关注，因此，材料的生物相容性是此类材料中重要的设计考虑。本发明涵盖的生物相容性检测包括但不限于细胞毒性检测、兔眼刺激实验、溶血检测和致热原检测。本发明的生物相容性检测是基于细胞的或基于无细胞的检测。

在另一特定的实施方案中，利用ISO MEM Elution检测(实施例6.4.2.2)来确定本发明的胶原组合物的细胞毒性。该研究的目的是评估胶原组合物在培养的小鼠成纤维细胞中引发细胞毒性应答的能力。在示例性检测中，使用添加了5％胎牛血清(FBS)的Eagle最小必需培养基(E-MEM)来提取测试样品。所述培养基还添加了一种或多种下列物质：L-谷氨酸、HEPES、庆大霉素、青霉素、万古霉素和两性霉素B(二性霉素B)。在空气中含5±1％二氧化碳的湿润大气中，在37±1℃下，L-929细胞(小鼠成纤维细胞)的培养物在一次性组织培养器皿中，作为单层生长和使用。使用比例等同于120cm²的样品和添加5％FBS的20ml-E-MEM来完整提取测试样品。在37±1℃和5±1％二氧化碳的条件下，在添加5％FBS的E-MEM中提取样品24-25小时。在提取期后，从测试培养孔中除去维持培养基，并用1ml的测试培养基/提取物、对照培养基/提取物和氯化钙加标的阳性对照培养基替代。阳性对照、中间对照、阴性对照与测试样品平行走样。测试培养基/提取物、对照培养基/提取物、和氯化钙加标的阳性对照培养基一式三份的放置，并在37±1℃和空气中含5±1％二氧化碳的湿润大气中培养72±4小时。在24、48和72±4小时的培养期，通过显微镜观察评估培养物的细胞毒性效应。评估细胞毒性的标准包括细胞形态学的改变，例如颗粒化、皱缩或变圆，由于裂解或脱离从单细胞层丧失活细胞。有效的测试需要阴性对照培养物在整个测试过程中维持健康的正常外观。毒性程度按如下评分：

0无毒：离散的胞质颗粒；无细胞裂解。

1轻微的：不超过20％的细胞变圆、松散的附着，没有胞质颗粒；偶尔存在裂解的细胞。

2温和的：不超过50％的细胞变圆，缺少胞质颗粒；没有大量的细胞裂解以及细胞间的空白区域。

3中度：不超过70％的细胞层含有变圆的细胞和/或出现裂解。

4严重的：细胞层几乎完全破坏。

根据USP，评分为“0”、“1”或“2”的测试品被认为是无毒的。评分为“3”或“4”的测试品被认为是有毒的。对于有效的测试，阳性对照样品必须具有“3”或“4”的评分，阴性对照样品必须具有“0”的评分。

已知兔的眼表面比人皮肤更敏感，因此兔眼刺激实验被用于评估本发明的胶原组合物的生物相容性。在示例性检测中，筛选样品的初级眼刺激作用(primary ocular irritation)。用0.05％脱氧胆酸一氢化钠盐的水性溶液(D-Cell)来清洁羊膜。根据联邦有害物质法令(FHSA)管理条例，16 CFR1500的指导，进行测试。在示例性检测中，使用辅助光源通过肉眼检查，来判断兔子对照眼为临床正常。为了检测任何已经存在的角膜损伤，用荧光染色处理眼，用0.9％ USP生理盐溶液(PSS)冲洗，并在暗室中用紫外光观察。按照标准技术，将样品徐徐滴入每只兔子的一只眼睛的较低结膜囊中。每只兔子的另一只眼睛不作处理，作为比较对照。在处理后，将动物放回笼中。在给药后24、48和72小时，用辅助光源和合适的放大镜检查每只兔子的测试眼，与未处理的对照眼相比，并对眼刺激进行评级。为了检测或验证角膜损伤，在24小时时，用荧光染色处理测试眼，用PSS漂洗，并在黑暗条件下用紫外灯检查。按照FHSA-修正的Draize评分规则对反应评分。三只动物中的一只表现出明显的阳性反应为临界发现。三只动物中的两只表现出明显的阳性反应为显著的阳性应答，并且认为测试品是刺激性的。

本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的溶血性质(参见实施例6.4.2.4)。溶血描述了将接触血液的测试样品的溶血性质。由于它测量了与材料和装置接触的红血细胞膜的易碎性，因此其被认为是要进行的特别重要的筛选检测。在示例性检测中，该过程涉及将测试材料暴露在血细胞悬浮液中，然后确定血红蛋白释放的量。测试在静态条件下进行，并且测试样品与人血液直接接触。血红细胞释放的血红蛋白的量采用荧光分光光度计在540nm下(在转变为氰化正铁血红蛋白后)与阴性对照和阳性对照同时测量。样品和对照的溶血指数按如下计算：

溶血指数＝释放的血红蛋白(mg/mL)×100

存在的血红蛋白(mg/mL)

其中：释放的血红蛋白(mg/mL)＝(常数+X系数)×光学密度×16。存在的血红蛋白(mg/mL)＝稀释的血液10±1mg/mL。

本发明涵盖了利用本领域已知的和本发明示例的方法，确定本发明的胶原组合物的致热原性(参见实施例6.4.2.5)。在一实施方案中，利用例如，鲎变形细胞溶解物(LAL)测试，通过测量本发明的胶原组合物中细菌内毒素的存在，来确定本发明的胶原组合物的致热原性。该测试为用于细菌内毒素检测和定量的体外检测。在示例性的测试中，98个胶原组合物样品(n＝1/批)，每个的大小是1×2cm，单独地检测提取物。所述提取通过在37-40℃下，在30mL提取液中洗涤每个样品40至60分钟，并伴随定轨摇床的间歇性搅拌来进行。如pH试纸所验证的，每个样品提取物的pH为介于6和8之间。通过动态比浊比色测试，用每mL 0.05内毒素单位(EU)的测试灵敏度，来测量致热原水平。将检测的内毒素值(EU/mL)乘以30mL(每装置的提取体积)和24(刺激6×8cm大小的装置)，来计算每个样品的总内毒素。

6.4.3微生物学研究

本发明涵盖了本领域已知的和本发明示例的，确定本发明的胶原组合物中微生物生物体的存在的方法，微生物生物体包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、草绿色链球菌(Staphylococcus viridans)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。此类方法可用于胶原组合物制备的任何步骤。在加工过程中，用于微生物学研究的示例性方法包括以下步骤：检测微生物“加标”的未加工的羊膜样品以及在加工过程中使用的设备。将样品浸泡在有以下8种微生物加标的生理盐溶液中5分钟，从而人为的污染样品：

1.大肠杆菌            5.白色念珠菌

2.肺炎克雷伯氏菌      6.普通变形杆菌

3.金黄色酿脓葡萄球菌  7.草绿色链球菌

4.粪肠球菌            8.绿脓假单胞菌

有利的，本发明的去细胞化和漂洗方法可以降低本发明的胶原组合物中的微生物数量。

本发明涵盖了本领域已知的和本发明示例的，用于确定本发明的胶原组合物的生物负载的方法。如本发明中使用的，“生物负载”是在经历工业灭菌过程之前，在给定量的材料上发现的污染生物体的测量值。在示例性的方法中，确定了可以实现具有无菌保证水平10^-6的最小电子束照射量。利用溶液，通过浸泡和人工振荡来抽提膜。平板培养法是利用大豆粉酪蛋白消化物琼脂的膜过滤。对于好氧条件，平板在30-35℃培养4天，然后计数。对于真菌，平板在20-25℃培养4天，然后计数。对于孢子形成菌，将提取部分热休克、过滤，并如同好氧菌一样涂板。平板在30-35℃培养4天，然后计数厌氧菌。平板在厌氧条件下在30-35℃培养4天，然后计数。使用的微生物是产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。

在特定的实施方案中，本发明的胶原组合物具有少于2克隆形成单位(cfu)的好氧性生物和真菌，少于1或0cfu的好氧性生物和真菌。在其它实施方案中，本发明的胶原组合物具有少于5.1克隆形成单位(cfu)，少于2，或少于1cfu的厌氧性生物和孢子。

在特定的实施方案中，根据本发明示例的和本领域技术人员已知的方法确定，本发明的胶原组合物不是抑制细菌的或抑制真菌的(参见实施例6.4.3.2)。如本发明中使用的，抑制细菌的指抑制细菌生长或繁殖，但是不杀死细菌的试剂。如本发明中使用的，抑制真菌的指由于非-杀真菌性的化学或物理物质的存在，抑制真菌的生长的试剂。

6.4.4胶原组合物的储存和处理

本发明涵盖了在室温下(例如25℃)储存本发明的胶原组合物。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物可以储存在至少0℃、至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃或至少40℃温度下。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物是不冷藏的。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物可以冷藏在约2至8℃的温度下。在其它实施方案中，本发明的胶原组合物可以在上述明确的任何温度下储存一段延长的时间。在特定的实施方案中，本发明的胶原组合物储存在无菌和非氧化的条件下。在某些实施方案中，根据本发明的方法生产的胶原组合物可以在任何特定的温度下储存12个月或更久，而不产生生物化学或结构完整性的改变(例如：不降解)，不具有胶原组合物的任何生物化学或生物物理学性质的改变。在某些实施方案中，根据本发明的方法生产的胶原组合物可以储存若干年，而不具有生物化学或结构完整性的改变(例如：不降解)，不具有胶原组合物的任何生物化学或生物物理学性质的改变。在某些实施方案中，预期根据本发明的方法制备的胶原组合物可以无限存放。胶原组合物可以储存在适合长期储存的任何容器中。有利的，本发明的胶原组合物可以储存在无菌的双层易撕包装中。

6.4.5灭菌

本发明的胶原组合物可以根据本领域技术人员已知的用于此类组合物灭菌的技术来灭菌。

在某些实施方案中，胶原组合物通过滤器过滤，允许内毒素通过而留下胶原组合物。可以使用本领域技术人员已知用于内毒素过滤的任何尺寸，例如30kDa的滤器。在某些实施方案中，在允许内毒素通过滤器，同时保留胶原组合物的条件下，将胶原组合物与滤器接触。所述条件可以是本领域技术人员已知的任何用于过滤的条件，例如，离心或泵压。滤器的尺寸应该是在允许一种或多种病毒颗粒通过滤器的同时保留胶原。在某些实施方案中，滤器可以在5kDa和100kDa之间。在特定的实施方案中，滤器是约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、或约100kDa。滤器可以是本领域技术人员已知的、适合胶原组合物的任何材料，例如纤维素、聚苯醚砜和其它本领域技术人员显而易见的材料。根据本领域技术人员的需要，过滤可以重复尽可能多次。可以根据标准技术检测内毒素来监控清除率。

在某些实施方案中，可以过滤胶原组合物，产生不含病毒颗粒或病毒颗粒减少的胶原组合物。有利的，在这些本发明的实施方案中，滤器在允许病毒颗粒通过的同时，保留了胶原组合物。可以使用本领域技术人员已知的任何用于清除病毒的滤器。例如，可以使用1000kDa滤器来清除或降低细小病毒、甲肝病毒和HIV。可以使用750kDa滤器来清除或降低细小病毒和甲肝病毒。可以使用500kDa滤器来清除或降低细小病毒。

因此，本发明提供了生产不含病毒颗粒或病毒颗粒减少的胶原组合物的方法，包括将胶原组合物与滤器接触的步骤，所述滤器的尺寸允许在一种或多种病毒颗粒通过滤器的同时，保留胶原组合物。在某些实施方案中，胶原组合物与滤器的接触条件是，允许一种或多种病毒颗粒通过滤器的同时，保留胶原组合物。所述条件可以是本领域技术人员已知的用于过滤的任何条件，例如离心或泵压。滤器的尺寸应该是在允许一种或多种病毒颗粒通过滤器的同时保留胶原。在某些实施方案中，滤器是介于500kDa和1000kDa之间。在特定的实施方案中，所述滤器是约500kDa，约750kDa和约1000kDa。滤器可以是本领域技术人员已知的、与胶原组合物相容的任何材料，例如纤维素、聚苯醚砜或其它本领域技术人员显而易见的材料。根据本领域技术人员的需要，可以多次重复过滤。可以根据标准技术来检测病毒颗粒从而监控过滤。

本发明的胶原组合物的灭菌还可以利用本领域技术人员已知的方法，例如：Gorham,D.Byrom(编著),1991,Biomaterials,Stockton Press,NewYork,55-122进行电子束照射来进行。任何足以杀死至少99.9％的细菌或其它潜在污染生物体的照射剂量都涵盖在本发明的范围内。在特定的实施方案中，使用至少18-25kGy的剂量来实现本发明的胶原组合物的最终灭菌。

6.5胶原组合物的制剂

在某些实施方案中，本发明提供了胶原组合物。胶原可以是本发明的任何胶原，例如由本发明中的方法之一制备的胶原。有利的，胶原可以在水或磷酸缓冲盐溶液中配制。在特定的实施方案中，在磷酸缓冲盐溶液中配制胶原。

胶原可以是本领域技术人员有效的任何浓度。在某些实施方案中，本发明的制剂包含0.1-100mg/ml、1-100mg/ml、1-75mg/ml、1-50mg/ml、10-40mg/ml、或20-40mg/ml胶原。在某些实施方案中，本发明的制剂包含约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、或50mg/ml的胶原。在特定的实施方案中，本发明提供了包含约35mg/ml胶原的制剂。

在本发明的某些实施方案中，胶原组合物可以干燥并成型为本领域技术人员有用的形状。所述形状可以是任何有用的形状，包括片状、管状、塞状、球状等。在某些实施方案中，胶原组合物成型为适合伤口或损伤的位点。成型的胶原组合物可用于对本领域技术人员显而易见的任何目的。下文提供了利用成型的胶原组合物的示例性方法。

由于从胎盘中提取，本发明的组合物通常是白色糊状物(paste)。该糊状物可以根据本领域已知的、用于此类材料成型的任何方法来成型。例如，所述组合物可以被压入模具中，或包围在模具外成型，来生产特定的形状，并加热干燥、真空干燥或冷冻干燥。还可以利用例如真空，使组合物伸展变薄并在例如干胶器上干燥。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以与药学或化妆品上可接受的载体结合，并作为组合物在体外或在体内施用。施用的形式包括但不限于：注射、溶液、膏剂、凝胶、植入物、泵、油膏、乳液、悬浮液、微球、颗粒、微颗粒、纳米颗粒、脂质体、糊剂、贴片、片剂、透皮给药装置、喷雾、气雾剂，或本领域常规技术人员熟悉的其它方式。此类药学或化妆品上可接受的载体是本领域普通技术人员普遍已知的。本发明的药物制剂可以使用本领域已知的方法，利用普遍已知并可方便获得的成分来制备。例如，可以用常规赋形剂、稀释剂或载体配制组合物，制成片剂、胶囊、悬浮液、粉末等。适合此类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括以下：填充剂和膨胀剂(例如：淀粉、糖、甘露糖醇和含硅衍生物)、结合剂(例如：羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、增湿剂(例如：甘油)、崩解剂(例如：碳酸钙和碳酸氢钠)、用于延迟溶解的试剂(例如：石蜡)、重吸收加速剂(例如：季铵化合物)、表面活性剂(例如：鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯)、吸收载体(例如：高岭土和斑脱土)、乳化剂、防腐剂、增甜剂、稳定剂、着色剂、芳香剂、增香剂、润滑剂(例如：滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁)、固体聚乙基乙二醇、及其混合物。

本发明中使用的术语“药学或化妆品上可接受的载体”意指不受任何限制的，任何液体、固体或半固体，包括但不限于：水或盐溶液、凝胶、膏剂、軟膏、溶剂、稀释剂、液态软膏基质、油膏、糊剂、植入物、脂质体、胶粒、巨胶粒等，适合在与活动物或人组织的接触中使用，而不导致不良的生理学或化妆品应答，也不与组合物的其它组分以有害方式相互作用。可以使用本领域技术人员已知的其它药学或化妆品上可接受的载体，制备用于递送本发明的分子的组合物。

可以构建制剂，使其仅仅或优选的在特定位置释放活性成分，可能的话持续一段时间。此类组合还提供了控制释放动力学的机制。包衣、外壳或保护性基质可以从例如多聚物或蜡来制造。

本发明的组合物或者包含此类组合物和其它材料(例如特别适合用于多种形式的本发明的载体)的制剂的体内给药方法包括但不限于：口服(例如：口腔或舌下给药)、肛门施用、直肠施用、作为栓剂施用、局部使用、气雾剂使用、吸入、腹膜内施用、静脉内施用、透皮施用、皮内施用、皮下施用、肌肉内施用、子宫内施用、阴道施用、向体腔施用、在肿瘤或内部损伤的位置手术施用、向器官的内腔或实质组织施用，以及胃肠外的施用。在上述不同给药类型中有效的技术包括但不限于：局部给药、摄入、手术给药、注射、喷雾、透皮递送装置、渗透泵、直接作用于理想位点的电沉积，或其它本领域常规技术人员熟悉的方式。使用位置可以是外部的，例如在表皮上，或者是内部的，例如胃溃疡、手术区域等。

本发明的胶原组合物可以膏剂、凝胶、溶液、悬浮液、脂质体、颗粒的方式使用，或以治疗和化妆品化合物的制剂和递送领域的技术人员已知的其它方式使用。可以使用超细颗粒尺寸的胶原材料，用于治疗剂的吸入给药。用于皮下给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：植入物、储库型(depot)、针剂、胶囊和渗透泵。用于阴道给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：膏剂和环。用于口服给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：丸剂、液体、糖浆和悬浮液。用于透皮给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：凝胶、膏剂、糊剂、贴片、喷雾和凝胶。用于皮下给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：植入物、储库型、针剂、胶囊和渗透泵。用于胃肠外给药的合适制剂的某些实例包括但不限于：水性或非水性的无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与目的受体的血液等渗的溶质，以及水性或非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮的试剂和增稠剂。可以用本领域普通技术人员常规使用的无菌粉末、颗粒和片剂来制备临时配制的注射液和悬浮液。

其中本发明的组合物与例如一种或多种“药学或化妆品上可接受的载体”或赋形剂组合的实施方案可以方便的用单位剂量提供，并可以通过常规制药技术制备。此类技术包括使含有活性成分的组合物与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，通过使活性成分和液体载体均匀和紧密的结合，来制备制剂。特定的单位剂量制剂是含有一服或一单位所施用成分，或其合适部分的制剂。应该理解，除了上述特别提及的成分外，包含本发明组合物的制剂还可以包括本领域普通技术人员常规使用的其它试剂。给药体积随给药途径变化。例如，肌肉内注射的体积范围可以是约0.1ml至1.0ml。

本发明的组合物可以向人和动物施用，以提供能够产生理想的生理学或药理学结果的任何剂量范围的物质。剂量依赖于所施用的物质，理想的治疗终点，在作用位点或体液中的理想有效浓度，以及给药类型。关于物质的合适剂量信息是本领域普通技术人员已知的，可见于参考文献例如L.S.Goodman和A.Gilman,编著，The Pharmacological Basis of Therapeutics,Macmillan Publishing,New York，和Katzung,Basic & Clinical Pharmacology,Appleton & Lang,Norwalk,Connecticut,(第6版，1995)。理想治疗领域的熟练医师可以根据情况需要和所施用的物质，选择特定的剂量和剂量范围，以及给药频率。

胶原组合物可以包括一种或多种非胶原的化合物或物质。例如可以将生物分子，在生产过程中或手术准备过程中注入胶原组合物。此类生物分子包括但不限于：抗生素(例如：克林霉素、米诺环素、脱氧土霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、镇痛药、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂包括但不限于：银(例如银盐，包括但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、元素银、抗生素、杀菌酶(例如溶菌酶)、愈伤剂(例如细胞因子，包括但不限于PDGF、TGF；胸腺素)、作为愈伤剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如含有或不含有凝血酶的纤维蛋白)、细胞引诱剂和支架试剂(例如纤粘连蛋白)等。在特定的实例中，可以将至少一种生长因子浸润至胶原组合物，例如成纤维细胞生长因子，表皮生长因子等。还可以用有机小分子浸润至胶原组合物，例如特定生化过程的特定抑制剂，例如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等。

在其它实施方案中，本发明的胶原组合物可以与水凝胶结合。本发明涵盖了本领域技术人员已知的任何水凝胶组合物，例如下列综述中公开的任何水凝胶组合物：Graham,1998,Med.Device Technol.9(1):18-22；Peppas等人，2000,Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1):27-46；Nguyen等人，2002,Biomaterials,23(22):4307-14；Henincl等人，2002,Adv.Drug Deliv.Rev 54(1):13-36；Skelhorne等人，2002,Med.Device.Technol.13(9):19-23；Schmedlen等人，2002,Biomaterials 23:4325-32；其均通过全文引用并入本发明中。在特定的实施方案中，水凝胶组合物是应用于胶原组合物上的，即，被置于胶原组合物的表面。例如，水凝胶组合物可以喷在胶原组合物上、浸透在胶原组合物的表面、与胶原组合物一起浸泡、与胶原组合物一起浸润、或包被在胶原组合物的表面。

本发明的方法和组合物中有用的水凝胶，可以采用本领域已知的任何水-相互作用，或水溶性多聚物来制造，其包括但不限于聚乙烯醇(PVA)、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、葡聚糖或其衍生物和类似物。

在一些实施方案中，本发明的胶原组合物在与水凝胶结合前，还浸渍一种或多种生物分子。在其它实施方案中，水凝胶组合物在与本发明的胶原组合物结合前，还浸渍了一种或多种生物分子。此类生物分子包括但不限于：抗生素(例如：克林霉素、米诺环素、脱氧土霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、镇痛药、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂包括但不限于银(例如银盐，包括但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、元素银、抗生素、杀菌酶(例如溶菌酶)、愈伤剂(例如细胞因子，包括但不限于PDGF、TGF；胸腺素)、作为愈伤剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如含有或不含有凝血酶的纤维蛋白)、细胞引诱剂和支架试剂(例如纤粘连蛋白)等。在特定的实例中，可以将至少一种生长因子浸渍至胶原组合物或水凝胶组合物中，例如成纤维细胞生长因子，表皮生长因子等。有利的，生物分子可以是治疗剂。

在某些实施方案中，水凝胶组合物与包含本发明的胶原组合物的薄片结合。

水凝胶/胶原组合物具有医学领域的用途，包括但不限于创伤、烧伤和皮肤适应症的治疗(例如：治疗疤痕)，美容用途(例如美容手术)、和任何作为植入物的应用。在某些实施方案中，水凝胶/胶原组合物局部的施用至个体，例如在皮肤的表面，例如用于创伤的治疗。在其它实施方案中，水凝胶/胶原组合物可施用至个体的内部，例如作为植入物，成为体内永久或半永久的结构。在一些实施方案中，水凝胶组合物配制成不可生物降解的。在其它实施方案中，水凝胶组合物配制成可生物降解的。在特定的实施方案中，水凝胶组合物配制成在数天内降解的。在另一特定的实施方案中，水凝胶组合物配制成在数月内降解的。

在一些实施方案中，在本发明的胶原组合物中种植了细胞，使细胞是均一的和汇合的。可用于种植本发明的胶原组合物的细胞包括但不限于：干细胞、人干细胞、人分化的成体细胞、全能干细胞、多能干细胞、多潜能该细胞、组织特异性干细胞、胚样干细胞、定向祖细胞、成纤维细胞。在其它实施方案中，本发明涵盖了用特定类型的祖细胞种植的本发明的胶原组合物，包括但不限于：软骨细胞、肝细胞、造血干细胞、胰腺实质细胞、神经母细胞和肌肉前体细胞。

6.6干细胞

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物包含大量的干细胞。干细胞可以是适合给定目的的任何干细胞，可以是全能或多能干细胞，或者可以是前体细胞。优选的，组合物包含胎盘干细胞，例如美国申请公开号2003/0032179和2003/0180269中，以及美国专利号7,045,148中描述的干细胞。然而，组合物可以包含来自任何组织来源的干细胞或前体细胞，优选哺乳动物干细胞或前体细胞，例如：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、间充质干细胞、骨髓来源的干细胞、造血前体细胞(例如：来自外周血、胎儿血、胎盘血、脐带血、胎盘灌流液等的造血干细胞)、成体干细胞、神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心肌干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞等。组合物可以包含任何干细胞类型的组合。在优选的实施方案中，干细胞是人干细胞，例如人胎盘干细胞。

一般而言，本发明的组合物与大量的干细胞或前体细胞接触一段时间，所述时间足以使所述大量的干细胞或前体细胞附着在组合物上。在优选的实施方案中，在与干细胞或前体细胞接触前，本发明的组合物成型成有用的构型，例如片状、塞状、管状或其它构型。可以通过本领域已知的任何方法来影响干细胞或前体细胞与本发明的组合物的接触，包括例如：将包含干细胞或前体细胞的基质分散在组合物的表面；将组合物的一部分或整体浸入干细胞或前体细胞的悬浮液中；在组合物的表面培养大量的干细胞或前体细胞一段时间，所述时间足以使大量的细胞增殖至少一次细胞分裂；等等。干细胞，优选的胎盘干细胞，可以存在于本发明的组合物上，例如，成型的组合物上，在整个的或部分的组合物的表面，例如可以随机的或汇合的存在于表面上，等。

在任何实施方案中，与本发明的组合物接触的干细胞或前体细胞的数量可以变化，但可以是至少1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹、或1×10¹²个；或可以是不超过1×10⁶、3×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、1×10⁹、3×10⁹、1×10¹⁰、3×10¹⁰、1×10¹¹、3×10¹¹、或1×10¹²个干细胞或前体细胞。

在某些其它实施方案中，本发明的组合物包含由干细胞沉积的一种或多种类型的胞外基质蛋白。例如，在一实施方案中，通过下列方法使本发明的胶原组合物包含胞外基质蛋白：将本发明的胶原组合物与大量的干细胞接触；在组合物上培养干细胞一段时间，所述时间足以使干细胞沉积可检测量的至少一种类型的胞外基质蛋白；和使组合物去细胞化，生产包含至少一种类型的胞外基质蛋白的胶原组合物。因此，在一实施方案中，本发明的组合物包含去细胞化的胞外基质，其中，由干细胞沉积或产生去细胞化的胞外基质。在多个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原(I、II、III和/或IV型)、弹性蛋白或纤粘连蛋白。在另一实施方案中，胞外基质蛋白是由大量的增殖且不分化的干细胞生产的。在另一实施方案中，胞外基质是由大量的分化的干细胞生产的，或者由从大量的干细胞分化成的大量的细胞产生的。在上述实施方案的特定的实施方案中，干细胞是胎盘干细胞，例如：CD34^-胎盘干细胞或CD200^-胎盘干细胞。

6.6.1胎盘干细胞

在优选的实施方案中，组合物包含大量的CD34^-胎盘干细胞。CD34^-胎盘干细胞是可从胎盘组织中获得的干细胞，其附着在组织培养底物上，并具有分化成非胎盘细胞类型的能力。胎盘干细胞可以是胎儿或母体来源的(即，可以具有母亲或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群，可以只包含胎儿来源或母体来源的胎盘干细胞，或者也可以包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群。胎盘干细胞，和包含胎盘干细胞的细胞群，可以通过下文讨论的形态学、标志物和培养特征来鉴定和选择。

当作为原代培养或细胞培养时，胎盘干细胞附着在组织培养底物上，例如组织培养容器表面(例如组织培养塑料)。培养中的胎盘干细胞通常表现出成纤维细胞样、星状外形，具有从中央细胞体延伸出许多胞质突起。然而，胎盘干细胞与相同条件下培养的成纤维细胞是形态可区分的，胎盘干细胞表现出比成纤维细胞更多数量的此类突起。形态学上，胎盘干细胞与造血祖细胞也是可区分的，后者在培养中通常表现为更圆的、或鹅卵石状的形态。

胎盘干细胞通常表达标志物CD10、CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，且不表达CD34、CD38或CD45。胎盘干细胞还可以表达HLA-ABD(MHC-1)和HLA-DR。因此，在一实施方案中，可以结合本发明的组合物的干细胞是CD200⁺或HLA-G⁺。在另一实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一实施方案中，胎盘干细胞是CD200⁺和OCT-4⁺。在另一实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一实施方案中，胎盘干细胞是CD73⁺和CD105⁺，并且，当处于允许胚样小体形成的条件下时，有利于在胎盘细胞群中形成一个或多个胚样小体。在另一实施方案中，胎盘干细胞是OCT-4⁺，并且，当在允许胚样小体形成的条件下培养时，和处于胎盘细胞群中时，有助于在包含所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样小体。

可以通过灌流获得胎盘干细胞。例如，本发明提供了根据以下方法生产的分离的胎盘干细胞群，所述方法包括：灌流已经排尽脐带血的哺乳动物胎盘，并灌流除去残留的血液；用灌流液灌流所述胎盘；和收集所述灌流液，其中在灌流后，所述灌流液包含胎盘细胞群，含有胎盘干细胞；从所述细胞群中分离大量的所述胎盘干细胞。在特定的实施方案中，灌流液通过脐静脉和脐动脉，收集从胎盘排出的溶液。通过此类方法生产的胎盘干细胞群通常包含胎儿细胞和母体细胞的混合物。在另一特定的实施方案中，灌流液通过脐静脉，从脐动脉收集，或通过脐动脉，从脐静脉收集。通过此类方法生产的胎盘干细胞群通常基本上是专一的胎儿来源的；即例如：群中多于90％、95％、99％或99.5％的胎盘干细胞是胎儿来源的。

在不同的实施方案中，从胎盘灌流获得的细胞群中，含有占所述胎盘细胞群的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％的胎盘干细胞。在另一特定的实施方案中，通过灌流收集的胎盘干细胞包括胎儿细胞和母体细胞。在另一特定的实施方案中，通过灌流收集的胎盘干细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％是胎儿细胞。

还可以通过器官或其一部分的物理解离，例如酶促消化，从哺乳动物胎盘中收集胎盘干细胞。例如，可以在接触本发明的干细胞收集组合物的同时，例如将胎盘或其部分压碎(crush)、剪碎(shear)、绞碎(mince)、切块(dice)、切细(chop)、浸软(macerate)等，然后将组织用一种或多种酶消化。还可以物理解离胎盘或其部分，并用一种或多种酶消化，然后将获得的材料浸入或与本发明的干细胞收集组合物混合。任何物理解离方法均可以使用，只要所述解离方法使所述器官中多数的，更优选的大多数的，更优选的至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活，其通过例如，台盼蓝不相容来确定。

在物理解离和/或酶促消化和干细胞回收前，可以将胎盘分割成各个组件。例如，可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘绒毛叶或其任意组合来获得胎盘干细胞。优选的，从包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织获得胎盘干细胞。通常可以通过将胎盘组织解离为小块来获得胎盘干细胞，例如胎盘组织块的体积是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米。

优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织解离酶。酶促消化优选使用酶的组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，如胶原酶和分散酶的组合。在一实施方案中，胎盘组织的酶促消化使用了基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合，或LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)和透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶。血清中的α2微球蛋白可以抑制丝氨酸蛋白酶，因此用于消化的培养基通常是无血清的。在酶促消化过程中通常使用EDTA和DNA酶来增加细胞回收的效率。优选稀释消化物从而避免干细胞陷入粘稠的消化物中。

可以使用任何组织消化酶的组合。组织消化酶的典型浓度包括例如：50-200U/ml的I型胶原酶和IV型胶原酶，1-10U/ml的分散酶，和10-100U/ml的弹性蛋白酶。可以组合使用蛋白酶，即，在同一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或者可以相继使用从而游离胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，胎盘或其一部分首先用合适量的I型胶原酶按2mg/ml消化30分钟，然后用0.25％的胰蛋白酶在37℃消化10分钟。优选的在其它酶的使用后再继续使用丝氨酸蛋白酶。

在另一实施方案中，可以通过向含有干细胞的干细胞收集组合物中，或者向在用干细胞收集组合物分离干细胞前用于解离和/或消化组织的溶液中，添加螯合剂(例如，乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N’N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))，进一步解离组织。

可以理解，当完整的胎盘或胎盘的一部分同时含有胎儿和母本细胞(例如，胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛小叶)时，收集的胎盘干细胞将包含同时来源于胎儿和母本源的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的部分不含有或只含有可忽略量的母本细胞时(例如，羊膜)，收集的胎盘干细胞将几乎只含有胎儿的胚胎干细胞。

6.6.1.1分离和表征胎盘干细胞

不论是否由灌流或酶促消化获得的，来自哺乳动物胎盘的干细胞，可以通过例如，聚蔗糖梯度离心从其它细胞中初步纯化(即，分离)。此类离心可以遵循任何标准方法的离心速度等。例如，在一实施方案中，从胎盘收集的细胞是通过在5000×g室温离心15分钟从灌流液中回收的，其将细胞与，例如污染的残渣和血小板分离开。在另一实施方案中，将胎盘灌流液浓缩至约200ml，轻轻的铺在聚蔗糖上，在22℃以约1100×g离心20分钟，收集低密度的细胞中间层用于进一步处理。

细胞沉淀可以重悬在新鲜的干细胞收集组合物中，或适合干细胞维持的培养基中，例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)。根据生产商的推荐方法，可以利用例如LYMPHOPREP(Nycomed Pharma,Oslo，挪威)分离总单核细胞部分。

如本发明中使用的，“分离”胎盘干细胞意指除去至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的通常在完整哺乳动物胎盘中与干细胞相关的细胞。当其存在于包含少于50％的通常在完整器官内与干细胞相关的细胞的细胞群中时，来自器官的干细胞就是“分离的”。

例如，通过灌流或消化获得的胎盘细胞可以进一步或一开始就利用例如具有0.2％ EDTA的0.05％胃蛋白酶(Sigma,St.Louis MO)溶液通过差别胰酶消化来分离。由于胎盘干细胞通常在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它附着的群通常要求超过20-30分钟培养，因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)中和胰蛋白酶后，可以收获脱离的胎盘干细胞。在分离附着细胞的一实施方案中，在每个T-75瓶中，优选的纤连蛋白包被的T75瓶中，放置等份的，约5-10×10⁶个细胞。在此类实施方案中，可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)培养细胞，并置于组织培养箱(37℃，5％CO₂)中。在10-15天后，通过用PBS洗涤从瓶中除去非附着细胞。然后用MSCGM替换PBS。优选的每天检查瓶中不同附着细胞类型的存在，特别的鉴别和扩增成纤维样细胞簇。

利用标准的细胞检测技术，例如流式细胞仪、细胞分选、免疫组织化学(例如用组织特异性或细胞标志特异性抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS)，通过利用光学或共聚焦显微镜检查细胞的形态学，和/或利用本领域普遍已知的技术(例如PCR和基因表达谱)来检测基因表达的改变，通过测量形态学和细胞表面标志物的改变，可以监测从哺乳动物胎盘中收集的细胞数量和类型。这些技术也可用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，利用CD34的抗体，利用上述技术，可以确定细胞是否含有可检测量的CD34；如果是，则细胞是CD34⁺。同时，如果细胞产生足够RT-PCR可检测的OCT-4RNA，或者显著多于成体细胞的OCT-4 RNA，则细胞是OCT-4⁺。细胞表面标志物(例如CD标志物如CD34)的抗体，和干细胞特异性基因例如OCT-4的序列，也是本领域普遍已知的。

胎盘细胞，特别是已经过聚蔗糖分离、差别附着，或两者的结合所分离的细胞可以利用荧光活化细胞分选仪(FACS)来分选。荧光活化细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光性质，用于分离颗粒(包括细胞)的普遍已知的方法(Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生微小的电荷，从而允许混合物中正电和负电颗粒的电磁分离。在一实施方案中，用不同的荧光标签来标记细胞表面标志物特异性抗体或配体。细胞经过细胞分选仪，从而基于其与所用抗体的结合能力来分离细胞。FACS分选的颗粒可以直接注入96-孔或384-孔板的单个孔中，以便于分离和克隆。

在一个分选技术方案中，基于标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的干细胞。上述方法可以结合基于其在培养中的附着性质来选择干细胞的方法来实施。例如，可以在基于标志物表达的分选之前或之后，实现干细胞的附着选择。例如，在一实施方案中，首先基于其CD34的表达来分选细胞；保留CD34^-的细胞，并将CD200⁺HLA-G⁺的细胞与所有其它CD34^-细胞分离。在另一实施方案中，基于其对标志物CD200和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的细胞；例如，分离表现出任一这些标志物的细胞供进一步使用。在特定的实施方案中，表达例如CD200和/或HLA-G的细胞可以基于其对CD73和/或CD105的表达，或通过抗体SH2、SH3或SH4识别表位，或缺少CD34、CD38或CD45的表达来进一步分选。例如，在一实施方案中，通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或其缺失来分选胎盘细胞，将CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离，供进一步使用。

在另一实施方案中，可以使用磁珠分离细胞。可以利用磁性活化细胞分选(MACS)技术来分选细胞，一种基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力来分选颗粒的方法。对磁微珠可以实施多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将磁珠与细胞混合，使其结合。然后将细胞通过磁场，分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一实施方案中，可以随后分离这些细胞，并与偶联了抗其它细胞表面标志物的抗体的磁珠再混合。使细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细胞。然后可以将此类细胞稀释入不同的盘中，例如微滴盘中用于克隆分离。

还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选胎盘干细胞。例如，胎盘干细胞可以表征为在培养中具有成纤维细胞样表型，和/或基于成纤维细胞样表型来选择。胎盘干细胞还可以表征为具有形成胚样小体的能力，和/或基于上述能力来选择。在一实施方案中，例如，将形状为成纤维细胞样，表达CD73和CD105，并在培养中产生一个或多个胚样小体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一实施方案中，将培养中产生一个或多个胚样小体的OCT-4⁺胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。

在另一实施方案中，可以通过集落生成单位试验来鉴别和表征胎盘干细胞。集落生成单位试验是本领域普遍已知的，例如MESENCULT^TM培养基(Stem Cell Technologies,Inc.,Vancouver British Columbia)。

利用本领域已知的标准技术，可以分析胎盘干细胞的活力、增殖潜力和寿命，例如台盼蓝不相容试验、醋酸荧光素摄取试验、碘化丙锭摄取试验(评估活力)；以及胸腺嘧啶核苷摄取试验、MTT细胞增殖试验(评估增殖)。通过本领域普遍已知的方法可以确定寿命，例如通过确定延长培养中群倍增的最大数。

利用本领域已知的其它技术也可以将胎盘干细胞与其它胎盘细胞相分离，例如：期望的细胞的选择性生长(正向选择)、不期望的细胞的选择性破坏(负选择)、基于混合群与例如大豆凝聚素的差别细胞可凝集性的分离、冻融步骤、过滤、低速离心和区带离心、离心冲洗(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布、电泳、等等。

6.6.1.2胎盘干细胞的培养

可以如上述分离胎盘干细胞，并立即与本发明的组合物接触。在与本发明的组合物接触前，还可以，例如在细胞培养中培养胎盘干细胞若干代。例如，分离的胎盘干细胞，或胎盘干细胞群，或胎盘干细胞从中生长出的细胞或胎盘组织，可用于起始或接种细胞培养。细胞通常转移到无菌的组织培养容器内，所述容器采用或未用胞外基质或配体包被，例如层粘连蛋白、胶原(如：天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘附蛋白和胞外膜蛋白(例如：(BD Discovery Labware,Bedford,Mass.))。

在优选的实施方案中，胎盘干细胞培养在本发明的胶原组合物上。在某些实施方案中，胶原组合物包含可检测量的纤粘连蛋白和层粘连蛋白。在其它实施方案中，胶原组合物包含不可检测量的纤粘连蛋白和层粘连蛋白。在其它实施方案中，胶原组合物包含占干重至少约5％，或至少约10％的弹性蛋白。在另一实施方案中，胶原组合物包含不超过干重约5％的弹性蛋白。

在某些实施方案中，培养胎盘干细胞用于特定细胞因子的生产，所述细胞因子可以从培养基中收集。在特定的实施方案中，细胞因子是IL-6、IL-8和/或单核细胞趋化性蛋白-1(MCP-1)。在某些其它的实施方案中，培养胎盘干细胞用于纤粘连蛋白的生产。在特定的实施方案中，在含有少于约5％纤粘连蛋白的本发明的组合物上培养胎盘干细胞。

如上述，本发明的胎盘胶原组合物可以成型成任何有用的形状，例如医疗有用的。这些组合物一旦成型并干燥，在水性溶液中，例如组织培养基或缓冲液中就是稳定的。因此，可以在成型的组合物上直接培养干细胞，如胎盘干细胞。可以在细胞培养皿或其它适合细胞培养的液体容器，例如瓶中，进行此类培养。

可以在本领域认为适合干细胞培养的任意培养基和任何条件下培养胎盘干细胞。优选的，培养基包含血清。胎盘干细胞可以培养在例如：DMEM-LG(Dulbecco改良的基础培养基，低糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基础培养基)，其含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖(dextrose)、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1，和青霉素/链霉素；含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15％ FBS的DMEM-HG；含有10％ FBS，10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)；含有10％ FBS、EGF和肝素的M199；含有10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的(最低基础培养基)；含有10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素的DMEM，等。优选的培养基是含有2％ FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF，和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。

可用于培养胎盘干细胞的其它培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基础培养基、Ham的F10培养基(F10)、Ham的F12培养基(F12)、Iscove改良的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz的L-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、改良的DMEM(Gibco)、DMIEM/MCDB201(Sigma)，和CELL-GRO FREE。

培养基可以添加一种或多种组分，包括例如：血清(如：胎牛血清(FBS),优选的约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选的约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)，和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸包括L-缬氨酸；和一种或多种用于控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B，庆大霉素、和制霉菌素，单独或组合使用。

可以在标准的组织培养条件下培养胎盘干细胞，例如在组织培养皿或多孔板中。还可以使用悬滴法培养胎盘干细胞。在该方法中，胎盘干细胞以约1×10⁴个细胞/mL悬浮在约5mL培养基中，将一滴或多滴培养基置于组织培养容器(例如100mL Petri培养皿)的盖的内侧。液滴可以是例如单滴或来自例如多通道移液器的多滴。将盖小心地倒转，并置于皿底部的顶上，所述皿底部含有一定体积的液体，例如无菌的PBS，其足以维持皿内空气的水分含量，并且培养干细胞。

一旦胎盘干细胞或者干细胞群被分离(例如，与至少50％的胎盘细胞分离的干细胞或干细胞群，所述胎盘细胞是干细胞或干细胞群通常在体外相关的)，就可以在体外增殖或扩增干细胞或干细胞群。例如，可以在组织培养容器(例如：皿、瓶、多孔板等)中培养胎盘干细胞群一段时间，所述时间足够使干细胞增殖至70-90％汇合度，即，直到干细胞及其后代占据组织培养容器的70-90％的培养表面区域。

以可以允许细胞生长的密度将胎盘干细胞种植在培养容器内。例如，细胞可以低密度(例如：约1,000至约5,000细胞/cm²)至高密度(例如：约50,000或更多细胞/cm²)来接种。在优选的实施方案中，在约0至约5％体积CO₂的空气中培养细胞。在某些优选的实施方案中，在约2至约25％体积O₂的空气中培养细胞，优选的在约5至约20％体积O₂的空气中培养细胞。细胞优选的培养在约25℃至约40℃，优选37℃。细胞优选的在培养箱中培养。培养基可以是静态的或搅动的，例如，利用生物反应器。胎盘干细胞优选在低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)生长。

一旦获得70％-90％汇合度，细胞就可以传代。例如，细胞可以利用本领域普遍已知的技术进行酶促处理，例如胰蛋白酶消化，将其与组织培养表面分离。在移液除去细胞和计数细胞后，约20,000-100,000个干细胞，优选的约50,000个干细胞传代到含有新鲜培养基的新培养容器内。典型的，新培养基与除去干细胞培养基是相同的类型。已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次的胎盘干细胞可与本发明的胎盘组合物联合使用。

6.6.2非干细胞

在某些实施方案中，包含干细胞的本发明的组合物，也包含一种或多种类型的非干细胞。如本发明中使用的，“非干细胞”表示终末分化的细胞。例如，在一实施方案中，本发明的组合物包含大量的干细胞和大量的成纤维细胞。本发明的组合物可以包括的非干细胞包括但不限于：成纤维细胞或成纤维样细胞；内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、心肌细胞、胰腺细胞等。在某些其它实施方案中，组合物包含至少两类干细胞和至少两类非干细胞。

6.7使用胶原组合物的方法

另一方面，本发明提供了治疗性、预防性或美容性使用本发明的胶原组合物的方法。

本发明的胶原组合物具有广泛的潜在用途。用途包括但不限于：制造经工程改造的组织和器官(包括例如基质材料或组织的补丁或填料的结构)、假肢和其它植入物、组织支架、创伤的修复或敷料、止血装置、用于组织修复和支持的装置(例如缝合线)、手术和矫形螺钉、以及手术和矫形板、合成植入物的天然包衣或组分、美容植入物和支持物、器官或组织的修复或结构支持物、药物递送、生物工程平台、用于测试药物对细胞影响的平台、细胞培养，和多种其它用途。上述潜在用途的讨论并非意在穷举，还存在许多其它实施方案。此外，针对胶原与其它材料和/或特定物质的组合，虽然下文提供了许多特定实例，但是仍可以使用其它的许多材料和物质的组合。

在胶原组合物用于创伤的治疗或填充的应用中，有利地，组合物刺激周围组织中的干细胞产生纤粘连蛋白。在此类实施方案中，创口可以接触包含不可检测量的纤粘连蛋白的本发明的组合物。

胶原材料中的细胞结合能力提供了使用本发明的组合物构建组织、器官或器官样组织的能力。此类组织或器官中包含的细胞可以包括这样的细胞，所述细胞具有递送物质的功能，提供替代组织来源的接种的细胞，或两者。多种类型的细胞可用于创建组织或器官。在不同实施方案中使用干细胞、定向的干细胞，和/或分化的细胞。在这些实施方案中使用的干细胞的实例包括但不限于：胚胎干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞，其用于制造器官或器官样组织，例如肝或肾脏。在一些实施方案中，组合物的形状有助于向细胞发送信号，从而使其以特定型的理想方式生长或增殖。基质中可以添加其它物质，例如分化诱导剂，来促进特定类型的细胞生长。此外，在某些实施方案中，组合物中整合了不同类型细胞的混合物。胶原材料和基质对组织或器官进行生物工程改造的能力创造了多种经生物工程改造的组织的替代应用。生物工程改造组分的实例包括但不限于：骨骼、牙齿结构、关节、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、腱、半月板、韧带、血管、支架、心瓣膜、角膜、耳鼓、神经导管(nerve guide)、组织或器官补丁或封闭剂、缺失组织的填充物、美容修复的薄膜(sheet)、皮肤(添加了细胞的薄膜使其成为皮肤的等价物)、喉的软组织结构例如气管、会厌软骨和声襞，其它软骨结构例如鼻软骨、睑板、气管环、甲状腺软骨和杓状软骨、结缔组织、脉管移植物及其组分，和用于局部应用的薄膜，或者器官的修复或替代例如肝、肾和胰腺。在某些实施方案中，此类基质与本发明的药物和物质递送基质结合，所述结合方式将改善植入物的功能。例如，可以向经生物工程改造的器官的培养基添加抗生素、抗炎剂、局部麻醉剂或其组合，从而加速愈合过程并降低不适。

6.7.1美容应用

人皮肤是表皮和真皮的复合材料。皮肤表皮层的最外层是角质层。角质层下是表皮。表皮下是真皮的最外层，称为乳头状真皮，其下是网状真皮和皮下层。

皮肤具有多种功能，包括保护、吸收、色素生成、感知觉、分泌、排泄、温度调节和免疫过程调节。这些皮肤功能被衰老、过度阳光暴露、吸烟、外伤和/或环境因素负面的影响，其导致皮肤结构改变，并可以导致皮肤屏障功能的损伤和减少的表皮细胞转化。受损的胶原和弹性蛋白丧失了适当收缩的能力，其导致皮肤皱纹和表面粗糙。皱纹是皮肤的改变，通常与皮肤衰老有关，通常出现在日光照射的皮肤上。随着衰老进行，面部以及身体的其它区域开始表现出重力、日光照射和多年面部肌肉运动(例如：笑、咀嚼和斜视)的影响。随着皮肤衰老或逐渐病变，皮肤产生皱纹、下垂和妊娠纹，皮肤变粗糙，同时皮肤合成维生素D的能力降低。由于胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖的改变，衰老的皮肤还变薄，并且真皮表皮界面变平。通常，衰老的皮肤的特征为厚度、弹性和与下层组织的附着能力降低。

由于衰老、环境因素、日光暴露和其它因素(例如减肥、怀孕、疾病(如痤疮和癌症)以及手术)造成的皮肤损伤，通常导致皮肤轮廓缺陷和其它皮肤异常。为了矫形皮肤的轮廓缺陷和其它异常，人们通常求助于美容手术，例如面部去皱和皮肤整形。然而，美容手术通常是昂贵的、侵入性的，具有在手术区域遗留疤痕的可能，并可能影响正常的生物学和生理学功能。因此，还需要替代疗法。

本发明提供了用于填充患者的皮肤的方法。在一实施方案中，用于填充患者皮肤的方法包括将本发明的胶原组合物注射或施用到患者面部或身体需要填充的区域，其中，与使用胶原前的所述区域相比，患者面部或身体的区域被填充了。在本发明的上下文中，“填充皮肤”指由于外部作用或影响，患者(例如人)皮肤及相关区域的天然状态的任何改变。可以通过填充皮肤来改变的皮肤的非限制性区域包括：表皮、真皮、皮下层、脂肪、立毛肌、毛干、汗腺孔、皮脂腺或其组合。

在某些实施方案中，本发明的方法包括将本发明的胶原组合物注射或施用到患者，用于治疗眼角皱纹、鼻唇褶(“笑纹”)、木偶纹、眉间皱纹(“皱眉纹”)或其组合。本发明的胶原组合物可以帮助填充纹路、褶痕和其它皱纹，重建更平滑、视觉上更年轻的外表。本发明的胶原组合物可以单独使用，或与一种或多种其它可注射的组合物、表面重建方法(例如激光治疗)或整形方法(例如面部祛皱)结合使用。

在一实施方案中，本发明的胶原组合物还可以用于填充面部起皱或凹陷的区域，和/或添加或增加患者面部和身体区域的丰满度。需要填充的面部和/或身体的区域可以是例如衰老、创伤、疾病、病症、环境因素、减肥、分娩或其组合导致的。可以注射或施用本发明的胶原组合物的、患者的面部或身体区域的非限制性实例包括：眼底、太阳穴、上颧骨、下颧骨、下巴、嘴唇、下颌外形、前额、眉间、眉外侧、脸颊、嘴唇和鼻子之间的区域(例如鼻梁)、颈、臀部、腰间、胸骨或面部或身体的任何其它部分，或其组合。

可以用于治疗皮肤缺陷的本发明的胶原组合物包括但不限于：皱纹、凹陷或其它褶皱(例如：皱眉纹、忧思纹、眼角皱纹、木偶纹)、妊娠纹、内部和外部疤痕(例如由损伤、创伤、事故、咬伤或手术造成的疤痕)，或其组合。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物可用于矫形例如：“空洞化”的眼睛、黑眼圈导致的可视的血管、以及可视的泪沟。本发明的胶原组合物还可用于例如：在下眼睑成形术过度除去眼底脂肪垫后用于矫形眼底，或者在过度颊脂抽脂或天然损失后矫形下颌。在一实施方案中，本发明的胶原组合物可用于矫整鼻整形术的结果、植皮或其它手术导致的瑕疵，例如脂肪吸除手术导致的凹陷。在其它实施方案中，本发明的胶原组合物可用于矫形面部或身体的疤痕(例如：创伤、水痘或痤疮疤痕)。在某些实施方案中，本发明的胶原组合物注射或施用到患者上用于面部重塑。可以使用本发明方法在以下患者中完成面部重塑，所述患者患有颈部松弛，或具有枯瘦脸、长脸、底重(bottom-heavy)脸、不对称脸、圆脸，或者具有局部脂肪萎缩、面中部下颌后移、凹陷的眼睛的面部，以及上述的组合。

在一实施方案中，本发明的方法包括将本发明的胶原组合物注射或施用于患者，用于治疗皮肤缺陷，例如由疾病或病症(例如癌症或痤疮)导致的皮肤缺陷。该缺陷可以是疾病或病症的直接或间接的结果。例如，由疾病或病症导致的皮肤缺陷，或由疾病或病症的治疗导致的皮肤缺陷。

6.7.2非美容性应用

6.7.2.1空隙填补

本发明提供了用于封闭、填补和/或其它治疗患者体内空隙的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括将本发明的胶原组合物注射或施用到患者上，从而填补患者体内的空隙。例如，胶原组合物可以施用在空隙分布的区域。术语“空隙”意在涵盖由于衰老、疾病、手术、先天性异常或其组合导致的任何不期望的空洞空间。例如，在从患者身体中手术除去肿瘤或其它团块后，可以产生空隙。可以用本发明的胶原组合物填补的空隙的非限制性实例包括：患者身体的任何组织或器官中的裂纹、瘘管、憩室、动脉瘤、囊肿、病变或任何其它不期望的空洞空间。

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物可用于整体或部分的填补、封闭和/或治疗裂缝、裂纹或瘘管，所述裂缝、裂纹或瘘管在组织、器官或身体的其它结构(例如：血管)内，或相邻组织器官或结构之间的连结内，从而防止生物体液，例如血液、尿液或其它生物液体的渗漏。例如，本发明的胶原组合物可以注射、植入、贯穿或以其它方式施用于脏器之间的瘘管中，或脏器向患者身体外部的开口或孔中。本发明的胶原组合物可用于填补空隙或其它由这类病理状态形成的缺陷，并且刺激成纤维细胞渗透，愈合和组织向内生长。

在一实施方案中，使用本发明的方法填补、封闭和/或治疗需要治疗的患者内的瘘管，所述方法包括向患者注射或施用本发明的胶原组合物。可以通过针头在一个瘘管开口注射，向患者施用本发明的胶原组合物，并且填补大部分或全部的开口分支。可选的，胶原绳或胶原杆都可以通过开口穿入瘘管病变，或者可以用导管将胶原导入患者体内。通过本发明的胶原组合物或方法可以填补、封闭和/或治疗不同类型的瘘管，例如肛门瘘、动静脉瘘、膀胱瘘、颈动脉海绵窦瘘、外瘘、胃瘘、肠瘘、体壁瘘、涎瘘、阴道瘘和肛门直肠瘘，及其组合。

在一实施方案中，使用本发明的方法填补、封闭和/或治疗需要治疗的患者中的憩室，所述方法包括向患者注射或施用本发明的胶原组合物。憩室是这样的异常生理学结构，所述结构是管状或囊状器官例如肠、膀胱等，上的袋状或囊状开口，可以使用本发明的胶原组合物填充或增强。

在另一实施方案中，本发明的方法用于填补、封闭和/或治疗需要治疗的患者中的囊肿，所述方法包括向患者注射或施用本发明的胶原组合物。囊肿是具有膜内层的异常囊，其含有气体、液体或半固体物质。在一些实施方案中，囊肿是假性囊肿，其具有例如液体聚集，但不包含上皮或其它膜性内层。可以用本发明来填补、封闭和/或治疗的囊肿的其它非限制性实例包括皮脂囊肿、皮样囊肿、骨囊肿，或浆液囊肿，或其组合。

在另一实施方案中，本发明的方法包括注射或施用本发明的胶原组合物，来填补全部或部分的任何空隙，所述空隙是从患者中手术的、化学的或生物学的除去不需要的或不期望的赘生物、液体、细胞或组织所导致的。可以在空隙位置局部注射或施用胶原组合物，从而填充剩余的和周围的组织，帮助愈合过程，使感染风险最小化。该填充对于肿瘤切除造成的空隙位置是特别有用的，例如乳腺癌手术、除去瘤性结缔组织、骨组织或软骨组织等的手术。

本发明还提供了产生填充的方法，所述方法通过不直接向身体注射或施用本发明的胶原组合物，而是在将所述组织、器官或器官组分包埋到身体内前，将本发明的胶原组合物体外注射到器官、器官组分或组织。

6.7.2.2组织扩大(tissue bulking)

在一实施方案中，本发明的方法包括向患者施用本发明的胶原组合物，用于组织扩大。在本发明的上下文中，“组织扩大”指由于外部作用或影响，患者(例如：人)的非真皮软组织的天然状态的任何改变。本发明涵盖的组织包括但不限于：肌肉组织、结缔组织、脂肪和神经组织。本发明涵盖的组织可以是多种器官或身体部分的一部分，包括但不限于：括约肌、膀胱括约肌和尿道。

6.7.2.3尿失禁

尿失禁(包括压迫性尿失禁)是伴随导致腹内压升高的活动，例如咳嗽、喷嚏、笑或运动所发生的突发尿液漏出。在这些活动中，腹内压瞬时升高高于尿道阻力，导致突发的、通常少量的尿液漏出。压迫性尿失禁通常是膀胱储藏问题，其中尿道括约肌的力量减小，当腹部存在升高的压力时，括约肌不能防止尿液流出。尿失禁的出现可能是支持膀胱和尿道的骨盆肌减弱的结果，或者是由于尿道括约肌机能失常。例如，在尿道区域创伤之前，神经受损和某些药物治疗可以削弱尿道。尿失禁最常见于绝经期、盆腔外科手术或分娩后的妇女，例如在多次妊娠和阴道分娩后，或具有盆腔脱垂的妇女(膀胱、尿道或直肠壁突出到阴道空间)、膀胱突出症、膀胱尿道突出或直肠突出，通常与阴道前支持缺失有关。在男性中，在前列腺手术后可以观察到尿失禁，最常见于根治性前列腺切除术，其中可能损伤了尿道外括约肌。

本发明涵盖了控制或治疗尿失禁或由其导致的症状或适应症的方法，包括向需要的患者注射或施用本发明的胶原组合物，其中，填充了患者的括约肌组织，患者的自制力得到改善或重建。胶原组合物可以尿道旁注射或施用，从而增加尿道周围的组织体积，以控制和/或治疗尿失禁。通过增加组织体积，从而增加对尿液外流的抵抗力，能够实现压迫性尿失禁的改善。

在某些实施方案中，将本发明的胶原组合物注射或施用到患者的尿道周围区域中，例如，接近尿道上漏出尿液的孔，或增加尿道壁的厚度，从而当抑制尿液时能紧密的封闭。

在另一实施方案中，将本发明的胶原组合物注射或施用到患者的膀胱出口的尿道肌肉外侧的尿道周围。可以通过皮肤、通过尿道，或者在女性中通过阴道，来注射使体积增大的材料。

当使用针头注射本发明的胶原组合物时，可以通过使用插入尿道内的膀胱镜引导针头放置。可以在局部麻醉下实施尿道重建过程，但是某些患者可能需要全身麻酔、区域麻醉或脊髓麻醉。可以使用局部麻醉，使患者在注射后能够站立，并可以确定是否已经实现了自制。如果尚未重建自制力，可以向患者施用一次或多次后续注射。在数月后可能需要重复步骤，以实现膀胱控制。胶原注射通过增大尿道周围区域，从而收缩括约肌，来帮助控制尿液漏出。

6.7.2.4膀胱输尿管反流

膀胱输尿管反流(VUR)(或尿意反射)的特征是尿液从膀胱至肾脏的尿液逆流。未治疗的VUR对患者的肾功能和整体健康可以产生毁灭性的长期影响。患有VUR的患者具有发展出尿道感染、肾瘢痕、肾盂肾炎、高血压和渐进性肾衰竭的增加的风险。

本发明提供了控制或治疗VUR或由其导致的症状或适应症的方法，包括向需要的患者注射或施用本发明的胶原组合物，其中，填充了患者的输尿管壁，降低或消除了VUR的症状。可以利用本领域已知的任何方法，将胶原组合物在例如内窥镜的引导下，注射(例如：亚三角区注射)或施用在输尿管口下方的逼尿肌背侧。

6.7.2.5胃食管返流疾病

胃食管返流疾病(GERD)通常是由于食道下端括约肌(LES)－食道连接胃处的肌肉阀－不能正确闭合、松弛或削弱，以及胃内容物回漏或返流进入食道，所导致的功能紊乱。当胃酸，或偶尔的胆盐与食道接触时，就导致人们偶尔感觉到的烧心的灼烧感觉。当返流的胃酸接触食道内层时，导致胸部或咽喉处的灼烧感觉(烧心)，并在口腔后部可以尝到液体(胃酸过多)。随时间推移，胃酸返流破坏了食道的组织内层，导致炎症和疼痛。在成人中，长期持续的、未治疗的GERD可以导致食道的永久损伤，甚至导致癌症。任何人，包括婴儿、儿童和孕妇，都可以患有GERD。

本发明提供了控制或治疗GERD或由其导致的症状或适应症的方法，包括向需要的患者注射或施用本发明的胶原组合物，其中，填充了患者的LES，降低或消除了GERD的症状。在某些实施方案中，在内窥镜的引导下，将胶原组合物施用在食道胃连接水平的食道壁上。为了阻止返流，体积增大的效应是滞留的材料和后续的组织应答组合的结果。可以通过标准的或大口径(例如：大号)注射针头来注射本发明的胶原组合物。

6.7.2.6声襞和喉头

本发明提供了方法，用于控制或治疗影响一侧或两侧声襞(声带)和/或喉头(喉)的疾病、功能紊乱(例如：神经障碍)或其它异常。此类喉头或声襞的疾病、功能紊乱或其它异常的非限制性实例是：声门型喉癌、单侧喉返神经麻痹、双侧喉返神经麻痹、麻痹性发音困难、非麻痹性发音困难、痉挛性发音困难或其组合。在其它实施方案中，本发明的方法还可用于控制或治疗导致声襞闭合失常的疾病、功能紊乱或其它异常，例如声襞的不全麻痹(“轻瘫”)、普通虚弱的声襞例如伴随老年的(“老年喉小囊(presbylaryngis)”)，和/或声襞的瘢痕(例如：由于以前的手术或放疗)。

本发明涵盖了为患者的声襞提供支持或增大体积的方法，所述患者缺失了声襞原有的体积(例如：声襞弓形突出或萎缩)或移动性(例如瘫痪)。在某些实施方案中，可以用本发明的胶原组合物来填充声襞和/或喉头的其它软组织，其可以单独使用或与其它治疗或药物结合使用。在一实施方案中，本发明的胶原组合物填充或增加了一侧(或两侧)声襞的体积，使其能够与另一侧声襞接触。

可以使用本领域普遍已知的任一种方法，用于向患者的声襞或喉头施用本发明的胶原组合物。在一些实施方案中，使用弯针通过患者的口来注射本发明的胶原组合物。在其它实施方案中，可以使用针头(例如大号、短针)直接通过患者的皮肤和喉结注射本发明的胶原组合物。向患者施用本发明的胶原组合物时，可以用喉镜在视频监视器上监控患者的声襞。

6.7.2.7声门闭合不全

在一实施方案中，本发明提供了控制或治疗声门闭合不全的方法。利用本领域已知的方法，使用针头将本发明的胶原注射到患者声襞中，实现经皮喉头胶原填充。在一些情况下，患者患有发音过弱和/或声门闭合不全，其影响喉头的发声功能，增加肌强直和降低甲杓肌的运动能力。在另一实施方案中，发音过弱是帕金森氏症的结果。在一实施方案中，用于控制或治疗患者中声门闭合不全的本发明的方法包括：将本发明的胶原组合物注射或施用到患者的声襞，其中注射填充了声襞，改善了声门闭合，从而减弱或消除了患者中的声门闭合不全。在施用本发明的胶原组合物之前，患者可以具有或不具有可移动的声襞。

6.7.2.8发音困难

发音困难是声音的任何损伤或说话困难。发音困难可以与喉或声襞瘫痪有关或无关。本发明提供了用于控制或治疗发音困难，例如瘫痪性发音困难、非瘫痪性发音困难或痉挛性发音困难的方法。在一实施方案中，控制或治疗患者的发音困难的方法包括：向需要的患者注射或施用本发明的胶原组合物，其中，与胶原组合物施用前相比，患者的发音困难改善了。在某些情况下，喉胶原注射允许以小的增量对一侧或两侧声襞进一步医学处理，从而在结合甲状软骨成形术或在甲状软骨成形术之后，改善发声。

6.7.2.9声襞瘫痪

声襞本质上是被粘膜覆盖的肌肉。当肌肉不再与神经连接时，肌肉就萎缩了。因此，典型的瘫痪的声襞是小尺寸和弯如弓状的。此外，根据瘫痪的类型，声襞可以或不可以移动至足够接近中部，使另一侧声襞能够接触。当声襞不能够接触时，患者难以发出声音(或至少发出大的声音)。因此，本发明提供了方法，用于填充或扩大声襞瘫痪患者的萎缩的声襞，其中，声襞相互接触的能力被改善。

单侧声襞瘫痪是一侧声襞不能运动，通常是由于神经功能障碍，通常喉头不能完全闭合。喉返神经是负责两侧声襞大部分运动的主要神经，其可以被例如多种疾病、某些手术或病毒感染破坏。在某些实施方案中，患者的声襞瘫痪是甲状腺癌、肺癌、结核或肉瘤病(或任何导致淋巴结扩大至胸部的原因)、中风或神经疾病(例如：夏-马-图三氏(Charcot-Marie-Tooth)、希-德二氏(Shy-Drager)和多系统萎缩)的症状或结果。

双侧声襞瘫痪是两侧声襞不能运动(通常接近中线)。在某些实施方案中，患者的双侧声襞瘫痪是例如中风或其它神经适应症(例如：阿-希二氏畸形(Arnold-Chiari malformation))、甲状腺癌、手术(例如大脑手术)甲状腺切除术的症状或结果。

本发明提供了用于控制或治疗声襞瘫痪的方法。在一实施方案中，提供了控制或治疗患者单侧或双侧声襞瘫痪，或与其相关的综合症的方法，包括：向患者注射或施用本发明的胶原组合物，其中，患者的声襞闭合改善了。在一实施方案中，本发明的胶原组合物填充或增加了一侧(或两侧)瘫痪声襞的体积，使其可以与另一侧声襞接触。可以通过患者的口，或直接通过皮肤和喉结，向需要的患者注射本发明的胶原组合物。

6.7.2.10药物递送

可以使用本发明的胶原组合物作为药物递送载体，用于药物(例如：治疗剂)的受控递送。在某些实施方案中，胶原组合物向个体(例如：人)递送一种或多种治疗剂。本发明范围涵盖的治疗剂是蛋白质、肽、多糖、多糖偶联物、遗传疫苗、减毒活疫苗、完整的细胞。本发明的方法中使用的药物的非限制性实例是抗生素、抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂；疫苗；麻醉剂；镇痛剂；抗哮喘剂；抗炎剂；抗抑郁剂；抗关节炎剂；抗糖尿病剂；精神抑制剂；中枢神经系统刺激剂；激素；免疫抑制剂；肌肉松弛剂；前列腺素。

胶原组合物可用作递送载体，用于一种或多种小分子向个体(例如：人)的控制递送。在一些实施方案中，胶原组合物向个体(例如：人)递送一种或多种小分子。如本发明中使用的，术语“小分子”以及类似的术语包括但不限于肽、类肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、具有少于每摩尔约10,000克的分子量的有机或无机化合物(即，包括异源有机化合物或有机金属化合物)、具有少于每摩尔约5000克的分子量的有机或无机化合物、具有少于每摩尔约1000克的分子量的有机或无机化合物、具有少于每摩尔约500克的分子量的有机或无机化合物、具有少于每摩尔约100克的分子量的有机或无机化合物，或此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。还涵盖了此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物作为药物递送的载体，导致药物的增强的吸收；改善的药物动力学谱，和与本领域已知的其它药物递送系统有关的药物的系统分布。对于改善药物动力学，意指通过例如测量标准药物动力学参数，实现了增强的药物动力学谱，所述参数为例如实现最大血浆浓度的时间(Tmax)、最大血浆浓度的强度(Cmax)、出现可检测的血液或血浆浓度的时间(Tlag)。对于增强吸收，意指根据此类参数的测量，药物的吸收是改善了的。药物动力学参数的测量是本领域常规实施的。

在某些实施方案中，本发明的胶原组合物还包括一种或多种生物分子，例如：治疗剂，包括但不限于：抗生素、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、镇痛药、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂、愈伤剂、伤口封闭剂、细胞引诱剂和支架试剂、酶、受体拮抗剂或激动剂、激素、生长因子、自体骨髓或其它细胞类型、抗生素、抗微生物剂和抗体等，或其组合。在特定的实例中，可以采用一种或多种生长因子，例如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等浸润胶原组合物。还可以用一种或多种小分子浸润胶原组合物，所述小分子包括但不限于：有机小分子，例如特定生化过程的特定抑制剂，例如膜受体抑制剂、激素、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等。

在某些实施方案中，在生产前或注射前，根据预期的用途，用生物分子浸润本发明的胶原组合物。在一些实施方案中，本发明的胶原组合物包含一种或多种干扰素(α-IFN、β-IFN、γ-IFN)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、淋巴毒素、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子、红细胞生成素、转化生长因子(TGF)、制瘤素M、白介素(IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20，等)，其家族成员，或其组合。在一些实施方案中，本发明的胶原组合物包含此类生长因子或其它生物分子的生物活性类似物、片段，或衍生物。

本发明的方法中使用的特定活性剂包括：生长因子例如转化生长因子(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板衍生生长因子(PDGFs)、表皮生长因子(EGFs)、结缔组织活性肽(CTAPs)、成骨因子，以及此类生长因子的生物学活性类似物、片段和衍生物。转化生长因子(TGF)超基因家族的成员是有用的，其是多功能的调节蛋白。TGF超基因家族的成员包括β转化生长因子(例如：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；骨形态发生蛋白(例如：BMP-1、BMP-2、BMP-3、BM-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BM-8、BM-9)；肝素结合生长因子(例如：成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF))；抑制素(例如：抑制素A、抑制素B)；生长分化因子(例如：GDF-1)；和激活素(例如：激活素A、激活素B、激活素AB)。

6.7.2.11伤口和烧伤

部分的由于其物理性质，本发明的胶原组合物被预期，与本领域已知的其它生物材料相比，例如在美国专利号3,157,524、4,320,201、3,800,792、4,837,285、5,116,620中描述的那些，具有作为伤口敷料的增强的临床用途，其用于填充或取代硬和/或软组织修复。由于本发明的胶原组合物保留了胶原的天然四级结构，本发明的胶原组合物通过细胞迁移进入胶原基质的间隙中，从而提供了改善的组织向内生长。本发明的胶原组合物允许细胞附着并生长到胶原基质内，合成自身的大分子。从而使细胞产生了新的基质，所述基质允许新组织的生长。在其它已知的胶原形式(例如纤维、羊毛织物和可溶性胶原)上，尚未观察到此类细胞生长。

在一些实施方案中，本发明涵盖了通过将本发明的胶原组合物直接置于个体的伤口位置的皮肤上(即，角质层上)，从而伤口被覆盖，利用例如胶布，来治疗伤口。在其它实施方案中，本发明涵盖了使用本发明的胶原组合物作为植入物，例如皮下植入物，来治疗伤口。

本发明涵盖了通过向本发明的胶原组合物中添加能够促进组织向内生长的大分子，以增加伤口愈合的速率。此类大分子包括但不限于透明质酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖(参见例如：Doillon等人，(1987)Biomaterials 8:195 200；和Doillon and Silver(1986)Biomaterials 7:3 8)。

在一些实施方案中，本发明的胶原组合物用于控制伤口，所述伤口包括但不限于：部分伤口和全层伤口、压迫溃疡、压迫溃疡、静脉曲张性溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道/潜行伤、术后伤口(例如：供体部位/移植物、Mohs手术后、激光手术后、足病、伤口裂开)、外伤(例如：擦伤、割伤、二度烧伤和皮肤划伤)以及引流伤。在一些实施方案中，本发明的胶原组合物意在一次性使用。

本发明还涵盖了将药物活性剂，其包括但不限于：血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、血管生成因子、抗生素、抗真菌剂、杀精子剂、激素、酶、酶抑制剂，掺入本发明的胶原组合物中，如本发明4.4.2.7节所述用于向皮肤递送，以及任何上述生物分子。在某些实施方案中，药物活性剂以生理有效量来提供。

在一些实施方案中，胶原组合物在用于伤口位点前，还种植了活细胞，所述细胞包括但不限于自体干细胞、干细胞和自体成体细胞。

本发明的胶原组合物用于治疗伤口感染是特别有用的，例如手术故障或外伤导致的伤口感染。在特定的实施方案中，胶原组合物采用用于伤口感染治疗的治疗有效量的试剂来浸润，所述试剂包括但不限于抗生素、抗微生物剂和抗细菌剂。本发明的胶原组合物具有治疗本领域已知的任何微生物的伤口感染的临床和治疗用途，例如：来源于人体内的感染伤口的微生物(人体已知是病原微生物的储库)，或来源于环境来源的。在伤口中的生长可以被本发明的方法和组合物降低或阻止的微生物的非限制性实例是：金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermis)、β-溶血性链球菌(haemolytic Streptococcus)、E.coli、克雷伯菌(Klebsiella)和假单胞菌(Pseudomonas)属，以及厌氧细菌魏氏梭状芽胞杆菌(Clostridium welchii)或第三梭状芽胞杆菌(Clostridium tertium)，其是气性坏疽的病因，主要位于深部外伤中。

在其它实施方案中，本发明的胶原组合物用于伤口治疗，包括但不限于表皮伤口、皮肤伤口、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口(例如：在手术过程中，胶原组合物可以围绕在吻合位点，以防止血液从缝合线漏出，并且防止身体对缝合材料形成粘附)、先天性伤口(例如：营养不良性大疱性表皮松解症)。特别的，胶原组合物在压迫溃疡(例如：褥疮)的治疗中具有增强的用途。压迫溃疡通常发生在经历长期卧床的患者上，例如四肢麻痹患者和下身麻痹患者，由于局部压力的原因，承受着皮肤丧失的痛苦。产生的褥疮表现出真皮腐蚀并缺少表皮和皮肤附属器。在其它更特定的实施方案中，本发明的胶原组合物用于控制伤口，包括但不限于部分和全层伤口、压迫溃疡、静脉曲张性溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道/潜行伤口、术后伤口(例如：供体部位/移植物、Mohs手术后、激光手术后、足病、伤口裂开)、外伤(例如：擦伤、割伤、二度烧伤和皮肤划伤)和引流伤。

本发明的胶原组合物还可用于烧伤的治疗，包括但不限于一度烧伤、二度烧伤(部分厚度烧伤)、三度烧伤(全层烧伤)，烧伤的感染、切痂和不切痂的烧伤、移植伤口的感染、供体位点的感染、原移植或愈合烧伤或皮肤移植供体位点的表皮缺失，以及烧伤脓疱病。

6.7.2.12牙科

本发明的胶原组合物在牙科(例如：牙周手术)中具有特殊的用途，其能指导牙周组织再生的组织再生，指导骨质再生和牙根覆盖。本发明涵盖了使用本发明的胶原组合物促进牙周骨内组织缺损的再生，其包括但不限于：匹配双侧牙周组织缺损、牙间隙骨内缺损、深3壁骨内缺损、2壁骨内缺损、和骨内缺损2和3。对于牙周组织骨内缺损治疗，本发明的胶原组合物与本领域已知的其它技术相比，预期具有增强的治疗用途和增强的临床参数，所述已知技术例如：如Quteish等人，1992,J.Clin.Periodontol.19(7):476-84；Chung等人，1990,J.Periodontol.61(12):732-6；Mattson等人，1995,J.Periodontol.66(7):635-45；Benque等人，1997,J.Clin.Periodontol.24(8):544-9；Mattson等人，1999,J.Periodontol.70(5):510-7中公开的交联的胶原膜的使用。利用本发明的胶原组合物改善的临床参数的实例包括但不限于：菌斑和牙龈指数评分、牙周袋探针深度(probingpocket depth)、探针附着深度(probing attachment depth)，以及根分叉病变和骨质缺损的分类，都是本领域技术人员已知的。

本发明还涵盖了本发明的胶原组合物在治疗II型根分叉缺损中的用途，所述缺损包括但不限于：双侧缺损、成对的口腔II级下颌磨牙根分叉缺损，和双侧下颌根分叉缺损。本发明的胶原组合物在治疗II级根分叉缺损中的应用，可以部分的解释为它在根分叉缺损中使缺失的齿根膜再生的能力。与本领域使用的胶原膜相比，预期本发明的胶原组合物对于II级根分叉缺损的治疗，具有增强的治疗和临床用途，所述胶原膜如在Paul等人，1992,Int.J.Periodontics Restorative Dent.12:123-31；Wang等人，1994,J.Periodontol.65:1029-36；Blumenthal,1993,J.Periodontol.64:925-33；Black等人，1994,J.Periodontol.54:598-604；Yukna等人，1995,J.Periodontol.67:650-7中公开的。

本发明还涵盖了本发明的胶原组合物在牙根覆盖方法中的用途。本发明的胶原组合物在牙根覆盖中的应用，可以部分的解释为基于指导组织再生的原则，其取代缺失的、受损的或疾病的牙龈组织的能力。与本领域传统用于牙根覆盖的胶原膜相比，预期本发明的胶原组合物对于牙根覆盖，具有增强的治疗和临床用途，所述的胶原膜公开在例如Shieh等人，1997J.Periodontol.,68:770-8；Zahedi等人，1998J.Periodontol.69:975-81；Ozcan等人，1997J.Marmara Univ.Dent.Fa.2:588-98；Wang等人，1997J.Dent.Res.78(Spec Issue):119(摘要.106)中，如上文的原因引用。

本发明还涵盖了胶原组合物在具有牙周病的个体中的用途，所述牙周病包括但不限于牙周炎和齿龈炎。本发明的胶原组合物还具有作为添加剂在洁治加根面平整(scaling and root planing)方法中的临床用途。本发明涵盖了使用本发明的胶原组合物治疗具有牙周病的个体。使用本发明的胶原组合物治疗个体的牙周病的示例性方法包括：将胶原组合物(其可以采用抗生素例如葡萄糖酸洗必太进行浸润)插入个体的一个或多个牙周袋中，例如大于或等于5mm。有利的，胶原组合物可以是生物可降解的。

根据治疗的牙病的类型，在牙科中使用的本发明的胶原组合物可以采用一种或多种生物分子来浸润。本发明的方法和组合物涵盖了本领域已知的、用于牙病治疗的任何生物分子。在特定的实施方案中，在与感染相关的牙病治疗中使用的胶原组合物可以采用一种或多种抗生素进行浸润，所述抗生素包括但不限于：盐酸强力霉素(doxocycline)、四环素(tetracycline)、葡萄糖酸洗必太(chlorhexidine gluconate)和米诺环素(minocycline)。

6.7.2.13其它用途

本发明的胶原组合物还可以用作卵巢或子宫角的术后粘连障碍。胶原组合物还可以用作脑的粘连障碍(例如：脑膜-脑粘连)。因此，胶原组合物可用于重建分隔硬脑脊膜和软脑膜的硬膜下腔。通常的，胶原组合物可用作受伤内脏的包裹物，例如脾脏，或作为附着在肺上的薄膜，以控制术后漏气。胶原组合物还可用于(在鼓膜穿孔中)支持鼓膜移植的手术治疗，或作为乳突腔的内层。胶原组合物还可用作新阴道成形术中的内层组织。在心血管手术中，胶原组合物可以用作心包封闭材料。胶原组合物还可以在输精管吻合术中完成吻合中使用。

6.7.3包含干细胞的组合物的应用

在任何上述用途的范围内，不论是美容的或非美容的，组合物可以包含一种或多种类型的干细胞，优选的胎盘干细胞，如上文5.6节描述的。当胎盘干细胞与本发明的组合物接触时，胎盘干细胞分泌促进伤口愈合的细胞因子，例如：IL-6、IL-8和MCP-1(单核细胞化学引诱蛋白-1)。在本发明的组合物不包含或仅包含可忽略量的纤粘连蛋白的实施方案中，当允许胎盘干细胞附着在组合物上时，胎盘干细胞分泌胞外基质蛋白，包括纤粘连蛋白。因此，组合物，结合附着在组合物上的胎盘干细胞，可以作为创建表面或导管，来刺激和允许细胞迁移到接受所述组合的个体一部分之内，或沿所述部分迁移。

组合物和干细胞可以共同向个体施用。例如，在一实施方案中，组合物可以包含干细胞(在向个体施用组合物之前不久(例如：在10-20分钟内)，已经与组合物接触)。在另一实施方案中，在施用前，通常在施用前至少1小时，干细胞可以与组合物接触一段时间以允许干细胞附着至组合物。在更特定的实施方案中，施用前的时间是足以使干细胞附着和增殖的时间，通常在施用前至少24小时至48小时，或更久。在另一更特定的实施方案中，所述时间是足以使干细胞在本发明的组合物上附着和增殖，并沉积可检测量的胞外基质蛋白，例如纤粘连蛋白的时间。

组合物和干细胞也可以分别向个体施用。例如，在一实施方案中，组合物可以向个体的伤口位点或组织需要修复的位点施用，然后再施用干细胞。在另一实施方案中，干细胞与伤口或需要修复的组织位点接触，然后伤口或需要修复的组织再接触本发明的组合物。

因此，在一实施方案中，本发明提供了促进伤口愈合的方法，包括用包含干细胞(例如：胎盘干细胞)的本发明的组合物接触伤口，其中，干细胞分泌IL-6、IL-8或MCP-1，或其任意组合，或者向至少一部分伤口分泌纤粘连蛋白。当干细胞分泌纤粘连蛋白时，优选的本发明的胶原组合物包含不可检测量的纤粘连蛋白。在特定的实施方案中，组合物几乎按照伤口的形状成型或形成。在某些实施方案中，伤口是不愈合的伤口。在特定的实施方案中，伤口是小腿溃疡，例如静脉曲张性小腿溃疡、动脉小腿溃疡、糖尿病小腿溃疡或褥疮(压迫)溃疡。当伤口是小腿溃疡时，组合物优选的形成大小足以覆盖至少一部分溃疡的薄膜，且薄膜至少在接触溃疡的薄膜表面包含胎盘干细胞。在不同的实施方案中，所述伤口是意外伤，或由手术操作引起的或附属的伤口。所述手术操作可以是如上述本发明的胶原组合物可应用的任何手术操作，并且所述手术操作可以是美容手术或非美容手术。

在另一实施方案中，本发明促进了个体的一部分身体的组织缺损的改善或愈合。此类缺损可以是天然存在的，例如遗传缺损，如瘘管、缺陷型心瓣膜、腹壁穿孔，等。

6.8包含胶原组合物的试剂盒

本发明的另一方面，提供了包含本发明的胶原组合物的试剂盒。例如，本发明提供了用于填充或取代哺乳动物组织的试剂盒。所述试剂盒包括封装的本发明的一种或多种胶原组合物，用于向本领域熟练的技术人员分发。试剂盒可以包括标签，或采用根据本发明的方法使用胶原组合物用于填充或取代哺乳动物的组织的说明来标注。在某些实施方案中，试剂盒包括用于执行方法的组分，例如用于施用胶原组合物的装置，如一种或多种注射器、插管、导管等。在某些实施方案中，试剂盒可以包括用于安全处理施用胶原组合物的装置的组分(例如：用于使用过的注射器的“利器”容器)。在某些实施方案中，试剂盒可以包括在预填充的注射器、单位剂量和单位用量包装中的组合物。

在某些其它实施方案中，本发明的试剂盒可以包括本发明的胶原组合物，以及一种或多种用于干细胞群培养的其它组分。例如，试剂盒可以包括一种或多种构型的本发明的胶原组合物，所述构型适于干细胞(例如：胎盘干细胞)的培养，例如呈薄膜、管状、网状等形状的胶原组合物。试剂盒可以包括一种或多种用于干细胞培养的器具，例如在细胞培养过程中能够容纳本发明的胶原组合物的培养皿；塑料制品、注射器、移液器枪头、细胞培养基、一种或多种细胞因子或生长因子、一次性用品等。

在其它实施方案中，试剂盒可以包含一种或多种有利于从胎盘组织中收集干细胞的组分。在不同的特定实施方案中，试剂盒包含有利于灌流胎盘以收集干细胞的组分，例如：灌流液；一种或多种大小足以容纳胎盘的盘子，用于收集灌流液的玻璃器皿或塑料器皿；一个或多个用于收集灌流液的袋子，用于脐带血管插管的必需物和/或套管；等。在其它特定的实施方案中，试剂盒包含一种或多种有利于酶促消化胎盘组织，以分离胎盘干细胞的组分，例如：一种或多种组织消化酶(例如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)；适合细胞培养的塑料器皿(例如：培养皿、多孔培养板等)。

在某些实施方案中，试剂盒包括用于在至少一种医学领域，例如伤口愈合方面使用本发明的胶原组合物的说明书。在其它实施方案中，试剂盒包括用于在本发明的胶原组合物上培养一种或多种干细胞群的说明书。

7.实施例

在下列章节中，本领域技术人员应认识到短语“在约23℃”可以指室温。

7.1实施例1：从胎盘分离胶原

该实施例示例了从胎盘分离胶原。

根据本发明中描述的方法获得冷冻的胎盘。通过包裹在有水的Nalgene盘中1-4小时，来解冻胎盘。然后，除去塑料包裹，并置于水中进一步解冻。

将解冻的胎盘置于绞肉机的不锈钢盘中。从每个胎盘上切除脐带部分，并在约23℃将每个胎盘切成约4片。在约23℃用绞肉机磨碎所述片。

渗透压冲击：将获得的磨碎的胎盘添加到装有0.5M NaCl(5升/胎盘)的Nalgene槽中，并用马达驱动的搅拌器在75-100rpm混合(4-6℃，24小时)。

24小时后，停止搅拌器，使组织在约23℃沉淀在搅拌器的底部。在约23℃，使用蠕动泵，用#36管泵出组织和液体，并通过#40筛过滤，将分离的组织放回搅拌槽中。

将新鲜的0.5M NaCl(5升/胎盘)添加到混合物中，在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，75-100rpm)。在24小时后使用上述方法分离组织。

用水(5升/胎盘)洗涤组织，并在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，75-100rpm)。在24小时后使用上述方法分离组织。

用0.5M NaCl再次洗涤组织，然后再根据上述四个段落所述，用0.5M NaCl，接着再用水来洗涤组织。

冷冻干燥：将获得的样品按200-400g的量分装到冷冻干燥容器中，并在-70℃冷冻1-2小时。将冷冻样品在冷冻干燥器中冷冻干燥24-48小时，然后移除。在搅拌机中将冻干样品混合成均匀的粉末，然后转移至清洁的搅拌槽。

去垢剂处理：将1％脱氧胆酸溶液(1L/胎盘)与拌匀的、冻干样品添加到搅拌槽中。将样品和1％脱氧胆酸溶液在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，75-100rpm)。在24小时后，停止搅拌器，如上述用#40筛分离组织。

在4-6℃重复去垢剂处理24小时(有发动机的搅拌器，75-100rpm)。在24小时后，停止搅拌器，如上述用#40筛分离组织。

水洗涤：用水(5升/胎盘)洗涤组织，并在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，75-100rpm)。在24小时后，使用上述方法分离组织。

然后用水(5升/胎盘)再次洗涤组织，在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，100-150rpm)。在24小时后，使用上述方法分离组织。

然后用水(5升/胎盘)再次洗涤组织，在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，150rpm)。在24小时后，使用上述方法分离组织。

任选的，用水(5升/胎盘)第四次洗涤组织，并在4-6℃混合24小时(有发动机的搅拌器，150rpm)。在24小时后，使用上述方法分离组织。

冷冻干燥：将获得的样品按200g的量添加到搅拌器中。向样品中添加200mL去离子水，并在搅拌机中将样品混合成均匀的糊状。倒出混匀的样品，并用水(1升/胎盘)漂洗。

将200-400g量的样品添加到冻干容器中。将样品分装并在-70℃冷冻。分装的样品冻干24-48小时。

无菌碱处理：倒出冻干的样品。将氢氧化钠溶液(0.5M，1L)添加到高压灭菌的、无菌瓶中。将低内毒素水(1L)添加到倒出的、冻干样品中。在约23℃，将样品和氢氧化钠溶液在振荡器上250rpm混合4小时。

无菌水洗涤：通过无菌的#70滤器过滤，回收样品，并用1L无内毒素的水漂洗。添加无内毒素水(1L)，并在约23℃，在振荡器上250rpm混合样品18-24小时。

通过无菌的#70滤器过滤，回收样品。添加无内毒素水(1L)，在约23℃，在振荡器上250rpm混合样品18-24小时。

通过无菌的#70滤器过滤，回收样品，并用1L无内毒素的水漂洗。添加无内毒素水(1L)，并在约23℃，在振荡器上250rpm混合样品18-24小时。

如果pH大于9，用无内毒素的水再次洗涤样品，并在振荡器上约250rpm混合样品约18-24小时。

如果pH小于或等于9，则样品可供制剂。

产量可以是10g/胎盘或更多。

可以冻干获得的样品，供储存。对于使用，样品可以在搅拌器中以300-1000mg/mL悬浮在磷酸缓冲盐溶液中，作为糊剂在例如注射器中使用。样品还可以500-1000mg/ml在磷酸缓冲盐溶液中铸模，并成型成例如薄膜、管状、塞状等供使用。

7.2实施例2：端肽胶原样品的制备

根据实施例1的渗透压冲击、冷冻干燥、去垢剂处理、水洗涤、冷冻干燥、碱处理、水洗涤和冷冻干燥步骤，制备出7.5g端肽胶原。

根据实施例1的渗透压冲击、冷冻干燥、去垢剂处理、水洗涤、碱处理、水洗涤和冷冻干燥步骤，制备出11.8g端肽胶原。

根据实施例1的渗透压冲击、冷冻干燥、去垢剂处理、水洗涤、碱处理、水洗涤和冷冻干燥步骤，制备出12.0g端肽胶原。

根据实施例1的渗透压冲击、去垢剂处理、水洗涤、碱处理、水洗涤和冷冻干燥步骤，制备出11.8g端肽胶原。

7.3实施例3：生物化学分析

根据实施例1和2制备胶原样品。标准技术进行的生物化学分析显示，胶原占干重80.40％，水11.00％和少于0.01％纤粘连蛋白、层粘连蛋白和糖胺聚糖。未测定弹性蛋白含量。

根据实施例1和2制备的样品的氨基酸分析显示，34-35％甘氨酸、约11％羟脯氨酸和10-11％脯氨酸。

根据实施例1和2制备的样品的免疫学分析显示，74-92％ I型胶原，4-6％ III型胶原和2-15％ IV型胶原。

7.4实施例4：制造ECM的替代方法，和在ECM上的干细胞培养

该实施例示例了制造本发明的胶原组合物的替代方法，并提供了分析通过这类方法制造的材料组合物的方法。

材料和方法

胞外基质(ECM)的分离：如下分离ECM。简而言之，在0.5M氯化钠中解冻冷冻的人胎盘，在绞肉机中磨碎，并在23℃下，在培养箱的振荡器中，在0.5M氯化钠和水中重复洗涤，再用去垢剂，例如1％ SDS或0.5％脱氧胆酸来洗涤。用0.1-0.5N氢氧化钠处理无血液的胎盘组织，处理的时间在3小时和24小时之间不等，以使小叶组织可溶化，再用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗，以中和pH。如此生产的材料是稳定的糊状物，并储存在4℃下。

生物化学分析：为了确定分离的ECM的生物化学组成，冷冻干燥1克样品，并确定干重。通过在70℃溶于100mM HCl中，或在23℃下，在10mM HCl中胃蛋白酶处理(1mg/gm)ECM 18小时，使ECM溶解。使用溶解在100mM HCl中的组织来确定纤粘连蛋白、层粘连蛋白、GAG和弹性蛋白的含量。使用胃蛋白酶-溶解的组织来确定胶原含量。

使用夹心ELISA来确定纤粘连蛋白和层粘连蛋白的浓度。使用染料检测来确定弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)含量。使用夹心ELISA(Chondrex)进行I型胶原含量的确定。使用II型和IV型胶原的一抗，和HRP-偶联的二抗，采用自制ELISA，来确定III型和IV型胶原含量。

ECM构建体的制备：为了制备ECM材料的薄膜，将一层水合的ECM糊状物夹在两层医学级的膜之间。将该构建体装载到干胶器上，在23℃使用真空过夜，直到ECM膜干燥。将薄膜剪切成用于细胞培养研究的合适大小。为了制备ECM的3D结构，将ECM糊状物填充到不同的模具中，并冻干。研究ECM膜和3D模具在培养基或水中的稳定性。将构建体置于水、生理盐水或细胞培养基中，在37℃下培养长达1周时间。

细胞培养物：将胎盘干细胞继代培养于60％低糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)、40％ MCDB-201(Sigma,St.Louis MO)、2％胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒添加物(Invitrogen)、0.02％亚麻酸/牛血清白蛋白(Sigma)、10ng/ml表皮生长因子(Sigma)、10ng/ml血小板衍生生长因子(R&D Systems,Minneapolis,MN)、0.05M地塞米松(Sigma)、0.1mM抗坏血酸2-磷酸(Sigma)和100U青霉素/1000U链霉素(Invitrogen)中。将胎盘干细胞(30,000个/孔)接种在已经置于24多孔微孔板中的ECM膜上。胎盘干细胞还以相等的密度，接种在用胶原(Inamed,Fremont,CA)预包被的Labtek腔室玻片(Nalgene Nunc International,Rochester,NY)上。细胞在37℃培养3和48小时，并被处理用于免疫荧光显微镜检。

免疫荧光显微镜检：在用ECM膜培养3或48小时后，用3.7％甲醛固定胎盘干细胞-ECM构建体10分钟，并用0.5％ Triton-X 100透化20分钟。用AlexaFluor 488-偶联的鬼笔环肽培养胎盘干细胞，使F-肌动蛋白可视化。对于纤粘连蛋白染色而言，用兔抗人纤粘连蛋白抗体(Sigma)在封闭的缓冲液(3％牛血清白蛋白/1×磷酸缓冲盐溶液)中培养样品1小时，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，并再用AlexaFluor 594-偶联的抗兔-抗体在封闭缓冲液中培养样品30分钟。将样品再用磷酸缓冲盐溶液洗涤，并置于载玻片上，用荧光显微镜观察。

细胞因子分泌分析：从含有胎盘干细胞的细胞培养ECM薄膜上，以及从含有胎盘干细胞的组织培养处理板上，在培养的0、3、24和48小时，移除培养基样品(100μl)。将样品用1mL PBS稀释，并分析细胞因子的存在。根据已知浓度的细胞因子的标绘图，计算每种细胞因子的浓度。

分离ECM：对应湿重约300g每个的胎盘，典型的胎盘干重是约30g。如图1所示，可以使用渗透压冲击步骤和去垢剂洗涤步骤来除去大量的非胞外基质组织，其最终残留重量为约10g。使用NaOH和去垢剂的增溶作用的结合，导致残重进一步降低至约6g。已经发现暴露在NaOH中的时间，和NaOH的浓度，将影响从胎盘分离的ECM总量。使用不同的去垢剂和NaOH洗涤步骤，将产生5种不同的ECM终材料。通常，单个胎盘产生约6g至约10g的ECM材料。

ECM的生物化学组成：5种不同的ECM的生物化学分析显示，它们基本上由胶原组成；I型是主要的胶原(总胶原的约74％至约90％)，III型(总胶原的约4％至约6％)和IV型(总胶原的约2％至约15％)是次要组分。在胎盘ECM中发现的其它主要的胞外基质蛋白是弹性蛋白。如表1所示，弹性蛋白代表了ECM-1至ECM-4的总干重的约3-5％。然而，未使用NaOH产生的ECM-5，含有约12％弹性蛋白。当鉴别在通过五种方法制造的ECM材料中的糖胺聚糖时，％干重似乎不受分离方法中使用NaOH的影响。相反，重要的粘附蛋白纤粘连蛋白和层粘连蛋白的存在，则对NaOH的使用非常敏感。经过NaOH处理，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不能保留，其在ECM 1至4中都未发现。然而，不使用NaOH分离的ECM-5则具有更丰富的黏附蛋白的组成(表1)。

表1：由不同方法制造的胎盘胶原组合物中存在的胞外基质蛋白组分。

	纤粘连蛋白	层粘连蛋白	GAGs	弹性蛋白
					ECM-5	0.6％	0.16％	0.40％	12％
ECM-4	0	0	0.28％	4.7％
					ECM-3	0	0	0.34％	3.2％
ECM-2	0	0	0.38％	4.4％
					ECM-1	0	0	0.59％	3.5％

％＝百分比干重

细胞结合研究：在接种3个小时后，在所有的ECM(#1-5)中都观察到了相似水平的胎盘干细胞附着。与ECM结合的干细胞的水平少于在纯化胶原上观察到的水平。此时，纤粘连蛋白的免疫染色揭示了丰富的胞外染色，并且没有检测到胞外纤粘连蛋白。通过48小时培养，在纯化的胶原、ECM2和ECM4上观察到胎盘干细胞数量增加，并且具有相似的伸展良好的形态学。相反，在ECM1上培养的胎盘干细胞则没有旺盛生长。不仅只观察到少量的细胞，而且细胞的形态学是圆形的，而不是伸展良好的。在ECM5上的胎盘干细胞比其它ECM或胶原上的胎盘干细胞表现出更多的拉长或极化。

因为干燥后材料表面不均一，对附着在ECM3上的细胞的测定有些损害。由于难以沿着一个焦平面成像，它开始表现出非常少的细胞附着；然而，对不同焦平面的观察揭示了某些细胞附着在ECM3上。

在48小时时间点对纤粘连蛋白的免疫染色揭示在ECM1-ECM4上存在大量的胞外纤粘连蛋白培养基纤丝的网络。这些纤粘连蛋白培养基纤丝是由胎盘干细胞组装的，因为对照中，在没有培养胎盘干细胞的ECM上没有显示出纤粘连蛋白纤丝。与ECM1-ECM4相反，ECM5和胶原不支持胎盘干细胞组装纤粘连蛋白培养基；在它们的表面没有检测到胞外纤丝状的纤粘连蛋白。

细胞因子阵列研究：我们研究了作为在ECM上结合和增殖的结果，胎盘干细胞的关键性细胞因子/趋化因子的分泌。将ECM上的细胞因子分泌与在组织培养处理的细胞培养板上培养的胎盘干细胞进行比较。使用了标准的25-多重细胞因子阵列，其包括某些白介素和细胞因子(Biosource)。细胞因子包括IL-1β、IL-1Ra、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40/p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、嗜酸细胞活化趋化因子、Rantes和MCP-1。对于研究的25种细胞因子，当胎盘干细胞在ECM膜上培养时，观察到3种细胞因子的分泌增加：IL-6、IL-8和MCP-1，超过和多于在组织培养处理板上培养的胎盘干细胞的分泌。附图2A-2C显示，在5种ECM构建体上的胎盘干细胞的细胞因子分泌(IL-6、IL-8和MCP-1)呈时间依赖性增加。所有数据都归一化为1000个结合细胞/cm²。由于没有MCP-1分泌的明显增加，ECM-5是个例外，这提示当培养在该胞外基质上时，胎盘干细胞发生细胞生理学改变。如前所示，非常不同于ECM-1至-4，ECM-5不支持纤粘连蛋白的表达。需要注意的是，ECM-5是唯一不用NaOH制备的培养基，并具有保留了2种关键性细胞粘附蛋白纤粘连蛋白和层粘连蛋白的生物化学组成。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过全文引用纳入本发明中，正如同特定和单独指出每种单独的出版物或专利申请都通过全文引用并纳入本发明。虽然为了清楚的理解，前述本发明已经通过示例和实施例的方式，进行了详细描述，但是，对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导，可以在不脱离所附权利要求的主旨和范围内，对本发明进行某些改变和修饰，这是显而易见的。

Claims (13)

1.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原。

2.去垢剂处理的端肽胶原，其包含可检测量的纤粘连蛋白。

3.权利要求1或权利要求2的组合物，包含大量的干细胞。

4.一种填充、扩大或取代哺乳动物组织的方法，包括向哺乳动物的组织施用权利要求1的胶原。

5.一种填充、扩大或取代哺乳动物组织的试剂盒，包括权利要求1的胶原和标签，该标签具有施用交联的端肽胶原的指示。

6.一种从包含胶原的哺乳动物组织制备端肽胶原的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将所述组织与渗透压冲击溶液接触，以产生胶原组合物；

b.将所述胶原组合物与去垢剂接触；和

c.将所述去垢剂-处理的胶原溶液与碱溶液接触。

7.一种促进伤口愈合的方法，包括将所述伤口与本发明的胶原组合物接触，其中，与未接触所述组合物的伤口相比，所述接触导致所述伤口的一方面有可检测的较大的改善。

8.一种制造组合物的方法，包括将权利要求1的组合物与大量的干细胞接触。

9.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原在治疗中的用途。

10.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原用于填充、扩大或取代哺乳动物组织的用途，其中所述填充、扩大或取代包括将所述胶原施用到所述哺乳动物的组织。

11.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原在生产用于填充、扩大或取代哺乳动物组织的组合物中的用途，其中所述填充、扩大或取代包括将所述胶原施用到所述哺乳动物的组织。

12.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原在促进个体的伤口愈合中的用途，其中所述促进包括将所述伤口与组合物接触，并且与未接触所述组合物的伤口相比，其中所述接触导致所述伤口的一方面有可检测的较大的改善。

13.碱处理的、去垢剂处理的端肽胶原在生产用于促进个体的伤口愈合的组合物中的用途，其中所述促进包括将所述伤口与所述组合物接触，并且与未接触所述组合物的伤口相比，其中所述接触导致所述伤口的一方面有可检测的较大的改善。