KR20180086533A - 천연(텔로펩티드) 태반 콜라겐 조성물 - Google Patents

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KR20180086533A
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cells
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모힛 브하티아
크리스 루고
퀴안 예
제임스 더블유. 에딘져
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안트로제네시스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 사람 태반 텔로펩티드 콜라겐을 함유하는 조성물, 이 조성물을 제조하는 방법, 이 조성물의 사용 방법과 이 조성물을 함유하는 키트를 제공한다. 이러한 본 발명의 조성물, 키트와 방법은 유용한데, 예를 들어, 포유류 조직을 보강하거나 대체하는데 유용하다.

Description

천연(텔로펩티드) 태반 콜라겐 조성물{Native(telopeptide) Placental Collagen Compositions}
본 발명은 콜라겐, 예를 들어 사람 태반 콜라겐을 함유하는 조성물과 이러한 조성물의 제조 방법 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2006년 10월 6일에 출원한 미국 임시 특허 출원 제60/850,131호의 우선권을 주장하는데, 본 출원은 인용에 의하여 이 출원의 내용 전부를 포함한다.
콜라겐은 피부와 내부 장기를 지탱하는 힘줄, 뼈, 이빨과 판을 비롯한 많은 체내 구조를 이루는 단백질이다. 콜라겐은 3중 나선을 이루는 세 개의 사슬로 이루어진다. 이 구조는 세 아미노산의 반복으로부터 유래한다. 이러한 나선에서는 아미노산 세 개마다 글리신이 한 번 포함되며 나머지 아미노산 중 다수가 프롤린과 하이드록시프롤린이다.
콜라겐은 상업적으로 또 임상적으로 오랜 동안 쓰이어 왔다. 현재 콜라겐은 피부, 힘줄, 연골, 뼈와 사이질(interstitum) 등의 경질 또는 연질의 연결 조직을 보강하거나 대체하는데 쓸 수 있다. 고형 콜라겐을 이식하는 수술이 이루어진바 있고, 주사형 콜라겐 제형도 더 편리한 투여를 위하여 이용할 수 있다. 현재 주사할 수 있는 콜라겐 조성물이 몇 가지 시판 중인데, 여기에는 ZYDERM(등록상표), ZYPLAST(등록상표), COSMODERM(등록상표)과 COSMOPLAST(등록상표)가 포함된다.
각 콜라겐 조성물은 어떠한 기법을 쓰느냐에 따라 사용하는데 유리하거나 불리한 특정한 물리적 성질을 가지고 있다. 따라서 종래 기술에서는 이 분야의 당업자에게 콜라겐 조성물의 선택폭을 넓힐 수 있게 하는 새로운 물리적 성질을 갖춘 콜라겐 조성물에 대한 필요성이 남아 있었다.
본 발명은 사람 태반 텔로펩티드 콜라겐을 함유하는 조성물, 이 조성물을 제조하는 방법, 이 조성물의 사용 방법과 이 조성물을 함유하는 키트를 제공하기 위한 것이다.
발명의 요약
*본 발명은 부분적으로는 유용한 조성물, 예를 들어 포유류 조직의 보강이나 대체에 유용한 콜라겐 조성물을 발견한 것에 그 바탕을 두고 있다. 몇몇 실시 태양에서, 이 콜라겐 조성물은 원료 조직으로부터 상당한 높은 수율로 제조할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 오염, 예를 들어 세포 및/또는 기타 단백질 오염원에 의한 오염이 적게 나타난다. 본 발명의 몇몇 실시 태양에서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 유리하게도 독성이 낮다. 본 발명의 몇몇 태양에서, 이 콜라겐 조성물은 텔로펩티드(telopeptide) 콜라겐 조성물의 제조를 위한 편리한 원료가 된다.
본 발명의 한 측면에서는 염기와 세제(detergent)로 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 함유하는 조성물을 제공한다. 심지어 포유류 조직을 원료로 삼아 시작하는 경우에도, 이러한 조성물을 비교적 적은 단계 수를 밟아 쉽게 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 제공하는 일부 조성물은 세포 잔해, 세포 수준 이하 잔해(subcellular debris) 및/또는 단백질 오염물을 실질적으로 포함하지 않는데, 단백질 오염물에는 피브로넥틴, 라미닌, 사이토킨과 성장 인자가 있다. 본 명세서에서 개시하는 일부 조성물은 콜라겐 함량이 높다. 몇몇 실시 태양에서, 본 조성물은 전체 조성물 속 단백질 양 기준으로 적어도 90% 이상의 콜라겐을 함유한다. 다른 일부 태양에서는 본 콜라겐 조성물이 라미닌 및/또는 피브로넥틴을 실질적으로 가지고 있지 않다(예를 들어, 이 조성물은 건조 중량 기준으로 라미닌 및/또는 피브로넥틴을 각각 1% 미만으로 가지거나 검출할 수 있는 양 미만으로 함유한다).
다른 측면에서 본 발명은 복수의 줄기세포를 함유하는 본 발명의 콜라겐 조성물, 예를 들어 염기와 세제로 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 제공한다. 여러 실시 태양에서, 이 줄기세포는 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 중간엽 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 조혈 전구세포(예를 들어 말초 혈액 유래의 조혈 줄기세포, 신생아 혈액, 태반 혈액, 제대혈, 태반 관류물 등), 체세포 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 이자 줄기세포, 내피 줄기세포, 심장 줄기세포, 근육 줄기세포, 지방 줄기세포 등이다.
더 구체적인 실시 태양에서, 이 줄기세포는 태반 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34- 및/또는 CD200+이다. 상기 태반 줄기세포는 CD10, CD73, CD105, CD200, HLA-G 및/또는 OCT-4를 발현하고 CD34, CD38 또는 CD45를 발현하지 않는다. 이 태반 줄기세포는 또한 HLA-ABC(MHC-1)와 HLA-DR를 발현할 수 있다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명의 조성물과 함께 쓰일 수 있는 줄기세포는 CD200+이거나 HLA-G+이다. 다른 특정 태양에서 이 줄기세포는 CD73+, CD105+이고 CD200+이다. 다른 특정 태양에서 이 줄기세포는 CD200+이고 OCT-4+이다. 다른 특정 태양에서 이 줄기세포는 CD73+, CD105+이고 HLA-G+이다. 다른 특정 태양에서, 이 줄기세포는 CD73+과 CD105+이며, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진한다. 다른 특정 태양에서 이 태반 줄기세포는 OCT-4+이고, 배아유사체의 형성을 촉진하는 조건 속에서 배양하였을 때, 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진한다.
줄기세포와 결합하기 전 또는 결합 후에, 줄기세포를 함유하는 이 조성물을 어떠한 형태로라도 형성할 수 있다. 한 태양에서, 상기 조성물은 판상(sheet)인데, 예를 들어 두 개의 면을 가지는 건조된 판이며, 이 줄기세포는 이들 면 중 적어도 한 쪽에 존재한다. 다른 태양에서, 본 조성물은 튜브 형태인데, 상기 줄기세포는 이 튜브의 내측과 외측면 중 적어도 한 쪽 면에 존재한다. 다른 특정 실시 태양에서, 이 줄기세포는 본 조성물에 부착하고 있다. 상기 실시 태양들 중 하나의 특정 태양에서, 이 줄기세포는 본 조성물과 접촉하였을 때 IL-6, IL-8, 및/또는 MCP-1(단핵구 화학주성 단백질-1)을 분비한다.
다른 측면에서, 본 발명은 염기와 세제로 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다. 태반 조직의 근원은 어느 포유류를 사용하여도 되지만, 몇몇 실시 태양에서는 사람 태반을 이용한다. 이 태반 조직은 (가용성 또는 불용성을 막론한) 양막, 융모막과 탯줄 또는 태반 전체를 비롯한 태반의 모든 부분에서 유래할 수 있다. 몇몇 태양에서 이 태반 콜라겐은 탯줄을 꺼낸 뒤 사람의 전체 태반으로부터 제조하게 된다.
몇몇 태양에서 이 과정은 태반 조직에 삼투압 쇼크를 주는 단계를 포함한다. 작동 방식에 관한 어떠한 이론에 얽매이고자 하는 바는 아니지만, 이 삼투압 쇼크는 조직 속 세포를 터뜨려서 세포, 세포내 성분과 혈액 성분의 제거를 돕는 것으로 생각하고 있다. 이 삼투압 쇼크 단계는 본 발명의 콜라겐 조성물을 더 유리한 순도로 얻게 해 준다. 삼투압 쇼크는 이 분야 당업자에게 알려진 모든 삼투압 쇼크 조건하에서 이루어질 수 있다. 어떤 실시 태양에서는 고농도 염 조건에서 배양한 뒤 수용액 속에서 배양함으로써 이 삼투압 쇼크를 수행한다. 이러한 배양은 당업자의 판단하에 반복할 수 있다. 몇몇 태양에서는 배양을 두 단계 이상 실시한다.
이 삼투압 쇼크 후에 생기는 콜라겐 조성물은 세제로 처리할 수 있다. 이 세제로는 원료 조직의 단백질과 지질 세포 성분을 가용화할 수 있는 세제로서 당업자가 알고 있는 모든 것을 사용할 수 있다. 몇몇 태양에서 이 세제는 황산도데실나트륨이나 데옥시콜린산나트륨 등의 이온성 세제이다. 몇몇 실시 태양에서 이 세제는 TWEEN(등록상표) 또는 TRITON(등록상표)-X 세제 등의 비이온성 세제이다. 몇몇 태양에서 이 세제는 츠비터 이온성 세제이다. 몇몇 실시 태양에서 이 세제는 황산도데실나트륨(SDS)이다. 몇몇 태양에서는 원료 조직의 세포 또는 세포 수준 이하 성분을 가용화하는 조건으로 이 분야에 공지된 조건하에서 이 콜라겐 조성물을 세제에 접촉시킨다. 이 세제 처리는 당업자의 판단에 따라 거듭할 수 있다. 몇몇 태양에서 세제 처리는 두 번 이상 거듭된다.
몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 염기성 조건에서 처리할 수 있다. 예를 들어 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 알칼리성 용액, 예를 들어 수산화암모늄, 수산화칼륨이나 수산화나트륨 용액에 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 약 0.5 M의 수산화나트륨 속에 본 발명의 조성물을 얻기에 충분한 시간 동안 배양한다. 이러한 염기성 처리는 당업자의 판단에 따라 거듭할 수 있다. 몇몇 태양에서 염기성 처리는 두 번 이상 거듭된다.
몇몇 실시 태양에서, 제조 방법은 어떠한 순서로도 진행될 수 있다. 몇몇 태양에서는 모든 세제 처리 또는 염기성 조건하 처리에 앞서 삼투압 쇼크 단계가 적어도 하나 존재한다. 몇몇 태양에서는 염기성 처리 단계에 세제 처리 단계가 선행하고, 다시 이 앞에 적어도 하나의 삼투압 쇼크 단계가 존재한다.
나아가 본 발명의 한 측면에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 조직을 보강하거나 대체할 필요가 있는 포유동물에 투여함으로써 포유동물 조직을 보강, 대체하는 방법을 제공한다. 몇몇 태양에서 이 포유동물은 사람이다. 이 콜라겐 조성물은 당업자에게 공지된 모든 수단을 이용하여 투여할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 주사로 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 본 발며의 콜라겐 조성물의 유변학적(rheological) 특성이 유리하다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 미국 특허 공보 제2004/0048796호에 기재한 방법에 따라 세포외 매트릭스로 사용할 수 있는데, 이 공보 내용 전부는 본 발명의 참조 문헌이다.
본 발명의 다른 측면에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 투여가 필요한 포유동물에 투여하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 본 발명의 조성물을 당업자에게 배포하기에 편리하게 포장하여 갖추고 있는 것이 전형적이다. 이 키트는 본 발명의 콜라겐 조성물을 포유동물에 투여하는 수단을 더 갖추고 있을 수 있다. 이러한 수단은 주사기, 주사기와 바늘, 카눌라(canula) 등 콜라겐 조성물을 투여하는 수단으로 당업자에게 알려진 어떠한 수단이라도 가능하다. 몇몇 태양에서 이러한 수단은 본 발명의 콜라겐 조성물로 미리 채워져 있다.
다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 콜라겐 조성물을 상처에 접촉시키는 단계를 포함하는 상처 치유 촉진 방법을 제공하는데, 여기서 상기 접촉은 이 조성물과 접촉하지 못한 상처와 비교하였을 때 상처의 한 가지 측면을 측정 가능하게 개선한다. 어느 특정 태양에서 이 방법은 상기 상처를 복수의 줄기세포와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 상기 상처와 접촉하는 것이 상기 조성물이 상기 상처와 접촉하는 것과 별도로 이루어진다. 다른 특정 태양에서 상기 조성물은 상기 줄기세포를 함유한다. 다른 특정 태양에서 상기 조성물은 양쪽 면을 가지는 판상인데, 상기 줄기세포는 이 면 중 적어도 하나에 존재한다. 다른 특정 태양에서 상기 줄기세포는 상기 조성물에 부착하고 있다. 상기 실시 태양들 중 하나의 특정 태양에서, 이 줄기세포는 본 조성물과 접촉하였을 때 IL-6, IL-8, 및/또는 MCP-1(단핵구 화학주성 단백질-1)을 분비한다. 더 구체적인 실시 태양에서, 이 줄기세포는 태반 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD34- 및/또는 CD200+이다. 다른 구체적인 태양에서 상기 상처는 다리의 궤양이다. 이 다리의 궤양은 정맥성 다리 궤양, 동맥성 다리 궤양, 당뇨성 다리 궤양이나 다리 욕창이다. 다른 특정 태양에서 상기 조성물은 상처 충전물(wound filler)로 쓰인다.
다른 측면에서 본 발명은 조성물의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 조성물을 복수의 줄기세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 실시 태양에서 본 방법은 상기 복수의 줄기세포 중 적어도 일부가 상기 조성물에 부착하도록 한다. 다른 실시 태양에서, 본 방법은 상기 줄기세포가 상기 조성물 상에서 증식하도록 한다. 한 특정 태양에서 이 방법은 상기 줄기세포가 상기 조성물 상에서 세포 합류(confluency)에 이를 때까지 증식하도록 한다. 몇몇 태양에서 상기 줄기세포는 IL-6, IL-8 및/또는 MCP-1을 측정 가능한 양으로 생산한다. 다른 특정 태양에서 이 방법은 상기 줄기세포가 측정 가능한 양으로 적어도 하나의 세포외 매트릭스 단백질을 내어 놓았을 때 조성물을 탈세포화(decellularization)하는 단계를 포함한다. 더 구체적인 태양에서 이 세포외 매트릭스 단백질은 콜라겐(예를 들어, 제 I, II, III 또는 IV형), 피브로넥틴이나 엘라스틴이다.
앞서 설명한 내용과 이하에서 기술하는 바와 같이 본 발명의 조성물, 제조 방법, 기타 방법과 키트는 콜라겐 조성물이 필요한 포유동물에게 이를 투여하는데 쓸모가 있다.
이하 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
1. 정 의
본 발명에서 다음 용어들은 다음과 같은 의미를 지닌다.
"콜라겐"이란 용어는 이 분야 당업자에게 알려진 모든 콜라겐을 가리킨다.
"텔로펩티드 콜라겐(telopeptide collagen)"이라는 용어는 이 분야 당업자에게 알려진 콜라겐의 한 형태를 가리키는데, 이 콜라겐은 하나 이상의 텔로펩티드 영역(region)을 지닌다.
"무텔로펩티드 콜라겐(atelopeptide collagen)"이라는 용어는 이 분야 당업자에게 알려진 콜라겐의 한 형태를 가리키는데, 이 콜라겐은 하나 이상의 텔로펩티드 영역이 없다. 몇몇 태양에서는 이 텔로펩티드 영역을 아래 상술하는 단백질 분해효소 소화로 제거할 수 있다.
본 명세서에서 쓰인 "생체 적합성(biocompatibility)"이나 "생체적합한"이란 생체 조직에서 독성 반응, 유해 반응(injurious response)이나 면역 반응 또는 거부 반응을 일으키지 않음으로써 생물학적으로 적합한 특성을 가리킨다. 미지 물질에 대한 생체 반응은 생체에 인공 재료를 사용할 때 주된 염려거리이며 재료의 생체 적합성이란 따라서 이러한 재료를 설계할 때 중요한 고려 사항이다.
본 명세서에서 쓰인 "비발열성(non-pyrogenic)"이라는 용어는 시험 결과 발열원(pyrogen), 예를 들어 내독소(endotoxin)를 0.5 EU/mL 이하로 가진다고 밝혀진 것을 가리킨다. 단위 EU는 밀리리터 당 내독소 약 0.1 내지 0.2 ng으로서 근거 문헌에 따라 그 양이 달라진다.
"대상(subject)"이란 포유류 등의 동물을 가리키는데, 여기에는 영장류(예를 들어 사람), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 실시 태양에서는 대상이 사람이다.
2. 본 발명의 구현 태양
본 발명은 콜라겐 조성물, 콜라겐 조성물을 제조하기 위한 공정, 이 콜라겐 조성물을 함유하는 키트와 그 사용 방법에 관한 것이다.
2. 1. 본 발명의 콜라겐 조성물
한 실시 태양에서, 본 발명은 콜라겐 조성물은 유용한데, 예를 들어 포유류 조직을 보강하거나 대체하는데 유용하다. 몇몇 실시 태양에서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 유리한 내구성, 주사성과 유변학적 특성을 갖추고 있다. 몇몇 다른 태양에서, 공간을 메우는 특성이 있고 예를 들어 접촉하였을 때 조직의 혈관 형성을 촉진하고 지원하는 콜라겐 조성물을 제공한다. 몇몇 다른 태양에서 본 발명의 조성물은 공기 건조 또는 동결 건조되며, 유용한 형상으로 성형된다. 다른 몇몇 태양에서 본 발명의 조성물은 물에 녹지 않는다.
본 발명의 이러한 측면에서 콜라겐은 이 분야에 알려진 모든 것을 사용할 수 있다. 몇몇 태양에서 이 콜라겐은 포유류 콜라겐이다. 특정 태양에서 이 콜라겐은 사람, 소, 양, 래트나 캥거루 콜라겐이다. 몇몇 비포유류 실시 태양에서 이 콜라겐은 어류 콜라겐이다. 비록 콜라겐을 이들 콜라겐원 중 어느 곳에서 취해도 되지만 사람 콜라겐이 특별한 예이다.
이 콜라겐은 콜라겐원의 어떠한 부분에서 유래하여도 된다. 유용한 콜라겐원에는 소의 피부, 송아지 피부, 래트의 꼬리, 캥거루 꼬리와 어류의 피부가 포함된다. 특정 태양에서는 이 콜라겐이 태반 콜라겐으로서, 예를 들어 소 태반 콜라겐, 양 태반 콜라겐이나 사람 태반 콜라겐이다. 하나의 예는 사람 태반 콜라겐이다.
이 콜라겐은 이 분야 당업자에게 알려진 어떤 콜라겐도 가능하며, 이들의 혼합물도 될 수 있다. 몇몇 태양에서 이 콜라겐은 하나 이상의 콜라겐을 함유하는 콜라겐 조성물의 형태이다. 두드러진 콜라겐에는 제I형(type I) 콜라겐, 제II형 콜라겐, 제III형 콜라겐과 제IV형 콜라겐이 포함된다. 몇몇 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물이 이들 콜라겐을 특정한 양으로 함유한다. 어떤 조성물은 제I형 콜라겐을 상당량 함유하면서 동시에 제IV형 콜라겐도 다량 지닌다. 몇몇 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 제IV형 콜라겐을 1~15%, 제IV형 콜라겐을 2~13%, 제IV형 콜라겐을 3~12% 혹은 제IV형 콜라겐을 4~11% 함유한다. 동시에 이 콜라겐 조성물은 제I형 콜라겐을 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 함유할 수 있다. 예를 들어 이 콜라겐 조성물은 제I형 콜라겐을 70~95%, 74~92% 또는 80~90% 함유할 수 있다. 같은 본 발명의 콜라겐 조성물은 제III형 콜라겐을 예를 들어 1%까지, 2%까지, 3%까지, 4%까지, 5%까지, 6%까지 또는 7%까지 함유할 수 있다. 몇몇 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 제IV형 콜라겐을 2~15%, 제I형 콜라겐을 70~95% 그리고 제III형 콜라겐을 6%까지 함유할 수 있다.
몇몇 실시 태양에서 이 콜라겐 조성물은 콜라겐에 더하여 세포외 매트릭스의 단백질이나 성분을 하나 이상 함유한다. 구체적인 태양에서 이 콜라겐 조성물은 피브로넥틴, 엘라스틴, 라미닌 및/또는 글리코스아미노글리칸을 함유한다. 다른 구체적인 실시 태양에서 이 콜라겐 조성물은 피브로넥틴을 검출할 수 없는 양으로 함유하거나 라미닌을 검출할 수 없는 양으로 함유한다. 다른 구체적 태양에서 이 콜라겐 조성물은 피브로넥틴과 라미닌을 검출 가능한 양으로 함유한다. 다른 구체적 태양에서 이 콜라겐 조성물은 건조 중량 기준 엘라스틴을 약 5% 이상 함유한다. 다른 구체적 태양에서, 이 콜라겐 조성물은 건조 중량 기준 엘라스틴을 약 10% 이상 함유한다. 다른 구체적 태양에서, 이 콜라겐 조성물은 건조 중량 기준 엘라스틴을 5%보다 더 많이 함유하지 않는다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 이 분야 당업자에게 자명한 어떠한 방법을 써서 구하여도 무방하다. 자세한 공정은 이하에서 서술한다.
*몇몇 실시 태양에서, 본 발명의 현 측면에 따른 콜라겐 조성물은 가교된다. 몇몇 태양에서 이 콜라겐 조성물은 글루타르알데히드 등의 가교제를 이용하여 이 분야 당업자에게 잘 알려진 방법으로 가교할 수 있다. 이러한 방법에 관한 자료는 방대한데, 예를 들어 미국 특허 제4,852,640, 5,428,022, 5,660,692호와 제5,008,116호, 그리고 McPherson 외, 1986, J. Biomedical Materials Res. 20:79~92를 들 수 있으며, 이들의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
가교제와 그 사용법에 관한 더 많은 예시는 미국 특허 제 5,880,242호와 6,117,979호 그리고 Zeeman 외, 2000, J Biomed Mater Res. 51(4):541~8, van Wachem 외, 2000, J Biomed Mater Res. 53(1):18~27, van Wachem 외, 1999, J Biomed Mater Res. 47(2):270~7, Zeeman 외, 1999, J Biomed Mater Res. 46(3):424~33, Zeeman 외, 1999, Biomaterials 20(10):921~31를 들 수 있으며, 이들의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
또 다른 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르로 가교한다. 다른 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 제니핀(genipin)으로 가교한다. 제니핀은 독성이 없는 천연 가교제이다. 제니핀은 그 모체 화합물인 제니포시드(geniposide)로부터 얻을 수 있는데, 제니포시드는 Gardenia jasminoides의 열매에서 분리할 수 있다. 제니핀은 시중에서 Challenge Bioproducts Co., Ltd사(7 Alley 25, Lane 63, TzuChiang St. 404 Taichung Taiwan R.O.C., 소재 Tel 886-4-3600852)로부터 입수할 수 있다. 제니핀을 가교제로 사용하는 것은 미국 특허 출원 공보 제20030049301호에 자세히 나와 있는데, 이 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
추가적 실시 태양에서는 콜라겐 조성물을 이 분야 당업자에게 알려진 다른 가교제로 가교할 수 있다. 또 다른 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 이 분야 당업자에게 알려진 효소 매개 가교법 중 어떤 것으로도 가교할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 콜라겐 조성물을 당업자에게 알려진 트랜스글루타민아제(transglutaminase)를 써서 가교할 수 있다. 트랜스글루타민아제는 글루타민과 콜라겐의 리신 잔기 사이에 아미드 가교 형성을 촉매한다. 이러한 방법은, 예를 들어 Orban 외, 2004, J. Biomedical Materials Res. 68(4):756~62에 나와 있는데, 이 글의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
본 발명의 콜라겐 조성물을 하나의 가교제나 가교제 혼합물을 써서 가교할 수 있다. 몇몇 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 글루타르알데히드로 가교하고, 염기 처리, 세제 처리된 콜라겐을 함유한다.
3. 본 발명의 콜라겐 조성물의 제조를 위한 공정
다른 측면에서 본 발명에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 제조하기 위한 공정을 제공한다. 이러한 공정은 유용한데, 예를 들어 전술한 본 발명의 콜라겐 조성물을 제조하는데 유용하다.
몇몇 실시 태양에서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 여기서 기술하는 방법에 따라 사람 태반으로부터 만들 수 있다. 사람 태반으로부터 콜라겐 조성물을 제조하는 방법의 초기 단계는 미국 특허 제5,428,022, 5,660,692호와 5,008,116호 그리고 미국 특허 출원 공보 제20040048796, 20030187515호에 자세히 나와 있는데, 이들의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
이 태반 조직은 태반의 어느 부분에서 유래하여도 무방한데, 여기에는 (수용성 또는 불용성을 막론하거나 양 쪽 모두인) 양막, 융모막과 탯줄 또는 태반 전체가 포함된다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 탯줄을 뺀 온전한 사람 태반으로부터 제조한다.
태반낭(placental sac)은 성긴 연결 조직에 의하여 밀접하게 연결된 두 개의 층으로 이루어진다. 이 층들은 양막층과 융모막층으로 알려져 있다. 양막층은 이 두 층 중 안쪽의 것이며 태아를 둘러싼 양수와 접촉하는데, 융모막과 함께 태반낭을 이룬다. 양막층에는 혈관이 없으며 기저막(basal membrane) 위에 놓인 두께 30~60 ㎛의 단순한 원주상피가 이를 덮고 있다. 융모막은 태반낭의 바깥층이며 다량의 세포가 소재한다. 혈관 줄기(vascular tree)는 태반에서 유래하여 융모막층을 거쳐 이들 태반막까지 뻗어간다. 융모막층은 느슨한 연결 조직을 두고 양막층과 떨어져 있으며 이 두 막을 합하여 두께가 120~180 ㎛이다. 이들 태반막은 점액다당류(mucopolysaccharide)가 두껍게 덮고 있는 콜라겐 매트릭스를 갖추고 있으며 자라나는 태아를 보호하는 주머니를 제공하는 것이 이들 막의 주된 기능이라고 생각하고 있다. 이들 막은 또한 모체의 순환계에 존재하는 감염성 또는 면역학적 인자들을 가로막는 차단막이 되기도 한다. 태반 막은 능동과 수동 수송을 모두 갖추고 있다. 대부분의 소형 분자와 단백질은 이들 막을 자유로이 드나들지만 IgM 등의 큰 단백질은 기저막을 관통할 수 없다.
특정 태양에서는 본 발명의 방법에 쓰일 태반을 신생아 분만 후 최대한 빨리 취하게 된다. 또 다른 특정 태양에서는 건강한 정상 신생아의 제왕 절개 수술 직후 신속하게 취하게 된다. 무균 조건하에서 태반을 수집하면 유리하다. 몇몇 태양에서는 이 태반을 분만 후로부터 모든 후속 처리 전까지 48시간 동안 저장한다. 다른 태양에서는 이 태반을 분만 후로부터 모든 후속 처리 전까지 5일 동안 저장한다.
후속 처리를 위하여 이러한 태반, 탯줄과 제대혈을 분만실로부터 다른 장소, 예를 들어 실험실로 옮기면 유리한다. 이 태반을 멸균 운반 용기, 예를 들어 멸균 백이나 용기로 옮길 수 있고, 선택적으로 단열 용기를 쓸 수 있다. 몇몇 태양에서는 이러한 태반을 후속 처리시까지 실온에서 보관한다. 다른 태양에서는 이 태반을 후속 처리시까지 냉장, 즉 약 2℃에서 8℃의 온도에 보관한다. 또 다른 태양에서는 이 태반을 후속 처리 전 최대 5일 동안 멸균 환경하에서 보관한다. 특정 태양에서는 이 태반을 이 분야 당업자에게 알려진 무균 환경 하에서 취급하고 처리한다. 그 실험실은 HEPA 여과 시스템(클린룸 분류의 정의에 따를 때 클래스 1000 이상)을 갖출 수 있다. 특정 태양에서는 이 HEPA 여과 시스템을 본 발명의 방법을 진행하기 위한 실험실에서 적어도 1시간 미리 가동한다.
몇몇 태양에서는 태반을 실혈(exsanguination), 즉 출생 후 남은 제대혈을 완전히 뽑아낸다. 몇몇 태양에서는 태반을 70%, 80%, 90% 95% 또는 99% 실혈한다.
본 발명은 분만 예정 산모에서 출산 전에 당업자에게 알려진 표준적인 방법으로 전염병을 검사하는 것을 망라하고 있는데, 전염병에는 HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV와 태반 조직을 오염한다고 알려진 기타 바이러스 질환이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명 방법을 이용하여 미국 식품의약청 소정의 규정에 따라 전염병을 검사하면 편리하다. 이 산모에 대하여 출산 후 한 달 내, 특히 출산 후 2주내, 출산 후 1주내 혹은 출산시 검사(예를 들어 진단 용도로 혈액 채취)할 수도 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 그 산모가 상기 병원체에 대하여 음성 또는 비활성이라는 검사 결과를 받은 기증자에서 얻은 조직만을 이용하여 제조한다. 태반 막 기증자의 의료, 사회적 내력과 아버지의 내력에 관한 철저한 기록, 예를 들어 자세한 가족력을 비롯한 기록을 얻는 것이 유익하다.
몇몇 태양에서는 이 분야 당업자가 알고 있는 표준 혈청학적 세균학적 시험법으로 기증자를 검사한다. 이러한 병원체를 확인할 수 있는 모든 검사법 또는 진단법이면 본 발명의 방법 범위에 포함되지만, 그 중에서 높은 정확성과 고효율(high throughput)을 겸비한 분석법이 특별히 바람직하다. 특정 태양에서 본 발명은 이 분야 당업자가 알고 있는 항원 및/또는 항체에 관한 표준적인 방법을 써서 기증자를 검사한다. 항원과 항체 관련 방법의 예를 일부만 들자면 다음과 같다: 항체 검사(antibody screen, ATY), 알라닌 아미노 전달효소 검사(ALT), 간염 핵심 항체(핵산과 ELISA), B형 간염 표면 항원, C형 간염 바이러스 항체, HIV-1과 HIV-2, HTLV-1과 HTLV-2, 매독 진단법(RPR), CMV 항체 검사, C형 간염과 HIV 검사법. 이 분야 당업자에 알려진 핵산 기반 분석법이나 ELISA 기반 분석법을 분석 방법으로 사용할 수도 있다.
본 발명은 나아가 신생아 탯줄의 혈액을 이 분야 당업자가 알고 있는 표준적인 방법으로 검사하는 것을 망라한다(예를 들어, Cotorruelo 외., 2002, Clin. Lab. 48(5 6):271 81; Maine 외, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn., 1(1):19 29; Nielsen 외, 1987, J. Clin. Microbiol. 25(8):1406 10를 보라. 이들 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다). 한 실시 태양에서는 당업자가 알고 있는 표준적인 방법을 사용하여 신생아 탯줄에서 나온 피에 대하여 (그램 양성과 그램 음성균을 포함하지만 이에 한정되지는 않는) 세균 병원체와 진균을 검사한다. 특정 태양에서는 당업자가 알고 있는 표준적인 방법을 사용하여 신생아 탯줄에서 나온 피의 혈액형과 Rh 인자를 시험한다. 다른 태양에서는 당업자가 알고 있는 표준적인 방법을 사용하여 신생아 탯줄에서 나온 피에 대하여 감별수를 포함한 전체 혈구수(CBC)를 측정한다. 또 다른 태양에서는, 당업자가 알고 있는 표준적인 방법을 사용하여 신생아 탯줄에서 나온 피로부터 호기성 세균 배양물을 채취한다. CBC 값이 정상 범위(예를 들어 정상값으로부터 큰 값의 비정상치나 편차가 없음)에 있고 혈청학과 세균학 검사가 음성이며 전염 또는 감염성 질병에 대한 검사가 음성이거나 비활성인 기증자에서 수집한 조직만을 사용하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 제조한다.
사람 태반 조직을 수집한 다음 이를 이하의 절차에 따라 처리하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 제조할 수 있다. 비록 이하의 절차를 차례로 설명하고 있지만 이 분야 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 몇 군데 단계의 순서를 뒤바꿀 수 있다는 점을 잘 알 것이다. 더욱이 본 발명의 콜라겐 조성물 중 어느 것을 원하느냐에 따라 몇몇 단계는 선택 사항이라고 나타내었다. 완충 용액 교환, 침전법, 원심분리, 재현탁, 단백질 조성물의 희석과 농축 등 당업자에게 자명하다고 생각되는 기술은 자세히 설명할 필요가 없다고 가정하겠다. 예시 제조법은 아래 실시예에서 기술한다.
전체 태반이나 태반의 어떠한 일부라도 본 발명의 방법에 쓸 수 있다. 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 전체 태반으로부터 제조한다. 그러나 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 태반의 융모막이나 양막 부위로부터 제조할 수 있다.
이러한 실시 태양에서 본 발명은 태반막을 처리하여 탯줄을 태반 원반으로부터 떼어내고 양막을 융모막으로 분리하는 단계를 포함한다. 어느 특정 태양에서는 태반 막을 자르기 전에 양막을 융모막으로부터 분리한다. 양막을 융모막으로부터 분리하는 것은 태반 막의 가장자리로부터 시작할 수 있다. 다른 태양에서는 무딘 절개법(blunt dissection), 예를 들어 장갑 낀 손가락을 써서 양막을 융모막으로부터 분리한다. 양막을 융모막과 태반 원반으로부터 떼어내면 탯줄의 밑동(stump)을 예를 들어 가위로 잘라, 태반 원반으로부터 떼어 낸다. 몇몇 태양에서 조직을 찢지 않고 양막과 융모막을 분리할 수 없을 때, 본 발명은 양막과 융모막을 태반 원반으로부터 한 조각으로 잘라 내고 이어서 이들을 서로 떼어내는 단계를 포함한다.
양막, 융모막이나 전체 태반을 본 발명의 방법에 쓰기 전에 저장할 수 있다. 당업자에게 저장 방법은 자명할 것이다. 예시 저장 방법은 미국 특허 출원 공보 제20040048796과 20030187515호에 나와 있는데, 이들 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
본 발명의 몇몇 공정에서는 태반 조직을 탈세포화한다. 이 태반 조직은 미국 특허 출원 공보 제20040048796과 20030187515호에 자세히 나와 있는 것과 같으 당업자에게 알려진 모든 방법을 이용하여 탈세포화할 수 있는데, 이들 문헌의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
몇몇 태양에서는 태반 조직에 삼투압 쇼크를 가한다. 이 삼투압 쇼크 단계는 본 발명의 콜라겐 조성물을 우수한 순도로 얻게 하여 준다. 작동 원리에 관한 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 삼투압 쇼크는 조직 속의 세포를 터뜨려 세포, 세포 성분 및 혈액 성분의 제거를 돕는 것으로 생각된다. 삼투압 충격을 어떠한 투명화(clarification) 단계와도 결합할 수 있고, 당업자의 판단에 따라서는 삼투압 충격이 유일한 투명화 단계가 될 수도 있다.
삼투압 충격은 당업자에게 알려진 어떠한 삼투압 충격 조건하에서도 수행할 수 있다. 이러한 조건은 조직을 고삼투압(high osmotic potential)이나 저삼투압 용액 속에서 배양하거나 높고낮은 삼투압 용액 속에서 번갈아 배양하는 것을 포함한다. 고삼투압 용액은 당업자가 알고 있는 모든 삼투압 용액일 수 있는데, 예를 들어 NaCl(예를 들어, 0.2 ~ 1.0 M), KCl(예를 들어, 0.2 ~ 1.0 or 2.0 M), 황산암모늄, 단당류, 이당류 (예를 들어, 20% 슈크로스), 친수성 고분자(예를 들어 폴리에틸렌글리콜), 글리세롤 등에서 하나 이상을 함유하는 용액일 수 있다. 몇몇 태양에서 고삼투압 용액은 염화나트륨 용액이다. 몇몇 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 2 M 또는 2.5 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서, 이 염화나트륨 용액은 약 0.25~5 M, 약 0.5~4 M, 약 0.75~3 M 또는 약 1.0~2.0 M NaCl이다.
저삼투압 용액은 물 등 당업자에게 알려진 모든 저삼투압 용액일 수 있는데, 예를 들어 당업자가 알고 있는 모든 방법에 따라 탈이온화한 물이다. 몇몇 태양에서는 저삼투압 용액이 50 mM NaCl보다 더 낮은 삼투압을 가지는 물을 함유한다.
몇몇 실시 태양에서 이 삼투압 쇼크는 염화나트륨 용액에 이은 수용액에서 이루어진다. 몇몇 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 0.5 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 0.75 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 1.0 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 1.5 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서 이 염화나트륨 용액은 적어도 2.0 M NaCl이다. 몇몇 실시 태양에서는 0.5 M NaCl 처리를 1회 한 후 물로 세척한다. 몇몇 태양에서는 2 M NaCl 처리를 1회 한 후 물로 세척한다. 이러한 순서는 당업자의 판단에 따라 거듭할 수 있다.
몇몇 태양에서 삼투압 쇼크에서 얻은 콜라겐 조성물을 세제와 함께 배양할 수 있다. 작동 원리에 관한 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 세제는 조성물 속에 있을 수 있는 세포, 세포막, 세포내 막과 세포 잔해를 파괴하는 것으로 생각된다. 이 세제로는 세포막과 세포내 막을 파괴할 수 있는 세제로서 당업자가 알고 있는 모든 것을 사용할 수 있다. 몇몇 태양에서 이 세제는 이온성 세제이다. 예를 들어 몇몇 태양에서 이 세제는 황산도데실나트륨이나 데옥시콜린산나트륨이다. 이하에 기재하는 실시예에서는 세제 처리의 예시로 데옥시콜린산을 사용한다. 몇몇 태양에서 이 세제는 츠비터 이온성 세제이다. 몇몇 실시 태양에서 이 세제는 비이온성이다. 예를 들어, 몇몇 태양에서 세제는 TWEEN(등록상표) 세제, 예를 들어 TWEEN-20(등록상표)이거나 Triton-X 세제, 예를 들어 Triton X 100이다. 이 콜라겐 조성물은 이 분야 당업자가 조성물로부터 원하지 않는 성분을 제거하기에 적절하다고 판단하는 조건 하에서 세제와 접촉하여야 한다. 예시 조건은 이하 기술하는 실시예에서 제공한다.
이 세제 처리는 당업자 판단에 따른 어떠한 온도에서라도 수행할 수 있다. 몇몇 태양에서는 세제 처리를 약 0~30℃, 약 5~25℃, 약 5~20℃ 또는 약 5~15℃에서 행한다. 몇몇 태양에서는 이 세제 처리를 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃ 또는 약 30℃에서 수행한다. 특정 태양에서는 이 세제reatment 처리를 약 5~15℃에서 수행한다.
당업자의 판단에 따라 세체 처리를 적절한 시간 동안 수행할 수 있다. 몇몇 태양에서 세제 처리는 약 1~24 시간, 약 2~20 시간, 약 5~15 시간, 약 8~12 ㅅ시간 또는 약 2~5 시간 동안 이루어진다.
몇몇 실시 태양에서는 세제 처리 후 얻는 콜라겐 조성물을 염기성 조건 속에서 배양할 수 있다. 작동 원리에 대한 어떤 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 염기성 처리는 콜라겐 조성물을 오염시킬 수 있는 바이러스 입자를 제거할 수 있다고 믿고 있다. 몇몇 태양에서 이 염기성 세척은 내독소를 제거하는 역할을 한다. 염기성 조건이란 당업자가 알고 있는 모든 염기성 조건일 수 있다. 특히 바이러스를 제거할 수 있다고 알려진 pH의 어떠한 염기라도 쓰일 수 있다. 염기성 처리를 위한 특별한 염기에는 생적합성 염기, 휘발성 염기와 콜라겐 조성물로부터 쉽고 안전하게 제거할 수 있다고 당업자에게 알려진 염기가 포함된다. 이 염기는 당업자에게 알려진 모든 유기 또는 무기 염기로서 예를 들어 0.2~1.0 M의 농도에 있을 수 있다. 몇몇 태양에서는 수산화암모늄, 수산화칼륨과 수산화나트륨으로 이루어진 군에서 이 염기를 선택한다. 몇몇 태양에서는 수산화나트륨 용액으로 이 염기성 처리를 수행한다. 이 수산화나트륨 용액은 0.1 M NaOH, 0.25 M NaOH, 0.5 M NaOH나 1 M NaOH일 수 있다. 특정 태양에서는 이 염기성 처리를 0.1 M이나 0.5 M NaOH로 수행한다.
당업자 판단에 따른 어떠한 온도에서라도 염기성 처리를 할 수 있다. 몇몇 태양에서는 염기성 처리를 약 0~30℃, 약 5~25℃, 약 5~20℃ 또는 약 약 5~15℃에서 수행한다. 몇몇 태양에서는 염기성 처리를 약 0℃, 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃나 약 30℃에서 수행한다. 특정 태양에서는 염기성 처리를 약 5~15℃에서 한다.
*염기성 처리를 위한 시간은 당업자 판단에 따른 어떠한 적절한 시간 동안이라도 무방하다. 몇몇 태양에서는 염기성 처리를 약 1~24시간, 약 2~20시간, 약 5~15시간, 약 8~12시간 또는 약 2~5시간 동안 한다.
세제와 NaOH 세척 단계에 변화를 주어 최종 세포외 매트릭스(ECM) 재료에 여러가지 변화를 줄 수 있다. 예를 들어 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 함유 조직을 약 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M 또는 약 0.5 M NaOH로 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23이나 약 24 시간에 걸쳐 처리할 수 있다.
몇몇 다른 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 염기 처리 없이 제조한다. 이러한 공정을 태반 조직에 적용했을 때 염기 처리 단계를 건너뛰면 엘라스틴, 피브로넥틴 및/또는 라미닌의 함량이 염기성 처리를 거쳐 제조한 콜라겐 조성물보다 더 높은 콜라겐 조성물을 얻는 것이 전형적이다.
몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 건조할 수 있다. 건조는 콜라겐 조성물의 건조와 패키지 포장을 용이하게 한다. 건조는 또한 세포 성분을 조성물로부터 제거하기 쉽게 만든다. 나아가 상기 단계 중 어떠한 단계 후에라도 이 콜라겐 조성물을 그 후속 단계에 앞서 건조할 수 있다. 건조는 당업자가 알고 있는 어떠한 방법을 사용하여도 무방하다. 유용한 건조법은 미국 특허 공보 제2004/0048796호가 기재하고 있는데 이 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다. 예시 건조법에는 이하 실시예에서 보이는 것과 같은 냉동 진공 건조, 진공 건조, 열(예를 들어 약 50℃ 미만), 동결 건조가 포함된다.
몇몇 태양에서는 상기 단계 중 어떠한 것이라도 무균 환경에서 진행할 수 있다. 특정 태양에서는 염기성 처리와 모든 그 후속 단계를 무균 조건하에서 진행한다. 또 다른 실시 태양에서는 본 명세서에서 기재하는 방법에 따라 제조한 모든 콜라겐 조성물을 당업자에게 자명한 방법을 이용하여 멸균 처리할 수 있다.
몇몇 실시 태양에서 본 발명은 앞서 설명한 삼투압 쇼크, 동결 건조, 세제 처리, 물 세척, 동결 건조, 염기성 처리, 물 세척과 동결 건조 단계를 포함하는 공정을 제공한다. 몇몇 태양에서는 이 단계들을 순서대로 진행한다. 몇몇 태양에서 세제는 1% 데옥시콜린산이다. 몇몇 태양에서 염기성 처리는 0.5 N NaOH 속에서 4시간 동안 이루어진다. 몇몇 태양에서는 첫번째 물 세척을 반복한다(총 두 번 세척). 몇몇 태양에서는 두번째 물 세척을 2회 반복한다(총 세 번 세척). 몇몇 태양에서는 세제가 1% 데옥시콜린산이고 염기성 처리는 0.5 N NaOH 속에서 4시간이며, 첫번째 물 세척은 1회 반복(총 두 번 세척)하고, 두번째 물 세척은 2회 반복(총 세 번 세척)한다. 몇몇 태양에서는 이러한 공정을 진행하여 약 0.59%의 글리코스아미노글리칸, 약 3.5%의 엘라스틴을 함유하고 피브로넥틴과 라미닌이 없거나 거의 함유하지 않는 조성물을 제공한다.
몇몇 태양에서 전술한 본 발명은 삼투압 쇼크, 염기성 처리와 물 세척 단계를 포함하는 공정을 제공한다. 몇몇 태양에서 이 단계들을 순서대로 진행한다. 몇몇 태양에서는 염기성 처리가 0.5 N NaOH 속에서 4시간이다. 몇몇 태양에서는 이러한 공정을 진행하여 약 0.28% 내지 약 0.38%의 글리코스아미노글리칸, 약 3.2% 내지 4.7%의 엘라스틴을 함유하고 피브로넥틴과 라미닌이 없거나 거의 함유하지 않는 조성물을 제공한다.
몇몇 태양에서 본 발명은 전술한 삼투압 쇼크, 세제 처리와 물 세척 단계를 포함하는 공정을 제공한다. 몇몇 태양에서는 이 단계들을 순서대로 진행한다. 몇몇 태양에서는 세제가 1% 데옥시콜린산이다. 어떤 태양에서는 이러한 공정을 진행하여 약 0.4%의 글리코스아미노글리칸, 약 12%의 엘라스틴, 약 0.6% 피브로넥틴과 약 0.16%의 라미닌을 함유하는 조성물을 제공한다.
3.1 추가적인 후속 처리
몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물이 무텔로펩티드(atelopeptide) 콜라겐 조성물의 원료로 쓰일 수 있다. 무텔로펩티드 콜라겐 분야 당업자에게 자명한 모든 용도에 이 무텔로펩티드 콜라겐 조성물을 쓸 수 있다.
이러한 실시 태양에서는 콜라겐으로부터 텔로펩티드를 완전히 또는 부분적으로 제거할 수 있는 효소에 이 콜라겐 조성물을 접촉시킬 수 있다. 이 효소는 콜라겐에서 텔로펩티드를 제거할 수 있다고 당업자에게 알려진 모든 단백질 분해성 효소일 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 효소가 펩신이나 파파인이다. 일반적으로 텔로펩티드 제거에 적합하다고 당업자가 알고 있는 조건하에서 콜라겐 조성물을 효소와 접촉시킨다.
콜라겐 조성물을 효소로 처리하여 텔로펩티드를 제거하는 방법은 미국 특허 제4511653, 4582640, 5436135와 6548077호에 자세히 나와 있는데, 이들의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다. 일반적으로 텔로펩티드 제거에 적합하다고 당업자가 알고 있는 조건하에서 콜라겐 조성물을 효소와 접촉시킨다. 이러한 조건에는 예를 들어 효소와 콜라겐 조성물을 적절한 pH에서, 적절한 효소 농도로, 적절한 용액 부피 속에서 적절한 온도와 적절한 시간 동안 접촉시키는 것이 포함된다.
당업자 판단에 따라 콜라겐 조성물을 낮은 pH 조건에서 효소와 접촉시킬 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 약 1~3이나 약 2~3 pH에서 펩신과 접촉시킨다.
몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물과 효소를 높은 온도에서 접촉시킨다. 특정 작동 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 고온에서는 최종 콜라겐 조성물 속의 제I형 콜라겐의 수득률이 향상된다고 믿고 있다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 약 15~40℃, 약 20~35℃, 약 25~30℃, 약 20~30℃ 또는 약 23~27℃에서 펩신과 접촉시킨다. 특정 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 약 23~27℃에서 텔로펩티드를 제거하기에 충분한 시간 동안 펩신과 접촉시킨다.
당업자의 판단에 따라 콜라겐 조성물은 텔로펩티드를 제거하는데 충분한 시간 동안 효소와 접촉하게 된다. 몇몇 태양에서는 콜라겐을 펩신과 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30시간 동안 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 콜라겐을 펩신과 약 5~30시간, 약 10~25시간 또는 약 20~25시간 동안 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 콜라겐을 펩신과 약 8, 16, 24 또는 32시간 동안 접촉시킨다.
당업자의 판단에 따라 텔로펩티드를 제거하기에 충분한 양의 효소와 콜라겐 조성물을 접촉시키게 된다. 몇몇 태양에서는 냉동 태반 kg마다 약 0.1 g, 0.5 g, 1.0 g, 2.0 g이나 5.0 g 펩신을 콜라겐 조성물과 접촉시킨다. 다른 태양에서는 태반 1 kg에 약 0.1 g, 0.5 g, 1.0 g, 2.0 g 또는 5.0 g의 펩신을 콜라겐 조성물과 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 약 0.1~10.0 g/L, 약 0.5~5 g/L, 약 1~2.5 g/L 또는 약 0.5~1.5 g/L 펩신과 접촉시킨다. 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 약 0.1 g/L, 약 0.2 g/L, 약 0.5 g/L, 약 1.0 g/L, 약 2.0 g/L, 5 g/L 또는 10 g/L 펩신과 접촉시킨다. 특정 태양에서는 콜라겐 조성물을 pH 약 2~3이고, 약 23~27℃에서 약 16~24시간 동안 약 0.5~1.0 g/L 펩신의 아세트산 용액에 접촉시킨다.
당업자의 판단에 따라 텔로펩티드를 제거하기에 적절한 용액 부피:태반의 비율로 콜라겐 조성물을 효소와 접촉시킨다. 태반에 대한 용액 부피 비율이 높으면 펩신에 의한 효과를 최대화할 수 있는 것으로 관측되었다. 몇몇 태양에서는 매 태반마다 약 1, 2, 4 또는 8 부피의 아세트산 용액을 사용한다. 특정 태양에서는 매 태반마다 약 2 부피의 아세트산 용액을 사용한다.
원할 경우 본 발명의 콜라겐 조성물을 섬유 연축(攣縮 fibrillation)을 이용하여 더 가공할 수 있다. 섬유 연축은 당업자가 알고 있는 모든 방법을 써서 이룰 수 있다. 콜라겐 조성물의 섬유 연축은 미국 특허 제4511653, 4582640과 5436135호에 자세히 나와 있는데 이들의 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다. 필요할 경우, 콜라겐 조성물을 섬유 연축 전에 표준적인 방법으로 농축할 수 있다.
*원할 경우 본 발명의 콜라겐 조성물을 가교(cross-linking)할 수 있다. 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 가교 전에 섬유 연축한다. 이 가교는 당업자가 알고 있는 모든 가교제, 예를 들어 본 장에서 설명하는 가교제로 이루어질 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 가교제가 글루타르알데히드이고 당업자가 알고 있는 콜라겐의 글루타르알데히드 가교법으로 가교를 할 수 있다. 다른 태양에서 이 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르이거나 제니핀이다. 특정 태양에서는 이 가교제가 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르이다.
몇몇 태양에서는 가교제와 콜라겐 사이의 공유결합을, 예를 들어 안정성을 높이기 위하여, 환원할 수 있다. 환원은 이 콜라겐 조성물을 당업자가 알고 있는 모든 환원제와 접촉시켜 이룰 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 환원제가 수소화붕소나트륨, 황산수소나트륨, β-메르캅토에탄올, 메르캅토아세트산, 메르캅토에틸아민, 벤질메르캅탄, 티오크레졸, 디티오트레이톨이나 트리부틸포스핀과 같은 포스핀이다. 수소화붕소나트륨은 유용한 예이다. 몇몇 태양에서는 환원제로 환원하기 전에 콜라겐 조성물을 가교한다. 콜라겐 조성물의 환원과 가교된 콜라겐 조성물은 미국 특허 제4185011, 4597762, 5412076과 5763579호에 자세히 나와 있는데, 이 내용의 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다.
몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 당업자가 알고 있는 방법에 따라 기계적으로 전단(剪斷 shearing)함으로써 더 가공할 수 있다. 전단법의 예시 사례는 미국 특허 제4642117호에 나와 있는데, 이 명세서 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다. 몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 당업자에게 알려진 조직 균질기(homogenizer)로 전단한다.
몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물 속 단백질 분해 효소의 활성을 통제하기 위한 절차를 밟는다. 예를 들어 1,10-페난트롤린과 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 이온 킬레이트제 등의 첨가제는 많은 단백질 분해 효소에 불리한 환경을 만든다. 콜라겐 분해효소와 같은 단백질 분해 효소에 대하여 최적에 못 미치는 조건을 제공하면 콜라겐 조성물을 파괴로부터 지킬 수 있다. 단백질 분해 효소의 최적 미만 조건은 용액 속에서 칼슘과 아연 이온의 양을 제한하거나 없앤 조성물을 조제함으로써 이룰 수 있다. 많은 단백질 분해 효소는 칼슘과 아연 이온의 존재 하에서 활성이 있고 칼슘과 아연 이온이 없는 환경에서 활성의 대부분을 잃는다. pH, 칼슘과 아연 이온의 이용 가능성 저하, 금속 킬레이트제의 존재 그리고 콜라게나아제에 특이적인 단백질 분해 효소 억제제를 사용하도록 조건을 택함으로써 유리하게 콜라겐 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어 어떤 콜라겐 조성물은 EDTA 등의 금속 킬레이트제를 포함하고 칼슘과 아연 이온이 없는 pH 5.5 내지 8이나 7 내지 8의 완충 수용액을 함유할 수 있다. 나아가 콜라겐 조성물을 처리할 때 온도와 시간 조건을 조절하여 단백질 분해 효소의 활성을 억제할 수도 있다.
4. 콜라겐 조성물의 특성 분석
4.1. 생화학적 특성 분석
이 분야에 알려져 있고 본 명세서에서 예시하는 생화학 기반 분석법을 이용하여 본 발명의 콜라겐 조성물의 생화학적 조성을 측정할 수 있다. 본 발명은 예를 들어 흡광도 기반 분석법과 비색법 기반 분석법 등의 시료의 단백질 총함량을 결정하기 위한 생화학 기반 분석법을 망라한다. 흡광도 기반 분석법은 280 nm(예를 들어 Layne, E, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzymology 3: 447~455, (1957); Stoscheck, CM, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990); 이 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다)와 205 nm에서의 흡광도, 그리고 시료의 흡광도 계수(Scopes, RK, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); Stoscheck, CM. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50~69, (1990); 이 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다)에 바탕을 둔 방법이 포함되지만 이것이 전부는 아니다. 본 발명은 본 발명의 콜라겐 조성물 속 특정 단백질의 함량을 측정하는 방법을 포함하고 있는데, 여기에는 콜라겐(예를 들어 제I, II, III, IV형 콜라겐), 라미닌, 엘라스틴, 피브로넥틴과 글리코스아미노글리칸이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
비색법에 바탕한 분석법은 변형 Lowry 분석, 뷰렛 분석, Bradford 분석, 비신초니닉산(Bicinchoninic acid 혹은 Smith) 분석(예를 들어 Stoscheck, CM. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50~69, (1990)를 보라)가 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다.
특정 실시 태양에서는 Bradford 염료 결합 분석법(Bradford, M., Analytical Biochemistry, 72, 248(1976), 이 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다)으로 본 발명의 콜라겐 조성물 속 단백질 총함량을 측정한다. 본 발명의 방법에 쓰일 수 있는 예시 Bradford 분석법으로는 다음 방법을 사용할 수 있다: 미국 캘리포니아 Hercules 소재 Bio-Rad의 Bradford 염료 결합 분석법으로 수행할 수 있다. 이 단백질 분석법은 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250이 단백질 농도에 차이에 따라 색깔이 바뀌는데 바탕을 두고 있다. 이 분석법은 농도를 알고 있는 일련의 사람 콜라겐 표준 물질의 흡광도를 (595 nm에서) 측정하여 표준 검정 곡선을 만드는 것을 포함하고 있다. 시험 시료, 예를 들어 양막의 콜라겐 농도를 상기 검정 곡선과 대비하여 결정한다. 이 분석법은 0.2~1.4 mg/mL 농도 범위의 콜라겐을 측정할 수 있는 표준 분석 방식으로 개발되어 있으며, 25 ㎍ 농도까지의 단백질을 측정할 수 있는 미세분석법으로도 개발되어 있다. 표준 분석법에서는 100 mM 시트르산(pH 2.4)에 용해한 콜라겐을 1.5 mL 들이 마이크로원심분리 튜브에 나눠 담아 농도를 0.1~1 mg/mL, 총 부피를 0.1 mL로 맞춘다. 각 튜브에 쿠마시 블루 염료 1 mL를 가한다. 시료를 보르텍스(vortex) 처리하고 실온에서 10분 동안 방치한다. 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 미세분석법에서는 100 mM 시트르산(pH 2.4)에 용해한 콜라겐을 96-웰 역가판에 총 부피를 0.1 mL(2.5~30 ㎍/mL)로 하여 나눠 담는다. 각 웰에 염료 시료 10 μL를 가한다. 시료를 보르텍스 처리하고 역가판으로 595 nm의 흡광도를 측정하기 전에 실온에서 10분 동안 방치한다. 단백질 농도는 표준 곡선과 대비하여 결정한다. 단백질 농도는 막의 건조 총 중량에 대한 백분율로 계산한다. 10%의 오차 범위 안에서 각 막의 단백질 함량은 실질적으로 막의 총 건조 중량의 95% 이상이다. 물의 함량은 낮으며 실험 오차 범위 안에 있다(약 10%)이다.
본 발명의 콜라겐 조성물의 총 콜라겐 함량을 대략적으로 알아보는 것은 당업자에게 잘 알려져 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 사용하여 이룰 수 있다. 특정 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물의 콜라겐 함량을 영국 Biocolor Ltd.에서 제조하는 정량적인 염료 비색법 기반 키트(SIRCOL)로 측정한다. 이 분석법은 Sirius Red(혹은 Direct Red 80)를 특이적인 콜라겐 결합 염료로 사용한다. 콜라겐에 결합한 염료는 자외선-가시광선 분광 광도계 속 540 nm에서 농도에 의존적인 흡광도 증가를 나타낸다. 이 분석법은 농도를 알고 있는 일련의 소 콜라겐 표준 물질의 흡광도를 측정함으로써 표준 검정 곡선을 그리는 단계를 포함한다. 시험 시료, 예를 들어 양막 속 콜라겐 농도는 상기 표준 곡선과 대비하여 결정하게 된다. 예시 분석법에서는 1.5 mL 들이 마이크로원심분리 튜브 속에 콜라겐(1 mg/mL)을 5~100 ㎍/μL 농도로 나누어 담는다. 물로 시료 부피를 100 μL로 조절한다. 시료 1 mL마다 SIRCOL 염료 시약을 실온에서 가하여 준다. 시료 튜브에 마개를 씌우고 기계 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 배양한다. 이 시료를 12,000×g로 15분 동안 원심분리하고 액체를 피펫으로 덜어낸다. 각 튜브 바닥에 있는 붉은 빛의 침전을 0.5 M NaOH(수산화나트륨) 1 mL에 녹인다. 시료의 자외선 흡광도를 Beckman DU-7400 자외선-가시광선 분광광도계로 540 nm에서 측정한다. 각 시료 속 콜라겐의 농도와 540 nm에서의 흡광도(OD)의 관계를 이용하여 표준 검정 곡선을 그린다. 분석법의 실험 오차를 가리기 위하여 낮은 농도의 한 콜라겐 표준 물질(10 ㎍/100 μL)에 대하여 분석을 반복(n=10)한다. 막 시료는 같은 실험 방법으로 분석하는데, 시료를 총 부피가 100 μL가 되도록 가한다.
또 다른 실시 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물 속 콜라겐의 종류를 알아내기 위하여 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 표준적인 방법, 예를 들어 ELISA 분석을 이용할 수 있다. 본 발명 콜라겐 조성물 속 콜라겐의 종류, 예를 들어 제I, III과 IV형 콜라겐을 알아내는 예시 분석법은 예를 들어, 미국 워싱턴주 Redmond 소재 Chondrex Inc.에서 키트 형태로 제공하는 Anthrogen-CIA Collagen-I을 쓰는 샌드위치 ELISA 분석 단계를 포함한다. 제III형과 IV형의 분석을 위해서는 1차(포획 항체)와 2차(진단 항체) 항체 그리고 콜라겐 표준물질을 펜실베니아주 Gilbertsville의 Rockland Immunochemicals로부터 입수할 수도 있다. 이 진단 항체는 비오틴화한 사람 제I, III 또는 IV형 콜라겐인데, 이는 스트렙트아비딘 과산화효소에 결합한다. 발색 기질과 요소, H2O2 사이의 효소 반응이 일어나면 노란색이 생기는데 이를 490 nm에서 자외선-가시광선 분광법으로 검출할 수 있다. 종류별 콜라겐의 양을 정량하려면 농도를 알고 있는 일련의 사람 콜라겐 표준물질 시료로부터 표준 검정 곡선을 작성한다. 양막 시험 시료 속 콜라겐의 농도는 이 표준 곡선과 대비하여 알 수 있다. 분석 방법은 ELISA 키트에서 추천하는 바에 따라 정한다. 표준 검정 곡선을 작성하려면 키트에서 제공하는 포획 항체를 100배로 희석한 용액을 100 μL 가하여 96-웰 트레이의 웰 10~12 개를 포획 황체(항사람 제I형 콜라겐 항체, 비접합형)로 피복한다. 밤새 배양한 다음 이 웰들을 세척 완충액으로 세 차례 씻어서 결합하지 않은 항체를 제거한다. 사람 제I형 콜라겐을 이어 웰에 0~5 ㎍/mL 범위에서 늘어나는 농도 순서로 100 μL의 부피로 가한다. 실온에서 두 시간 배양한 다음, 이 웰을 세척 완충액으로 씻어 결합하지 않은 콜라겐을 제거한다. 비오틴화 제I형 콜라겐 항체를 이어서 웰 속의 상기 100 μL 부피의 항체-콜라겐 착물에 가하고 실온에서 두 시간 동안 결합하도록 놓아 둔다. 미결합 항체를 세척 완충액으로 세 차례 씻어낸다. 다음에 키트에서 제공하는, 진단 효소인 스트렙트아비딘 과산화효소를 200배 희석한 시료를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 과산화 효소를 상기 항체-콜라겐-항체 착물에 결합시킨다. 이 96-웰 역가판을 거듭하여(6 차례) 씻어 미결합 효소를 모두 없앤다. 발색 기질+요소/H2O2를 100 μL 부피로 각 웰에 가한다. 이 반응이 실온에서 30분 동안 진행하도록 놓아 둔다. 2.5 N 황산 50 μL를 가하여 반응을 중지시킨다. 490 nm에서 흡광도를 측정한다.
본 발명의 또 다른 실시 태양은 당업자에게 잘 알려져 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 이용하여 본 발명 콜라겐 조성물 속의 총 엘라스틴 함량을 결정하는 분석법을 망라하고 있다. 본 발명 콜라겐 조성물 속 총 엘라스틴 함량을 측정하는 예시 방법은 영국 Biocolor Ltd에서 생산하는 정량적 염료 기반 분석 키트(FASTIN)를 포함하고 있을 수 있다. 이 분석법은 5,10,15,20-테트라페닐-21,23-포르피린(TPPS)을 특이적 엘라스틴 결합성 염료로 사용한다(예를 들어 Winkleman, J.(1962), Cancer Research, 22, 589~596을 보라. 이 논문 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다). 엘라스틴에 결합한 염료는 513 nm의 자외선-가시광선 분광 광도계에서 농도 의존적 흡광도 증가를 나타낸다. 이 분석법은 농도를 알고 있는 일련의 소 엘라스틴 표준물질로부터 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선을 작성하는 단계를 포함한다. 시험 시료, 예를 들어 양막 시료 속 엘라스틴의 농도는 상기 표준 곡선과 대비하여 결정한다. 예시 분석법에서는 1.5 mL 들이 마이크로원심분리 튜브 속에 엘라스틴(1 mg/mL)을 5~100 ㎍/μL 농도로 나누어 담는다. 물로 시료 부피를 100 μL로 조절한다. 시료 1 mL마다 엘라스틴 침전 시약(트리클로로아세트산+아르기닌)을 4℃에서 가하여 주고 같은 온도에서 밤새 배양한다. 이 시료를 12,000×g로 15분 동안 원심분리하고 액체를 피펫으로 덜어낸다. 각 시료에 FASTIN 염료 시약(TPPS) 1 mL와 함께 90% 포화 황산암모늄 100 μL를 가해 준다. 시료 튜브에 마개를 닫고 실온에서 1시간 동안 기계 교반하면서 배양한다. 황산암모늄은 엘라스틴-염료 착물이 침전하도록 하는 역할을 맡는다. 1시간 동안 혼합하는 단계 후 시료를 12,000×g로 15분 동안 원심분리하고 액체를 피펫으로 덜어낸다. 각 튜브 바닥에 있는 갈색 침전을 이소프로판올 속 구아니딘 HCl인 FASTIN 분리 시약 1 mL에 녹인다. 시료의 자외선 흡광도를 Beckman DU-7400 자외선-가시광선 분광광도계로 513 nm에서 측정한다. 각 시료 속 엘라스틴의 농도와 513 nm에서의 흡광도(OD)의 관계를 이용하여 표준 검정 곡선을 그린다. 분석법의 실험 오차를 가리기 위하여 낮은 농도의 한 엘라스틴 표준 물질(10 ㎍/100 μL)에 대하여 분석을 반복(n=10)한다. 막 시료는 같은 실험 방법으로 분석하는데, 시료를 총 부피가 100 μL가 되도록 가한다. 각 시료를 3회 반복 분석한다.
본 발명의 또 다른 실시 태양은 당업자에게 잘 알려져 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 이용하여 본 발명 콜라겐 조성물 속의 총 글리코스아미노글리칸(GAG) 함량을 결정하는 분석법을 망라하고 있다. 본 발명 콜라겐 조성물 속 총 GAG 함량은 영국 Biocolor Ltd에서 생산하는 정량적 염료 기반 분석 키트(BLYSCAN)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 분석법은 1,9-디메틸-메틸렌블루를 특이적 GAG 결합성 염료로 사용한다. GAG에 결합한 염료는 656 nm의 자외선-가시광선 분광 광도계에서 농도 의존적 흡광도 증가를 나타낸다. 이 분석법은 농도를 알고 있는 일련의 소 GAG 표준물질로부터 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선을 작성하는 단계를 포함한다. 시험 시료, 예를 들어 양막 시료 속 GAG의 농도는 상기 표준 곡선과 대비하여 결정한다. 1.5 mL들이 마이크로원심분리 튜브 속에 소 GAG(0.1 mg/mL)을 0.5~5 ㎍/100 μL 농도로 나누어 담는다. 물로 시료 부피를 100 μL로 조절한다. 시료 1 mL마다 1,9-디메틸-메틸렌블루 시약을 실온에서 가한다. 시료 튜브에 마개를 씌우고 실온에서 30분 동안 기계 교반하면서 배양한다. 다음에 이 시료를 12,000×g로 15분 동안 원심분리하고 액체를 피펫으로 덜어낸다. 각 튜브 바닥에 있는 붉은 빛의 침전을 염료 분리 시약 1 mL에 녹인다. 시료의 자외선 흡광도를 Beckman DU-7400 자외선-가시광선 분광광도계로 656 nm에서 측정한다. 각 시료 속 GAG의 농도와 540 nm에서의 흡광도(OD)의 관계를 이용하여 표준 검정 곡선을 그린다. 분석법의 실험 오차를 가리기 위하여 낮은 농도의 한 GAG 표준 물질(1 ㎍/100 μL)에 대하여 분석을 반복(n=8)한다. 막 시료는 같은 실험 방법으로 분석하는데, 시료를 총 부피가 100 μL가 되도록 가한다. 각 시료를 3회 반복 분석한다.
또 다른 실시 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물 속 라미닌의 총함량을 알아내기 위하여 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명 콜라겐 조성물 속 라미닌의 총함량을 알아내는 예시 분석법은 다음을 포함할 수 있다: 일본 시가 소재 Takara Bio Inc.에서 키트(카탈로그 번호 MK107) 형태로 제공하는 샌드위치 ELISA 분석법을 쓸 수 있다. 이 키트는 사람 라미닌에 대한 쥐 단일 클론 항체인 1차 항체(포획 항체)로 미리 피복한 96-웰 역가판을 갖추고 있다. 2차 항체(진단 항체)와 사람 라미닌 표준물질은 키트에서 제공한다. 이 진단 항체는 과산화효소와 접합한 사람 라미닌 항체이다. 발색 기질과 H2O2 사이의 효소 반응이 일어나면 파란색이 생기는데 이를 450 nm에서 자외선-가시광선 분광법으로 검출할 수 있다. 라미닌의 양을 정량하려면 농도를 알고 있는 일련의 사람 라미닌 표준물질(키트에서 제공) 시료로부터 표준 검정 곡선을 작성한다. 양막 시험 시료 속 라미닌의 농도는 이 표준 곡선과 대비하여 알 수 있다. 분석 방법은 ELISA 키트에서 추천하는 바에 따라 정한다. 표준 검정 곡선을 작성하려면 사람 라미닌 표준물질을 키트에서 제공하는, 항체로 미리 피복한 96-웰 트레이의 웰 별로 가하는데, 5 ng/mL 내지 160 ng/mL 범위에서 차례로 농도를 높여가며 최종 부피가 100 μL가 되게 가한다. 실온에서 1시간 배양한 다음 이 웰들을 세척 완충액(0.05% TWEEN(등록상표) 함유 PBS)으로 세 차례 씻어서 결합하지 라미닌을 제거한다. 웰 속의 항체-라미닌 착물에 100 μL의 부피로 과산화효소 접합 라미닌 항체를 가하고 실온에서 1시간 동안 결합하도록 방치한다. 이 96-웰 역가판을 거듭하여(4 차례) 씻어 미결합 효소/항체를 모두 없앤다. 발색 기질+H2O2를 100 μL 부피로 각 웰에 가한다. 이 반응이 실온에서 30분 동안 진행하도록 놓아 둔다. 2.5 N 황산 100 μL를 가하여 반응을 중지시킨다. 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 가용화한 막을 1000 ng/mL의 농도에서 시험한다. 각각의 막 시료는 3회 반복 분석한다. 라미닌 농도는 전체 막 중량의 농도로 아래에 보는 것처럼 나타낸다.
또 다른 실시 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물 속 피브로넥틴의 총함량을 알아내기 위하여 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명 콜라겐 조성물 속 피브로넥틴의 총함량을 알아내는 예시 분석법은 다음을 포함할 수 있다: 일본 시가 소재 Takara Bio Inc.에서 키트(카탈로그 번호 MK115) 형태로 제공하는 샌드위치 ELISA 분석법을 쓸 수 있다. 이 키트는 사람 피브로넥틴에 대한 쥐 단일 클론 항체인 1차 항체(포획 항체)로 미리 피복한 96-웰 역가판을 갖추고 있다. 2차 항체(진단 항체)와 사람 피브로넥틴 표준물질은 키트에서 제공한다. 이 진단 항체는 고추냉이 과산화효소와 접합한 사람 피브로넥틴 항체이다. 발색 기질과 H2O2 사이의 효소 반응이 일어나면 파란색이 생기는데 이를 450 nm에서 자외선-가시광선 분광법으로 검출할 수 있다. 피브로넥틴의 양을 정량하려면 농도를 알고 있는 일련의 사람 피브로넥틴 표준물질(키트에서 제공) 시료로부터 표준 검정 곡선을 작성한다. 시험 시료 속 피브로넥틴의 농도는 이 표준 곡선과 대비하여 알 수 있다. 분석 방법은 ELISA 키트에서 추천하는 바에 따라 정한다. 표준 검정 곡선을 작성하려면 사람 피브로넥틴 표준물질을 키트에서 제공하는, 항체로 미리 피복한 96-웰 트레이의 웰 별로 가하는데, 12.5 ng/mL 내지 400 ng/mL 범위에서 차례로 농도를 높여가며 최종 부피가 100 μL가 되게 가한다. 실온에서 1시간 배양한 다음 이 웰들을 세척 완충액(0.05% TWEEN(등록상표) 함유 PBS)으로 세 차례 씻어서 결합하지 라미닌을 제거한다. 웰 속의 항체-피브로넥틴 착물에 100 μL의 부피로 과산화효소 접합 피브로넥틴 항체를 가하고 실온에서 1시간 동안 결합하도록 방치한다. 이 96-웰 역가판을 거듭하여(4 차례) 씻어 미결합 효소/항체를 모두 없앤다. 발색 기질+H2O2를 100 μL 부피로 각 웰에 가한다. 이 반응이 실온에서 30분 동안 진행하도록 놓아 둔다. 2.5 N 황산 100 μL를 가하여 반응을 중지시킨다. 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 가용화한 막을 1000 ng/mL의 농도에서 시험한다. 각각의 막 시료는 3회 반복 분석한다.
4.2. 생체 적합성 연구
본 발명의 콜라겐 조성물은 그 근원이 생물학적이며 상당한 양의 콜라겐을 함유한다. 그러나 동물 공급원(소와 돼지)에서 유래한 콜라겐과 달리 사람 콜라겐은 비면역원성이다. 비면역원성인 사람 조직은 내재적으로 다른 사람 조직과 생체 적합성이 있기 때문에 표준적인 생체 적합성 검사(예를 들어 피부 자극과 민감화, 급성 전신 독성) 중 몇 가지를 하지 않아도 된다. 본 발명은 본 발명 콜라겐 조성물의 생체 적합성을 분석하는 방법을 포함하고 있다. 본 명세서에서 쓰인 생체 적합성이란 생체 조직에서 독성 반응, 유해 반응(injurious response)이나 면역 반응 또는 거부 반응을 일으키지 않음으로써 생물학적으로 적합한 특성을 가리킨다. 미지 물질에 대한 생체 반응은 생체에 인공 재료를 사용할 때 주된 염려거리이며 재료의 생체 적합성이란 따라서 이러한 재료를 설계할 때 중요한 고려 사항이다. 본 발명에서 망라하고 있는 생체 적합성 분석법에는 세포독성 분석, 토끼 눈 자극 검사, 용혈 분석과 발열원성 분석이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 생체 적합성 분석은 세포 기 반이거나 무세포 기반 분석이다.
또 다른 본 발명의 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물의 세포독성을 ISO MEM 용리 시험(실시예 4.2.2)을 이용하여 측정한다. 이 연구의 목적은 콜라겐 조성물이 배양된 마우스 섬유모세포에서 세포독성 반응을 끌어내는 능력이 있는지를 평가하는데 있다. 한 예시 분석법에서는 5% 송아지 태아 혈청(FBS)이 보강된 Eagle 최소 필수 배지(E-MEM)를 사용하여 실험 시료를 추출해낸다. 이 배지는 또한 이하의 물질 중 하나 이상으로 보강될 수 있다: L-글루타민, HEPES, 겐타마이신, 페니실린, 반코마이신, 암포테리신 B(fungizone). L-929 세포(마우스 섬유모세포)를 배양하여 공기 중 이산화탄소가 5±1%인 37±1℃의 가습 분위기 하의 1회용 조직 배양 용기 속에 세포 단일층으로 사용하였다. 시료 120 ㎠에 대하여 E-MEM+5% FBS 20 mL에 해당하는 비율로 실험 시료를 그대로 추출하였다. 실험 시료를 24~25 시간에 걸쳐 공기 중 이산화탄소가 5±1%인 37±1℃의 가습 분위기 하의 E-MEM+5% FBS로 추출하였다. 이 추출 후 유지용 배양 배지를 실험용 배양 웰에서 덜어내고 실험용 배지/추출물과 대조군 배지/추출물과 염화카드뮴을 가한 양성 대조군 배지 1 mL로 대체하였다. 양성, 중간과 음성 대조군을 실험 시료와 나란히 진행하였다. 실험 배지/추출물과 대조군 배지/추출물과 염화카드뮴을 가한 양성 대조군을 3차례 도포하고 72±4 시간 동안 공기 중 이산화탄소가 5±1%인 37±1℃의 가습 분위기 하에서 배양하였다. 배양 후 24, 48과 72±4 시간째에 세포를 현미경 관찰하여 세포독성 효과를 평가하였다. 세포독성 평가 기준에는 육아(肉芽) 형성(granulation), 원거치상 형성(圓錮齒狀, crenation)이나 세포 원순화(rounding) 등의 형태 변화와 용혈이나 세포 이탈에 의한 세포 단일층의 생존 세포 유실이 포함된다. 이 실험의 유효성은 음성 대조군 배양물이 실험 기간 동안 정상적이고 건강한 외양을 유지하는데 달려 있다. 독성의 정도는 다음 기준에 따라 평가한다.
0 독성 없음: 흩어져 구별되는 세포질 내 과립. 세포 용해 없음.
1 사소한 독성: 세포 중 원순화하거나, 세포 부착이 느슨하거나 세포질 내 괴립이 없는 세포가 20%를 넘지 않음. 용해된 세포가 간혹 있음.
2 약한 독성: 세포 중 원순화하거나 세포질 내 과립이 없는 세포가 50%를 넘지 않음. 세포 용해나 세포 사이 빈 공간이 많지 않음.
3 중간 독성: 원순화 및/또는 용해된 세포가 있는 세포층이 70%를 넘지 않음.
4 심한 독성: 세포층이 거의 완전히 파괴됨.
미국 약전에 따를 때, 실험 대상의 평가가 "0", "1", "2"이면 독성이 없다고 간주한다. 실험 대상 평가가 "3"이나 "4"이면 독성이 있다고 평가한다. 양성 대조군 시료는 "3"이나 "4"의 평가값이 되어야 하며, 음성 대조군 시료는 "0"의 값을 받아야 유효한 실험이다.
토끼 눈 표면은 사람 피부보다 더 민감하다고 알려져 있기 때문에 본 발명 콜라겐 조성물의 생체 적합성을 평가하기 위하여 토끼 눈 자극을 연구하였다. 한 예시 분석법에서는 1차 눈 자극 여부로 시료를 선별한다. 양막을 0.05% 데옥시콜린산 나트륨 염 1수화물 수용액(D-Cell)으로 세척하였다. 이 실험은 미국 연방 유해물질법(Federal Hazardous Substances Act, FHSA) 시행규칙 16 CFR 1500의 지침에 따라 할 수 있다. 한 예시 분석법에서는 보조 광원하에서 거시적으로 토끼 눈을 검안하여 대조군이 정상인지 판단한다. 전부터 있던 각막 손상이 있는지 살펴보기 위하여 토끼 눈을 플루오레사인 염료로 염색하고 이를 0.9% 미국 약전 생리 식염수(PSS)로 씻어낸 다음 암실에서 자외선으로 관찰한다. 토끼마다 시료를 한쪽 눈의 결막 주머니에 표준적인 방식으로 방울 주입한다. 각 토끼에서 반대쪽 눈은 처리하지 않아 비교 실험군 역할을 한다. 처리 후 토끼를 우리로 옮긴다. 처리 후 24, 48과 72시간째에 보조 광원으로 적절한 배율에서 각 토끼의 처리한 눈을 검안하여 처리하지 않은 대조군 눈과 비교한 눈 자극을 평가한다. 각막 손상을 진단하거나 확인하기 위하여 실험 눈을 플루오레사인 염료로 처리하고 PSS로 씻어낸 다음 암실 조건에서 자외선 램프로 24시간째에 검안한다. FHSA-변형 Draize 평가 기준에 따라 반응의 점수를 매긴다. 세 토끼 중 한 마리가 유의미한 양성 반응을 보이는 경우가 경계값이다. 세 마리 중 두 마리가 유의미한 양성 반응을 보이는 것이 유의미한 양성 반응이며 이 실험 시료는 자극성이라고 판단한다.
본 발명에서는 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법(실시예 4.2.4.를 보라)을 이용하여 본 발명 콜라겐 조성물의 용혈 특성을 측정하는 방법을 망라하고 있다. 용혈이란 실험 시료가 피에 접촉하였을 때 가지는 용혈 특성을 일컫는다. 용혈은 특히 중요한 선별 시험인데 이는 왜냐하면 재료와 장치에 접촉하는 적혈구 세포막의 취약성을 측정하기 때문이다. 한 예시 분석에서는 실험 시료를 적혈구 현탁액에 노출한 다음 방출된 헤모글로빈을 측정하는 단계를 포함한다. 이 실험은 실험 시료가 사람 피와 직접 접촉하는 정적인 조건에서 이루어진다. 적혈구가 방출한 헤모글로빈의 양은 음성과 양성 대조군과 동시에 540 nm에서 분광 광도법으로(시아노메트헤모글로빈으로 변환한 후에) 측정한다. 시료와 대조군의 용혈 지수(hemolytic index)는 다음과 같이 계산할 수 있다.
용혈 지수=방출된 헤모글로빈(mg/mL)/헤모글로빈 현존량(mg/mL) × 100
여기서 방출된 헤로글로빈(mg/mL) = (상수 + X 계수) ×광학 밀도×16이고,
헤모글로빈 현존량(mg/mL) = 희석한 혈액 10±1 mg/mL
당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법(실시예 4.2.5.를 보라)을 이용하여 본 발명 콜라겐 조성물의 발열원성(pyrogenicity)을 측정하는 방법을 망라하고 있다. 한 실시 태양에서는 예를 들어 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 검사를 이용하여 상기 콜라겐 조성물 속 세균 내독소의 존재를 측정함으로써 본 발명 콜라겐 조성물의 발열원성을 결정한다. 이 검사는 세균 내독소의 검출과 정량을 위한 시험관내 검사이다. 한 예시 검사에서는 각각 1×2 cm 규모의 콜라겐 조성물 98개 시료(로트 당 n=1)를 개별적으로 추출하여 검사한다. 이 추출은 각 시료를 37~40℃에서 추출액 30 mL에 40 내지 60분 동안 오비탈 셰이커(orbital shaker)로 가끔식 흔들어 주면서 세척함으로써 이루어진다. 각 시료 추출물의 pH는 6 에서 8이고 이는 pH 시험지로 확인할 수 있다. 발열원의 양은 감도가 mL 당 0.05 내독소 단위(EU)인 속도론적 탁도 비색 검사(kinetic turbidimetric colorimetric test)로 측정한다. 시료 당 총 내독소량은 측정된 내독소 값(EU/mL)에 30 mL(장치 당 추출 부피)를 곱하고 이어서 24(6×8 cm 규모의 장치에서의 효과를 나타내기 위하여)를 곱함으로써 얻을 수 있다.
4.3. 미생물학적 연구
본 발명에서는 본 발명 콜라겐 조성물 속에 존재하는 미생물, 즉 Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans와 Pseudomonas aeruginosa를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 미생물의 존재를 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법을 이용하여 측정하는 방법을 망라하고 있다. 이러한 방법은 콜라겐 조성물의 제조 도중 어느 단계에서라도 쓰일 수 있다. 제조 과정에서의 미생물학적 연구의 한 예시 절차는 다음을 포함한다: 제조 과정에 쓰인 미가공 양막과 장비에 미생물을 가하고 검사하는 단계. 시료를 5분 동안 아래 8개의 미생물을 가한 식염수 속에 담가 의도적으로 시료를 오염시킨다:
1. Escherichia coli 5. Candida albicans
2. Klebsiella pneumoniae 6. Proteus vulgaris
3. Staphylococcus aureus 7. Staphylococcus viridans
4. Enterococcus faecalis 8. Pseudomonas aeruginosa
본 발명의 탈세포화 방법과 세척 방법은 유리하게도 본 발명의 콜라겐 조성물 표면의 미생물 수를 줄일 수 있다.
본 발명에서는 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법으로서, 본 발명 콜라겐 조성물의 생체부하(bioburden)를 측정하기 위한 방법을 망라하고 있다. 본 명세서에서 "생체부하(bioburden)"란 산업적 멸균 처리에 처하기 전 어떠한 양의 재료에서 찾을 수 있는 오염 미생물의 수이다. 한 예시 방법에서는 멸균 보증 수준(sterilization assurance level) 10-6에 이르는데 필요한 최소 E-광선 복사량(E-beam radiation dose)을 측정한다. 막은 PEPTONE-TWEEN(등록상표) 용액을 이용한 침지(沈漬)와 수동 교반으로 추출한다. 도포 방법은 대두 카제인 소화물 한천(digest agar)을 이용한 막 투과이다. 호기성 조건에서 도포한 한천을 30~35℃에서 4일 동안 배양한 다음 수를 세게 된다. 곰팡이류에 대해서는 도포한 한턴을 20~25℃에서 4일 동안 배양한 다음 수를 세게 된다. 포자를 형성하는 세균의 경우 추출물 부분을 열 쇼크 처리하고 거른 다음 획성 세균과 마찬가지로 도포한다. 도포한 한천을 30~35℃에서 4일 동안 배양하고 혐기성 세균의 수를 센다. 혐기성 조건에서 도포한 한천을 4일 동안 30~35℃로 배양한 다음 수를 세었다. 이용할 수 있는 미생물은 Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa와 Bacillus atrophaeus이다.
특정 실시 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 호기생 미생물, 곰팡이류에 대하여 콜로니 형성 단위(colony forming unit, cfu)가 2 미만, 1 미만이거나 0이다. 다른 태양에서 본 발명 콜라겐 조성물은 혐기성 미생물과 포자 형성 미생물에 대하여 cfu가 5.1 미만, 2 미만이거나 1 미만이다.
특정 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 당업자가 알고 있고 본 명세서에서 예시하는 방법(실시예 4.3.2를 보라)에 따라 판정하였을 때 정균제(靜菌劑 bacteriostatic)나 정진균제(靜眞菌劑 fungistatic)가 아니다. 본 명세서에서 정균제란 세균을 죽이지는 아니하나 세균의 성장이나 생식을 억제하는 물질을 가리킨다. 본 명세서에서 정진균제란 진균을 죽이지는 않는 물리적 화학적 작용제로서 진균의 성장을 억제하는 물질을 가리킨다.
4.4. 콜라겐 조성물의 저장과 취급
본 발명은 실온(예를 들면 25℃)에서 본 발명의 콜라겐 조성물을 저장하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 적어도 0℃, 적어도 4℃, 적어도 10℃, 적어도 15℃, 적어도 20℃, 적어도 25℃, 적어도 30℃, 적어도 35℃ 또는 적어도 40℃의 온도에서 저장될 수 있다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 냉장하지 않는다. 일부 태양에서는, 본 발명의 콜라겐 조성물을 약 2 내지 8℃의 온도에서 냉장할 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명의 콜라겐 조성물은 장기간 동안 상기 표시한 어떠한 온도에서라도 저장할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 본 발명의 조성물은 무균 및 비산화성 조건하에서 저장된다. 몇몇 실시 태양에서 본 발명의 방법에 따라 제조한 콜라겐 조성물은 콜라겐 조성물의 생화학적 또는 생물리적 성질의 어떠한 변화도 없이, 생화학적 또는 구조적 형태의 변화없이(예를 들면, 파괴 없이) 앞서 명시한 어떠한 온도에서라도 12개월 또는 그 이상 저장할 수 있다. 몇몇 태양에서 본 발명의 방법에 따라 제조한 콜라겐 조성물은 콜라겐 조성물의 생화학적 또는 생물리적 성질의 어떠한 변화 없이, 생화학적 또는 구조적 형태의 변화없이(예를 들면, 파괴 없이) 수년 동안 저장될 수 있다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 방법에 따라 제조된 본 발명의 조성물이 무기한 지속될 것으로 기대된다. 이 콜라겐 조성물은 장기간 저장에 적합한 어떤 컨테이너 속에라도 저장할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 콜라겐 조성물은 무균 이중 필-파우치(peel-pouch) 포장으로 저장된다.
4.5. 살 균
본 발명의 콜라겐 조성물은 이러한 조성물을 살균하는 것으로 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 살균할 수 있다.
몇몇 실시 태양에서는 내독소는 통과할 수 있지만 콜라겐 조성물은 가두는 필터로 이 콜라겐 조성물을 여과한다. 내독소 여과를 위한 필터로 당업자에게 알려진 모든 필터, 예를 들어 30 kDa 필터를 쓸 수 있다. 몇몇 태양에서는 내독소는 통과할 수 있지만 콜라겐 조성물은 가두는 조건하에서 콜라겐 조성물을 필터와 접촉시킨다. 이 조건은 당업자에게 여과 조건으로 알려진 모든 조건일 수 있는데, 예를 들어 원심분리나 펌프 가압일 수 있다. 필터는 콜라겐을 가두면서 내독소가 관통할 수 있는 크기여야 한다. 몇몇 태양에서는 이 필터의 크기 한계가 5 kDa과 100 kDa 사이이다. 특정 태양에서는 이 필터의 크기 한계가 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa이나 약 100 kDa이다. 이 필터는 셀룰로오스, 폴리에테르술폰과 기타 당업자에게 자명한 재료를 비롯하여 콜라겐 조성물 성분과 적합성이 있다고 이 분야에 알려진 모든 소재일 수 있다. 여과는 당업자가 원하는 만큼 몇 번이고 거듭할 수 있다. 내독소는 내독소 제거를 감시하는 표준적인 방법을 써서 검출할 수 있다.
몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물을 여과하여 바이러스 입자가 없거나 줄어든 콜라겐 조성물을 제조할 수 있다. 유리하게도 본 발명의 이 같은 실시 태양에서는 필터가 콜라겐 조성물은 지니고 있는 대신 바이러스 입자는 통과하도록 한다. 바이러스 제거에 유용하다고 당업자가 알고 있는 모든 필터를 쓸 수 있다. 예를 들어 파로바이러스(parovirus), A형 간염 바이러스와 HIV의 제거 또는 저감을 위하여 1000 kDa 필터를 쓸 수 있다. 750 kDa 필터는 파로바이러스와 A형 간염 바이러스의 제거와 저감에 쓸 수 있다. 500 kDa 필터는 파로바이러스의 제거와 저감에 쓸 수 있다.
이에 따라 본 발명에서는 바이러스 입자가 없거나 줄어든 콜라겐 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하나 이상의 바이러스 입자를 통과시키지만 콜라겐 조성물은 보류하는 크기의 필터에 콜라겐 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 하나 이상의 바이러스 입자를 통과시키지만 콜라겐 조성물을 보류하는 조건 하에서 상기 필터와 콜라겐 조성물을 접촉시킨다. 이 조건은 여과 조건으로 당업자가 알고 있는 모든 조건인데, 예를 들어 원심분리나 펌프 가압이다. 이 필터는 콜라겐을 보류하지만 하나 이상의 바이러스 입자가 필터를 통과하도록 하는 크기여야 한다. 몇몇 태양에서는 이 필터가 500 kDa과 1000 kDa 사이이다. 특정 태양에서 이 필터는 약 500 kDa, 약 750 kDa 또는 약 1000 kDa이다. 이 필터는 콜라겐 조성물과 적합성이 있다고 당어자가 알고 있는 모든 소재인데, 예를 들어 셀룰로오스, 폴리에테르술폰 또는 당업자에게 자명한 재료이다. 여과는 당업자가 원하는 수만큼 거듭할 수 있다. 바이러스 입자는 여과를 감시하는 표준적인 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 조성물의 살균은 이 분야 당업자에게 알려진 방법, 예를 들면 Gorham, D. Byrom(ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55~122을 이용하여 전자선 조사에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 적어도 99.9%의 세균이나 또는 다른 잠재적으로 오염을 일으키는 유기체들을 죽이는데 충분한 어떠한 방사선량이라도 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 실시 태양에서, 본 발명의 조성물의 최종적인 살균을 얻기 위하여 적어도 18-25 kGy의 선량이 사용되었다.
5. 콜라겐 조성물의 제형
몇몇 태양에서 본 발명은 콜라겐 조성물을 제공한다. 이 콜라겐은 본 발명에 따른 모든 콜라겐, 예를 들어 본 명세서에 따른 방법 중 하나로 제조한 콜라겐일 수 있다. 유리하게도 이 콜라겐을 물 또는 인산 완충 식염수 제형으로 만들 수 있다. 특정 태양에서는 이 콜라겐을 인산 완충 식염수 제형으로 만든다.
콜라겐은 당업자가 유용하다고 알고 있는 모든 농도일 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 본 발명의 제형이 0.1 ~ 100 mg/mL, 1 ~ 100 mg/mL, 1~75 mg/mL, 1~50 mg/mL, 1~40 mg/mL, 10~40 mg/mL 또는 20~40 mg/mL 콜라겐을 함유한다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 제형이 약 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL 또는 50 mg/mL 콜라겐을 함유한다. 특정 태양에서 본 발명은 약 35 mg/mL 콜라겐을 함유하는 제형을 제공한다.
본 발명의 몇몇 실시 태양에서는 콜라겐 조성물을 건조하고 당업자에게 유용한 형상으로 성형할 수 있다. 이 형상은 판, 튜브, 플러그, 구 등 유용한 모든 형상일 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물을 성형하여 부상이나 상처 자리에 맞게끔 한다. 성형한 콜라겐 조성물은 당업자에게 자명한 모든 용도에 쓰일 수 있다. 성형한 콜라겐 조성물의 사용하는 방법의 예시는 이하에서 제공한다.
태반에서 추출한, 본 발명의 조성물은 흰 페이스트인 것이 전형적인 경우이다. 이 페이스트는 이러한 재료를 성형하는 것으로 이 분야에 알려진 모든 방법으로 성형할 수 있다. 예를 이 조성물을 가압하여 틀에 넣거나 틀을 둘러싸게 페이스트를 성형하여 특정 형상을 만든 다음 열 건조, 진공 건조 또는 동결 건조할 수 있다. 이 조성물을 또한 얇게 펴서 건조, 예를 들어 겔 건조기 위에서, 예를 들어 진공을 써서 건조할 수 있다.
몇몇 실시 태양에서는 본 발명의 조성물을 약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체에 결합시켜 시험관내 또는 생체내에 조성물로 투여할 수 있다. 투여 형태는 주사, 용액, 크림, 겔, 이식물, 펌프, 연고, 유탁액, 현탁액, 마이크로스피어, 입자, 미세입자, 나노입자, 리포솜, 페이스트, 패치, 정제, 경피 전달 장치, 스프레이, 에어로졸이나 기타 당업자에게 친숙한 수단이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 약학적 제형은 쉽게 입수할 수 있는 원료를 가지고 이 분야에 잘 알려진 방법을 통하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 흔한 부형제, 희석제나 담체와 함께 제형화하여 정제, 캡슐, 현탁액, 분말 등으로 만들 수 있다. 이러한 제형에 적합한 부형제, 희석제와 담체의 예는 다음을 포함한다: 충전제와 증량제(예를 들어 녹말, 당류, 만니톨과 실리실산 유도체(siliicic derivative)), 결합제(예를 들어 카르복시메틸 셀룰로오스와 기 타 셀룰로오스 유도체, 알긴산화물, 젤라틴과 폴리비닐피롤리돈), 습윤제(글리세롤 등), 붕해제(탄산칼슘과 탄산수소나트륨 등), 용해 지연제(파라핀 등), 재흡수 촉진제(4급 암모늄 화합물 등), 계면활성제 등(예를 들어 세틸 알코올, 모노스테아르산글리세롤), 흡착성 담체(adsorptive carrier)(예를 들어 카올린과 벤토나이트), 유화제, 보존제, 감미료, 안정제, 착색제, 방향제, 조미료, 윤활제(예를 들어 활석, 칼슘과 스테아르산마그네슘), 고형 폴리에틸글리콜 및 이 성분들의 혼합물.
"약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체(carrier)"나 "약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 매개체(vehicle)"란 본 명세서에서 제한 없이 살아 있는 동물이나 사람 조직에 접촉하는데 쓰이기에 적합하면서 불리한 생리적 또는 미용적 반응을 일으키지 않고 본 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 어떠한 액체, 고체나 반고체라도 의미할 수 있으며, 여기에는 물이나 식염수, 겔, 크림, 살브(salve), 용매, 희석제, 유체 연고 베이스, 연고, 페이스트, 이식물, 리포솜, 미셀, 거대 미셀 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 당업자에게 알려진 다른 약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체나 매개체를 이용하여 본 발명의 분자를 운반하기 위한 조성물을 제조할 수 있다.
오로지 또는 선택적으로 어느 특정 장소에서, 가능하면 어느 정도 시간에 걸쳐서, 활성 성분을 방출하도록 이러한 제형을 구성할 수도 있다. 이러한 조합은 방출 속도를 제어하는 또 다른 기전을 제공한다. 피복, 외피와 보호 매트릭스는 예를 들어 고분자 물질이나 왁스로부터 만들 수 있다.
본 발명 조성물이나 이러한 조성물과 본 발명의 담체 등의 기타 물질을 함유하는 제형을 생체내 투여하는 방법으로서 다양한 형태에 특히 쓸모가 있는 것에는 경구 투여(볼 속 또는 혀밑 투여 등), 항문 투여, 직장 투여, 좌약 투여, 국소 도포, 에어로졸 도포, 흡입, 복강내 투여, 정맥하 투여, 경피 투여, 진피내 투여, 피부 밑 투여, 근육내 투여, 자궁내 투여, 질내 투여, 체강내 투여, 종양이나 내부 손상 자리로의 수술에 의한 투여, 장기 속 내강(lumen)이나 실질(實質 parenchyma)로의 투여와 비경구 투여가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 다양한 투여 형태에 유용한 기술에는 국소 도포, 섭취, 외과적 투여, 주사, 스프레이, 경피 전달 장치, 삼투압 펌프, 원하는 부위에 대한 직접 전기 석출이나 당업자에게 친숙한 다른 수단이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 적용 부위는 표피 위 등 외부일 수도 있고, 위 궤양이나 외과 시술 부위 등 내부이거나 기타 위치일 수 있다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 크림, 겔, 용액, 현탁액, 리포좀, 입자나 치료용 혹은 미용 화합물의 제형과 전달 분야의 당업자에 친숙한 기타 수단의 형태로 적용할 수 있다. 치료제를 흡입 전달하는 데에는 극미세 입자 크기의 콜라겐 재료를 사용할 수 있다. 피하 투여를 위한 적절한 제형의 일부 예를 들면 이식물, 데포(depot), 주사침, 캡슐과 삼투압 펌프가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 질내 투여를 위한 적절한 제형의 일부 예를 들면 크림과 링이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 경구 투여를 위한 적절한 제형의 일부 예를 들면 알약, 액체, 시럽과 현탁액이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 경피 투여를 위한 적절한 제형의 일부 예를 들면 겔, 크림, 페이스트, 패치, 스프레이와 겔이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 피하 투여를 위한 적절한 전달 메커니즘의 일부 예를 들면 이식물, 데포(depot), 주사침, 캡슐과 삼투압 펌프가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 비경구 투여에 적합한 제형은 수성과 비수성 무균 주사액과 수성과 비수성 무균 현탁액을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 수성과 비수성 주사액은 항산화제, 완충제, 정균제와 제형이 원하는 피투여자의 혈액과 등장이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있고, 상기 수성과 비수성 현탁액은 현탁제와 비후제(肥厚劑 thickening agent)를 함유할 수 있다. 임시 주사액과 현탁액은 이 분야 당업자가 흔히 사용하는 무균 분말, 과립과 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명 조성물이 예를 들어, 하나 이상의 "약학적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체"나 부형제와 결합하는 구현예는 단위 투여 형태(unit dosage form)로 편리하게 제시할 수 있고 통상적인 약학 기법으로 조제할 수도 있다. 이러한 기법에는 활성 성분을 함유하는 조성물과 약학적 담체 또는 부형제를 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 이러한 제형은 활성 성분과 액체 담체를 밀접하고 균일하게 결합시킴으로써 조제한다. 특정 단위 투여 제형은 투여할 성분의 1회 또는 단위 투여량 혹은 그 일부분을 함유하는 것이다. 앞서서 구체적으로 언급한 성분 외에도 본 발명의 조성물을 함유하는 제형은 당업자가 흔히 사용하는 다른 성분을 함유할 수 있다는 것을 밝혀둔다. 투여하는 부피는 투여 경로에 따라 달라진다. 예를 들어 근육내 주사는 부피로 약 0.1 mL에서 1.0 mL에 있을 수 있다.
본 발명 조성물은 원하는 생리적 또는 약학적 효과를 발휘할 수 있는 모든 용량 범위에서 물질을 제공하기 위하여 사람이나 동물에 투여할 수 있다. 투여 용량은 투여할 물질이나 물질들, 치료의 바라는 종착점, 작용 부위나 체액 속의 원하는 유효 농도와 투여의 종류에 달려 있다. 물질의 적절한 투여 용량에 관한 정보는 당업자에게 알려져 있으며, L. S. Goodman와 A. Gilman, eds, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, 그리고 Katzung, Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Connecticut, (6th Ed. 1995)와 같은 참조 문헌에 나와 있다. 원하는 치료범에 숙련된 임상 전문가는 상황과 투여할 물질에 따라 필요한 구체적 투여 용량, 투여량의 범위 및 투여 빈도를 선택할 수 있을 것이다.
콜라겐 조성물은 콜라겐이 아닌 물질이나 화합물을 하나 이상 가질 수 있다. 예를 들어 이 콜라겐 조성물에 예를 들어, 제조 과정이나 수술 준비 도중에 생분자를 함침할 수 있다. 이러한 생분자에는 항생제(클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신 등), 호르몬, 성장 인자, 항종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증약, 항히스타민, 항염증제 그리고 은(질산은과 설파디아진 은을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 은 염 등)과 원소 상태의 은, 항생제, 살세균성 효소(리소자임 등)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 항감염제, 상처 치유제(PDFG, TGF, 티모신을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 사이토킨 등), 상처 치유제로서의 히알루론산, 상처 봉합제(트롬빈을 갖추거나 갖추지 않은 피브린 등), 세포 유인제와 세포 스캐폴드 시약(피브로넥틴 등) 등이 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 특정 사례에서는 이 콜라겐 조성물을 적어도 하나의 성장 인자, 예를 들어 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자 등에 함침시킬 수 있다. 이 콜라겐 조성물을 또한 특정 생화학적 과정에 대한 구체적인 억제제 등의 소형 유기분자, 예를 들어 막 수용체 억제제, 키나아제 억제제, 성장 억제제, 항암제, 항생제 등 분자에 함침할 수 있다.
또 다른 실시 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물을 하이드로겔과 결합시킨다. 당업자에 알려진 모든 하이드로겔 조성물을 본 발명은 망라하고 있는데, 예를 들어 다음 문헌에서 개시하고 있는 모든 하이드로겔인데 이들 문헌 내용 전부는 본 명세서의 참조 문헌이다: Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18~22; Peppas 외, 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27~46; Nguyen 외, 2002, Biomaterials, 23(22): 4307~14; Henincl 외, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13~36; Skelhorne 외, 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19~23; Schmedlen 외, 2002, Biomaterials 23: 4325~32. 특정 태양에서는 하이드로겔 조성물을 콜라겐 조성물 위에 도포, 즉 콜라겐 조성물의 표면 위에 방출한다. 하이드로겔 조성물을 예를 들어, 콜라겐 조성물 위에 분무하거나 콜라겐 조성물의 표면 위에 포화시키거나 콜라겐 조성물로 함침하거나, 콜라겐 조성물 속에 담그거나 콜라겐 조성물 표면에 피복할 수 있다.
본 발명의 방법과 조성물에 유용한 하이드로겔은 당업자가 알고 있는 모든 물 상호작용성 고분자 또는 수용성 고분자로부터 제조할 수 있는데, 여기에는 폴리비닐알코올(PVA), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산, 덱스트란과 이들의 유도체 또는 유사물이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
몇몇 실시 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물을 하이드로겔과 결합하기 전에 하나 이상의 생분자로 더 함침시킨다. 다른 태양에서는 이 하이드로겔 조성물을 본 발명의 콜라겐 조성물을 결합하기 전에 하나 이상의 생분자로 함침시킨다. 이러한 생분자에는 항생제(클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신 등), 호르몬, 성장 인자, 항종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증약, 항히스타민, 항염증제 그리고 은(질산은과 설파디아진 은을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 은 염 등)과 원소 상태의 은, 항생제, 살세균성 효소(리소자임 등)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 항감염제, 상처 치유제(PDFG, TGF, 티모신을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 사이토킨 등), 상처 치유제로서의 히알루론산, 상처 봉합제(트롬빈을 갖추거나 갖추지 않은 피브린 등), 세포 유인제와 세포 스캐폴드 시약(피브로넥틴 등) 등이 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 특정 사례에서는 이 콜라겐 조성물이나 하이드로겔 조성물을 적어도 하나의 성장 인자, 예를 들어 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자 등에 함침시킬 수 있다. 이 생분자가 치료제이면 유리하다.
몇몇 실시 태양에서는 하이드로겔 조성물을 본 발명의 콜라겐 조성물을 함유하는 라미네이트(laminate)와 결합할 수 있다.
상기 하이드로겔/콜라겐 조성물은 상처, 화상과 피부 상태(예를 들어 흉터 치료를 위한)의 치료, 미용 용도(성형 수술 등) 그리고 모든 이식물 용도를 포함하는 의학 분야에서 쓸모가 있지만 이러한 용도가 전부는 아니다. 몇몇 태양에서는 이 하이드로겔/콜라겐 조성물을 대상에 국소 적용하는데, 즉 피부 표면 위에, 예를 들어 상처를 치료하는데 쓴다. 다른 태양에서는 이 하이드로겔/콜라겐 조성물을 대상의 내부에 사용하는데, 예를 들어 몸 속에서 고정 또는 반고정적인 구조가 될 이식물로 사용한다. 몇몇 태양에서는 이 하이드로겔 조성물을 비생분해성 제형으로 조제한다. 또 다른 태양에서는 이 하이드로겔 조성물을 생분해성 제형으로 조제한다. 특정 태양에서는 이 하이드로겔 조성물을 며칠 내에 분해되도록 조제한다. 다른 특정 태양에서는 이 하이드로겔 조성물을 몇 달 안에 분해되도록 조제한다.
몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물에 세포를 심어 세포가 균일하게 세포 합류(confluency)에 이르게 한다. 본 발명 콜라겐 조성물에 심을 수 있는 세포로는 줄기세포, 사람 줄기세포, 분화된 사람 성체 세포, 전능성(totipotent) 줄기세포, 다능성(pluripotent) 줄기세포, 중복성(multipotent) 줄기세포, 조직 특이적 줄기세포, 배아 유사 줄기세포, 수임 전구세포, 섬유모세포 유사 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 태양에서는 본 발명 콜라겐 조성물에 특정 전구세포 유형을 심는 것을 망라하고 있는데, 여기에는 연골 세포, 간세포, 조혈 세포, 이자 실질(parenchymal) 세포, 신경 모세포와 근육 전구 세포가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
6. 줄기세포
몇몇 태양에서 본 발명의 콜라겐 조성물은 복수의 줄기세포를 함유한다. 이 줄기세포는 해당 용도에 걸맞은 모든 줄기세포일 수 있고, 전능성(totipotent)이거나 다능성(pluripotent) 줄기세포 또는 전구세포일 수 있다. 바람직하게는 이 조성물이 미국 출원 공보 제2003/0032179와 2003/0180269호 및 미국 특허 제7,045,148호에서 기재하는 것과 같은 태반 줄기세포를 함유한다. 그러나 이 조성물은 어떠한 조직에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포, 바람직하게는 포유류 줄기세포 또는 전구세포라도 함유할 수 있는데, 예를 들어 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 중간엽 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 조혈 전구세포(예를 들어, 말초 혈액, 태아 혈액, 태반 혈액, 제대혈, 태반 관류물 등에서 유래한 조혈 줄기세포), 체세포 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 이자 줄기세포, 내피 줄기세포, 심근 줄기세포, 근육 줄기세포, 지방 줄기세포 등이 있다. 이 조성물은 서로 다른 유형의 줄기세포의 어떠한 조합도 함유할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서 이 줄기세포는 사람 줄기세포, 예를 들어 사람 태반 줄기세포이다.
일반적으로 본 발명의 조성물은 복수의 줄기 또는 전구세포가 조성물에 부착하기에 충분한 시간 동안 복수의 상기 줄기 또는 전구세포에 접촉하게 된다. 바람직한 태양에서는 상기 줄기 또는 전구세포와 접촉하기 전에 본 발명의 조성물을 유용한 형태, 예를 들어 판, 플러그, 튜브나 기타 형태로 성형한다. 줄기 또는 전구세포를 본 발명의 조성물과 접촉하는데는 이 분야에 알려진 모든 방법을 사용할 수 있는데, 이 방법은 예를 들어 상기 줄기나 전구세포를 함유하는 배지를 조성물의 표면에 가하는 단계, 이 조성물의 일부 또는 전부를 상기 줄기 또는 전구세포의 현탁액 속에 담그는 단계, 복수의 줄기 또는 전구세포가 적어도 한 번 세포 분열하여 증식하기에 충분한 시간 동안 상기 조성물의 표면 위에서 상기 복수의 줄기 또는 전구세포를 배양하는 단계 등을 포함한다. 이 줄기세포, 바람직하게는 태반 줄기세포는 본 발명의 조성물 위에 존재할 수 있는데, 예를 들어 성형된 조성물 위, 조성물 표면 전부 또는 일부분 상에, 예를 들어 표면 위에 무작위로 세포 합류 상태로 등등 존재할 수 있다.
어느 한 실시 태양에서 본 발명의 조성물과 접촉하는 줄기세포 또는 전구세포의 수는 달라질 수 있지만 적어도 1×106, 3×106, 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010, 3×1010, 1×1011, 3×1011 또는 1×1012개이거나, 혹은 1×106, 3×106, 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010, 3×1010, 1×1011, 3×1011 또는 1×1012개 이하의 줄기세포 또는 전구세포를 함유한다.
몇몇 다른 실시 태양에서 본 발명의 조성물은 줄기세포가 배출하는 세포외 매트릭스 단백질을 한 종류 이상 함유한다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 본 발명의 콜라겐 조성물이 세포외 매트릭스 단백질을 함유하도록 하는데, 이를 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 복수의 줄기세포와 접촉시키고, 이 줄기세포를 상기 조성물 상에서 상기 줄기세포가 적어도 한 종류의 세포외 매트릭스 단백질을 검출할 수 있는 양으로 배출하는데 충분한 시간 동안 배양하고, 상기 조성물을 탈세포화하여 적어도 한 종류의 세포외 매트릭스 단백질을 함유하는 콜라겐 조성물을 제조한다. 한 실시 태양에서는 따라서 본 발명의 조성물이 탈세포화된 세포외 매트릭스를 갖추고 있는데, 여기서 탈세포화된 세포외 매트릭스는 줄기세포가 배출 또는 생산한 것이다. 여러 태양에서 이 세포외 매트릭스 단백질은 콜라겐(제 I, II, III 및/또는 IV형), 엘라스틴이나 피브로넥틴이다. 다른 태양에서 증식하고 있지만 분화하지는 않는 복수의 줄기세포가 상기 세포외 매트릭스 단백질을 생산한다. 다른 태양에서 분화 중인 복수의 줄기세포 또는 복수의 줄기세포에서 분화한 복수의 세포가 상기 세포외 매트릭스를 생산한다. 상기 실시 태양 중에서 한 특정 태양은 상기 줄기세포가 태반 줄기세포, 예를 들어, CD34- 태반 줄기세포 또는 CD200+ 태반 줄기세포이다.
6.1. 태반 줄기세포
바람직한 실시 태양에서 본 조성물은 복수의 CD34- 태반 줄기세포를 함유한다. CD34- 태반 줄기세포는 태반 조직에서 얻을 수 있는 줄기세포로서, 조직 배양 기질(substrate)에 부착하며 비태반 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖추고 있는 세포이다. 태반 줄기세포는 태아에서 유래하거나 모체로부터 유래(즉 모체 혹은 태아의 유전형을 가질 수 있다)한 것일 수 있다. 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 완전히 태아 유래이거나 혹은 모체 유래인 태반 줄기세포를 함유하거나 모체와 태아 유래 세포를 모두 가지는 혼합 태반 줄기세포군을 함유할 수 있다. 태반 줄기세포와 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 이하에서 논하는 형태적, 표지적, 배양 특성을 이용하여 확인하거나 선별할 수 있다.
1차 배양 형태로 배양하거나 세포 배양 형태로 배양하였을 때 태반 줄기세포는 조직 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(예를 들어 조직 배양용 플라스틱)에 부착한다. 배양물 속의 태반 줄기세포는 일반적으로 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상인 별 모양인데 세포 중심체로부터 다수의 세포질 돌기가 뻗어나온다. 태반 줄기세포는 그러나 같은 조건에서 배양한 섬유모세포와 형태적으로 구별할 수 있는데, 태반 줄기세포는 섬유모세포보다 이러한 돌기를 더 많이 가지고 있다. 형태적으로 태반 줄기세포는 또한 조혈 줄기세포와도 구별할 수 있는데, 조혈 줄기세포는 배양 중에 더 둥글거나 조약돌 형태를 나타낸다
태반 줄기세포는 일반적으로 CD73, CD105, CD200, HLA-G 및/또는 OCT-4를 발현하고, CD34, CD38 또는 CD45를 발현하지 않는다. 태반 줄기세포는 또한 HLA-ABC(MHC-1)와 HLA-DR을 발현한다. 따라서 한 실시 태양에서는 본 발명의 조성물과 결합할 수 있는 줄기세포가 CD200+이거나 HLA-G+이다. 다른 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 CD73+, CD105+이고 CD200+이다. 다른 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200+이고 OCT-4+이다. 다른 태양에서 태반 줄기세포는 CD73+, CD105+, HLA-G+ 이다. 다른 태양에서 태반 줄기세포는 CD73+, CD105+이고, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 있을 때, 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 다른 태양에서 태반 줄기세포는 OCT-4+이고, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때 분리된 태반 세포군에서 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진한다.
이러한 태반 줄기세포는 관류로 얻을 수 있다. 예를 들어 본 발명에서는 다음 단계를 포함하는 방법에 따라 제조한 분리된 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이 방법은 제대혈을 제거하고 남은 피를 관류하여 제거함으로써 포유류 태반을 관류하는 단계, 상기 태반을 관류액으로 관류하는 단계, 태반 줄기세포를 갖춘 태반 세포군을 함유하고 있는 상기 관류 후의 관류액을 수집하는 단계, 상기 태반 세포로부터 복수의 상기 태반 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 특정 태양에서는 상기 관류액이 제대 정맥과 제대 동맥 양쪽 모두를 통과하고 태반으로부터 스며나온 뒤 이를 수집한다. 이 방법으로 얻은 태반 줄기세포군은 태아 모체 세포의 혼합물을 포함하고 있는 것이 전형적이다. 다른 특정 태양에서는 이 관류액이 제대 정맥을 통과하고 제대 동맥으로부터 이를 수집하거나 관류액이 제대 동맥을 통과하고 제대 정맥으로부터 이를 수집하게 된다. 이 방법으로 얻은 태반 줄기세포군은 실질적으로 태아 유래 세포만으로 이루어지는데, 즉 예를 들어 세포군 속 태반 줄기세포 중 태아 유래 세포가 90%, 95%, 99% 또는 99.5%를 넘는다.
여러 실시 태양에서 태반 관류하여 얻은 세포군 속에 포함된 태반 줄기세포는 상기 태반 세포군의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 99.5%를 차지한다. 다른 구체적 태양에서 관류로 수집한 태반 줄기세포는 태아 모체 세포를 함유한다. 다른 구체적 태양에서 관류로 수집한 이 태반 줄기세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 99.5%는 태아 세포이다.
태반 줄기세포를 물리적 파괴, 예를 들어 태반 또는 그 일부분의 효소 소화시켜 포유류 태반에서 얻을 수도 있다. 본 발명에 따른 줄기세포 수집용 조성액에 접촉하고 있는 채로이 태반 또는 그 일부분을 예를 들어, 갈거나, 잡아 떼거나, 저미거나, 네모난 조각으로 썰거나, 잘게 썰거나, 액체에 담그어 연화시키는 등으로 처리할 수 있고 이어서 하나 이상의 효소로 이 조직을 소화할 수 있다. 이러한 태반 또는 그 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴하고 소화하여, 얻은 물질을 본 발명의 상기 줄기세포 수집용 조성액에 담그거나 섞을 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 세포 중 생존 세포 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다.
태반은 물리적 파괴 및/또는 효소 소화와 줄기세포 회수 단계 전에 구성 성분들로 나뉠 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽, 또는 이들의 모든 조합으로부터 얻을 수 있다. 태반 줄기세포는 양막과 융모막을 함유한 태반 조직에서 얻는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 태반 조직의 작은 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리를 파괴하여 얻는 것이 전형적인 경우이다.
바람직한 줄기세포 수집용 조성액은 조직 파괴 효소를 하나 이상 갖추고 있다. 효소 소화는 여러 효소의 조합, 예를 들어 매트릭스 금속단백 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소나 예를 들어 콜라겐 분해 효소와 디스파제의 조합을 이용하면 바람직하다. 한 실시 태양에서 태반 조직의 효소 소화에서는 금속단백 분해 효소, 중성 단백 분해 효소, 히알루론산의 소화를 위한 점액 용해성(mucolytic) 효소의 조합, 예를 들어, 콜라겐 분해 효소,디스파제와 히알루로니다제 또는 LIBERASE(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 베링거 만하임 회사)과 히알루로니다제의 조합을 사용한다. 태반 조직 파괴에 쓰일 수 있는 다른 효소로는 파파인, 디옥시리보핵산 가수분해효소, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제와 같은 세린 단백 분해 효소를 들 수 있다. 세린 단백 분해 효소는 혈청 속 α-2-마이크로글로불린에 의하여 억제될 수 있으므로 소화에 사용되는 배지는 혈청이 포함되어 있지 않아야 한다. EDTA와 디옥시리보핵산 분해 효소는 세포 회수율을 높이기 위하여 효소 소화에 흔히 사용된다. 끈적한 소화물 속에 줄기세포가 갇히는 일을 막기 위하여 소화물을 희석하는 것이 바람직하다.
조직 소화 효소의 모든 조합 역시 사용될 수 있다. 조직 소화 효소의 전형적인 농도로는 예를 들어 콜라겐 분해 효소 I과 IV의 경우 50~200 단위/mL, 디스파제의 경우 1~10 단위/mL, 엘라스타제의 경우 10~100 단위/mL을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 방출하기 위하여 단백질 분해 효소를 조합하여, 즉 둘 이상의 단백질 분해 효소를 같은 효소 소화 반응에 사용하거나, 차례로 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 또는 그 일부분을 30 분 동안 적절한 양의 2 mg/mL 콜라겐 분해 효소 I로 먼저 소화시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 0.25% 트립신으로 소화한다. 다른 효소를 사용한 다음 이어서 세린 단백 분해 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
다른 실시 태양에서 상기 줄기세포를 함유하는 상기 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 수집용 조성액에서 줄기세포를 분리하기 전에 이 조직을 파괴 및/또는 소화한 용액에, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 이 조직을 더 파괴할 수 있다.
온전한 태반 또는 태아와 모체 세포 양쪽을 포함하는 그 태반의 일부(예를 들어, 태반에서 융모막과 태반엽을 함유하는 부분)를 이용하는 경우, 수집한 상기 태반 줄기세포는 모체와 태아 양쪽에서 유래한 태반 줄기세포를 포함한다는 것을 이해할 필요가 있다. 모체 세포(양막 등)를 전혀 가지고 있지 않거나 또는 무시할 수 있는 정도로 가지고 있는 태반의 일부분이 쓰인 경우는 수집한 상기 태반 줄기세포가 거의 전적으로 태아 태반 줄기세포이다.
6.1.1. 태반 줄기세포의 분리와 특성 파악
효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이건 관계 없이, 포유류 태반 등의 장기로부터 얻은 세포는 처음에 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리를 하여 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등에 관한 모든 표준적인 실험 방법에 따라 이루어질 수 있다. 한 실시 태양에서는 예를 들어 태반 등의 장기에서 수집한 세포를 5000×g로 15분 동안 실온에서 원심분리하여 관류물로부터 회수하는데, 이를 통하여 세포를 오염시키는 잔류물과 혈소판으로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는 태반 관류물을 약 200 mL로 농축하여, 피콜 위에 부드럽게 하나의 층으로 가하고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리하여, 세포의 저밀도 계면층을 후속 처리를 위하여 수집한다.
세포 펠렛은 신선한 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA(미국 뉴욕주 GibcoBRL), DMEM 등을 함유한 IMDM 무혈청 배지에 재현탁된다. 단핵 세포 총분획은 Lymphoprep(노르웨이 오슬로 Nicomed Pharma사) 등을 이용하여 제조사의 설명에 따라 얻을 수 있다.
본 명세서에서 태반 줄기세포의 "분리"란 처리하지 않은 장기, 예를 들어 포유류 태반 속에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포를 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 제거하는 것을 뜻한다. 한 장기에서 얻은 줄기세포는 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50％ 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.
관류나 소화에 의하여 얻은 태반 세포는 차등 트립신 처리(differential trypsinization)로 더 분리되거나, 처음에 이를 이용하여 분리할 수 있는데, 예를 들어 0.2％ EDTA(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma사)를 함유한 0.05％ 트립신 용액을 사용한다. 차등 트립신 처리는 예를 들어 태반으로부터 얻은 섬유모세포 유형세포(fibroblastoid)가 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착하는데 반하여 다른 부착 세포군은 20~30 분보다 더 많은 배양 시간을 요하는 것이 전형적인 경우이기 때문에 가능하다. 탈착된 태반 줄기세포는 트립신 처리와 트립신 중화 용액(Cambrex사의 TNS) 등을 이용한 트립신 중화 처리 후에 수집할 수 있다. 부착 세포를 분리하는 한 실시 태양에서는 예를 들어, 5~10×106 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담게 되는데, 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크가 바람직하다. 이 실시 태양에서는 세포를 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(Cambrex사의 MSCGM)로 배양하고 조직 배양기(37℃, 5％ CO2) 속에 놓아 둔다. 10~15일 후 PBS 세척으로 비부착 세포를 상기 플라스크로부터 제거한다. 이어 PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.
포유류 태반에서 수집한 세포의 수와 종류는 예를 들어 흐름세포 측정법, 세포 분류법, 면역세포화학(예를 들어 조직 특이적 또는 세포 표지 특이적 항체로 세포를 염색하는 것), 형광표지 세포 분리(FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준적인 세포 검출법을 통한 세포 형태와 세포 표면 표지의 변화를 측정함으로써, 빛이나 공초점 현미경을 이용한 세포 형태 분석 및/또는 PCR과 유전자 발현 분석(profiling) 등의 공지 기술을 이용한 유전자 발현 변화 측정으로써 관측할 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상의 특정 표지에 대하여 양성인 세포를 확인하는데에도 쓰일 수 있다. 예를 들어 CD34에 대한 항체를 써서 전술한 방법을 이용하여 어느 세포가 검출 가능한 양의 CD34를 함유하는지를 측정할 수 있다. 그러할 경우 이 세포는 CD34+이다. 마찬가지로 세포가 RT-PCR로 검출할 수 있을 만큼 많은 OCT-4 RNA를 발현하거나, 성체 세포보다 현저하게 더 많은 OCT-4 RNA를 발현하면 그 세포는 OCT-4+이다. 세포 표면 표지에 대한 항체(예를 들어 CD34 등의 CD 표지)와 OCT-4 등의 줄기세포 특이적인 유전자 서열은 이 분야에 잘 알려져 있다.
한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 도 4에 나타낸 것처럼 AC133, CD34, CD38, CD90, CD117, HLA-DR, CD10, CD4, CD71, CD38, CD45와 CD61 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 다른 실시 태양에서는 태반에서 얻은 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 한 실시 태양에서는 이들 표지 중 어느 하나라도 나타내는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 예를 들어 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포는, 특정 실시 태양에서 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 혹은 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 추가적으로 분류된다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38-이고 CD45-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.
한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.
한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 배양시 자갈 모양 또는 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내느냐에 따라서 특성 분류 및/또는 선별될 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체(embryoid body) 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및 CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4+ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.
태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들을 조합하여 분리한 세포는 형광표지 세포 분리 장치(FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. FACS는 세포를 포함한 입자를 분류하는 공지의 방법으로서, 입자의 형광 특성에 바탕을 두고 있다(Kamarch의 Methods Enzymol, 151:150~165(1987)). 개별 입자의 형광부를 레이저로 들뜨게 하면 작은 전하가 발생하여 양과 음의 입자를 혼합물로부터 전자기적으로 분리할 수 있다. 한 실시 태양에서는 세포 표면 표지에 특이적인 항체 또는 리간드를 서로 다른 형광 표지로 표지한다. 이어서 사용된 항체에 결합하는지 여부에 따라 세포를 세포 분리기로 처리하여 분리한다. FACS로 분류된 입자들은 분리와 클로닝을 더 용이하게 하기 위하여 곧바로 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰 속으로 운반될 수 있다.
한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 이 분류는 줄기세포가 배양 중에 부착하느냐 여부에 따라 세포를 선별하는 절차와 함께 이루어질 수 있다. 예를 들어, 부착성 줄기세포는 표지 발현에 따른 세포 분류 전 또는 후에 선별할 수 있다. 한 실시 태양에서는, 예를 들어 CD34의 발현 여부에 따라 먼저 세포를 분류한다. CD34- 세포는 보류하고 CD200+HLA-G+인 세포를 다른 모든 CD34- 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는 태반 유래 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 발현 여부에 따라 분류한다. 예를 들어 이들 표지 중 하나를 발현하는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 한 특정 태양에서는 예를 들어. CCD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포를 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 또는 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 더 분류한다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38-이고 CD45-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.
한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.
한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 줄기세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 배양시 자갈 모양 또는 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내느냐에 따라서 특성 분류 및/또는 선별될 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체(embryoid body) 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및 CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4+ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.
*다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 콜로니 형성 단위 분석(colony forming unit assay)를 이용하여 확인하고 특성 파악하게 된다. 콜로니 형성 단위 분석은 이 분야에서 널리 알려져 있는데, Mesen Cult(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 밴쿠버의 Stem Cell Technologies, Inc.의 상표) 배양 배지를 예로 들 수 있다.
태반 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한) 요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는) MTT 세포 증식 분석. 세포의 수명도 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 등의 이 분야에 잘 알려진 방법으로 알아낼 수 있다.
다른 공지 방법을 이용하여 태반 줄기세포를 다른 태반 세포에서 분리할 수 있는데, 예를 들어 원하는 세포의 선택적 성장(적극적 선택), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(소극적 선택), 혼합 세포군의 차별적 세포 교착성(agglutinability), 예를 들어 대두 아글루티닌에 대한 교착성에 기반한 분리법, 동결-해동 과정, 여과, 통상적인 원심분리와 띠 원심분리, 원심 세정(centrifugal elutriation, counter-streaming centrifugation), 단위 중량 분리, 역류 분배(countercurrent distribution), 전기 영동 등이 있다.
6.1.2. 태반 줄기세포의 배양
*
*태반 줄기세포를 전술한 것처럼 분리하고 즉시 본 발명의 조성물에 접촉시킬 수 있다. 태반 줄기세포를 본 발명의 조성물과 접촉하기 전에 몇 세대 동안 예를 들어 세포 배양물로서 배양할 수도 있다. 예를 들어 분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포가 자라나오는 태반 조직은 세포 배양을 개시하거나 파종하는데 쓰일 수 있다. 세포는 무균 조직 배양 용기로 옮겨지는데, 이 용기는 표면이 라미닌, 콜라겐(예를 들어 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴과 세포외 막 단백질(미국 매사추세츠주 Bedford의 BD Discovery Labware사의 MATRIGEL)과 같은 세포외 매트릭스 또는 리간드로 피복되거나 피복되지 않을 수 있다.
바람직한 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 본 발명의 콜라겐 조성물 위에서 배양한다. 몇몇 태양에서는 이 콜라겐 조성물이 검출할 수 있는 양의 피브로넥틴과 엘라스틴을 함유한다. 다른 실시 태양에서 이 콜라겐 조성물은 피브로넥틴을 검출할 수 없는 양으로 함유하거나 라미닌을 검출할 수 없는 양으로 함유한다. 다른 구체적 태양에서 이 콜라겐 조성물은 건조 중량 기준 엘라스틴을 적어도 5% 또는 적어도 10% 함유한다. 다른 구체적 태양에서, 이 콜라겐 조성물은 건조 중량 기준 엘라스틴을 5%보다 더 많이 함유하지 않는다.
몇몇 실시 태양에서는 배양 배지 속에서 수집할 수 있는 특정 사이토킨의 생산을 위하여 태반 줄기세포를 배양한다. 몇몇 태양에서 이 사이토킨은 IL-6, IL-8 및/또는 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1)이다. 다른 일부 태양에서는 이 태반 줄기세포를 피브로넥틴의 생산을 위하여 배양한다. 구체적인 한 태양에서는 이 태반 줄기세포를 피브로넥틴을 약 5% 미만으로 함유하는 본 발명의 조성물 위에서 배양한다.
앞서 밝힌 바와 같이, 본 발명의 태반 콜라겐 조성물은 모든 유용한 형태, 예를 들어 의학적으로 유용한 형태로 성형할 수 있다. 일단 성형과 건조를 마치고 나면 이러한 조성물은 수용액, 예를 들어 조직 배양 배지나 완충 용액 속에서 안정적이다. 따라서 태반 줄기세포 등의 줄기세포를 성형된 조성물 위에서 직접 배양할 수 있다. 이러한 배양은 세포 배양 접시나 세포 배양에 적합한 다른 액체 용기, 예를 들어 플라스크 속에서 이루어질 수 있다.
이 분야에서 줄기세포 배양 용도로 적합하다고 인정받은 모든 배양 배지 또는 배양 조건을 이용하여 태반 줄기세포를 배양할 수 있다. 배양 배지는 혈청을 함유하는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 예를 들어 다음 배양 배지를 이용할 수 있다:
ITS(인슐린-트랜스페린-셀렌), LA+BSA(리놀레산+소 혈청 알부민), 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-I와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG(Dulbecco's Modified Essential Medium, 저포도당)/MCDB 201(병아리 섬유모세포 기저 배지),
10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 DMEM-HG(고포도당),
15% FBS 함유 DMEM-HG,
10% FBS, 10% 말 혈청과 하이드로코르티손을 함유하는 IMDM(Iscove 변형 Dulbecco 배지),
10% FBS, EGF와 헤파린 함유 M199,
10% FBS, 글루타맥스(상표)와 겐타마이신 함유 α-MEM(최소 필수 배지),
10% FBS, 글루타맥스와 겐타마이신 함유 DMEM 등.
바람직한 배지는 2% FBS, ITS, LA+BSA, 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG/MCDB-201이다.
태반 줄기세포 배양에 쓰일 수 있는 다른 배양 배지에는 DMEM(고농도 또는 저농도의 포도당), Eagle 기본 배지, Ham FlO 배지(FlO), Ham F-12 배지(F12), Iscove 변형 Dulbecco 배지, 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM), Liebovitz L-15 배지, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, 개량 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201(시그마사)와 CELL-GRO FREE가 포함된다.
이 배양 배지는 하나 또는 그 이상의 성분을 보충받을 수 있는데 이러한 성분으로는 혈청[예를 들어 바람직하게는 약 2~15%(v/v)인 소 태아 혈청, 말 혈청(ES), 사람 혈청(HS)], 바람직하게는 약 0.001%(v/v)인 β-메르캅토에탄올(BME), 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-I), 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장 인자(VEGF)와 에리드로포이에틴이 있으며, L-발린을 포함하는 아미노산, 그리고 미생물 오염을 조절하기 위한 하나 또는 그 이상의 항생제 및/또는 항진균약(antimycotic)이 있는데 항생제 및/또는 항진균약에는 페니실린 G, 황산스트렙토마이신, 암포테리신 B, 겐타마이신과 니아스타틴이 있으며 단독으로 또는 이들을 조합하여 쓸 수 있다.
태반 줄기세포는 표준적인 조직 배양 조건, 예를 들어 조직 배양 접시나 다중 웰 역가판에서 배양할 수 있다. 태반 줄기세포를 맺힌 물방울(hanging drop) 법으로 배양할 수도 있다. 이 방법에서는 약 5 mL 배지 속에 태반 줄기세포를 약 1×104 세포/mL로 현탁한 다음 이 배지 한 방울 또는 여러 방울을 100 mL 페트리 접시 등의 조직 배양 용기 뚜껑 안쪽에 놓는다. 이 배지 방울은 예를 들어 다중채널 피페터에서 나온 한 방울이나 여러 방울일 수 있다. 이 뚜껑을 조심스레 뒤집고 배양 접시 바닥의 위에 놓고 줄기세포를 배양하는데, 이 접시 바닥은 접시 내 분위기의 수분을 유지하게에 충분한 양의 액체, 예를 들어 무균 PBS를 가지고 있다.
분리된 태반 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군(예를 들어 생체 내에서 줄기세포 또는 줄기세포군에 정상적으로 결부되어 있는 태반 세포들을 적어도 50% 떼어낸 줄기세포 또는 줄기세포군)을 얻은 뒤에는 이 줄기세포 또는 줄기세포군을 시험관내에서 증식시키고 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포군은 배양 접시, 플라스크, 다중웰 역가판 등의 조직 배양 용기에서 그 태반 줄기세포가 세포 합류(confluence) 조건의 70~90%에 이르는데 충분한 시간, 즉 이 줄기세포와 그 자손이 조직 배양 용기 표면적의 70~90%를 차지할 때까지 배양할 수 있다.
태반 줄기세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 파종할 수 있다. 예를 들어 이 세포들을 낮은 밀도(예를 들어 1 ㎠ 당 약 1000에서 약 5000 세포) 내지 높은 밀도(1 ㎠ 당 약 50,000 세포 또는 그 이상)로 파종할 수 있다. 한 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 0 내지 5% 이산화탄소 속에서 배양한다. 몇몇 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 2 내지 약 25% 산소 속에서 배양하고, 바람직하게는 약 5 내지 약 20퍼센트 산소를 사용한다. 이들 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양하게 된다. 이들 세포는 배양기 속에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 배지는 정지상이거나 교반될 수 있는데, 예를 들어 생반응기를 이용할 수 있다. 태반 줄기세포는 낮은 산화성 스트레스(글루타티온의 첨가, 아스코르브산, 카탈라아제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등) 하에서 성장하는 것이 바람직하다.
70%~90% 세포 합류를 이룬 다음에는 이들 세포를 계대할 수 있다. 예를 들어, 공지 기술을 이용하여 이들 세포를 효소 처리, 이를 테면 트립신 처리하여 조직 배양 표면으로부터 떼어낼 수 있다. 피펫으로 세포를 떼어내고 그 세포 수를 세어 약 20,000~100,000 줄기세포, 바람직하게는 약 50,000 줄기세포를 신선한 배양 배지를 담고 있는 새 배양 용기에 옮겨 계대한다. 이 새로운 배양 배지는 상기 줄기세포를 들어낸 배양 배지과 같은 종류인 것이 전형적인 경우이다. 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 회, 또는 그 이상 계대한 태반 줄기세포군도 망라하고 있다.
6.2. 비줄기세포
줄기세포를 함유하는 본 발명의 조성물은 몇몇 태양에서 하나 이상의 비줄기세포도 함유한다. 본 명세서에서 "비줄기세포"란 분화 완료된(terminall-differentiated) 세포를 가리킨다. 한 실시 태양에서는 예를 들어 본 발명의 조성물이 복수의 줄기세포와 복수의 섬유모세포를 함유한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 비줄기세포의 예를 제약 없이 일부만 들자면 섬유모세포나 섬유모세포 유사 세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 심근 세포, 이자 세포 등이다. 몇몇 다른 태양에서는 이 조성물이 적어도 두 종류의 줄기세포와 적어도 두 종류의 비줄기세포를 함유한다.
7. 콜라겐 조성물의 이용 방법
본 발명의 또 다른 측면에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 치료적으로, 예방적으로 또는 미용적으로 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 광범위한 잠재적 용도를 지닌다. 용도에는 가공한 조직과 장기의 제조, 보철물, 기타 이식물(implant), 조직 스캐폴딩, 상처의 치유와 치료 재료, 지혈 장치, 조직 수리와 지지를 위한 봉합재, 외과와 정형외과용 나사, 외과와 정형외과용 판 등의 장치, 합성 이식물, 미용 이식물과 지지를 위한 천연 피복과 구성 성분, 장기와 조직의 수리나 구조적 지지,물질 전달, 생체공학 플랫폼, 물질이 세포에 미치는 효과를 시험하기 위한 플랫폼, 세포 배양과 기타 수많은 용도가 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 가능한 용도에 관한 이 논의는 모든 것을 포괄하려는 의도가 아니며 다른 많은 구현예가 존재한다. 더욱이 아래에 콜라겐과 기타 재료 및/또는 특정 물질을 결합한 수많은 구체적 예를 들어 놓았지만 재료와 물질의 수많은 다른 조합을 이용할 수도 있다.
상처의 치유나 그 틈을 메우는데 이 콜라겐 조성물을 쓰는 용도에서는 이 조성물이 주변 조직 속 줄기세포의 피브로넥틴 생성을 자극하는 것이 바람직하다. 이러한 실시 태양에서는 이 상처를 측정 가능한 양으로 피브로넥틴을 함유하지 않은 본 발명의 조성물에 접촉시킬 수 있다.
콜라겐 소재 속에 세포를 결합시키는 능력 덕택에 본 발명의 조성물을 조직, 장기나 장기 유사 조직(organ-like tissue)을 구성하는데 쓸 수 있다. 이러한 조직이나 장기에 포함되는 세포에는 물질 전달 기능을 가지는 세포, 대체 조직의 실마리가 될 파종된(seeded) 세포 및 이 두 가지 세포가 포함된다. 조직이나 장기를 만드는데 수많은 세포 유형을 쓸 수 있다. 줄기세포, 수임 줄기세포 및/또는 분화된 세포를 여러 실시 태양에서 사용한다. 이들 태양에서 쓰이는 줄기세포의 예에는 간이나 콩팥 등의 장기 또는 장기 유사 조직을 만드는데 쓰이는 배아 줄기세포, 골수 줄기세포와 제대 줄기세포가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다. 몇몇 태양에서는 조성물의 형태가 원하는 특정 유형으로 성장하고 생식하도록 하는 신호를 세포에 보내는데 도움을 준다. 기타 물질, 예를 들어 분화 유도제를 이 매트릭스에 가하여 특정 유형의 세포 성장을 촉진할 수 있다. 나아가 세포 유형들의 서로 다른 혼합물이 일부 실시 태양에서는 본 조성물에 포함된다. 콜라겐 소재와 매트릭스를 이용하여 조직이나 장기를 생체공학 가공할 수 있는 능력은 다양한 생체공학적 조직 대체 적용 분야를 창조한다. 생체공학 가공한 요소에는 뼈, 치아 구조, 관절, 연골, 골격근, 평활근, 심근, 건, 반월판, 인대, 혈관, 스텐트, 심장 밸브, 각막, 고막, 신경 유도관(nerve guide), 조직이나 장기 패치 또는 봉합재, 결실 조직의 충전재, 미용 복구용 판, 피부(피부 대용물을 만들기 위하여 세포를 더한 판), 기관, 후두개와 성대와 같은 목구멍의 연질 조직 구조, 코 연골이나 눈꺼풀판이나 기관 연결고리나 방패 연골이나 모뿔 연골과 같은 기타 연골 구조, 연결 조직, 혈관 이식물과 그 성분, 국소 적용을 위한 판, 그리고 간, 콩팥, 이자 등의 장기의 복구나 대체가 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 몇몇 태양에서는 이러한 매트릭스를 이식물의 기능을 향상시킬 수 있는 방식으로 약물 및 본 발명의 물질 전달 매트릭스와 결합한다. 예를 들어, 항생제, 항염증제, 국부 마취제나 이들의 조합물을 생체공학 가공한 장기의 매트릭스에 가하여 치유를 재촉하고 불편을 덜 수 있다.
7.1. 미용 분야 응용
사람 피부는 표피와 진피의 복합 재료이다. 피부 표피층의 가장 바깥층은 각질층이다. 각질층 밑은 표피이다. 표피 밑은 유두진피로 불리는 진피의 가장 바깥층이고, 다시 그 다음은 망상 진피와 피하층이다.
피부는 보호, 흡수, 색소 생성, 감각 인지, 분비, 배출, 열 조절과 면역 과정의 조절을 포함하는 여러 가지 기능을 한다. 이러한 피부 기능은 예를 들어 노화, 과도한 햇빛 노출, 흡연, 손상 및/또는 환경 요인에 의하여 부정적으로 바뀔 수 있는데, 이들은 피부에 구조적인 변화를 일으킬 수 있고 피부의 차단층 기능에 손상을 주고 표피 세포의 전환을 저하할 수 있다. 손상된 콜라겐과 엘라스틴은 제대로 수축하는 능력을 잃게 되는데, 이는 피부 주름과 거친 표면을 낳게 된다. 주름은 피부 노화 전형적으로 연관이 되는 피부의 변형으로서 햇빛에 노출된 피부에 특히 잘 생긴다. 노화가 진행하면서 얼굴 몸의 다른 부분은 중력과 햇빛 노출 및 다년간의 안면근 움직임, 예를 들어 웃음, 씹기와 눈을 가늘게 뜨고 보기 등의 효과를 나타내게 된다. 피부가 노화 또는 불건강해지면서 주름, 처짐과 펴진 자국(stretch mark)이 생기고, 거칠어지며 비타민 D를 합성하는 능력이 떨어지게 된다. 노화한 피부는 또한 얇아지며 콜라겐, 엘라스틴과 글리코스아미노글리칸의 변화 때문에 진피 표피 계면이 편평해진다. 노화하는 피부는 두께, 탄력과 바닥에 있는 조직에 부착력의 감소라는 특징을 나타내는 것이 전형적이다.
노화, 환경 요인, 햇빛 노출 및 체중 감소, 육아, 질병(예를 들어 여드름과 암), 수술 등의 기타 요소에 따른 피부 손상은 흔히 피부 윤곽의 결손과 다른 피부 이상을 가져 온다. 윤곽 결손과 다른 피부 이상을 고치기 위해서 사람들은 흔히 얼굴 성형이나 처진 살 제게 등의 성형 수술에 의존한다. 성형 수술은 그러나 일반적으로 고가이고 침습성(invasive)이며 수술 부위에 흉터를 남길 소지가 있고 정상적인 생물학적, 생리적 기능에 영향을 줄 수 있다. 따라서 대체 요법에 대한 필요가 있다.
본 발명에서는 환자의 피부 보강을 위한 방법을 제공한다. 한 실시 태양에서는 환자의 피부 보강을 위한 방법이 보강이 필요한 환자의 얼굴이나 몸의 부위에 본 발명의 콜라겐 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 얼굴이나 몸의 부위는 콜라겐 투여 전의 부위와 비교하였을 때 보강된다. 본 명세서에서 “피부 보강”이란 외부적 행동 또는 효과에 의하여 환자(예를 들어 사람)의 피부와 관련 부위의 자연적 상태에 생기는 모든 변화를 일컫는다. 피부 보강에 의하여 변화할 수 있는 피부 부위의 비제한적인 예로는 표피, 진피, 피하층, 지방, 털세움근(arrector pili muscle), 털줄기, 땀구멍, 피지샘 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
몇몇 태양에서 본 발명의 방법은 눈가의 주름, 코와 입술의 주름("웃음 주름"), 입술 아래턱 주름(marionette line), 미간 주름(glabellar fold)을 치료하기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 주사 또는 기타 방식으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 주름선과 고랑을 메우고 더 매끈하고 젊게 보이는 외모를 되찾도록 도와 준다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 단독으로 쓰이거나 하나 이상의 추가적인 주사 조성물, 레이저 치료 등의 표면 처리(resurfacing) 절차나 얼굴 성형 등의 윤곽 재생(recontouring) 절차와 함께 쓰일 수 있다.
한 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 얼굴에서 주름지거나 꺼진 부분을 보강 및/또는 환자 얼굴과 몸 부위에 탱탱함을 강화 또는 증대하는 데 쓸 수 있다. 보강이 필요한 얼굴 및/또는 몸 부위는 예를 들어 노화, 외상, 질병, 환경 요인, 체중 감소, 출산이나 이들 요인의 조합의 결과일 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사나 기타 수단으로 투여할 수 있는 환자의 얼굴이나 몸 부위의 예를 일부만 들자면 눈 아래, 관자놀이, 윗쪽 뺨, 아래쪽 뺨, 턱, 입, 아래턱선, 이마, 미간, 바깥눈썹, 볼, 인중과 그 주변, 코(예를 들어 콧마루), 목, 엉덩이, 흉골이나 기타 몸이나 얼굴의 다른 부분 및 이들의 조합을 들 수 있다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 주름, 꺼짐 또는 다른 주름살(예를 들어 찌푸린 주름, 걱정해서 생긴 주름, 눌가의 주름, 입술 아래턱 주름), 살 터진 자국(stretch mark), 내외부의 흉터(예를 들어 부상, 상처, 사고나 수술로 또는 물려서 생긴 흉터)와 이들의 조합을 비롯한 피부 결손을 치료하는데 쓸 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 예를 들어 "움푹 들어간 눈(hollow eye)", 다크 서클로 보이는 핏줄과 드러난 눈물 고랑(tear trough)을 치료하는 데 쓸 수 있다. 일례로 본 발명의 콜라겐 조성물을 아래 눈꺼풀 성형(lower blepharoplasty)으로 눈밑 지방체(fat pad)가 과도하게 제거된 후의 눈밑 교정이나 과도한 볼 밑 지방체 적출 또는 자연적 손실로 후의 아래쪽 볼을 교정하는데 쓸 수 있다. 한 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 코 성형술, 피부 이식 또는 기타 수술로 유발된 비정상, 예를 들어 지방 흡입으로 인한 함입에 따른 결과를 교정하는데 쓸 수 있다. 다른 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 얼굴이나 몸의 흉터(예를 들어 상처, 수두 자국이나 여드름 흉터) 교정에 쓸 수 있다. 일부 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에 주사 또는 다른 방식으로 투여하여 얼굴 형태를 교정(reshaping)할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용한 얼굴 형태 교정은 목 이완증(neck laxity)이나 초췌한 얼굴(gaunt face), 긴 얼굴(long face), 하관이 육중한 얼굴(bottom-heavy face), 비대칭인 얼굴, 뚱뚱한 얼굴이나 국소적인 지방 위축이 있는 얼굴, 얼굴 중간 후퇴(midface retrusion), 꺼진 눈(sunken eyes) 및/또는 이들의 모든 조합을 보완하는데 쓰일 수 있다.
한 실시 태양에선 본 발명의 방법이 암이나 여드름 등 질병이나 질환에 따른 피부 결손과 같은 피부 결손을 치료하기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 주사나 기타 방식으로 투여하는 단계를 갖추고 있다. 이 결손은 상기 질병이나 질환에 직간접적인 결과일 수 있다. 예를 들어 피부 결손은 질병이나 질환에 따라 생기거나 질병이나 질환을 치료하면서 생길 수 있다.
7.2. 비미용 분야 응용
7.2.1 틈새 메우기(void filling)
본 발명은 환자의 몸 안에 있는 틈새(void)를 봉합, 충전 및/또는 기타 방식으로 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는 본 발명 방법이 환자 몸 안의 틈새를 메우기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 주사 또는 기타 방식으로 투여하는 단계를 포함하고 있다. 예를 들어 이 콜라겐 조성물을 환자에서 틈새가 자리잡은 부위에 투여할 수 있다. "틈새(void)"라는 용어는 노화, 질병, 수술, 선천적 기형이나 이들을 조합한 원인에 의하여 생간 모든 원하지 않는 빈 공간을 망라하는 의미이다. 예를 들어 종양이나 다른 덩어리를 환자 몸에서 수술로 외과적으로 제거할 때 틈새가 생길 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물로 메울 수 있는 틈새에 대한 비제한적인 예로는 열구(裂溝 fissure), 샛길(fistula), 게실(憩室 divercula), 동맥 자루(aneurysm), 낭종(cyst), 병터(lesion)나 환자 몸속 장기나 조직 중 어떤 곳에라도 생긴 다른 모든 빈 공간을 들 수 있다.
몇몇 태양에서는 피, 오줌이나 기타 생물학적 유체 등의 생물학적 유체가 새어 나가는 것을 막기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하여 조직, 장기나 기타 몸의 다른 구조(예를 들어 혈관)에 있는 틈, 열구나 샛길 혹은 이웃하는 조직, 장기나 구조들 사이의 접합부를 전체적으로 또는 부분적으로 충전, 봉합 및/또는 기타 방식으로 치료할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 콜라겐 조성물을 내장 사이의 샛길이나 환자의 내장으로부터 외부로 열린 구멍이나 틈에 주사하거나, 이식하거나, 틈새로 밀어 넣거나 기타 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하여 이러한 병리학적 상태에서 비롯한 틈새나 다른 흠을 채우고 조직의 섬유모세포 침입, 치유와 내증식을 자극할 수 있다.
한 태양에서는 본 발명의 방법을 이용하여 치료가 필요한 환자의 샛길(fistula)을 충전, 봉합 및/또는 기타 방식으로 치료할 수 있는데, 이 방법은 주사 또는 다른 방식으로 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 샛길 구멍(fistular orifice) 중 하나로 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 바늘을 통하여 주사하여 이 구멍에서 뻗어 나온 툼새를 전부 혹은 거의 메울 수 있다. 혹은 실이나 막대 모양의 콜라겐을 구멍을 통하여 샛길 병터(fistular lesion)로 밀어 넣거나 카테터로 콜라겐을 환자에 도입할 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물로 여러 종류의 샛길을 충전, 봉합 및/또는 다른 방식으로 치료할 수 있는데, 이러한 샛길에는 항문치루, 동정맥루, 방광 샛길, 목동맥 해면굴 샛길(carotid-cavernous fistula), 체외 샛길, 위루(胃瘻), 장루(腸瘻), 벽쪽 샛길(parietal fistula), 침샘 샛길, 질내 샛길, 항문직장 샛길(anorectal fistula) 이나 이들의 조합이 있다.
한 실시 태양에서는 본 발명의 방법을 이용하여 치료가 필요한 환자의 게실을 충전, 봉합 및/또는 다른 방식으로 치료하는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 게실은 창자, 방광 등의 관 모양이나 주머니 모양 장기에 생긴 주머니나 자루 모양 구멍의 비정상적인 생리적 구조물인데 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하여 메우거나 보강할 수 있다.
다른 태양에서는 본 발명의 방법을 이용하여 치료가 필요한 환자의 낭종(cyst)을 충전, 봉합 및/또는 다른 방식으로 치료하는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 낭종은 기체, 유체나 반고형 물질을 담은 내막층을 가지고 있는 비정상적인 주머니이다. 몇몇 태양에서 이 낭종은 가성 낭종인데, 이들은 예를 들어 유체로 차 있지만 상피나 다른 내막층을 갖추고 있지 않다. 본 발명의 콜라겐 조성물로 충전, 봉합 및/또는 다른 방식으로 치료할 수 있는 낭종의 비제한적인 예에는 피지낭, 피부 모양 기형 낭종, 장액낭이나 이들의 조합이 포함된다.
다른 태양에서는 본 발명의 방법이 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 환자에게 투여하여 불필요한 또는 원하지 않는 성장물이나 유체, 세포 또는 조직을 환자에게서 수술, 화학 또는 생물학적 방법으로 제거하여 생긴 모든 틈새를 전부 또는 부분적으로 메우는 것을 포함한다. 콜라겐 조성물을 틈새 자리에 국소적으로 주사하거나 다른 방식으로 투여하여 남아 있는 주변 조직을 보강하거나 치유 과정을 돕고 감염 위험성을 최소화할 수 있다. 이러한 보강은 유방암 수술, 종양성 연결 조직, 뼈 조직이나 연골 조직의 제거 수술 등의 종양 절제로 생긴 틈새 자리에 특히 유용하다.
본 발명은 나아가 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 투여하되 몸에 직접 하지 않고 체외에서 몸 안에 도입할 조직, 장기나 장기 성분에 대하여 이들 조직 장기나 장기 성분의 도입 전에 투여함으로서 보강하는 방법을 제공한다.
7.2.2. 조직 팽윤(tissue bulking)
한 실시 태양에서 본 발명의 방법은 조직 팽윤을 위하여 환자에게 콜라겐 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 “조직 팽윤"이란 외부적 행동 또는 효과에 의하여 환자(예를 들어 사람)의 피부가 아닌 연질 조직의 자연적 상태에 생기는 모든 변화를 일컫는다. 본 발명이 망라하고 있는 조직에는 근육 조직, 연결 조직, 지방과 신경 조직이 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명이 망라하고 있는 조직은 여러 장기 또는 여러 신체 부위의 일부일 수 있는데, 여기에는 괄약근, 방광 괄약근과 요도가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
7.2.3. 요실금
요실금(스트레스성 요실금 포함)은 복부내 압력을 키우는 기침, 재채기, 웃음 또는 운동 등의 활동에 동반하여 나타나는 갑작스런 오줌의 누수이다. 이러한 활동 중에 복부내 압력이 순간적으로 요도 저항 위로 증가하여 대체로 작은 양의 오줌 누수가 갑작스레 일어나게 된다. 스트레스성 요실금은 일반적으로 요도 괄약근의 힘이 줄어들어 괄약근이 복부 압력이 늘어났을 때는 오줌의 흐름을 막을 수 없게 되는 방광내 저장 문제이다. 요실금은 방광과 요도를 지탱하는 골반 근육의 약화나 요도 괄약근의 기능 이상 때문에도 일어날 수 있다. 예를 들어 요도 부위에 대한 예전의 손상, 신경학적 손상, 일부 약물이 요도를 약화시킬 수 있다. 요실금은 폐경, 골반 수술이나 출산, 이를 테면 여러 번의 임산과 질 분만 후 또는 골반 탈출증(방광, 요도나 직장벽이 질내 공간으로 돌출하는 것)이 있는 여성, 방광 탈출증, 방광 요도 처짐증, 직장류가 있는 경우의 여성에서 가장 흔히 볼 수 있고 대개 앞쪽 질 지탱력의 손실과 관련이 있다. 남성에서는 요실금을 전립선 수술, 가장 흔히는 근치 전립선 절제술 후에 볼 수 있는데 여기서는 외요도 괄약근(external urethral sphincter)에 손상이 있을 수 있다.
본 발명은 요실금 또는 그로부터 발생하는 증상이나 상태를 관리 또는 치료하는 방법을 망라하고 있는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 조성물이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는데 여기서는 환자의 괄약근 조직을 보강하고 환자의 소변 통제력을 향상시키거나 회복시킨다. 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방식으로 요관 주위에(periureterally) 투여하여 요도를 둘러싼 조직 크기를 늘려 요실금을 치료 및/또는 관리한다. 스트레스성 요실금 증상의 개선은 조직 부피를 늘리고 그에 따라 오줌 흐름에 대한 저항을 키움으로써 이룰 수 있다.
몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 환자의 요도 주변 부위에 투여하여, 이를 테면 오줌이 새어 나오는 요도에 난 구멍을 막거나 요도 벽의 두께를 키워 오줌을 참을 때 단단하게 밀봉하도록 한다.
다른 태양에서는 환자의 방광 구멍에 있는 요도 근육 바로 바깥쪽에 있는 요도 주변 부위에 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 투여한다. 팽윤성 재료는 피부를 통하거나 요도를 통하거나 여성의 경우 질을 통하여 주사할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 조성물을 바늘을 이용하여 주사할 때 바늘이 놓일 자리를 방광경을 요도에 넣음으로써 인도할 수 있다. 요도 팽윤 과정은 국소 마취하에서 이루어질 수 있지만 일부 환자는 전신, 부위 또는 척추 마취를 요할 수도 있다. 환자가 주사 후 일어설 수 있도록 국소 마취를 할 수 있고 오줌 통제력이 생겼는지를 알아볼 수 있다. 만약 통제력이 생기지 않았다면 환자에 한 번 이상의 주사 투여를 할 수 있다. 방광 통제력을 얻기 위해서 이 과정을 몇 달 후 반복할 수도 있다. 콜라겐 주사는 요도 주변 부위를 팽윤시켜 괄약근을 압박함으로써 오줌 누수에 대한 통제를 돕는다.
7.2.4. 방광뇨관 역류
방광뇨관 역류(VUR 또는 요 역류)는 오줌이 방광에서 콩팥으로 역류하는 특징이 있다. VUR를 치료하지 않으면 콩팥 기능과 환자의 전체 건강에 대한 장기적 효과는 치명적이다. VUR이 있는 환자는 요도 감염, 콩팥 흉터 형성(renal scarring), 깔때기 콩팥염, 고혈압과 진행성 신부전증을 일으킬 위험성이 커진다.
본 발명은 VUR 또는 그로부터 생기는 증상이나 상태를 관리 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 조성물이 필요한 환자에 투여하여는 단계를 포함하며, 이때 환자의 요도 벽은 보강되고 VUR의 증상은 누그러지거나 없어진다. 이 콜라겐 조성물을 모든 공지 수단을 이용하여 요도 입구 아래의 배뇨근 지지 부위 속으로, 예를 들어 내시경 인도를 받아, 주사(예를 들어 방광 삼각선하(subtrigonal) 주사) 또는 기타 방식으로 투여할 수 있다.
7.2.5. 위식도 역류
위식도 역류 질환(GERD)은 대개 식도와 위가 만나는 근육 판막인 하부 식도 괄약근(LES)이 적절하게 닫히지 않거나 이완 또는 약화되어 위 속 내용물이 새어 나오거나 식도로 역류하기 때문에 일어나는 장애이다. 위산 혹 간혹 있는 경우 쓸개즙염이 식도와 닿으면 대부분의 사람이 가끔 느끼는 가슴 통증의 타는 듯한 감각을 불러일으킨다. 역류한 위산이 식도의 내벽에 닿으면 가슴이나 목 구멍(가슴 통증)에 타는 듯한 느낌이 오고 입 안쪽에서 이 유체의 맛이 느껴진다(산성 소화불량). 시간이 지나면서 위산 역류는 식도 내벽의 조직을 망가뜨려 염증과 통증을 가져온다. 성인에서는 지속성이고 치료하지 않은 GERD가 식도를 영구적으로 손상하고 어떤 경우는 암까지 불러올 수 있다. 유아, 어린이와 임산부를 포함한 모든 사람이 GERD를 앓을 수 있다.
본 발명은 GERD 또는 그로부터 생기는 증상이나 상태의 치료 또는 관리 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사 또는 기타 방법으로 조성물이 필요한 환자에 투여하여는 단계를 포함하며, 이때 환자의 LES는 보강되고 GERD의 증상은 누그러지거나 없어진다. 일부 태양에서는 콜라겐 조성물을 내시경 인도하에 식도위 이음부 자리의 식도 벽에 투여한다. 역류를 방해하기 위한 팽윤 효과는 보류된 물질(retained material)과 그에 따른 조직 반응에서 비롯한다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 표준 또는 대구경(예를 들어 대형 게이지) 주사 바늘을 통하여 주사할 수 있다.
7.2.6. 성대와 후두
본 발명은 하나 또는 양쪽 성대(주름) 및/또는 후두(voice box)에 영향을 미치는 질병, 장애(신경학적 장애 등)나 기타 이상을 관리 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 성대와 후두의 질병, 질환이나 이상의 비제한적인 예로는 성문(聲門) 기능부전(glottic incompetence), 한 쪽(unilateral) 성대 마비, 양쪽 성대 마비, 마비성 발성 장애(paralytic dysphonia), 비마비성 발성 장애, 연축성(攣縮性 spasmodic) 발성 장애 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 다른 실시 태양에서는 불완전한 성대 마비(불완전 마비(paresis)), 노령에 따른 일반적인 성대 약화(노인성 후두 경련(presbylaryngis)) 및/또는 (예를 들어 이전의 수술이나 방사선 치료로부터) 성대의 흉터 발생과 같이 성대가 불완전하게 닫히는 질병, 장애나 기타 이상을 관리 또는 치료하는데 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 한 때는 성대가 갖추고 있었지만 (성대 주름 휨이나 위축에서와 같이) 부피나 (성대 마비에서와 같이) 이동성을 잃어버린 환자에게 성대 주름을 지탱하거나 부피를 늘려주는 방법을 망라하고 있다. 몇몇 실시 태양에서는 성대 및/또는 후두의 다른 연질 조직을 본 발명의 콜라겐 조성물로 보강할 수 있는데, 이는 단독으로 또는 다른 치료법이나 약물과 함께 쓰일 수 있다. 한 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물로 한 쪽 (또는 양쪽) 성대 주름에 부피를 더하거나 보강하여 반대쪽 성대 주름과 접촉할 수 있게 한다.
본 발명의 콜라겐 조성물을 환자의 성대나 후두에 투여하기 위한 수단으로는 공지된 수많은 수단 중 어느 것을 써도 좋다. 몇몇 태양에서는 환자의 입을 통하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 주사하기 위하여 굽은 바늘을 이용한다. 몇몇
태양에서는 (대형 게이지, 짧은 바늘 등의) 바늘을 사용하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자의 피부와 후두 융기(Adam's apple)를 통하여 직접 주사할 수 있다. 비디오 모니터에 연결된 대형 후두경으로 환자의 성대 주름을 관찰하면서 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에 투여할 수도 있다.
7.2.7. 성문 기능부전
한 실시 태양에서 본 발명은 성문 기능부전을 관리 또는 치료하는 방법을 제공한다. 후두의 경피 콜라겐 보강은 본 발명의 콜라겐을 공지 수단을 이용하여 환자의 성대 속으로 바늘을 넣어 주사함으로써 이루어질 수 있다. 몇몇 경우에 이 환자는 발성부전(hypophonia) 및/또는 성문 기능부전이 있어 후두의 음성 기능에 영향을 받고, 근육이 더 경직되며, 갑상피열근의 운동 능력이 저하된다. 다른 태양에서는 이 발성부전이 파킨슨병에 의한 것이다. 한 태양에서 관리 또는 치료가 필요한 환자에서 성문 기능부전의 관리 또는 치료를 위한 본 발명의 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 주사 또는 기타 방식으로 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 이 주사는 성대를 보강하고 성문 기능부전을 개선하여 환자의 성문 기능부전이 줄어들거나 없어지게 한다. 환자는 본 발명의 콜라겐 조성물을 투여하기 전에 움직일 수 있는 성대를 가지고 있었을 수도 없었을 수도 있다.
7.2.8. 발성 장애
발성 장애는 목소리의 모든 장애 혹은 말하기의 곤란함이다. 발성 장애는 후두 또는 성대 마비와 관련이 있을 수도 없을 수도 있다. 본 발명은 마비성 발성 장애, 비마비성 발성 장애 또는 연축성 발성 장애 등의 발성 장애를 관리 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시 태양에서 환자의 발성 장애를 관리 또는 치료하는 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물이 필요한 환자에게 이를 주사 또는 투여하는 단계를 포함하며, 이 때 환자의 발성 장애는 본 발명의 콜라겐 조성물을 투여하기 전과 비교하였을 때 개선된다. 몇몇 경우에 후두 콜라겐 주사는 하나 또는 양쪽 성대가 조금씩 더 내전될 수 있도록 하여 갑상성형술(medialization thyroplasty)과 함께, 또는 그 이후에 발성이 개선될 수 있게 한다.
7.2.9. 성대 마비
성대는 실질적으로 점액질 막으로 덮인 하나의 근육이다. 이 근육이 더 이상 신경에 이어져 있지 않으면 근육 위축이 일어난다. 따라서 전형적인 마비된 성대는 크기가 작고 굽어 있다. 또한 마비의 유형에 따라 성대는 다른 쪽 성대와 닿을 수 있을 만큼 가깝게 가운데로 움직일 수도 않을 수도 있다. 성대가 서로 닿을 수 없으면 환자가 소리(혹은 적어도 큰 소리)를 내기 어렵다. 따라서 본 발명은 성대 마비로 위축된 환자의 성대를 보강 또는 팽윤하는 방법을 제공하는데, 이 방법에서는 두 성대가 서로 모이는 능력이 향상된다.
한 쪽(unilateral) 성대 주름 마비는 전형적인 경우에 신경의 기능 장애 때문에 한 쪽 성대 주름이 움직일 수 없게 되는 것인데, 종종 후두는 완전히 닫히지 못한다. 되돌이 후두신경는 각 성대 주름의 움직임을 다루는 주된 신경인데, 예를 들어 여러 가지 질병, 몇몇 수술이나 바이러스 감염에 의하여 손상될 수 있다. 일부 태양에서는 환자의 성대 마비가 갑상선암, 폐암, 결핵이나 사코이드증(또는 림프절이 가슴에서 팽창하도록 하는 모든 것), 뇌졸중, 신경병(예를 들어 Charcot-Marie-Tooth, Shy-Drager와 다발 계통 위축증)의 증상이나 결과이다.
양 쪽 성대 마비는 양 쪽 성대 주름의 (대개 가운데 선 부근의) 움직임 상실이다. 몇몇 태양에서는 환자의 양 쪽 성대 주름 마비가 예를 들어 뇌졸중,이나 기타 신경병적 상태(Arnold-Chiari 이상 형성 등), 갑상선암, 수술(중대한 뇌 수술 등)이나 갑상선 절제술의 증상이나 그 결과이다.
본 발명은 성대 마비를 관리 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시 태양에서는 환자의 한 쪽 성대 마비 또는 양 쪽 성대 마비 혹은 그 관련 증상을 관리 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 콜라겐 조성물을 환자에게 주사 또는 투여하며, 이 때 환자의 성대 주름 폐쇄는 개선된다. 한 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물은 마비된 한 쪽 (또는 양쪽) 성대 주름을 보강하거나 팽윤하여 다른 쪽 성대 주름에 닿을 수 있게 한다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 그가 필요한 환자에게 주사하는 것은 환자의 입을 통하거나 피부와 후두 융기를 거쳐 직접적으로 이루어질 수 있다.
7.2.10. 약물 전달
본 발명의 콜라겐 조성물은 예를 들어, 치료 성분과 같은 약물의 조절 전달을 위한 약물 전달 운반체로 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 조성물은 하나 이상의 치료 성분을 대상, 예를 들어 인간에게 전달한다. 본 발명의 범주 내에 포함된 치료 성분은 단백질, 펩티드, 다당류, 다당류 접합체(conjugate), 유전학 기반 백신, 생 약화 백신, 전체의 세포들이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 약물의 비-한정적 예는 항생제, 항암제, 항세균제, 항바이러스제, 백신, 마취제, 진통제, 항천식제, 항염증 치료제, 항우울제, 항관절염 치료제, 항당뇨 치료제, 항정신병제, 중추 신경계 자극제, 호르몬, 면역 억제제, 근육 이완제, 프로스타글란딘이다.
콜라겐 조성물은 대상, 예를 들어 인간에게 하나 이상의 소형 분자의 조절 전달을 위한 전달 운반체로 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 조성물은 대상, 특히 인간에게 하나 이상의 소형 분자를 전달한다. 여기에서 사용된 것처럼, 용어 "소형 분자" 및 유사한 용어는 몰 당 약 10,000그람보다 작은 분자량을 가진 펩티드, 펩티드 의사체(peptidomimetic), 아미노산, 아미노산 유사체(analog), 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 또는 무기 화합물(즉 헤테로유기화합물 및 유기금속 화합물을 포함함), 몰 당 약 5,000그람보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 1,000그람보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 500그람보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 100그람보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물 및 그러한 화합물의 염, 에스테르 및 이들의 다른 약학적으로 허용 가능한 형태를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 약학적으로 허용 가능한 형태 또한 포함된다.
일정 실시예에서, 약물 전달을 위한 운반체로서의 본 발명의 콜라겐 조성물은 본 발명이 속한 분야에서 알려진 다른 약물 전달 시스템에 비하여 약물의 향상된 흡수, 개선된 약동학적 프로파일 및 약물의 전신적 분포를 가져온다. 개선된 약물동태에 있어, 약물동력학적 프로파일의 개선은 예를 들어 최고 혈장 농도에 도달하는 시간(Tmax); 최고 혈장 농도의 크기(Cmax); 검출 가능한 혈액 또는 혈장 농도를 나타내는 시간(Tlag)과 같은 표준 약물동력학적 파라미터로 측정된다. 향상된 흡수란, 약물의 흡수가 이러한 파라미터로 측정되는 바 향상됨을 뜻한다. 약물동력학적 파라미터의 평가는 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 수행된다.
*몇몇 태양에서는 콜라겐 조성물이 하나 이상의 생분자, 예를 들어 치료제 등의 생분자를 더 갖출 수 있는데, 이들 치료제에는 항생제, 호르몬, 성장 인자, 항암제, 항진균제, 항바이러스제,진통제, 항히스타민, 항염증제, 항감염제, 상처 치유제, 상처 봉합제, 세포 유인제와 세포 스캐폴드 시약, 효소, 수용체 길항제나 작용제, 호르몬, 성장 인자, 자가 골수나 기타 세포 유형, 항생제, 항미생물제, 항체 등이 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 적어도 하나의 성장 인자, 예를 들어 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자 등에 함침시킬 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 또한 하나 이상의 소형 분자에 함침할 수 있는데, 소형 분자에는 특정 생화학적 과정에 대한 구체적인 억제제, 예를 들어 막 수용체 억제제, 키나아제 억제제, 성장 억제제, 항암제, 항생제 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시 태양에서는 원하는 용도에 따라 제조 도중 또는 주사 전에 본 발명의 콜라겐 조성물에 생분자를 함침한다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물이 인터페론(α-IFN, β-IFN, γ-IFN), 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 림프독소(lymphotoxin), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자, 에리드로포이에틴, 전환 성장 인자(TGF), 온코스타틴 M, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 등), 이들이 속한 패밀리의 다른 원소 또는 이들의 조합을 하나 이상 포함한다. 몇몇 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물이 생물학적으로 이러한 성장 인자나 다른 생분자의 유도체, 조각 또는 유사체로서 생물학적 활성이 있는 것들을 함유한다.
본 발명의 방법에 쓰일 때 특히 활성이 있는 성분에는 성장 인자가 포함되는데, 이를 테면 전환 성장 인자(TGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 연결 조직 활성화 펩티드(CTAP), 골 생성 인자와 생물학적 활성이 있는 이러한 성장 인자의 유사체, 조각 및 유도체가 있다. 다기능 조절 단백질인 전환 성장 인자(TGF) 유전자 초거대집단의 구성원들은 유용하다. 전환 성장 인자(TGF) 유전자 초거대집단의 구성원에는 β 전환 성장 인자(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), 골 형태 형성 단백질(예를 들어, BMP1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9), 헤파린 결합성 성장 인자(예를 들어 섬유모세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF)), 인히빈(inhibin)(예를 들어 인히빈 A, 인히빈 B), 성장 분화 인자(예를 들어 GDF-1)와 액티빈(예를 들어 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C)이 포함된다.
7.2.11. 상처와 화상
본 발명의 콜라겐 조성물은 경질 및/또는 연질 조직 회복을 보강하기 위한 상처 드레싱으로서 종래 기술에서 알려진 조성물, 예를 들어 미국특허 제3157524호, 제4320201호, 제3800792호, 제4837285호, 제5116620호에 개시된 것보다 향상된 임상적 유용성을 가지리라고 예상되는데, 이는 부분적으로는 상기 조성물의 물리적 특성 덕택이다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 콜라겐의 천연 4차 구조를 유지하기 때문에 콜라겐 매트릭스의 간극(interstices) 내로 세포 이동을 통하여 향상된 조직 내성장(tissue in-growth)을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 세포가 콜라겐 매트릭스 내에 부착하고 성장하도록 하고, 그들의 자연적 거대분자(macromolecules)를 합성하도록 한다. 세포는 그로써 새로운 조직의 성장을 위한 새로운 매트릭스를 생성한다. 그러한 세포 발달은 섬유, 플리스(fleece) 및 가용성 콜라겐과 같은 다른 알려진 콜라겐의 형태에서는 관찰되지 않는다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 개체의 피부 위에 직접 즉, 상처부위 위 각질층 위에 직접 콜라겐 조성물을 놓아 상처를 치유하는 것을 포함하고, 상처는 예를 들어 부착성 테입을 사용하여 덮어진다. 다른 실시예로, 본 발명은 예를 들어 피하 이식물과 같은 이식물로써 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하여 상처를 치료하는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 콜라겐 조성물에 조직 내 성장을 촉진할 수 있는 거대분자를 첨가하여 상처 치료 속도를 높이는 것을 포함한다. 그러한 거대분자는 히알루론산, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌, 및 프로테오글리칸을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, Doillon 외. (1987) Biomaterials 8: 195-200; 및 Doillon과 Silver (1986) Biomaterials 7: 3-8 참조).
몇몇 태양에서는 상처 관리에 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하는데, 이러한 상처에는 부분 두께와 전체 두께(partial and full-thickness)의 상처, 압력 궤양, 정맥 궤양, 당뇨성 궤양, 만성 혈관 궤양(chronic vascular ulcer), 수도창/잠식성 상처(tunneled/undermined wound), 수술 상처(예를 들어 기증 자리/이식물, 모(Moh) 수술 후 상처, 레이저 수술 후 상처, 족학(足學 podiatric) 수술 후상처, 열개창), 외상 상처(예를 들어 찰과상, 열창, 2도 화상과 피부의 째진 상처)와 배농중인 상처(draining wound)가 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다. 몇몇 실시 태양에서는 본 발명의 콜라겐 조성물이 1회용으로 쓰인다.
본 발명은 또한 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 전환 성장 인자 β, 혈관신생 인자, 항생제, 항진균제, 살정제(spermicidal agents), 호르몬, 효소, 효소 억제제를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 약리학적으로 활성인 성분과 전술한 모든 생분자를 4.2.7장에서 설명한 것처럼 피부에 전달하기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물 내에 함유하는 것을 포함한다. 바람직하게 약리학적으로 활성인 성분은 생리학적으로 효과적인 양만큼 제공된다.
몇몇 실시예에서, 콜라겐 조성물은 상처 부위에 적용하기 전에 동종이형(allogenic) 줄기세포, 줄기세포 및 자가 성인 세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 살아있는 세포를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 특히 외과적 또는 외상의(traumatic) 상처 파손에 의한 상처 감염과 같은 상처를 치료하는데 유용하다. 특정 실시예에서, 콜라겐 조성물은 항생제, 항-미생물제, 및 항-박테리아제를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 상처 감염의 치료에 유용한 성분을 치료학적으로 유효한 양만큼 함유한다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 예를 들어 인체 내 또는 외부 환경 기원의, 상처를 감염시킬 수 있는, 병원성 세균에 대한 알려진 레저보어인 미생물과 같은 본 발명이 속한 분야에 잘 알려진 어떠한 미생물로부터의 상처감염의 치료에 있어서 임상적 및 치료학적 유용성을 가진다. 상처 내 미생물의 성장이 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 감소 또는 억제될 수 있는 미생물의 비-한정적 예는 S. aureus, St. epidermis, β 헤모라이틱(haemolytic) Streptococci, E. coli, Klebsiella 및 Pseudomonas 종, 및 혐기성 박테리아로 깊은 외상성 상처의, 가스 괴저의 원인인 Clostridium welchii 또는 tartium이 있다.
다른 실시예로, 본 발명의 콜라겐 조성물은 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처(예를 들어 콜라겐 조성물은 봉합선으로부터 혈액의 누출을 막기 위해, 및 신체가 봉합 물질에 부착하는 것을 막기 위해 수술 동안 아나스토스모시스(anastosmosis) 부위 둘레로 감싸질 수 있다), 선천적 상처(예를 들어 위축물집표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa))를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 상처 치료를 위해 사용된다. 특히 콜라겐 조성물은 압박 궤양(예를 들어 욕창 궤양)의 치료에 있어 향상된 유용성을 가진다. 압박 궤양은 주로 오랫동안 침대에 있어야 하는, 예를 들어 피부 손실로 고통 받는 사지마비환자 및 하반신마비환자와 같은 환자에게 국소적 압력의 효과 때문에 발생한다. 결과적인 압박 상처는 진피 마손 및 표피와 피부 부속물의 손실을 나타낸다. 또 다른 구체적 실시 태양에서는 상처 관리에 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하는데, 이러한 상처에는 부분 두께와 전체 두께(partial and full-thickness)의 상처, 압력 궤양, 정맥 궤양, 당뇨성 궤양, 만성 혈관 궤양(chronic vascular ulcer), 수도창/잠식성 상처(tunneled/undermined wound), 수술 상처(예를 들어 기증 자리/이식물, 모(Moh) 수술 후 상처, 레이저 수술 후 상처, 족학(足學 podiatric) 수술 후상처, 열개창), 외상 상처(예를 들어 찰과상, 열창, 2도 화상과 피부의 째진 상처)와 배농중인 상처(draining wound)가 포함되지만 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 콜라겐 조성물은 또한 1도 화상, 2도 화상(부분적 두께 화상), 3도 화상(총 두께 화상), 화상 상처의 감염, 절제 및 비절제(unexcised) 화상 상처의 감염, 이식 상처의 감염, 공여 부위의 감염, 전에 이식된 또는 치유된 화상 상처 또는 피부 이식 공여 부위로부터 표피의 손실, 및 화상 상처 농가진을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 화상의 치료에 사용될 수 있다.
7.2.12. 치과
본 발명의 콜라겐 조성물은 예를 들어 치주 수술, 치주 조직의 재생성을 위한 조직의 유도 재생성, 유도된 뼈 재생성 및 치근 덮음과 같은 치과 분야에서 특히 유용하다. 본 발명은 양쪽 매치 치주 결함, 치아 사이 내 뼈 결함(interdental intrabony defect), 깊은 3-벽(wall) 내 뼈 결함, 2-벽 내 뼈 결함, 및 내 뼈 결함 2 및 3을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 치주 내 뼈 결함(periodontal intrabony defect)의 재생성을 촉진하기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 예를 들어 Quteish 외, 1992, J. Clin. Periodontol. 19 (7): 476-84; Chung 외, 1990, J. Periodontol. 61 (12): 732-6; Mattson 외, 1995, J. Periodontol. 66 (7): 635-45; Benque 외, 1997, J. Clin. Periodontol. 24 (8): 544-9; Mattson 외, 1999, J. Periodontol. 70 (5):510-7에 개시된 것과 같은 가교된 콜라겐 막을 사용하는 등의 본 발명이 속한 분야에 알려진 다른 기술과 비교하여 치주 내 뼈 결함의 치료에 있어 향상된 치료적 유용성 및 향상된 임상적 파라미터를 가질 것으로 기대된다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하여 향상된 임상적 파라미터의 예는 플라크 및 잇몸 인덱스 스코어링, 포켓 깊이(pocket depth)의 검사, 부착 깊이(attachement depth)의 검사 및 분기 관련성(furcation involvement)과 뼈 결함의 분류를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 이들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 양쪽 결함(bilateral defect), 양쪽 볼 클래스 II 턱뼈 어금니 분기 결함(paired buccal Class II mandibular molar furcation defects) 및 양쪽 턱뼈 분기 결함(bilateral mandibular furcation defect)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 클래스 II 분기 결함을 치료하기 위하여 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 클래스 II 분기 결함을 치료하는데 있어서 본 발명의 콜라겐 조성물의 유용성은 부분적으로 분기 결함 내 없어진 치주를 재생성하는 그것의 능력으로 설명될 수 있다. 본 발명의 콜라겐 조성물은 Paul 외, 1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang 외, 1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black 외, 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukna 외, 1995, J. Periodontol. 67: 650-7에 개시된 것과 같은 클래스 II 분기 결함을 치료하는데 있어 본 발명이 속한 분야에서 사용된 콜라겐 막과 비교하여 향상된 치료적 및 임상적 유용성을 가지리라 예상된다.
본 발명은 또한 치근(root) 덮음 시술에 있어 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 치근 덮음(root coverage)에서 본 발명의 조성물의 유용성은 부분적으로 가이드된 조직 재생성의 원리에 기초한 없어진, 손상된 또는 질병 있는 잇몸 조직을 대체하는 그것의 능력으로 설명될 수 있다. 본 발명의 조성물은 여러 이유로 위에서 인용되었던 Shieh 외, 1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahedi 외, 1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan 외, 1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wang 외, 1997 J. Dent. Res. 78 (Spec Issue): 119 (Abstr. 106)에 개시된 것과 같은 치근 덮음에 전통적으로 사용되어온, 본 발명이 속한 분야의 콜라겐 막과 비교하여 향상된 임상적 유용성을 가질 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 치주염 및 치은염(gingivitis)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 치주 질환을 가진 개체에게 콜라겐 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 스케일링 및 치근 계획 시술(root planning procedures)에 있어 부속물(adjunct)로써 임상적 유용성을 가진다. 본 발명은 본 발명의 콜라겐 조성물을 이용하여 치주 질환이 있는 개체를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 조성물을 사용하여 개체의 치주 질환을 치료하는 예시적 방법은 예를 들어 5 mm 이상의 크기를 가진 하나 이상의 치주 포켓 내로 콜라겐 조성물을 삽입하는 것을 포함하며, 이 경우 바람직하게 콜라겐 조성물은 클로헥시딘 글루코네이트와 같은 항생제를 함유한다. 바람직하게 콜라겐 조성물은 생분해된다.
치과학에서의 사용을 위한 본 발명의 콜라겐 조성물은 치료되는 치과 장애의 타입에 따라 하나 이상의 생분자를 함유할 수 있다. 치과 장애를 치료하는데 본 발명이 속한 분야에서 알려진 어떠한 생분자도 본 발명의 방법 및 조성물에 포함된다. 특정 실시예에서, 감염과 관련된 치과 장애를 치료하기 위해 사용된 콜라겐 조성물은 독시사이클린, 테트라사이클린, 클로헥시딘 글루코네이트, 및 미노사이클린을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 항생제를 함유할 수 있다.
7.2.13. 기타 용도
본 발명의 콜라겐 조성물은 수술 후 난소 또는 자궁각에 대한 유착 차단막(post-operative adhesion barrier)으로 쓰일 수 있다. 콜라겐 조성물은 뇌의 유착 차단막(예를 들어 뇌수막 유착(meningio-cerebral adhesion))으로 쓰일 수도 있다. 여기서 콜라겐 조성물은 경수막(硬髓膜 pachymeninx)과 연수막(軟髓膜 leptomeninx)을 가르는 경질막 밑 공간을 복원하는데 쓰일 수도 있다. 일반적으로 이 콜라겐 조성물은 예를 들어 지라 등의 손상된 내부 장기를 감싸는 포장이나 수술 후 누수를 통제하기 위하여 허파에 부착하는 시트로 스일 수 있다. 본 콜라겐 조성물은 또한 (고막 천공시의) 고막 이식물에 대한 외과 시술을 지원하거나 고실의 꼭지벽(mastoid wall)의 내막으로 쓰일 수 있다. 심혈관 수술에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 심막 봉합 재료로 쓸 수 있다. 콜라겐 조성물은 또한 정관 이음술에서 연결을 완료하는데도 쓰일 수 있다.
7.3. 줄기세포 함유 조성물의 용도
미용 또는 비미용 용도를 막론한 앞서 설명한 모든 용도의 맥락에서 볼 때 본 조성물은 상기 6장에서 기술한 것과 같은 줄기세포, 바람직하게는 태반 줄기세포를 한 유형 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물과 접촉하였을 때 태반 줄기세포는 상처 치유를 촉진하는 사이토킨, 예를 들어 IL-6, IL-8과 MCP-1(단핵구 화학주성 단백질-1)을 분비한다. 본 발명의 조성물에 피브로넥틴이 없거나 무시할만한 양인 실시 태양에서는 본 조성물에 접촉하였을 때 태반 줄기세포가 피브로넥틴을 비롯한 세포외 매트릭스 단백질을 분비한다. 그러므로 본 조성물은 본 조성물과 부착한 태반 줄기세포와 함께 세포 이동, 예를 들어 이러한 줄기세포와 조성물을 조합 투여받은 개체 속으로 뜨는 그 개체의 일부분을 따라 가는 세포 이동을 자극하고 또 허용하는 하나의 표면 또는 통로를 만들도록 작용할 수 있다.
본 조성물과 줄기세포는 함께 한 개체에 투여할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 조성물을 개체에 투여하기 직전(예를 들어 10~20분 전)에 이 조성물과 접촉한 줄기세포를 이 조성물이 포함하고 있다. 다른 태양에서는 조성물의 투여 전, 줄기세포가 조성물에 부착하기에 충분한 시간, 전형적으로는 적어도 투여하기 1시간 전에 줄기세포를 조성물에 접촉시킨다. 더 구체적인 태양에서는 조성물의 투여 전에 접촉하는 이 시간이 줄기세포가 부착하고 증식하기에 충분한 시간, 전형적으로는 적어도 투여하기 24에서 48시간 전이다. 다른 더 구체적인 태양에서 이 시간은 줄기세포가 본 발명의 조성물에 부착하고 증식하며 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 피브로넥틴을 검출 가능한 양으로 배출하기에 충분한 시간이다.
본 조성물과 줄기세포는 개체에 따로 투여할 수도 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 조성물을 개체, 예를 들어 수복이 필요한 상처나 조직의 자리에 투여하고 줄기세포를 이어서 투여할 수 있다. 다른 태양에서는 줄기세포를 수복이 필요한 조직이나 상처 자리에 줄기세포를 접촉시키고 수복이 필요한 이 상처나 조직에 이어서 본 발명의 조성물을 접촉시킨다.
따라서 한 실시 태양에서 본 발명은 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 줄기세포, 예를 들어 태반 줄기세포를 함유하는 본 발명의 조성물에 상처를 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 이 줄기세포는 상기 상처의 적어도 일부분에 IL-6, IL-8 또는 MCP-1 혹은 이들의 모든 조합을 분비하거나 피브로넥틴을 분비한다. 상기 줄기세포가 피브로넥틴을 분비하는 경우는 본 발명의 콜라겐 조성물이 피브로넥틴을 검출할 수 없는 양으로 함유하는 쪽이 바람직하다. 특정 태양에서는 본 조성물을 상처의 형상에 근사하도록 성형하거나 모양을 만든다. 몇몇 태양에서 이 상처는 치유되지 않는 상처이다. 특정 태양에서는 이 상처가 다리 궤양, 예를 들어 정맥 다리 궤양, 동맥 다리 궤양, 당뇨성 다리 궤양이나 욕창(압박성 궤양)이다. 이 상처가 다리 궤양인 경우, 이 궤양의 적어도 일부분을 덮을 있을만큼 큰 시트로 본 조성물을 성형하고 이 시트가 시트 표면 중 적어도 상기 궤양과 접촉할 면에는 태반 줄기세포가 갖추어져 있는 것이 바람직하다. 여러 실시 태양에서 이 상처는 사고에 의한 상처이거나 수술 절차에 의하여 발생한 또는 그에 부수한 상처이다. 이 수술 절차는 전술한 바와 같이 본 발명의 콜라겐 조성물이 쓸모가 있을 수 있는 모든 수술 절차이며 성형 수술이나 비성형 수술일 수 있다.
다른 태양에서 본 발명은 개체의 몸 일부분에 있는 결함의 개선 또는 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 결함은 자연 발생적인 것, 예를 들어 샛길(fistula), 결함이 있는 심장 판막, 배 벽의 천공 등의 유전적 결함일 수 있다.
8. 본 콜라겐 조성물을 함유하는 키트
본 발명의 다른 측면에서는 본 발명의 콜라겐 조성물을 함유하는 키트를 제공한다. 예를 들어 본 발명은 포유류 조직을 보강 또는 대체하는 키트를 제공한다. 이 키트는 당업자에게 배분하기에 위하여 포장된 본 발명의 콜라겐 조성물을 하나 이상 포함한다. 이 키트는 라벨과 본 발명 방법에 따라 포유류 조직을 보강 또는 대체하기 위한 콜라겐 조성물의 사용 설명서를 갖추고 있다. 몇몇 태양에서 이 키트는 콜라겐 조성물을 투여하는 수단과 같이 본 방법을 수행하는데 융용한 수단을 포함하고 있는데, 여기에는 하나 이상의 주사기, 카뉼라, 카테터 등이 있다. 일부 태양에서는 이 키트에 이 콜라겐 조성물의 투여 수단을 안정하게 폐기하는데 유용한 성분들(예를 들어 사용한 주사기를 위한 날카로운 폐기물 용기)이 포함된다. 몇몇 태양에서는 이 키트가 미리 채워 놓은 주사기, 단위 투여 용량이나 단위 사용 패키지를 갖추고 있다.
일부 다른 태양에서 본 발명의 키트는 본 발명의 콜라겐 조성물과 줄기세포군의 배양을 위한 하나 이상의 다른 성분을 포함한다. 예를 들어 이 키트는 줄기세포, 예를 들어 태반 줄기세포의 배양에 적합한 하나 이상의 형태로 본 발명의 콜라겐 조성물을 갖추고 있을 수 있는데, 예를 들어, 판, 튜브, 메시 등의 형태를 한 콜라겐 조성물일 수 있다. 이 키트는 줄기세포의 배양을 위하여 쓰이는 하나 이상의 도구, 예를 들어 세포 배양 중 본 발명의 콜라겐 조성물을 담을 수 있는 배양 접시, 주사기, 피펫 팁, 세포 배양 배지, 하나 이상의 사이토킨이나 성장 인자, 1회용품 등을 포함할 수 있다.
다른 태양에서 이 키트는 태반 조직으로부터 줄기세포의 수집을 용이하게 하는 성분을 하나 이상 갖출 수 있다. 여러 특정 태양에서 이 키트는 줄기세포 수집을 위한 태반 관류를 용이하게 하는 성분, 예를 들어 관류액, 태반 하나를 담을만큼 충분히 큰 하나 이상의 용기, 관류액 수집을 위한 유리 용기나 플라스틱 용기, 관류액 수집을 위한 하나 이상의 백, 탯줄 혈관을 관통화(官通化 canalization)하기 위한 바늘 및/또는 카뉼라 등을 포함한다. 다른 특정 태양에서 이 키트는 태반 조직을 효소 소화하여 태반 줄기세포 분리를 돕는 하나 이상의 성분, 예를 들어 하나 이상의 조직 소화 효소(트립신, 키모트립신 등), 세포 배양에 적절한 플라스틱 용기(배양 접시, 다중웰 배양판 등)를 갖추고 있다.
일부 태양에서는 이 키트가 본 발명의 콜라겐 조성물을 적어도 하나의 의료적 용도, 예를 들어 상처 치유에 사용하는데 필요한 설명서를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서는 이 키트에 하나 이상의 줄기세포군을 본 발명의 콜라겐 조성물 위에서 배양하는데 필요한 설명서가 포함되어 있다.
본 발명은 사람 태반 텔로펩티드 콜라겐을 함유하는 조성물, 이 조성물을 제조하는 방법, 이 조성물의 사용 방법과 이 조성물을 함유하는 키트를 제공한다. 이러한 본 발명의 조성물, 키트와 방법은 유용한데, 예를 들어, 포유류 조직을 보강하거나 대체하는데 유용하다.
도 1은 세포외 매트릭스(ECM)를 분리하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2a는 여러 가지 방법으로 제조한 콜라겐 조성물 상에서 자란 태반 줄기세포로부터 IL-6이 분비되는 것을 나타낸다. 가로 좌표: 조성물 종류별 구체적인 성장 조건과 이 조성물 상에서 세포가 자란 시간. 세로 좌표: ECM에 결합한 세포 1000개 당 피코그램/mL. NC = 세포 없음. Purecol = 정제한 콜라겐. TCPS = 조직 배양 폴리스티렌.
도 2b는 여러 가지 방법으로 제조한 콜라겐 조성물 상에서 자란 태반 줄기세포로부터 IL-8이 분비되는 것을 나타낸다. 가로 좌표: 조성물 종류별 구체적인 성장 조건과 이 조성물 상에서 세포가 자란 시간. 세로 좌표: ECM에 결합한 세포 1000개 당 피코그램/mL. NC = 세포 없음. Purecol = 정제한 콜라겐. TCPS = 조직 배양 폴리스티렌.
도 2c는 여러 가지 방법으로 제조한 콜라겐 조성물 상에서 자란 태반 줄기세포로부터 MCP-1이 분비되는 것을 나타낸다. 가로 좌표: 조성물 종류별 구체적인 성장 조건과 이 조성물 상에서 세포가 자란 시간. 세로 좌표: ECM에 결합한 세포 1000개 당 피코그램/mL. NC = 세포 없음. Purecol = 정제한 콜라겐. TCPS = 조직 배양 폴리스티렌.
이하에서 이 분야의 당업자는 "약 23℃에서"가 실온을 가리킨다는 것을 잘 알고 있을 것이다.
1. 실시예 1: 태반으로부터의 콜라겐 분리
이 실시예는 태반에서 콜라겐을 분리하는 것을 도시한다.
냉동 태반을 아래 기술하는 방법으로 얻었다. 이 태반을 싼 다음 Nalgene사 트레이 속에서 물로 1~4 시간 동안 해동하였다. 이어서 태반을 둘러싼 플라스틱 포장을 떼어 내고 물 속에 넣어 더 해동하였다.
해동한 태반을 스테인레스강제의 고기 분쇄기(meat grinder) 트레이 속에 놓았다. 탯줄 부분을 각 태반에서 잘라내고 각 태반을 약 23℃에서 4조각으로 잘랐다. 이 조각을 고기 분쇄기로 약 23℃에서 분쇄하였다.
삼투압 쇼크: 이렇게 얻은 분쇄한 태반을 0.5 M NaCl(태반 장 5 L)이담긴 Nalgene 탱크에 넣고 전동 믹서로 75~100 rpm에서 (4~6℃로 24시간 동안) 혼합하였다.
24시간 후 이 믹서를 중지하여 약 23℃에서 조직이 믹서 바닥에 가라앉도록 하였다. 조직과 유체를 #36 Tygon(등록상표) 튜빙이 달린 연동(peristaltic) 펌프로 내보낸 다음 #40 체로 약 23℃에서 거르고 분리된 조직을 다시 혼합 탱크에 넣었다.
새 0.5 M NaCl(태반 당 5 L)을 이 혼합물에 보태어 주고 이를 4~6℃에서 24시간(전동 믹서, 75~100 rpm) 동안 혼합하여 주었다. 24시간 후 전술한 방법을 사용하여 이 조직을 분리하였다.
조직을 물(태반 당 5 L)로 세척한 다음 4~6℃에서 24시간(전동 믹서, 75~100 rpm) 동안 혼합하여 주었다. 24시간 후 이 조직을 전술한 방법으로 분리하였다.
앞의 네 단락에 기재한 것처럼 이 조직을 0.5 M NaCl로 더 씻어 준 다음, 0.5 M NaCl로 한 번 더 씻고 이어서 물로 세척하였다.
동결 건조: 이렇게 얻은 시료를 200~400 g 분량씩 동결 건조 용기에 쉘(shell)로 넣고, -70℃에서 1~2 시간 동안 얼렸다. 이 냉동 시료를 24~48 시간 동안 동결 건조기 속에서 동결 건조하고 꺼냈다. 이 동결 건조한 시료들을 믹서 속에서 부드러운 분말로 되게 섞어 준 다음 깨끗한 혼합 탱크로 옮겼다.
세제 처리: 1% 데옥시콜린산 용액(태반 당 1 L)을 상기 혼합 탱크에 상기 혼합하고 동결 건조한 시료와 함께 가하였다. 이 시료와 1% 데옥시콜린산 용액을 24시간 동안 4~6℃에서 혼합하였다(전동 믹서, 75~100 rpm). 24시간 후, 이 믹서를 정지하고 앞서 기재한 것처럼 #40 체로 조직을 분리하였다.
이 세제 처리를 24시간 동안 4~6℃에서 반복하였다(전동 믹서 75~100 rpm). 24시간 후 믹서를 정지하고 전술한 것처럼 #40 체로 조직을 분리하였다.
물 세척: 조직을 물(태반 당 5 L)로 씻고 24시간 동안 4~6℃에서 혼합하였다(전동 믹서 75~100 rpm). 24시간 후 이 조직을 전술한 방법으로 분리하였다.
조직을 다시 물(태반 당 5 L)로 씻고 24시간 동안 4~6℃에서 혼합하였다(전동 믹서 100~150 rpm). 24시간 후 이 조직을 전술한 방법으로 분리하였다.
조직을 다시 물(태반 당 5 L)로 씻고 24시간 동안 4~6℃에서 혼합하였다(전동 믹서 150 rpm). 24시간 후 이 조직을 전술한 방법으로 분리하였다.
선택적으로 조직을 네번째로 물(태반 당 5 L)로 씻고 24시간 동안 4~6℃에서 혼합하였다(전동 믹서 150 rpm). 24시간 후 이 조직을 전술한 방법으로 분리하였다.
동결 건조: 이렇게 얻은 시료를 200 g 분량씩 믹서에 넣었다. 이 시료에 200 mL의 탈이온수를 가하고 시료를 믹서로 고운 가루가 되도록 섞어 주었다. 섞은 시료를 모으고 물(태반 당 1 L)로 헹구어 주었다.
동결 건조 용기에 시료를 200~400 g 분량씩 넣었다. 시료를 쉘 속에 넣고 -70℃에서 얼렸다. 쉘에 넣은 시료를 24~48 시간 동안 동결 건조하였다.
무균 염기성 처리: 동결 건조한 시료들을 모았다. 수산화나트륨 용액(0.5 M, 1 L)을 멸균 처리한 무균 플라스크에 넣었다. 내독소 함량이 적은 물(low endotoxin water) 1 L를 앞서 모은 동결 건조한 시료에 가하였다. 시료와 수산화나트륨 용액을 교반기(shaker)에서 250 rpm으로 4시간 동안 약 23℃에서 섞어 주었다.
무균 물 세척: 시료를 무균 #70 필터로 여과하여 회수하고 1 L의 무내독소 물로 헹구어 주었다. 무내독소 물(1 L)을 가하고 시료를 교반기(shaker)에서 250 rpm으로 18~24시간 동안 약 23℃에서 섞어 주었다.
이 시료를 무균 #70 필터로 여과하여 회수하였다. 무내독소 물(1 L)을 가하고 시료를 교반기(shaker)에서 250 rpm으로 18~24시간 동안 약 23℃에서 섞어 주었다.
이 시료를 무균 #70 필터로 여과하고 1 L의 무내독소 물로 헹구어 주었다. 무내독소 물(1 L)을 가하고 시료를 교반기(shaker)에서 250 rpm으로 18~24시간 동안 약 23℃에서 섞어 주었다.
pH가 9보다 크면 이 시료를 무내독소 물로 한 번 더 씻고 교반기(shaker)에서 250 rpm으로 18~24시간 동안 섞어 주었다.
pH가 9보다 작으면 이 시료는 조제를 위한 준비를 마친 것이다.
수득률은 10 g/태반 또는 그 이상일 수 있다.
이렇게 얻은 시료를 저장하기 위하여 동결 건조하였다. 이 시료를 이용, 예를 들어 주사기에 쓰일 페이스트로 이용하려면 시료를 믹서기 속에서 인산염 완충 식염수에 300~1000 mg/mL로 현탁할 수 있다. 이 시료를 또한 인산염 완충 식염수 속에서 500~1000 mg/mL로 성형하여 예를 들어 판,튜브, 플러그 등의 형태로 만들 수 있다.
2. 실시예 2: 텔로펩티드 콜라겐 시료 제조
텔로펩티드 콜라겐 7.8 g을 실시예 1에 나온 삼투압 쇼크, 동결 건조, 세제 처리, 물 세척, 동결 건조, 염기성 처리, 물 세척과 동결 건조 단계를 밟아 제조하였다.
텔로펩티드 콜라겐 11.8 g을 실시예 1에 나온 삼투압 쇼크, 동결 건조, 세제 처리, 물 세척, 염기성 처리, 물 세척과 동결 건조 단계를 밟아 제조하였다.
텔로펩티드 콜라겐 12.0 g을 실시예 1에 나온 삼투압 쇼크, 동결 건조, 세제 처리, 물 세척, 염기성 처리, 물 세척과 동결 건조 단계를 밟아 제조하였다.
텔로펩티드 콜라겐 11.8 g을 실시예 1에 나온 삼투압 쇼크, 세제 처리, 물 세척, 염기성 처리, 물 세척과 동결 건조 단계를 밟아 제조하였다.
3. 실시예 3: 생화학적 분석
콜라겐 시료를 실시예 1과 2에 따라 제조하였다. 표준적 방식의 생화학적 분석 결과 건조 중량 기준 콜라겐 80.40%, 물 11.00% 그리고 피브로넥틴, 라미닌과 글리코스아미노글리칸이 0.01% 미만이었다. 엘라스틴 함량은 측정하지 않았다.
실시예 1과 2에 따른 시료의 아미노산 분석 결과 글리신이 34~35%, 하이드록시프롤린이 11%, 프롤린이 10~11%였다.
실시예 1과 2에 따른 시료의 면역 분석 결과 제I형 콜라겐이 74~92%, 제III형 콜라겐이 4~6%, 제IV형 콜라겐이 2~15%였다.
4. 실시예 4: ECM 제조 방법의 다른 대안과 ECM 상의 줄기세포 배양
본 실시예에서는 본 발명의 콜라겐 조성물 제조 방법의 다른 대안을 설명하고, 이들 대안에 따라 재료의 조성 분석을 제공한다.
실험 재료와 방법
세포외 매트릭스(ECM)의 분리: ECM은 다음과 같이 분리하였다. 간략하게 냉동한 사람 태반를 0.5 M 염화나트륨 속에서 녹이고 고기 분쇄기에서 간 다음 ㅇ약 23℃의 배양 교반기(incubator shaker) 속에서 5 M 염화나트륨 수용액으로 거듭하여 씻고 1% SDS나 0.5% 데옥시콜린산 등의 세제로 처리하였다. 피를 뺀 태반 조직을 3시간에서 24시간 사이의 서로 다른 시간에 걸쳐 0.1~0.5 N 수산화나트륨으로 처리하여 태반엽 조직을 가용화하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 이어서 헹구어 주어 pH를 중화하였다. 이렇게 하여 얻은 재료는 그대로 안정한 페이스트였고 이를 4℃에 저장하였다.
생화학 분석: 분리된 ECM의 생화하적 조성을 결정하기 위하여, 시료 1 g을 동결 건조하고 그 건조 중량을 측정하였다. 이 ECM을 70℃의 100 mM HCl에 녹이거나 23℃의 10 mM HCl 속에서 18시간 동안 펩신 처리함으로써 가용화하였다. 100 mM HCl에 용해된 조직을 이용하여 피브로넥틴, 라미닌, GAG와 엘라스틴의 함량을 측정하였다. 펩신-가용화 조직을 이용하여 콜라겐 함량을 측정하였다.
피브로넥틴과 라미닌 농도는 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다. 엘라스틴과 글리코스아미노글리칸(GAG) 함량은 염료 기반 분석법으로 측정하였다. 제I형 콜라겐 함량을 위하여서는 샌드위치 ELISA(Chondrex)를 이용하였다. 제III형과 제IV형 콜라겐 함량은 제II형과 제IV형 콜라겐에 대한 1차 항체와 HRP-접합 2차 항체를 이용한 자체적인 ELISA 분석으로 측정하였다.
ECM 구조물의 준비: ECM 재료의 시트를 마련하기 위하여 수화된 ECM 페이스트 1 g을 두 개의 의료 등급 TYVEK(등록상표) 시트 사이에 샌드위치하였다. 이 구조물을 겔 건조기 속에 넣고 밤새 23℃에서 진공을 걸어 ECM 필름이 마를 때까지 계속하였다. 시트를 세포 배양 연구하는데 적절한 크기로 잘랐다. 3차원 구조의 ECM을 마련하기 위하여 상기 ECM 페이스트를 여러 가지 틀에 넣고 동결 건조하였다. 배지나 물 속에서 ECM 시트 또는 3차원 성형체의 안정성을 살펴보기 위하여 이들을 37℃의 물, 식염수 또는 세포 배양 배지 속에서 최대 1주 동안 배양하였다.
세포 배양: 태반 줄기세포를 60% 저포도당 DMEM(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen), 40% MCDB-201(미주리주 세인트루이스의 Sigma), 2% 소 태아 혈청(유타주 Logan의 Hyclone), 1× 인슐린-트랜스페린-셀린 보충제(Invitrogen), 0.02% 리놀레산/소 혈청 알부민(Sigma), 10 ng/mL 표피 성장 인자(Sigma), 10 ng/mL 혈소판 유래 성장 인자(미네소타주 미니아폴리스의 R&D Systems), 0.05 M 덱사메타손(Sigma), 0.1 mM 아스코르브산-2-인산(Sigma)와 100 단위 페니실린/1000 단위 스트렙토마이신(Invitrogen) 속에서 계대 배양(subculture)하였다. 태반 줄기세포(웰 당 30,000)를 24 다중웰 클러스터 역가판에 자리잡은 ECM 필름 위에 접종하였다. 태반 줄기세포를 또한 같은 밀도로 콜라겐(캘리포니아주 Fremont의 Inamed)이 미리 피복된 Labteck 체임버 슬라이드(뉴욕주 Rochester의 Nalgene Nunc International) 위에 접종하였다. 세포를 37℃에서 3시간 내지 48시간 동안 배양하고 면역 형광 현미경 분석으로 진행하였다.
면역 형광 현미경 분석: ECM 필름 위에 3 또는 48시간 배양한 후 태반 줄기세포-ECM 구조물을 3.7% 포름알데히드로 10분 동안 고정하고 0.5% Triton-X 100으로 20분 동안 투과 처리(permeabilization)하였다. 태반 줄기세포를 AlexaFluor 488-접합 팔로이딘 속에서 배양하여 F-액틴을 가시화하였다. 피브로넥틴 염색을 위해서는 시료를 차단 완충액(blocking buffer, 3% 소 혈청 알부민/1× 인산염 완충 식염수) 속의 토끼 항-사람 피브로넥틴 항체(Sigma)와 함께 1시간 배양하고 인산염 완충 식염수로 씻은 다음, 차단 완충액 속의 AlexaFluor 594-접합 항-토끼 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 시료를 다시 인산염 완충 식염수로 씻고 슬라이드에 올린 다음 형광 현미경으로 관찰하였다.
사이토킨 선별 분석: 태반 줄기세포를 함유하는 ECM 시트 위의 세포 배양물과 태반 줄기세포를 함유하는 세포 배양용으로 처리한 역가판으로부터 배지 시료(100 μL)를 배양 후 0, 3, 24와 48시간째에 채취하였다. 시료를 1 mL PBS로 희석하고 사이토킨의 존부를 분석하였다. 각 사이토킨의 농도는 농도를 알고 있는 사이토킨의 표준 곡선으로부터 계산하였다.
ECM의 분리: 전형적인 태반의 건조 중량은 약 30 g인데, 이는 태반 당 함수 중량 300 g에 해당한다. 도 1에 나타낸 것처럼 삼투압 쇼크 단계와 세제 세척 단계를 이용하여 상당한 양의 비세포외 매트릭스 조직을 제거하여 최종 잔류 중량이 약 10 g이 되도록 할 수 있다. NaOH와 세제를 조합하여 가용화하면 잔류 중량을 약 6 g으로 줄어들게 된다. NaOH 노출 시간과 NaOH의 농도가 태반에서 분리하는 ECM의 총 중량에 영향을 준다는 것을 발견하였다. 본 발명자들이 세제와 NaOH 세척 단계를 바꿔가며 최종적으로 5가지의 ECM 재료를 제조하였다. 전형적으로 한 태반이 약 6 g 내지 10 g의 ECM 재료를 낳는다.
ECM의 생화학적 조성: 5가지 ECM에 대한 생화학적 분석 결과 이들이 실질적으로 콜라겐으로 이루어져 있다는 것이 밝혀졌다: 제I형이 주된 콜라겐(총 콜라겐의 약 74% 내지 약 90%)이었고 제III형(총 콜라겐의 약 4% 내지 6% )과 제IV형(총 콜라겐의 약 2% 내지 약 15%)은 소수 성분이었다. 태반 ECM에 있는 나머지 주된 세포외 매트릭스 단백질로 밝혀진 것은 엘라스틴이었다. 표 1에 나타낸 것처럼 엘라스틴은 ECM-1 내지 ECM-4의 총 건조 중량에서 약 3~5%를 차지했다. 그러나 NaOH를 사용하지 않고 제조한 ECM-5는 약 12%의 엘라스틴을 함유하였다. 상기 5가지 방법으로 제조한 ECM 모두에서 글리코스아미노글리칸이 확인되었지만 건조 중량 중의 백분율은 분리 방법에 NaOH가 쓰였는지 여부에 영향을 받지 않았다. 역으로 주요 부착 단백질(adhesion protein)인 피브로넥틴과 라미닌의 함량은 NaOH의 사용 여부에 극적으로 예민하였다. 피브로넥틴과 라미닌은 NaOH 처리에 살아남지 못했고, ECM 1 내지 4에서는 발견할 수 없었다. 그러나 NaOH 없이 분리한 ECM-5에서는 이들 부착 단백질의 함량이 상대적으로 풍부하다(표 1).
표 1: 서로 다른 방법으로 제조한 태반 콜라겐 조성물에 존재하는 세포외 매트릭스 단백질.
피브로넥틴 라미닌 GAG 엘라스틴
ECM-5 0.6% 0.16% 0.40% 12%
ECM-4 0 0 0.28% 4.7%
ECM-3 0 0 0.34% 3.2%
ECM-2 0 0 0.38% 4.4%
ECM-1 0 0 0.59% 3.5%
% = 건조 중량에 대한 백분율세포 결합 연구: 파종 후 세 시간 뒤, 모든 ECM(1 내지 5)에서는 태반 줄기세포의 부착 정도가 유사한 것으로 관측되었다. ECM에 대한 줄기세포의 결합은 정제한 콜라겐에 대한 결합보다 약간 낮았다. 이 시점에 피브로넥틴에 대한 면역 염색을 하자 대규모의 세포내 염색을 볼 수 있었지만 세포외 피브로넥틴은 검출 가능한 양으로 있지 않았다. 배양 후 48시간이 되자 태반 줄기세포의 수가 늘고 정제된 콜라겐, ECM 2와 ECM 4 위에서는 유사하게 잘 펴진 형태를 나타내는 것을 볼 수 있었다. 이와 대조적으로 ECM 1 위에 배양한 태반 줄기세포는 번창하지 못하였다. 단지 세포 수가 더 적었을 뿐 아니라, 이들의 형태 또한 둥글었고 잘 펴진 형태가 아니었다. ECM 5 상의 태반 줄기세포는 나머지 ECM이나 콜라겐 위의 태반 줄기세포보다 더 길쭉하고 극화된 형태로 보였다.
ECM 3 상의 세포 부착을 측정하는 것은 상기 재료 표면이 건조하면서 이질적이 되었기 때문에 악영향이 있었다. 한 초점 평면(plane of focus)을 따라 상을 맺기가 어려웠기 때문에 부착한 세포 수가 매우 적은 것처럼 보였다. 그러나 다른 초점 평면에서 관찰한 결과 ECM 3에 얼마간 세포 부착이 일어났음이 드러났다.
48시간째 시점에서 피브로넥틴을 면역염색하자 ECM 1~ECM 4 위에 세포외 피브로넥틴 매트릭스 원섬유(fibril)의 네트워크가 광범위하게 형성된 것이 드러났다. 이 피브로넥틴 매트릭스는 원섬유는 태반 줄기세포가 조립한 것인데, 왜냐하면 ECM 위에서 태반 줄기세포를 배양하지 않은 대조군에서는 피브로넥틴 원섬유의 증거가 나타나지 않았기 때문이다. ECM 1~ECM 4와 달리 ECM 5와 콜라겐은 태반 줄기세포에 의한 피브로넥틴 매트릭스 조립을 지원하지 않았다. ECM 5와 콜라겐의 표면에서는 세포외 원섬유상 피브로넥틴을 관측할 수 없었다.
사이토킨 어레이 연구: 본 발명자들은 ECM 위에 결합하고 증식하게 되는 결과, 태반 줄기세포로부터 나오는 주요 사이토킨/케모킨의 분비를 조사하였다. ECM 위에서 분비되는 사이토킨을 조직 배양용으로 처리한 세포 배양판에서 배양한 태반 줄기세포의 사이토킨과 비교하였다. 여러 가지 인터류킨과 사이토킨(Biosource)을 갖추고 있는 표준적인 25-멀티플렉스 사이토킨 어레이를 사용하였다. 사이토킨에는 IL-1β, IL-1Ra, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40/p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, 에오탁신(Eotaxin), 란테스(Rantes), MCP-1이 포함된다. 연구한 사이토킨 25 중에서 사이토킨 3개의 분비가 증가하였는데, ECM 시트 위에서 태반 줄기세포를 배양한 경우가 조직 배양용으로 처리한 배양판에서 배양한 태반 줄기세포가 분비한 양보다 IL-6, IL-8과 MCP-1을 더 많이 관측할 수 있었다. 도 2a~2c는 상기 다섯 가지 ECM 상의 태반 줄기세포가 분비한 사이토킨(IL-6, IL-8과 MCP-1)의 시간에 따른 증가를 나타낸다. 모든 데이터는 결합한 세포 1000개/㎠에 대하여 규격화(normalization)하였다. ECM-5는 MCP-1 분비의 명백한 증가가 없다는 점에서 이례적이었는데, 이는 태반 줄기세포를 상기 세포외 매트릭스 위에서 배양하였을 때 세포 생리학적인 변화가 일어나는 것을 시사한다. 앞서 보인 바와 같이, ECM-5는 피브로넥틴 발현을 지원하지 않았는데, 이는 ECM 1~ECM 4와 사뭇 다르다. ECM-5가 NaOH를 쓰지 않고 제조한 유일한 매트릭스였으며 2개의 주요한 세포 부착 단백질인 피브로넥틴과 라미닌을 유지하는 생화학적 조성을 갖추고 있었다는 점은 흥미롭다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물과 특허 출원은 여기서 다시 참조 문헌으로써 내용이 포함됨을 밝히며, 이는 각각의 개별 간행물과 특허 출원에 대하여 일일이 구체적으로 참조 문헌으로서 내용이 포함된다고 밝히는 것과 마찬가지이다. 명확한 이해를 위하여 앞서 논한 발명을 비록 도시와 예시를 들어 어느 정도 자세히 기술하였지만, 이 분야의 당업자에게는 이 발명 개시 내용에 비추어 볼 때 이하 청구 범위의 취지나 범위에서 벗어나지 않고도 발명에 소정의 변경을 가할 수 있다는 것은 자명할 것이다.

Claims (53)

  1. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 포유류 콜라겐인 텔로펩티드 콜라겐.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 소, 양 또는 래트(rat) 콜라겐인 텔로펩티드 콜라겐.
  4. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 사람 콜라겐인 텔로펩티드 콜라겐.
  5. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 태반 콜라겐인 텔로펩티드 콜라겐.
  6. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 사람 태반 콜라겐인 텔로펩티드 콜라겐.
  7. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 가교된 것인 텔로펩티드 콜라겐.
  8. 제항에 있어서, 상기 콜라겐은 글루타르알데히드로 가교된 것인 텔로펩티드 콜라겐.
  9. 측정 가능한 양의 피브로넥틴을 함유하는 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐.
  10. 제1항 또는 제9항의 텔로펩티드 콜라겐과 복수의 줄기세포를 함유하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 배아 생식세포(germ cell), 중간엽 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 말초 혈액 유래 조혈 줄기세포, 태아 혈액 유래 조혈 줄기세포, 태반 혈액 유래 조혈 줄기세포, 제대혈 유래 조혈 줄기세포, 태반 관류액 유래 조혈 줄기세포, 체세포 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 이자 줄기세포, 내피 줄기세포, 심장 줄기세포, 근육 줄기세포, 지방 줄기세포 또는 CD34- 태반 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 CD34- 태반 줄기세포는 CD200+인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 CD34- 태반 줄기세포는
    a. CD200+ 또는 HLA-G+;
    b. CD73+, CD105+이면서 CD200+;
    c. CD200+ 이면서 OCT-4+;
    d. CD73+, CD105+이면서 HLA-G+, CD73+이고 CD105+이면서, 배아 유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서는, 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아 유사체 형성을 촉진하거나, 또는
    e. OCT-4+이면서 배아 유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아 유사체 형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 두 가지 유형 이상의 줄기세포를 함유하는 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 복수의 비(非)줄기세포를 함유하는 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 판(sheet) 모양으로 성형한 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 튜브 모양으로 성형한 조성물.
  18. 제10항에 있어서, 메시(mesh) 모양으로 성형한 조성물.
  19. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 상처나 부상 자리에 들어맞도록 성형한 조성물.
  20. 제1항의 콜라겐을 포유동물 조직에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 조직의 보강, 팽윤(bulking) 또는 대체 방법.
  21. 제1항의 콜라겐과 상기 가교한 텔로펩티드 콜라겐을 투여하기 위한 설명을 기재한 라벨을 갖추고 있는, 포유동물 조직의 보강, 팽윤 또는 대체를 위한 키트.
  22. 콜라겐을 함유하는 포유동물 조직으로부터 텔로펩티드 콜라겐을 제조하는 방법으로서,
    a. 이 포유동물 조직을 삼투압 쇼크 용액에 접촉시켜 콜라겐 조성물을 얻는 단계;
    b. 상기 콜라겐 조성물을 세제에 접촉시키는 단계; 및
    c. 상기 세제 처리한 콜라겐 용액을 염기성 용액에 접촉시키는 단계를 포함하는 콜라겐의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 삼투압 쇼크 용액은 삼투압이 50 mM NaCl의 삼투압보다 낮은 물을 함유하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    삼투압이 적어도 0.5 M NaCl의 삼투압이 되는 용액에 상기 조직을 접촉시키는 단계를 상기 a 단계 이전 또는 다음에 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 염기성 용액은 적어도 0.5 M 농도의 NaOH를 함유하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 염기 처리하고, 세제 처리한 콜라겐 용액을 여과하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  27. 제22항에 있어서,
    상기 콜라겐을 가교하여 가교된 콜라겐을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 콜라겐을 글루타르알데히드로 가교하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  29. 제22항에 있어서,
    가교한 콜라겐에 전단 응력을 가하는(shearing) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  30. 제22항에 있어서,
    하나 이상의 바이러스 입자를 통과시키되, 상기 콜라겐 조성물을 통과시키지 않는 크기의 필터에 상기 콜라겐 조성물을 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 필터의 크기 한계는 대략 500 kDa, 대략 750 kDa 또는 대략 1000 kDa인 것을 특징으로 하는 콜라겐의 제조 방법.
  32. 상처에 본 발명의 콜라겐 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉은 상기 콜라겐 조성물에 접촉하지 않은 상처와 비교하였을 때 상처의 특성을 측정 가능하게 더 나은 정도로 향상시키는 것을 특징으로 하는, 상처 치유 촉진 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 상처를 복수의 줄기세포에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 줄기세포와 상기 상처의 접촉은 상기 조성물과 상기 상처의 접촉과는 별도로 이루어지는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  36. 제32항에 있어서,
    상기 조성물은 양 면을 가지는 판(sheet)으로 성형한 것이며, 상기 줄기세포는 이들 면 중 적어도 한 면 위에는 존재하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  37. 제32항에 있어서,
    상기 줄기세포는 상기 조성물에 부착하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  38. 제32항에 있어서,
    상기 줄기세포는 IL-6, IL-8 및/또는 MCP-1을 분비하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  39. 제32항에 있어서,
    상기 줄기세포는 태반 줄기세포인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기 태반 줄기세포는 CD34-이고 CD200+인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  41. 제32항에 있어서,
    상기 상처는 다리 궤양인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  42. 제43항에 있어서,
    상기 다리 궤양은 정맥 다리 궤양, 동맥 다리 궤양, 당뇨성 다리 궤양 또는 욕창성 다리 궤양인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  43. 제32항에 있어서,
    상기 조성물은 상처 충전물로 쓰이는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 방법.
  44. 제1항의 텔로펩티드 콜라겐과 복수의 줄기세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 복수의 줄기세포 중 적어도 일부는 상기 텔로펩티드 콜라겐에 부착하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 줄기세포가 상기 텔로펩티드 콜라겐 위에서 증식하도록 하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 줄기세포는 상기 텔로펩티드 콜라겐 위에서 세포 합류(confluency)에 이를 때까지 증식하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
  48. 제46항에 있어서,
    상기 줄기세포는 상기 텔로펩티드 콜라겐과 접촉하였을 때 IL-6, IL-8 및/또는 MCP-1을 측정가능한 양으로 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
  49. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 치료에 쓰는 용도.
  50. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 포유동물 조직을 보강, 팽윤 또는 대체하는데 쓰는 용도로서, 상기 보강, 팽윤 또는 대체는 상기 콜라겐을 포유동물의 조직에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  51. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 포유동물 조직의 보강, 팽윤 또는 대체용 조성물의 제조에 쓰는 용도로서, 상기 보강, 팽윤 또는 대체는 상기 콜라겐을 포유동물의 조직에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  52. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 대상의 상처 치유 촉진에 쓰는 용도로서, 상기 촉진은 상처에 상기 콜라겐을 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 상기 콜라겐과 접촉하지 않은 상처와 비교하였을 때 상처의 특성을 측정 가능하게 더 나은 정도로 향상시키는 용도.
  53. 염기 처리하고, 세제 처리한 텔로펩티드 콜라겐을 대상의 상처 치유 촉진용 조성물의 제조에 쓰는 용도로서, 상기 촉진은 상처에 상기 조성물을 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 접촉은 상기 조성물과 접촉하지 않은 상처와 비교하였을 때 상처의 특성을 측정 가능하게 더 나은 정도로 향상시키는 용도.
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Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
EP1349918B1 (en) * 2000-12-06 2014-08-06 Anthrogenesis Corporation Method of collecting placental stem cells
ES2522526T3 (es) 2001-02-14 2014-11-14 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma
US7498171B2 (en) * 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
BR0205047C1 (pt) * 2002-11-21 2003-11-04 Ronaldo Da Rocha Loures Bueno Endoprótese revestida com membrana de celulose biossintética
CN1717177A (zh) * 2002-11-26 2006-01-04 人类起源公司 细胞治疗剂、细胞治疗单元及其用于治疗的方法
NZ550027A (en) * 2004-03-26 2009-03-31 Celgene Corp Systems and methods for providing a stem cell bank
US8187639B2 (en) 2005-09-27 2012-05-29 Tissue Tech, Inc. Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment
US8153162B2 (en) 2005-09-27 2012-04-10 Tissuetech, Inc. Purified amniotic membrane compositions and methods of use
WO2007047465A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-26 Anthrogenesis Corporation Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
PE20070771A1 (es) 2005-10-13 2007-08-11 Anthrogenesis Corp Inmunomodulacion mediante el uso de celulas madres de la placenta
EP2471904B1 (en) 2005-12-29 2018-10-24 Celularity, Inc. Placental stem cell populations
KR20080097190A (ko) * 2005-12-29 2008-11-04 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기세포의 수집과 보존을 위한 개선된 조성물과 이조성물의 이용 방법
CA2633775A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
US20070269476A1 (en) * 2006-05-16 2007-11-22 Voytik-Harbin Sherry L Engineered extracellular matrices control stem cell behavior
US7993918B2 (en) 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
US8372437B2 (en) 2006-08-17 2013-02-12 Mimedx Group, Inc. Placental tissue grafts
AU2007297611B2 (en) 2006-09-21 2013-02-07 Purdue Research Foundation Collagen preparation and method of isolation
EP2664341A3 (en) * 2006-10-06 2014-01-08 Anthrogenesis Corporation Native (telopeptide) placental collagen compositions
PL2084268T3 (pl) * 2006-10-23 2019-08-30 Celularity, Inc. Sposoby i kompozycje do leczenia ubytków kości z użyciem populacji komórek łożyska
CN101688177A (zh) 2007-02-12 2010-03-31 人类起源公司 来自贴壁胎盘干细胞的肝细胞和软骨细胞；以及cd34+、cd45-胎盘干细胞富集的细胞群
NZ597779A (en) 2007-02-12 2013-07-26 Anthrogenesis Corp Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US9200253B1 (en) 2007-08-06 2015-12-01 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes
EP3189731B1 (en) 2007-09-07 2020-01-29 MiMedx Group, Inc. Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same
SI2203176T1 (sl) 2007-09-28 2015-04-30 Anthrogenesis Corporation Tumorska supresija z uporabo humanega perfuzata placente in intermediarnih naravnih celic ubijalk, pridobljenih iz humane placente
US9480549B2 (en) 2008-04-25 2016-11-01 Allosource Multi-layer tissue patches
US9358320B2 (en) 2008-04-25 2016-06-07 Allosource Multi-layer tissue patches
US8828376B2 (en) 2008-08-20 2014-09-09 Anthrogenesis Corporation Treatment of stroke using isolated placental cells
NZ591292A (en) 2008-08-20 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Improved cell composition and methods of making the same
US8728805B2 (en) 2008-08-22 2014-05-20 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
WO2010040262A1 (zh) * 2008-10-10 2010-04-15 深圳市嘉天源生物科技有限公司 分离动物胚胎间质性干细胞并提取其分泌物的方法
RU2015130665A (ru) 2008-11-19 2018-12-24 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
MX353489B (es) 2009-07-02 2018-01-16 Anthrogenesis Corp Metodo para producir eritrocitos sin celulas alimentadoras.
WO2011014741A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Artemis Health, Inc. Methods and compositions for cell stabilization
DK2485779T3 (en) * 2009-10-07 2018-05-07 Kerecis Ehf A FRAME MATERIAL FOR SCREENING AND / OR OTHER TISSUE HEALING APPLICATIONS
US20110165676A1 (en) * 2009-11-06 2011-07-07 The Children's Mercy Hospital Method for decellularization
WO2011094181A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Anthrogenesis Corporation Treatment of bone-related cancers using placental stem cells
US20150010506A1 (en) * 2010-02-18 2015-01-08 Osiris Therapeutics, Inc. Therapeutic placental compositions, methods of making and methods of use
ES2663720T3 (es) 2010-02-18 2018-04-16 Osiris Therapeutics, Inc. Métodos de fabricación de productos terapéuticos que comprenden dispersiones placentarias vitalizadas
PT2556145T (pt) 2010-04-07 2016-10-25 Anthrogenesis Corp Angiogénese usando células estaminais placentárias
WO2011127113A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Anthrogenesis Corporation Treatment of sarcoidosis using placental stem cells
US9999702B2 (en) 2010-04-09 2018-06-19 Kci Licensing Inc. Apparatuses, methods, and compositions for the treatment and prophylaxis of chronic wounds
JP5996533B2 (ja) 2010-07-13 2016-09-21 アントフロゲネシス コーポレーション ナチュラルキラー細胞を生成させる方法
US20120027732A1 (en) * 2010-07-27 2012-02-02 Voytik-Harbin Sherry L Thermoreversible collagen
WO2012092485A1 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules
KR102331661B1 (ko) 2011-02-14 2021-11-25 미메딕스 그룹 인크. 마이크로화된 태반 조직 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법
US8597264B2 (en) 2011-03-24 2013-12-03 Kci Licensing, Inc. Apparatuses, methods, and compositions for the treatment and prophylaxis of chronic wounds
WO2012142569A2 (en) * 2011-04-15 2012-10-18 The Regents Of The University Of California Decellularized extracellular matrix
WO2012149486A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 Tissuetech, Inc. Methods of modulating bone remodeling
AU2012262273B2 (en) 2011-06-01 2017-09-14 Celularity Inc. Treatment of pain using placental stem cells
JP6416622B2 (ja) * 2011-06-21 2018-10-31 ジョージア・テック・リサーチ・コーポレイション 幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単離するための、接着シグネチャーベースの方法
WO2013055476A1 (en) 2011-09-09 2013-04-18 Anthrogenesis Corporation Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
US9162011B2 (en) 2011-12-19 2015-10-20 Allosource Flowable matrix compositions and methods
CN102552099B (zh) * 2011-12-30 2014-06-18 王英丽 一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法
US9023416B2 (en) 2012-01-27 2015-05-05 Cartilast II LLC Preservation of the biological activity of undenatured type II collagen
US10576037B2 (en) * 2012-03-14 2020-03-03 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Compositions comprising placental collagen for use in wound healing
US9644177B2 (en) * 2012-07-12 2017-05-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Extracellular matrix films and methods of making and using same
US9943551B2 (en) 2012-08-15 2018-04-17 Mimedx Group, Inc. Tissue grafts composed of micronized placental tissue and methods of making and using the same
EP2892577B1 (en) * 2012-09-04 2019-01-30 Anthrogenesis Corporation Methods of tissue generation
CN107760646A (zh) * 2012-09-04 2018-03-06 人类起源公司 组织产生方法
WO2014040026A2 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Wake Forest University Health Sciences Amniotic membrane and its use in wound healing and tissue engineering constructs
US9155799B2 (en) 2012-11-19 2015-10-13 Mimedx Group, Inc. Cross-linked collagen with at least one bound antimicrobial agent for in vivo release of the agent
US8946163B2 (en) 2012-11-19 2015-02-03 Mimedx Group, Inc. Cross-linked collagen comprising metallic anticancer agents
CN117899116A (zh) * 2012-12-07 2024-04-19 细胞结构公司 使用胎盘细胞外基质治疗口腔病变
EP2953635A4 (en) 2013-02-05 2016-10-26 Anthrogenesis Corp NATURAL KILLER CELLS FROM PLAZENTA
KR102101689B1 (ko) 2013-02-08 2020-04-17 아셀, 인크. 세포외 기질 재료로부터의 생리활성 겔의 제조 방법
US9770472B1 (en) 2013-03-08 2017-09-26 Brahm Holdings, Llc Organ jacket and methods of use
CA2899246C (en) 2013-03-13 2022-12-06 Allosource Fascia fibrous compositions and methods for their use and manufacture
NO2975611T3 (ko) * 2013-03-15 2018-06-09
KR102312720B1 (ko) 2013-03-15 2021-10-13 알로소스 연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스
EP2976095B1 (en) * 2013-03-15 2020-12-23 3M Innovative Properties Company Wound healing compositions
US10029030B2 (en) 2013-03-15 2018-07-24 Mimedx Group, Inc. Molded placental tissue compositions and methods of making and using the same
US10555897B1 (en) 2013-03-16 2020-02-11 Brahm Holdings Llc Cosmetic composition and methods of treatment
US20140336600A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Carl Randall Harrell Method for Obtaining Sterile Human Amniotic Fluid and Uses Thereof
US10485521B2 (en) 2013-05-10 2019-11-26 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Method for obtaining sterile human amniotic fluid and uses thereof
US9446142B2 (en) * 2013-05-28 2016-09-20 Mimedx Group, Inc. Polymer chelator conjugates
US20160304832A1 (en) 2013-06-24 2016-10-20 Anthrogenesis Corporation Extracellular matrix composition beads for cell culture
CA2919374C (en) 2013-07-30 2019-12-03 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
WO2015017772A1 (en) * 2013-08-01 2015-02-05 Parcell Laboratories, Llc Stem cell-based preparations and methods for dermal and connective tissue reconstruction and rejuvenation
EP3038630B1 (en) 2013-08-30 2020-03-18 MIMEDX Group Inc. Micronized placental compositions comprising a chelator
US9878071B2 (en) 2013-10-16 2018-01-30 Purdue Research Foundation Collagen compositions and methods of use
BR112016009178B1 (pt) 2013-11-04 2020-12-15 Lifecell Corporation Método de preparação de um produto de tecido e uso de um produto de tecido
WO2015085232A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Allosource Method of drying sheets of tissue
EP3082416A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-26 Basf Se Mixtures comprising a superabsorbent polymer (sap) and a biopesticide
US20150216947A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 George D. Petito Method and composition for tissue/cell repair
KR20220093383A (ko) * 2014-02-11 2022-07-05 안트로제네시스 코포레이션 마이크로-오가노이드, 및 이의 제조방법 및 사용방법
WO2015122867A1 (en) * 2014-02-15 2015-08-20 Cartilast Corporation Preservation of the biological activity of undenatured type ii collagen
WO2015138328A2 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Medtrain Technologies, Llc Collagen hydrogel kit and methods of making a collagen hydrogel
CN104195205B (zh) * 2014-04-24 2019-08-16 吉林金梓源生物科技股份有限公司 从动物胎盘制备高活性胶原蛋白肽的方法与所制备的高活性胶原蛋白肽及其用途
CN105267243B (zh) * 2014-07-23 2020-03-20 深圳培元生物科技有限公司 一种消除皮肤妊娠纹的干细胞提取物
EP3185888B1 (en) * 2014-08-25 2023-06-07 Celularity Inc. Extracellular matrix compositions
EP3197467A4 (en) * 2014-09-26 2018-05-23 Anthrogenesis Corporation Treatment of diabetic foot ulcer using placental stem cells
US20160095307A1 (en) * 2014-10-07 2016-04-07 NuTech Medical, Inc. Method and composition for hypothermic storage of placental tissue
WO2016109826A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Applied Biologics, Llc Standardized amniotic membrane tissue graft
WO2016149194A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-22 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Collagen compositions and uses for biomaterial implants
US11919941B2 (en) 2015-04-21 2024-03-05 Purdue Research Foundation Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same
CN104818264A (zh) * 2015-05-29 2015-08-05 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种消化酶组合物及其制剂、应用
US11077147B2 (en) * 2015-07-20 2021-08-03 Vivex Biologics Group, Inc. Acellular biologic composition and method of manufacture
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
US9907821B2 (en) 2015-10-09 2018-03-06 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Amniotic fluid formulation for treatment of joint pain or disorders
US11273183B2 (en) 2015-10-09 2022-03-15 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Amniotic fluid formulation for treatment of joint pain or disorders
US20170100440A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Amniotic fluid topical formulation
TW201733600A (zh) 2016-01-29 2017-10-01 帝聖工業公司 胎兒扶持組織物及使用方法
JP6712160B2 (ja) * 2016-03-29 2020-06-17 株式会社Adeka エンドトキシン測定のための前処理方法及びその測定方法
US11554158B2 (en) * 2016-04-13 2023-01-17 Northeast Ohio Medical University GPNMB compositions for treatment of skin wounds
US20170354692A1 (en) 2016-06-13 2017-12-14 MAM Holdings of West Florida, L.L.C. Amniotic fluid formulation for treatment of lung disorders
WO2018047785A1 (ja) * 2016-09-07 2018-03-15 ナガセケムテックス株式会社 コラーゲン様ポリペプチド
CN106421871A (zh) * 2016-09-29 2017-02-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种喷雾型医用胶原贴敷料及其制备方法
US10772986B2 (en) 2017-01-26 2020-09-15 Allosource Fascia fibrous compositions and methods for their use and manufacture
ES2930285T3 (es) * 2017-02-03 2022-12-09 Biocellix Spa Membrana o matriz de colágeno con propiedades antimicrobianas
US11739291B2 (en) 2017-04-25 2023-08-29 Purdue Research Foundation 3-dimensional (3D) tissue-engineered muscle for tissue restoration
CN107596428A (zh) * 2017-09-25 2018-01-19 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 一种胶原止血海绵及其制备方法
JPWO2019189786A1 (ja) * 2018-03-29 2021-03-25 凸版印刷株式会社 細胞培養用シート並びに三次元組織体及びその製造方法
CN108642115A (zh) * 2018-06-28 2018-10-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法
US11369718B1 (en) 2018-08-24 2022-06-28 Ariasa LLC Method and use of cryopreserved mesenchymal stem cells via liquid suspension from the amniotic sac for rejuvenation of the midface
CN109671346B (zh) * 2019-01-17 2021-11-19 南方科技大学 肝脏模型及其制备方法和应用
CN109985271B (zh) * 2019-02-26 2021-10-22 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 一种用于难愈合创面修复的复合胶原敷料及其制备方法
CN109675085B (zh) * 2019-02-26 2021-09-28 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 一种用于烧伤创面修复的复合胶原敷料及其制备方法
CN113677788A (zh) * 2019-04-01 2021-11-19 凸版印刷株式会社 三维组织体及其制造方法以及含细胞组合物的制造方法
CN112469432A (zh) * 2019-04-01 2021-03-09 格尔托公司 重组胶原的局部制剂
CN113134116B (zh) * 2020-01-20 2022-09-06 山东威高宏瑞医学科技有限公司 内镜微创手术用的填充组合物及填充制剂
US20230190648A1 (en) * 2020-05-15 2023-06-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Bioactive Tissue Derived Nanocomposite Hydrogels for Permanent Arterial Embolization and Enhanced Vascular Healing
KR102618453B1 (ko) * 2021-06-04 2024-01-02 주식회사 휴코드바이오 제대혈 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 튼살 예방 또는 개선용 조성물
CN113444761B (zh) * 2021-08-17 2022-09-09 中国海洋大学 一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3157524A (en) 1960-10-25 1964-11-17 Ethicon Inc Preparation of collagen sponge
US3800792A (en) 1972-04-17 1974-04-02 Johnson & Johnson Laminated collagen film dressing
DE2321306C2 (de) * 1973-04-27 1988-08-18 Böttger GmbH Pharmazeutische und Kosmetische Präparate, 1000 Berlin Hautpflegemittel
DE2462221A1 (de) * 1974-02-02 1976-05-06 Trommsdorff Fa H Kosmetisches mittel, enthaltend loesliches, natives human-kollagen
US4060081A (en) * 1975-07-15 1977-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer membrane useful as synthetic skin
US4185011A (en) 1978-10-16 1980-01-22 Firma Carl Freudenberg Process for the production of collagen fibers
DE2943520C2 (de) 1979-10-27 1982-05-19 Fa. Carl Freudenberg, 6940 Weinheim Verfahren zur Herstellung von Kollagenschwamm für medizinische oder kosmetische Zwecke
US4361552A (en) * 1980-09-26 1982-11-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Wound dressing
DE3042860A1 (de) 1980-11-13 1982-06-09 Heyl & Co Chemisch-Pharmazeutische Fabrik, 1000 Berlin Kollagenpraeparate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in der human- und veterinaermedizin
US4420339A (en) * 1981-03-27 1983-12-13 Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Collagen fibers for use in medical treatments
FR2516927B1 (fr) 1981-11-26 1986-05-23 Merieux Fond Procede de preparation industrielle de materiaux collageniques a partir de tissus placentaires humains, materiaux collageniques humains obtenus, leur application comme biomateriaux
US4582640A (en) 1982-03-08 1986-04-15 Collagen Corporation Injectable cross-linked collagen implant material
JPS58180162A (ja) * 1982-04-19 1983-10-21 株式会社高研 抗血栓性医用材料
US4973493A (en) * 1982-09-29 1990-11-27 Bio-Metric Systems, Inc. Method of improving the biocompatibility of solid surfaces
DE3248188A1 (de) * 1982-12-27 1984-06-28 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur herstellung eines kollagen-vlieses
US4599226A (en) * 1983-03-31 1986-07-08 Genetic Laboratories, Inc. Wound dressing comprising silver sulfadiazine incorporated in animal tissue and method of preparation
SU1286211A1 (ru) 1983-04-18 1987-01-30 Кишиневский государственный медицинский институт Способ лечени рубцов
US4801299A (en) * 1983-06-10 1989-01-31 University Patents, Inc. Body implants of extracellular matrix and means and methods of making and using such implants
US4837285A (en) * 1984-03-27 1989-06-06 Medimatrix Collagen matrix beads for soft tissue repair
US4642117A (en) 1985-03-22 1987-02-10 Collagen Corporation Mechanically sheared collagen implant material and method
US5230693A (en) * 1985-06-06 1993-07-27 Thomas Jefferson University Implantable prosthetic device for implantation into a human patient having a surface treated with microvascular endothelial cells
US5436135A (en) 1985-09-02 1995-07-25 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins New preparation of placenta collagen, their extraction method and their applications
US4883864A (en) * 1985-09-06 1989-11-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Modified collagen compound and method of preparation
CA1284250C (en) 1985-09-06 1991-05-14 Dale P. Devore Viscoelastic collagen solution for ophthalmic use and method of preparation
US4772284A (en) * 1986-03-27 1988-09-20 Collagenix Corporation Breast prosthesis with improved biocompatibility and method of making the same
US4852640A (en) 1986-03-28 1989-08-01 Exothermics-Eclipse Inc. Recuperative heat exchanger
JPS62268875A (ja) 1986-05-14 1987-11-21 東レ株式会社 繊維シ−ト状物
FR2613620B1 (fr) 1987-04-13 1991-04-19 Krom Robert Implant destine a la medecine humaine
DE3878909T2 (de) 1987-04-28 1993-08-19 Univ California Vorrichtung und verfahren zur herstellung eines komposithautersatzes.
FR2617488B1 (fr) * 1987-07-01 1990-03-09 Tab Procede de fabrication de structures organisees de collagene, notamment d'origine humaine, et structures organisees de collagene correspondantes
US5036056A (en) * 1987-07-08 1991-07-30 Martin Kludas Methods for treating damaged corneal, uterine, or cartilage tissue
GB8803697D0 (en) * 1988-02-17 1988-03-16 Deltanine Research Ltd Clinical developments using amniotic membrane cells
US4969912A (en) * 1988-02-18 1990-11-13 Kelman Charles D Human collagen processing and autoimplant use
US5660692A (en) 1988-02-24 1997-08-26 Cedars-Sinai Medical Center Method of crosslinking amino acid-containing polymers using photoactivatable chemical crosslinkers
ATE109491T1 (de) * 1988-03-11 1994-08-15 Chemokol G B R Ing Buero Fuer Verfahren zur herstellung von kollagenmembranen für hämostase, wundbehandlung und implantate.
US5008116A (en) 1988-11-14 1991-04-16 Frederick Cahn Immunostimulatory microsphere
US5162430A (en) * 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
CA2015495A1 (en) 1989-05-23 1990-11-23 David C. Muchow Modifying a membrane for use as a graft
US5141747A (en) * 1989-05-23 1992-08-25 Minnesota Mining And Manufacturing Company Denatured collagen membrane
US5116620A (en) * 1989-11-21 1992-05-26 Bruce A. Barber Antimicrobial wound dressing
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
CA2060223C (en) * 1991-02-12 1999-07-20 Clarence C. Lee Injectable medical lubricating fluid composition and method of use
NL9101149A (nl) 1991-07-01 1993-02-01 Wilhelmus Hubertus Maria Van E Preparaat voor medische en/of cosmetische toepassing met als werkzaam bestanddeel placentacomplex, werkwijze voor de bereiding ervan en werkwijze voor de medische toepassing.
CA2071137A1 (en) * 1991-07-10 1993-01-11 Clarence C. Lee Composition and method for revitalizing scar tissue
JPH0556987A (ja) 1991-09-05 1993-03-09 A M D:Kk 医療用具の原料用膜材料の製造方法
FR2692582B1 (fr) 1992-06-18 1998-09-18 Flamel Tech Sa Nouveaux derives reticulables de collagene, leur procede d'obtention et leur application a la preparation de biomateriaux.
US5428022A (en) * 1992-07-29 1995-06-27 Collagen Corporation Composition of low type III content human placental collagen
US5830548A (en) * 1992-08-11 1998-11-03 E. Khashoggi Industries, Llc Articles of manufacture and methods for manufacturing laminate structures including inorganically filled sheets
US5827641A (en) 1992-11-13 1998-10-27 Parenteau; Nancy L. In vitro cornea equivalent model
FR2699184B1 (fr) 1992-12-16 1995-03-10 Flamel Tech Sa Nouveaux dérivés de collagène, leur procédé d'obtention et leur application à la préparation de biomatériaux.
US6124259A (en) * 1993-01-28 2000-09-26 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for treating ophthalmic disorders with IGFBP
IT1263316B (it) * 1993-02-12 1996-08-05 Fidia Advanced Biopolymers Srl Tessuto non tessuto multistrato in cui uno degli strati e' costituito essenzialmente da esteri dell'acido ialuronico
US5698579A (en) * 1993-07-02 1997-12-16 Celgene Corporation Cyclic amides
US5607590A (en) * 1993-08-06 1997-03-04 Shimizu; Yasuhiko Material for medical use and process for preparing same
JP3542170B2 (ja) 1993-08-06 2004-07-14 株式会社アムニオテック 医用材料及びその製造方法
US5523291A (en) 1993-09-07 1996-06-04 Datascope Investment Corp. Injectable compositions for soft tissue augmentation
GB9400163D0 (en) * 1994-01-06 1994-03-02 Geistlich Soehne Ag Membrane
ATE250901T1 (de) 1994-02-18 2003-10-15 Organogenesis Inc Bioumbaubare collagentransplantat prothese
US5656478A (en) * 1994-02-25 1997-08-12 The Regents Of The University Of California Smooth muscle tissue formation in vivo using cultured smooth muscle cells combined with an extracellular matrix
EP0713707A1 (en) 1994-11-23 1996-05-29 Collagen Corporation In situ crosslinkable, injectable collagen composition for tissue augmention
US6337389B1 (en) * 1995-03-17 2002-01-08 Bioscience Consultants, L.L.C. Method and process for the production of collagen preparations from invertebrate marine animals and compositions thereof
EP0734736A1 (en) 1995-03-31 1996-10-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Medical device and method for producing the same
JPH09122225A (ja) * 1995-10-31 1997-05-13 Bio Eng Lab:Kk 医用材料の原料膜材およびその製造方法
JPH09122227A (ja) * 1995-10-31 1997-05-13 Bio Eng Lab:Kk 医用材料およびその製造方法
JP3476631B2 (ja) 1995-12-21 2003-12-10 株式会社アムニオテック ヒト由来の天然コラーゲン膜からなる医用材料
WO1997032615A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Baxter International Inc. Nonpolymeric epoxy compounds for cross-linking biological tissue and bioprosthetic grafts prepared thereby
CN1061812C (zh) * 1996-04-01 2001-02-14 胡杰 制备皮肤移植体的方法
EP0907721A1 (en) * 1996-05-28 1999-04-14 Brown University Research Foundation Hyaluronan based biodegradable scaffolds for tissue repair
WO1997048405A1 (fr) 1996-06-21 1997-12-24 Jury Evgenievich Belyaev Produit semi-fini permettant d'obtenir des bases de medicaments, bases de medicaments obtenues a l'aide ce dernier et variantes, et medicament faisant appel a ces bases et variantes
EP2070920B8 (en) 1996-07-24 2011-04-27 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-phthalimides and 1-oxoisoindolines and method of reducing TNF alpha levels
HU228769B1 (en) * 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
US6281230B1 (en) * 1996-07-24 2001-08-28 Celgene Corporation Isoindolines, method of use, and pharmaceutical compositions
US5798368A (en) * 1996-08-22 1998-08-25 Celgene Corporation Tetrasubstituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolines and method of reducing TNFα levels
US5635517B1 (en) * 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
DE69739181D1 (de) * 1996-08-12 2009-02-05 Celgene Corp Neue immunotherapeutische Mittel und deren Verwendung in der Reduzierung von Cytokinenspiegel
US5814328A (en) * 1997-01-13 1998-09-29 Gunasekaran; Subramanian Preparation of collagen using papain and a reducing agent
US6152142A (en) * 1997-02-28 2000-11-28 Tseng; Scheffer C. G. Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries
US5993844A (en) * 1997-05-08 1999-11-30 Organogenesis, Inc. Chemical treatment, without detergents or enzymes, of tissue to form an acellular, collagenous matrix
US6379323B1 (en) * 1997-05-09 2002-04-30 Acoustic Technologies, Inc. Bio erodable myringotomy tube
DE69837491T2 (de) * 1997-07-03 2008-01-17 Osiris Therapeutics, Inc. Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut
US5932205A (en) * 1997-07-24 1999-08-03 Wang; Ming X. Biochemical contact lens for treating photoablated corneal tissue
US6143315A (en) * 1997-07-24 2000-11-07 Wang; Ming X. Biochemical contact lens for treating injured corneal tissue
US6117979A (en) 1997-08-18 2000-09-12 Medtronic, Inc. Process for making a bioprosthetic device and implants produced therefrom
US5955476A (en) * 1997-11-18 1999-09-21 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing inflammatory cytokine levels
US5874448A (en) * 1997-11-18 1999-02-23 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6 dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing TNFα levels
US6371992B1 (en) * 1997-12-19 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Acellular matrix grafts: preparation and use
US6113932A (en) * 1998-03-02 2000-09-05 Children's Hospital Medical Center Nontoxic vernix compositions and method of producing
TR200101503T2 (tr) * 1998-03-16 2002-06-21 Celgene Corporation 2-(2,6-dioksopiperidin-3-il) izoindolin türevleri, bunların hazırlanması ve enflamatuar sitokinlerin inhibitörleri olarak kullanımı
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
DK1082410T3 (da) * 1998-05-29 2007-11-26 Osiris Therapeutics Inc Humane CD45 - og/eller fibroblast mesenchymale stamceller
ATE424164T1 (de) * 1998-06-05 2009-03-15 Organogenesis Inc Verfahren zur herstellung einer gefässprothese
US6110196A (en) 1998-06-17 2000-08-29 Edwards; Stuart D. Apparatus and method for tympanic membrane tightening
US6734018B2 (en) * 1999-06-07 2004-05-11 Lifenet Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced
US6093417A (en) * 1999-01-11 2000-07-25 Advanced Medical Instruments Composition to treat ear disorders
JP2000237300A (ja) 1999-02-23 2000-09-05 Djk Research Center:Kk 細孔径の中空糸およびその中空糸束とその製造方法
US7615373B2 (en) * 1999-02-25 2009-11-10 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed collagen and tissue engineering
US20020090725A1 (en) * 2000-11-17 2002-07-11 Simpson David G. Electroprocessed collagen
AU771015B2 (en) * 1999-03-18 2004-03-11 Celgene Corporation Substituted 1-oxo- and 1,3-dioxoisoindolines and their use in pharmaceutical compositions for reducing inflammatory cytokine levels
EP1124587A1 (en) 1999-08-27 2001-08-22 Department of National Defence Hydrogel wound dressing containing liposome-encapsulated therapeutic agent
US6300315B1 (en) * 1999-08-28 2001-10-09 Ceramedical, Inc. Mineralized collagen membrane and method of making same
US6312474B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-06 Bio-Vascular, Inc. Resorbable implant materials
US6432712B1 (en) * 1999-11-22 2002-08-13 Bioscience Consultants, Llc Transplantable recellularized and reendothelialized vascular tissue graft
US7004977B2 (en) 1999-11-24 2006-02-28 A Enterprises, Inc. Soft tissue substitute and method of soft tissue reformation
US6428802B1 (en) * 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US6376244B1 (en) * 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
US6866686B2 (en) * 2000-01-28 2005-03-15 Cryolife, Inc. Tissue graft
US20010038848A1 (en) * 2000-02-18 2001-11-08 Donda Russell S. Implantable tissues infused with growth factors and other additives
ATE289828T1 (de) 2000-03-09 2005-03-15 Syntacoll Ag Mehrschicht-kollagenmatrix zur geweberekonstruktion
GB2360789A (en) 2000-03-30 2001-10-03 Christopher Mason Method of producing tissue structures
US7713544B2 (en) 2000-07-28 2010-05-11 Emory University Biological component comprising artificial membrane
WO2002014480A2 (en) * 2000-08-16 2002-02-21 Duke University Decellularized tissue engineered constructs and tissues
US6432210B1 (en) * 2000-08-31 2002-08-13 The Ford Meter Box Company, Inc. Method for treating brass
WO2002022184A2 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Organogenesis Inc. Bioengineered flat sheet graft prosthesis and its use
JP2002142758A (ja) * 2000-11-09 2002-05-21 Sumitomo Bakelite Co Ltd 培養基質及び培養器
US6458810B1 (en) * 2000-11-14 2002-10-01 George Muller Pharmaceutically active isoindoline derivatives
IL139708A0 (en) 2000-11-15 2002-02-10 Amiel Gilad Process of decellularizing biological matrices and acellular biological matrices useful in tissue engineering
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
EP1349918B1 (en) * 2000-12-06 2014-08-06 Anthrogenesis Corporation Method of collecting placental stem cells
US20030045552A1 (en) 2000-12-27 2003-03-06 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
US7091353B2 (en) * 2000-12-27 2006-08-15 Celgene Corporation Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
CA2856986C (en) * 2001-02-14 2019-08-13 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placental stem cells for use in the treatment of neurological or renal diseases and disorders
WO2002067812A2 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 University Of Massachusetts Tympanic membrane patch
US6933103B1 (en) * 2001-03-21 2005-08-23 Brennen Medical, Inc. Biocompatible tissue for therapeutic use and method of making same
EP1409515A4 (en) * 2001-06-14 2005-05-25 Queensland Bioproc Technology PROCESS FOR EXTRACTION OF COLLAGEN FROM SWELLEN SEAFOOD
JP5024694B2 (ja) 2001-06-21 2012-09-12 株式会社ビーエムジー 放射線滅菌可能な医用材料及びその用途
CN1578624A (zh) 2001-08-31 2005-02-09 南加利福尼亚大学 无毒性交联试剂在增强椎间盘及其他白纤维组织的抗疲劳性并减轻其机械性退化中的用途
US7067492B2 (en) 2001-09-06 2006-06-27 Omnio Ab Method of promoting healing of a tympanic membrane perforation
US20030143207A1 (en) * 2001-10-18 2003-07-31 Livesey Stephen A. Remodeling of tissues and organ
US20030187515A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
US20050118715A1 (en) 2002-04-12 2005-06-02 Hariri Robert J. Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
WO2003102151A2 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Celgene Corporation Modulating cell differentiation and treating myeloprolifertive disorders with jnk/mkk inhibitors
GB2414990B (en) * 2003-02-21 2007-05-23 Uab Research Foundation Biologically active native biomatrix composition
UA83504C2 (en) * 2003-09-04 2008-07-25 Селджин Корпорейшн Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
US7244759B2 (en) * 2004-07-28 2007-07-17 Celgene Corporation Isoindoline compounds and methods of making and using the same
GB0420091D0 (en) * 2004-09-10 2004-10-13 Univ Nottingham Trent Medical implant materials
WO2006101548A2 (en) * 2004-12-21 2006-09-28 Ethicon, Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same
WO2006071777A2 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 Ethicon Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells and cell products
EP1856246B1 (en) * 2005-03-07 2015-07-15 Technion Research & Development Foundation Limited Natural tissue-derived decellularized matrix and methods of generating and using same
CN101237898A (zh) * 2005-06-10 2008-08-06 细胞基因公司 人胎盘胶原组合物、其制备方法、使用方法以及包含该组合物的试剂盒
EP1901789A2 (en) * 2005-06-30 2008-03-26 Anthrogenesis Corporation Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
EP1919500A2 (en) * 2005-07-13 2008-05-14 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
EP1919365A2 (en) * 2005-07-13 2008-05-14 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
DK1948259T3 (en) * 2005-10-26 2017-04-10 Genesis Tech Ltd ACELLULAR BIOabsorbable Tissue Regeneration Matrices Produced by Incubation of ACELLULAR BLOOD PRODUCTS
US20080044848A1 (en) * 2006-06-09 2008-02-21 Heidaran Mohammad A Placental niche and use thereof to culture stem cells
EP2664341A3 (en) * 2006-10-06 2014-01-08 Anthrogenesis Corporation Native (telopeptide) placental collagen compositions
KR101367241B1 (ko) 2009-10-16 2014-02-25 후지쯔 가부시끼가이샤 전자 장치

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