CN108642115A - 一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法，属于鱼胶原蛋白提取纯化技术领域。该方法是将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌后离心；向沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌后离心；向沉淀中加入盐酸胍溶液，搅拌离心；向沉淀中加入乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌后离心；向上清液中边搅拌边滴加入氯化钠‑乙酸母液，搅拌后离心；向沉淀中加入乙酸溶液溶解沉淀后透析；透析后将透析袋内的沉淀溶解于乙酸溶液中，加到正压过滤设备，用微孔滤膜过滤上清得蛋白溶液；先用乙酸溶液透析，再用水透析，得到胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白。获得的蛋白产物结构完整，生物活性保持完好，可直接用于医用及组织工程材料。

Description

一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法

技术领域

本发明涉及一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法，属于鱼胶原蛋白提取纯化技术领域。

背景技术

胶原蛋白是广泛存在于皮肤、血管、骨骼与脑膜等多种结缔组织中的结构蛋白质，在动物的生长、发育以及结构的维持、稳定与保护过程中发挥着重要的作用。在前期的研究中也发现，作为细胞基质中的主要成分，胶原蛋白的存在可以为创口处的细胞提供贴附场所，并能够辅助多种生长因子作用于细胞，从而促进细胞的分裂与分化，进而促进创口的再生；同时，胶原蛋白材料之内的纤维与空隙结构可以使血小板细胞贴附、聚集，从而促进血栓的形成并显著的加速血液凝固，起到了很好的止血效果；另一方面，胶原蛋白可以抑制创口处部分负责降解细胞外基质的蛋白酶活性，本身的降解物也可以直接作用于创口处，为组织的再生提供氨基酸补给，从而促进创口处胞外基质的生成与稳定。因此，胶原蛋白的这些功能特性赋予了它在医用材料、组织工程方面优异的应用前景。

我国具有广阔的海岸线，因此具有丰富的水产资源。然而在加工鱼类产品时，鱼皮、鱼骨等鱼结缔组织会被直接丢弃。而这些组织中含有丰富的胶原蛋白。利用这些鱼类结缔组织作为胶原蛋白的来源，可以有效的降低成本，并对于绿色海洋经济起到良好的促进作用。

正常具有生物活性的三螺旋胶原蛋白是一种酸溶性蛋白，单链分子量在120kD左右在中性条件下会通过胶原蛋白之间的聚合及自组装形成较大的蛋白结构，继而可通过自然/化学/物理交联形成胶原蛋白材料，包括胶原凝胶及胶原海绵等。在这个过程中，胶原蛋白的结构、质量会直接影响到后续胶原材料的质量和强度。因此，可用于组织工程及医用材料的胶原蛋白不仅对于胶原蛋白本身的纯度要求较高，同时对于胶原蛋白的原始结构及蛋白完整性有着较高的要求。在一般的实验文献所述的方法中，胶原蛋白的纯化一般是通过氢氧化钠洗涤去除部分杂蛋白，再通过醇类洗涤去除脂类，继而在酸性条件下通过蛋白酶解获得胶原蛋白溶液，利用氯化钠盐析获得目的胶原蛋白。这样的方法获得的胶原蛋白生物活性得到保留，可以满足蛋白分析以及实验的要求，但纯度无法满足体内植入的要求，仍包含部分杂蛋白与杂质，体内植入后易引起排异反应。同时，该纯化方法的固液分离极度依赖离心设备，这意味着这种方法只能在实验室进行小规模的纯化，成本较高，无法进行放大生产。同时在这类方法中，胃蛋白酶的活性没有及时终止，这也容易造成蛋白的过渡消化，包括了提取率的降低及蛋白活性下降等。

现阶段的胶原蛋白纯化技术主要围绕小分子胶原蛋白的提取，如在CN103993061A、CN104672323A、CN201710309865等专利中提到的纯化技术。这一类分离、纯化得到的胶原蛋白分子量一般在300-5000D之间，可溶于水，蛋白产物可以达到较高的纯度。但这一类胶原蛋白由于失去了原始的结构，无法用于组织工程材料的制备，其蛋白产物一般被应用于美容、保健等方面。同时色谱柱体系的应用会显著性的限制相关方法的应用，其纯化方法难以进行扩大化，纯化成本也会显著提升。

在一些专利及文献报道中，利用有机试剂沉淀(包括乙醇、丙酮等)等方法得到了纯度较高的胶原蛋白。但在实际操作中，在最终的分离阶段使用有机试剂易于造成蛋白质的变性，使目的产物失去生物活性，同时有机试剂容易残留在终产物中，从而造成安全隐患。

蛋白酶消化是绝大部分技术及文献中共通的胶原蛋白提取方法。在自然条件下，胶原蛋白与其他蛋白一起交联结合形成了复杂而稳定的结构。这种结构直接导致了在未酶解的情况下，胶原蛋白无法从结缔组织中提取出来。由于天然胶原蛋白本身具有三螺旋而能抵抗蛋白酶酶解的特性，因此利用蛋白酶消化酶解非目的蛋白并将胶原蛋白释放、溶解到溶液中，这成为了一种共通的方法。然而这种方法所带来的问题即在于如何在提取溶解胶原蛋白之后及时将所用蛋白酶失活，并不损伤到胶原蛋白的结构。利用提高温度加热的方法虽然可以使蛋白酶直接变性失活，但这也会导致胶原蛋白解旋及变性。在酶解后加入强碱(如氢氧化钠等)或者有机试剂也同样可以使蛋白酶变性、降解而导致失活，但这种作用同样会作用在胶原蛋白上，使其遭到变性与降解。

同时，可放大的有色杂质的去除方法是绝大部分专利技术及文献报道中未解决的。鱼类表皮的大部分区域都为着色区及深着色区，简单的通过物理分离及刮除会造成极大的浪费，显著增加人力成本，同时其产物蛋白一般仍有着明显的着色(附图1)。同时我们在动物实验中也发现，这种未除色的胶原蛋白易于引起炎症及异物反应，这意味着有色杂质的去除是医用胶原蛋白必需的。活性炭经常被用于有色杂质的去除。但在实际操作中我们发现，由于胶原蛋白溶液的粘稠度较高，活性炭的使用吸附大量的胶原蛋白，降低胶原的提取率，同时由于活性炭本身的易碎性，其本身极易在使用过程中形成细小的颗粒并带到终产物中。同时在一般情况下，可能是由于胶原蛋白的特殊性，活性炭的除色效果并不理想。

另一方面，由于具有活性的胶原蛋白具有自组装的特性，提取过程中产生的胶原蛋白溶液粘度过高，这使得大部分(完整而不是小分子的)胶原蛋白纯化过程中并没有使用过滤技术，这也使得产物蛋白中容易含有小颗粒异物及杂质，进而在植入之后引起排异反应。

上述因素都制约着胶原蛋白在医学、组织工程中的应用。大规模制备高纯度、高品质胶原蛋白的方法与纯化工艺仍为本领域的重要需求。

发明内容

为解决现有采用胃蛋白酶酶解法提取纯化胶原蛋白的过程中存在胃蛋白酶的活性没有及时终止容易造成蛋白的过渡消化、终止胃蛋白酶活性方法易于影响胶原蛋白活性、胶原蛋白酶提取率的降低及蛋白活性下降，鱼胶原蛋白提取纯化过程中色素去除，目标产物蛋白中含有小颗粒异物、过敏原及杂质，目标蛋白纯度低、目标蛋白在提取纯化过程中遭到破坏、活性下降等问题，本发明提供了一种可以大规模生产的高纯度、高品质鱼胶原纯化方法，并尽可能减少了有机试剂的使用，其原料包括鱼皮、鱼鳞与鱼骨等鱼类结缔组织，所获得产物纯度高，蛋白结构完整，生物活性好，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鱼胶原蛋白提取纯化方法，该方法包括如下步骤：

1)将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

2)向步骤1)得到的沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

3)向步骤2)得到的沉淀中加入盐酸胍溶液，搅拌6h-16h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

4)向步骤3)得到的沉淀中加入乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌24h-72h，搅拌完成后或40目滤布过滤保留上清液；

5)向步骤4)获得的上清液中边搅拌边滴加入氯化钠-乙酸母液至氯化钠的终浓度为0.6M-2M，继续搅拌12h-36h后离心，去除上清液得到沉淀；其中：氯化钠-乙酸母液是通过将氯化钠溶解于乙酸中制备的；

6)向步骤5)获得的沉淀中加入乙酸溶液溶解沉淀，然后进行透析，透析过程中使用磷酸氢二钠溶液作为透析液；

7)透析完成后将透析袋内的沉淀或胶体溶解于乙酸溶液中，然后加入到过滤设备中，并且利用微孔滤膜过滤上清，获得蛋白溶液；

8)将步骤7)获得的蛋白溶液进行透析48h-96h，透析过程中先使用乙酸溶液作为透析液，然后再使用水作为透析液，透析完成后得到的产物为胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白；上述步骤1至步骤8的全程温度控制在0～12℃下进行。

优选地，步骤1)所述氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.05M-0.2M，过氧化氢溶液的终浓度为0.01％-0.8％(体积)；氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20-100(mL/g)。更优选地，步骤1)所述氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中过氧化氢溶液的终浓度为0.1％(体积)；氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液的体积与冻干鱼皮干重质量之比为80(mL/g)。

优选地，步骤3)所述盐酸胍溶液的浓度为0.1M-5M，盐酸胍溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为10-20(mL/g)。更优选地，步骤3)所述盐酸胍溶液的浓度为4M，盐酸胍溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为7.5(mL/g)。

优选地，步骤4)中胃蛋白酶的添加量是冻干鱼皮干重的5％-20％(m/m)。更优选地，步骤4)中胃蛋白酶的添加量是冻干鱼皮干重的10％(m/m)。

优选地，步骤5)中氯化钠-乙酸母液中氯化钠的浓度为3.5M-5M。

优选地，步骤5)中滴加入氯化钠-乙酸母液至氯化钠的终浓度为0.8M。

优选地，步骤6)所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.01M-0.1M，pH值为9.0-9.6。更优选地，步骤6)所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.02M。

优选地，步骤4)中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)，乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M；步骤6)所述乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20-50(mL/g)；步骤7)中乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)。

更优选地，步骤4)中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为200(mL/g)，乙酸溶液的浓度为0.5M；步骤6)所述乙酸溶液的浓度为0.1M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20(mL/g)；步骤7)中乙酸溶液的浓度为0.5M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)。

优选地，步骤7)所述微孔滤膜孔径为0.2μm-0.5μm。

更优选地，根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；步骤1)所述氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的浓度为0.05M-0.2M，过氧化氢溶液的浓度为0.1％(体积)；氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的体积与冻干鱼皮干重质量之比为80(mL/g)；

2)向步骤1)得到的沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；

3)向步骤2)得到的沉淀中加入4M盐酸胍溶液，搅拌6h-16h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；盐酸胍溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为7.5(mL/g)；

4)向步骤3)得到的沉淀中加入0.5M乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌24h-72h，搅拌完成后离心保留上清液；步骤4)中胃蛋白酶的添加量是冻干鱼皮干重的10％(m/m)；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为200(mL/g)；

5)向步骤4)获得的上清液中边搅拌边滴加入3.5M-5M氯化钠-乙酸母液至氯化钠的终浓度为0.8M，继续搅拌12h-36h后离心，去除上清液得到沉淀；其中：氯化钠-乙酸母液是通过将氯化钠溶解于乙酸中制备的；

6)向步骤5)获得的沉淀中加入0.1M乙酸溶液溶解沉淀，然后进行透析，透析过程中使用0.02M、pH值为9.0-9.6的磷酸氢二钠溶液作为透析液；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20(mL/g)；

7)透析完成后将透析袋内的沉淀或胶体溶解于0.5M乙酸溶液中，然后加入到正压过滤设备，并且利用0.2μm-0.5μm微孔滤膜过滤上清，获得蛋白溶液；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)；

8)将步骤7)获得的蛋白溶液进行透析24h-48h，透析过程中先使用乙酸溶液作为透析液，然后再使用水作为透析液，透析完成后得到的产物为胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白；

上述步骤1至步骤8的全程温度控制在0～12℃下进行。

上述任一所述方法制得的鱼胶原蛋白。

本发明中小规模提取时透析可以采用透析袋，大规模提取时透析可以采用剪切流过滤系统。

本发明中可以采用40目滤布过滤代替所有离心步骤。

本发明进行大规模生产时，过滤设备可以采用正压过滤设备。

本发明在低温条件下，通过碱溶解清除部分杂蛋白，利用过氧化氢初步去除胶原内有色杂质，利用醇类去除多余脂质，继而利用盐酸胍去除部分杂蛋白和糖基化蛋白。通过胃蛋白酶消化溶解胶原蛋白，通过多部盐析反应有效提升胶原蛋白纯度(首先通氯化钠盐析沉淀获得胶原蛋白初产物，其次再通过磷酸氢二钠二次盐析沉淀获得胶原蛋白，消除胃蛋白酶活性)。继而在复溶后利用微孔过滤技术进一步去除有色杂质及其他颗粒。后利用溶剂置换以及冻干，获得纯度极高的医用胶原蛋白产物。

本发明通过氢氧化钠去除杂蛋白；通过正丁醇/异丙醇去除原料中的脂质；通过盐酸胍进一步纯化胶原产物，去除杂蛋白，有效降低胶原蛋白的炎症、异物反应；利用胃蛋白酶消化，溶解完整胶原蛋白；利用过氧化氢去除胶原内色素，有效增加胶原白度，去除产物腥味，有效降低胶原蛋白的炎症、过敏反应；通过多部盐析反应，有效提升胶原蛋白纯度；通过微孔过滤技术，有效降低纯化产物中的杂质含量，有效增加胶原白度，显著降低胶原蛋白在植入体内后的异物反应。

本发明利用盐酸胍去除糖蛋白及杂质蛋白，其工作浓度在0.1M～5M之间。利用微孔滤膜对胶原蛋白溶液进行过滤，或利用高速离心去除杂质颗粒及有色物质，滤膜的孔径范围在0.2μm-0.5μm之间，离心速度在1000～40000g之间。通过氯化钠盐析沉淀进行初始纯化，氯化钠的工作浓度在0.6M～2M之间。盐析后得到的胶原蛋白沉淀溶解后，利用磷酸氢二钠进行透析或者二次盐析沉淀，提高胶原蛋白纯度，同时使残留胃蛋白酶失活，磷酸氢二钠的工作浓度在0.01M～0.1M之间。利用过氧化氢去除胶原内色素，提高胶原白度，同时不影响胶原的溶解率，其工作浓度在0.01％～0.8％之间。通过透析置换去除胶原内的离子，降低灰分，透析时间为24～96h，透析膜孔径在3000～24000D之间。盐析过程为利用氯化钠/磷酸氢二钠母液对胶原溶液进行缓慢滴加，滴加完成时间为5min～4h。

本发明盐析过程为利用高浓度盐溶液在搅拌过程中缓慢滴加，防止局部沉淀的形成。

本发明有益效果：

本发明方法与已有方法相比，其优势在于利用低成本的原材料，通过无色谱柱纯化体系即可获得高纯度、高得率的鱼胶原蛋白产品，全过程避免了色谱柱系统及大量有机试剂的使用，全程除异丙醇/正丁醇外没有其他有机试剂。本发明方法所获得蛋白产物不含杂蛋白，目的蛋白结构完整，几无降解，脂质及灰分等成分含量极低，动物实验中几无炎症及异物反应，蛋白活性生物保持完好，拥有良好的生物相容性，局部组织再生效果明显，同时获得的胶原蛋白成胶、成海绵的机械性能状态良好，可直接应用于医用及组织工程材料。本发明方法可以进行扩大化生产，同时也可以应用于实验室级别的小规模纯化，应用范围广。

现有采用胃蛋白酶酶解法提取纯化胶原蛋白的过程中通常存在胃蛋白酶的活性没有及时终止，容易造成蛋白的过渡消化，或因为终止胃蛋白酶活性终止方法(包括加热、有机试剂及强碱处理等)过于极端，最终造成胶原蛋白提取率的降低及蛋白活性下降的问题，本发明通过使用低浓度(0.01M～0.1M)磷酸氢二钠透析/沉淀的方法解决了及时抑制蛋白酶活性的问题，本发明方法中低浓度(0.01M～0.1M)磷酸氢二钠透析/沉淀的作用有两个，一个是利用胶原蛋白在中性及弱碱性条件下自然组装成胶的特性，使胶原蛋白在低浓度磷酸氢二钠的条件下成胶、析出，即对胶原蛋白进行针对性的二次盐析，从而有效提升胶原蛋白的纯度，同时不损伤胶原蛋白的结构及生物活性；另一个是使蛋白酶失去活性，即利用低浓度(0.01M～0.1M)磷酸氢二钠的弱碱性使蛋白酶失去活性。

针对胶原蛋白中与胶原蛋白结合的杂质蛋白难以去除，并在植入后易成为过敏原的问题，本发明方法在纯化过程中采用盐酸胍对胶原蛋白中的杂质进行了进一步的去除，具体是利用胶原蛋白本身的三螺旋稳定结构，并且将盐酸胍控制在0.1M～5M，同时在低温下进行反应，有效的去除了胶原蛋白产物中的过敏原，降低了植入后的炎症及排异反应。

针对胶原蛋白有色杂质的去除的问题，本方法采用了低浓度0.01％-0.8％(体积)过氧化氢处理及微孔过滤方法。首先，本发明首次将过氧化氢用于鱼胶原蛋白的除色，通常过氧化氢参与氧化过程中的使用浓度一般在3～5％(体积)左右，但是由于胶原蛋白的特殊性，这种浓度会造成胶原蛋白性质上的变化，如出现可溶性变差、终产物生物活性的降低及胶原材料强度的下降等问题，而本发明中通过采用工作浓度在0.01％-0.8％(体积)之间的过氧化氢成功解决了上述问题，将过氧化氢浓度控制在0.05～0.8％(体积)以内，在低温条件下即可有效的去除胶原蛋白产物中带有的有色物质，同时不影响胶原蛋白的溶解性及蛋白活性；其次，在酸性条件下进行多倍稀释削弱胶原蛋白之间作用力后，发明人在实验过程中发现，在正压过滤的条件下，胶原蛋白溶液可以快速通过0.2～0.4μm的滤膜，这使得微孔过滤法可以应用于胶原蛋白的纯化过程中，通过微孔过滤，胶原蛋白溶液中的有色物质可以得到有效的去除，同时胶原蛋白的纯度也会得到有效提高，在植入后的生物相容性也有了显著增强。

在盐析后胶原蛋白与上清分离的问题，本方法也做了针对性的解决。在氯化钠沉淀后，利用大多数胶原蛋白会聚集形成大纤维的特点，可以利用多层滤布替代离心设备分离获得胶原蛋白的粗产物。如40目滤布过滤代替离心。

附图说明

图1为除色及未除色胶原蛋白产物；

(A，为除色后的胶原蛋白产物；B，为未除色的胶原蛋白产物)。

图2为纯化后胶原蛋白的电泳结果

(P为依据专利方法提取的胶原蛋白；C为对照组获得的胶原蛋白)。

图3为纯化后胶原蛋白的动物体内包埋检测结果；

(I，为利用本发明方法获得的胶原蛋白进行动物体内包埋在10倍镜拍摄结果；II，为对照组获得的胶原蛋白进行动物体内包埋在10倍镜拍摄结果；III，为利用本发明方法获得的胶原蛋白进行动物体内包埋在40倍镜拍摄结果；IV，为对照组获得的胶原蛋白进行动物体内包埋在40倍镜拍摄结果)。

图4为纯化后胶原制得的胶原海绵。

图5为纯化后胶原制得的胶原凝胶。

图6为胶原凝胶材料压力测试结果图；

图7为纯化后胶原蛋白的紫外光谱吸收峰。

图8为对照组获得的胶原蛋白的紫外光谱吸收峰。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

购买新鲜罗非鱼，刮取鱼皮，去除鱼鳞及肌肉组织，将获得鱼皮进行冻干，剪成细小碎块。取40目滤布，用超纯水清洗、灭菌，250℃干燥烘干后备用。

称取105g NaCl溶于终体积400ml 0.5M乙酸中，获得4.5M高浓度氯化钠母液，4℃备用。

称取5g冻干后鱼皮，加入冻干鱼皮干重的80倍体积(400mL)的NaOH溶液和过氧化氢溶液的混合溶液(氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.1M，过氧化氢溶液的终浓度为0.1％(体积))，4℃搅拌36h，每12小时更换一次NaOH溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的40倍体积(200ml)10％异丙醇溶液，4℃搅拌24h，每8小时更换一次异丙醇溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的10倍体积(50mL)4M盐酸胍溶液，4℃搅拌8小时，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的100倍体积(500mL)0.5M乙酸溶液，冻干鱼皮干重的10％(0.5g)胃蛋白酶，4℃搅拌48h，12000g20min离心保留上清。向上清液中边搅拌边缓慢滴加入4.5M高浓度氯化钠母液至氯化钠终浓度为0.8M，4℃缓慢搅拌24h，12000g 20min离心去上清。冻干鱼皮干重的20倍体积(100mL)0.1M乙酸溶液溶解沉淀，将所获得溶液装入孔径为8000D透析袋中，以0.02M、pH9.4的磷酸氢二钠作为透析液4℃透析24h。将所获得透析袋内沉淀/胶体溶于冻干鱼皮干重的100倍体积(500mL)0.5M乙酸中，将蛋白溶液加入正压过滤设备，利用0.45μm滤膜过滤上清。将过滤后蛋白溶液装入孔径为8000D透析袋中，0.5M乙酸透析48h，水透析48h。透析后产物为含水量极高的胶原凝胶，冻干后即为胶原蛋白产物。

全程温度(包括离心、搅拌透析等反应过程)为4摄氏度。

所获得胶原蛋白不含有杂质蛋白，灰度接近0，脂质含量为千分之五，产率为鱼皮干重的45％。

实施例2：

购买新鲜罗非鱼，刮取鱼皮，去除鱼鳞及肌肉组织，将获得鱼皮进行冻干，剪成细小碎块。取40目滤布，用超纯水清洗、灭菌，250℃干燥烘干后备用。

称取82g NaCl溶于终体积400ml 0.5M乙酸中，获得3.5M高浓度氯化钠母液，4℃备用。

称取5g冻干后鱼皮，加入冻干鱼皮干重的20倍体积(100mL)的NaOH溶液和过氧化氢溶液的混合溶液(氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.05M，过氧化氢溶液的终浓度为0.01％(体积))，4℃搅拌24h，每12小时更换一次NaOH溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的40倍体积(200ml)10％异丙醇溶液，4℃搅拌24h，每8小时更换一次异丙醇溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的10倍体积(50mL)0.1M盐酸胍溶液，4℃搅拌8小时，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的80倍体积(400mL)0.1M乙酸溶液，冻干鱼皮干重的5％(0.25g)胃蛋白酶，4℃搅拌48h，12000g 20min离心保留上清。向上清液中边搅拌边缓慢滴加入3.5M高浓度氯化钠母液至氯化钠终浓度为0.6M，4℃缓慢搅拌12h，12000g 20min离心去上清。冻干鱼皮干重的20倍体积(100mL)0.1M乙酸溶液溶解沉淀，将所获得溶液装入孔径为8000D透析袋中，以0.01M、pH9.0的磷酸氢二钠作为透析液4℃透析24h。将所获得透析袋内沉淀/胶体溶于冻干鱼皮干重的80倍体积(400mL)0.1M乙酸中，将蛋白溶液加入正压过滤设备，利用0.45μm滤膜过滤上清。将过滤后蛋白溶液装入孔径为8000D透析袋中，0.5M乙酸透析24h，水透析24h。透析后产物为含水量极高的胶原凝胶，冻干后即为胶原蛋白产物。

全程温度(包括离心、搅拌透析等反应过程)为4摄氏度。

所获得胶原蛋白不含有杂质蛋白，灰度接近0，脂质含量为千分之七，产率为鱼皮干重的30％。

实施例3：

购买新鲜罗非鱼，刮取鱼皮，去除鱼鳞及肌肉组织，将获得鱼皮进行冻干，剪成细小碎块。取40目滤布，用超纯水清洗、灭菌，250℃干燥烘干后备用。

称取117g NaCl溶于终体积400ml 0.5M乙酸中，获得5M高浓度氯化钠母液，4℃备用。

称取5g冻干后鱼皮，加入冻干鱼皮干重的100倍体积(500mL)的NaOH溶液和过氧化氢溶液的混合溶液(氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.2M，过氧化氢溶液的终浓度为0.8％(体积))，4℃搅拌48h，每12小时更换一次NaOH溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的40倍体积(200ml)10％异丙醇溶液，4℃搅拌24h，每8小时更换一次异丙醇溶液，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的20倍体积(100mL)5M盐酸胍溶液，4℃搅拌8小时，5000g 10min离心去上清。加入冻干鱼皮干重的200倍体积(1000mL)0.5M乙酸溶液，冻干鱼皮干重的20％(1g)胃蛋白酶，4℃搅拌48h，12000g 20min离心保留上清。向上清液中边搅拌边缓慢滴加入5M高浓度氯化钠母液至氯化钠终浓度为2M，4℃缓慢搅拌12h，12000g 20min离心去上清。冻干鱼皮干重的50倍体积(250mL)0.5M乙酸溶液溶解沉淀，将所获得溶液装入孔径为8000D透析袋中，以0.1M、pH9.6的磷酸氢二钠作为透析液4℃透析24h。将所获得透析袋内沉淀/胶体溶于冻干鱼皮干重的200倍体积(1000mL)0.5M乙酸中，将蛋白溶液加入正压过滤设备，利用0.5μm滤膜过滤上清。将过滤后蛋白溶液装入孔径为8000D透析袋中，0.5M乙酸透析48h，水透析48h。透析后产物为含水量极高的胶原凝胶，冻干后即为胶原蛋白产物。

全程温度(包括离心、搅拌透析等反应过程)为4摄氏度。

所获得胶原蛋白不含有杂质蛋白，灰度接近0，脂质含量为千分之六，产率为鱼皮干重的35％。

实施例4(大规模生产)

利用胶原蛋白在盐析后形成蛋白沉淀粒径较大的特点，通过利用滤布和正压过滤系统替代离心机设备，以及利用切向流过滤系统取代小规模的透析设备，本方法可以实现大批量的胶原蛋白提取。其实施例如下：

购买新鲜鲈鱼，刮取鱼皮，去除鱼鳞及肌肉组织，将获得鱼皮进行冻干，剪成细小碎块。取40目滤布，用超纯水清洗、灭菌，250℃干燥烘干后备用。

称取877g NaCl溶于终体积3L 0.5M乙酸中，获得5M高浓度氯化钠母液，4℃备用。

称取21.5g十二水磷酸氢二钠溶于终体积300ml水中4℃备用。

称取50g冻干后鱼皮，加入冻干鱼皮干重的80倍体积(4L)的NaOH溶液和过氧化氢溶液的混合溶液(氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.1M，过氧化氢溶液的终浓度为0.2％(体积))，4℃搅拌48h，每12小时更换一次NaOH溶液。40目滤布过滤，超纯水清洗滤布上沉淀。加入冻干鱼皮干重的40倍体积10％异丙醇(2L)，4℃搅拌36h，每12小时更换一次异丙醇溶液。40目滤布过滤，超纯水清洗滤布上沉淀。加入7.5倍体积4M盐酸胍溶液，4℃搅拌12h。40目滤布过滤，超纯水清洗滤布上沉淀。加入冻干鱼皮干重的200倍体积(10L)0.5M乙酸，以及冻干鱼皮干重的10％(5g)的胃蛋白酶，4℃搅拌48h。在搅拌过程中缓慢滴加入前述5M高浓度氯化钠母液至终浓度为0.8M，4℃缓慢搅拌24h。四层40目滤布过滤，超纯水清洗滤布上沉淀。加入冻干鱼皮干重的100倍体积(5L)0.1M乙酸溶液溶解沉淀。将所获得溶液加入正压过滤设备，利用0.45μm滤膜过滤上清。使用剪切流过滤系统将胶原溶液置换为0.02M磷酸氢二钠。四层40目滤布过滤，超纯水清洗滤布上沉淀。加入冻干鱼皮干重的40倍体积(2L)0.5M乙酸溶液溶解胶原沉淀。剪切流过滤系统置换胶原溶液，前24h为0.2M乙酸，后72h为超纯水。溶液置换后产物为含水量极高的胶原凝胶，冻干后即为胶原蛋白产物。所获得胶原蛋白不含有杂质蛋白，灰度接近0，脂质含量为百分之一，产率为鱼皮干重的40％。

为说明本发明方法所能够获得的效果，进行了如下实验：

对照组：按照文献中已有方法，即：利用0.1M氢氧化钠除杂，10％(体积比)异丙醇除脂，1％(质量体积比)胃蛋白酶消化，2M氯化钠盐析，0.5M冰醋酸溶解后蒸馏水透析并冻干后得到的胶原蛋白产物；

实验组1(鱼胶原1)：实施例1制备的胶原蛋白；

实验组2(鱼胶原2)：以鲈鱼为原料，其他与实施例1步骤相同；

标准样品：采购于麦克林公司的胶原蛋白标准样品(C823256)。

为了验证胶原蛋白的质量和纯度，我们依据专利方法进行了胶原蛋白提取(实验组1)。与对照组(按照传统未除色提取方法)获得的带有颜色的胶原蛋白(图1B)相比，利用相同原料经过本发明方法中获得的胶原蛋白为均一、白色的胶原蛋白产物(图1A)。为了进一步验证纯度，将获得的胶原蛋白进行电泳、染色比对。电泳、染色结果显示，所获得的胶原蛋白纯度较高，除去胶原特有的几条特异性条带外没有其他杂质蛋白，与对照产物相比，染色背景更浅，纯度更高(图2)。同时将所获得的胶原蛋白进行色氨酸以及其他氨基酸检测，其结果显示产物中不含有色氨酸(表1)。紫外光谱分析结果也显示，依据本专利方法获得的胶原蛋白仅在230nm处有特异性吸收峰，在260nm、280nm处没有吸收峰，这进一步证明了产物蛋白的纯度(图7)，且与对照胶原蛋白相比，其本底吸收值更低(图7&8)。这些结果共同证明依据本专利提供的纯化方法可以获得纯度极高的胶原蛋白。

表1

为了进一步验证所获得胶原蛋白的生物活性，我们将依据专利方法纯化得到的胶原蛋白与对照胶原蛋白进行了动物上的肌肉包埋实验。从结果中我们可以看到，依据专利方法得到的胶原蛋白具有良好的生物相容性，包埋处组织炎症反应良好，组织再生明显，肉芽生长丰富(图3I&III)。而依据传统方法获得的对照胶原蛋白生物相容性较差，包埋处组织炎症、排异反应明显，有较多的深染炎症细胞及多核结构的巨噬细胞(图3II&IV)。同时我们将依据本专利方法获得的胶原蛋白进行胶原蛋白成海绵、凝胶实验，其材料成型效果较好(图4&5)。对其凝胶进行压力测试，其最高承受压力可达0.1Mpa(图6)，接近天然组织。这些结果证明，依据本专利提供方法所获得的胶原蛋白纯度较高，没有明显的至敏源及异物、杂质，生物相容性较高，同时具有良好的生物活性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种鱼胶原蛋白提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

2)向步骤1)得到的沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

3)向步骤2)得到的沉淀中加入盐酸胍溶液，搅拌6h-16h，搅拌完成后离心或40目滤布过滤，得到沉淀；

4)向步骤3)得到的沉淀中加入乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌24h-72h，搅拌完成后或40目滤布过滤保留上清液；

5)向步骤4)获得的上清液中边搅拌边滴加入氯化钠-乙酸母液至氯化钠的终浓度为0.6M-2M，继续搅拌12h-36h后离心，去除上清液得到沉淀；其中：氯化钠-乙酸母液是通过将氯化钠溶解于乙酸中制备的；

6)向步骤5)获得的沉淀中加入乙酸溶液溶解沉淀，然后进行透析，透析过程中使用磷酸氢二钠溶液作为透析液；

7)透析完成后将透析袋内的沉淀或胶体溶解于乙酸溶液中，然后加入到过滤设备中，并且利用微孔滤膜过滤上清，获得蛋白溶液；

8)将步骤7)获得的蛋白溶液进行透析48h-96h，透析过程中先使用乙酸溶液作为透析液，然后再使用水作为透析液，透析完成后得到的产物为胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白；

上述步骤1至步骤8的全程温度控制在0～12℃下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的终浓度为0.05M-0.2M，过氧化氢溶液的终浓度为0.01％-0.8％(体积比)；氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20-100(mL/g)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述盐酸胍溶液的浓度为0.1M-5M，盐酸胍溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为10-20(mL/g)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中胃蛋白酶的添加量是冻干鱼皮干重的5％-20％(m/m)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中氯化钠-乙酸母液中氯化钠的浓度为3.5M-5M。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.01M-0.1M，pH值为9.0-9.6。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)，乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M；步骤6)所述乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20-50(mL/g)；步骤7)中乙酸溶液的浓度为0.1M-0.5M，乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)所述微孔滤膜孔径为0.2μm-0.5μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；步骤1)所述氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的浓度为0.05M-0.2M，过氧化氢溶液的浓度为0.1％(体积)；氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液中氢氧化钠溶液的体积与冻干鱼皮干重质量之比为80(mL/g)；

2)向步骤1)得到的沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌24h-48h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；

3)向步骤2)得到的沉淀中加入4M盐酸胍溶液，搅拌6h-16h，搅拌完成后离心，去除上清液得到沉淀；盐酸胍溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为7.5(mL/g)；

4)向步骤3)得到的沉淀中加入0.5M乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌24h-72h，搅拌完成后离心保留上清液；步骤4)中胃蛋白酶的添加量是冻干鱼皮干重的10％(m/m)；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为200(mL/g)；

5)向步骤4)获得的上清液中边搅拌边滴加入3.5M-5M氯化钠-乙酸母液至氯化钠的终浓度为0.8M，继续搅拌12h-36h后离心，去除上清液得到沉淀；其中：氯化钠-乙酸母液是通过将氯化钠溶解于乙酸中制备的；

6)向步骤5)获得的沉淀中加入0.1M乙酸溶液溶解沉淀，然后进行透析，透析过程中使用0.02M、pH值为9.0-9.6的磷酸氢二钠溶液作为透析液；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为20(mL/g)；

7)透析完成后将透析袋内的沉淀或胶体溶解于0.5M乙酸溶液中，然后加入到正压过滤设备，并且利用微孔滤膜过滤上清，获得蛋白溶液；其中乙酸溶液的体积与冻干鱼皮干重之比为80-200(mL/g)；

8)将步骤7)获得的蛋白溶液进行透析24h-48h，透析过程中先使用乙酸溶液作为透析液，然后再使用水作为透析液，透析完成后得到的产物为胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白；

上述步骤1至步骤8的全程温度控制在0～12℃下进行。

10.权利要求1-9任一所述方法制得的鱼胶原蛋白。