CN101363040A

CN101363040A - 胶原蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN101363040A
Application number: CNA2008101560700A
Authority: CN
Inventors: 任伟业; 李峰; 杨庆
Original assignee: WUXI BIOT BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUXI BIOT BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2009-02-11

Abstract

胶原蛋白的制备方法，步骤如下：1)原料前处理：将新鲜牛腱去除脂肪、筋膜，并经0.1±0.05％的碳酸钠溶液浸泡4±2h，用蒸馏水漂洗数次晾干；2)经预处理的牛腱加入蛋白水解酶，其质量配比为0.3±0.1wt％；并加入乙酸溶液，在1－12℃条件下缓慢搅拌3～5d；然后用高速冷冻离心机离心，取上清溶液，粗提得胶原蛋白溶液；3)胶原蛋白的提纯：在粗提胶原蛋白溶液加入质量分数为1±0.5％的H₂O₂溶液混匀静置4±2h，用柠檬酸三钠溶液调节pH值到5±1，离心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化钠盐析，再将沉淀物装入透析袋中，用乙酸溶液透析1±0.5d，再用蒸馏水透析3±1d，每天换透析液2－3次，得到胶原蛋白水液。

Description

胶原蛋白的制备方法

一、技术领域

本发明涉及医用级胶原蛋白及海绵，涉及一种高纯度完整三螺旋结构大分子活性胶原蛋白。尤其是生化医药级高纯度胶原蛋白的制备，尤其是涉及的用于从动物结缔组织中取得可溶性医用级胶原的工艺以及包含由该工艺所制得可溶性胶原医用产品。可广泛应用于生物医药、生物材料制备及美容保健等行业。

二、背景技术

胶原蛋白是构成各种细胞外基质的结构蛋白质，在动物细胞中扮演结合组织的角色。它是动物体内含量最多的蛋白质，约占人体蛋白质的25—35％，相当于人体重量的6％，分布遍及全身各个组织器官，如骨骼、软骨、韧带、皮肤、角膜、各种内膜、筋膜等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白。由于胶原蛋白富含甘胺酸及一般较少存在于其它蛋白质中的脯胺酸、羟脯胺酸等，所以衡量胶原蛋白的纯度高低，有时会以羟脯胺酸含量做为胶原蛋白的纯度指标。

胶原蛋白(Collagen)的来源：由于胶原蛋白普遍存在于动物、鱼类、植物体内，其来源、结构性、效能性及安全性，是选用胶原蛋白产品时必须加以考虑的地方。胶原蛋白依其溶解性可分为：(1)可溶性胶原蛋白；(2)不可溶性胶原蛋白。而可溶性胶原蛋白又可分为酸性可溶、碱性可溶和中性盐可溶胶原蛋白。此外，还有胶原蛋白的变性产物明胶。如中国专利CN1040309食用明胶的生产方法，涉及一种从动物骨和皮中或者从骨胶和皮胶中制取食用明胶的生产方法。是在18℃—25℃，pH为5.5—6.5条件下，用43％—65％的乙醇萃取明胶蛋白，经浓缩后回收乙醇的方法代替复杂的前处理过程，使生产周期缩短了65天时间，成品率提高15％以上。胶原蛋白的制造工艺较为复杂，主要应用在医疗和生物医学材料方面，如人工皮肤、止血剂、人工血管、以及护肤化妆品等，因此价位较高。而明胶不具备完整的三螺旋结构，制造较为简易，是一种由真皮或其它组织以酸、碱、热或酵素水解后的产物，分子量小，价位较低。对于其特殊立体结构与效能之间的关系仍有许多有待厘清的地方。明胶(果冻的成分之一)或市售某些水解性胶原蛋白几乎与蛋白质水解产物(氨基酸)无异，其原有的生理活性已遭到破坏，不同的处理方式会影响胶原蛋白原有的生理活性，但是如不进一步依开发的目的处理胶原蛋白分子，又会限制了它的应用范围。所幸研究显示，经特殊处理后的胶原蛋白，仍可维持其原有的三螺旋结构。胶原蛋白海绵具有低免疫性、组织亲和性强、止血性能好、生物降解性好、机械强度好、组织修复功能强等优点，是临床上使用的理想的止血修复生物材料，它可在体内自行降解吸收。

三、发明内容

本发明目的是：提出一种胶原蛋白制备方法、尤其是具备完整的三螺旋结构，保持了完整的生物活性结构的胶原蛋白。

本发明的技术解决方案是：胶原蛋白的制备方法，步骤如下：1)原料前处理：将新鲜牛腱去除脂肪、筋膜，并经0.1±0.05％的碳酸钠(CP)溶液浸泡4±2hr，用蒸馏水漂洗数次晾干；2)经预处理的牛腱加入蛋白水解酶，其质量配比为0.3±0.1wt％；并加入乙酸(CP)溶液(pH＝2～3)适量，在1-12℃条件下缓慢搅拌3～5d(天)，然后用高速冷冻离心机离心，取上清溶液，粗提得胶原蛋白溶液；3)胶原蛋白的提纯：在粗提胶原蛋白溶液加入质量分数为1±0.5％的H₂O₂溶液混匀静置4±2hr，用柠檬酸三钠溶液调节pH值到5±1，离心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化钠盐析，缓慢搅拌，4±2℃静置过夜保存，盐析沉淀是采用的氯化钠示差沉淀的方法，即运用不同的氯化钠的浓度对此蛋白液进行处理，然后取出盐析沉淀物用酸性溶液在4±2℃下浸泡24±8h，再将沉淀物装入透析袋中，用乙酸溶液透析1±0.5d，再用蒸馏水透析3±1d，每天换透析液2-3次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水液。尤其是透析后进行超滤浓缩，将浓缩液上阴离子交换树脂，在PH6.0，盐浓度为0.2mol/L进行提纯。经Akta分析表明，产品纯度可达到98.5％以上。

本发明方法的产品与国内一般胶原蛋白、明胶产品放在一起做SDS—PAGE电泳试验比较，可以看出：本发明的产品具备完整的三螺旋结构，保持了完整的生物活性结构，而明胶和其它一般胶原蛋白是变性蛋白，不具备生物活性，分子量呈现不规则散乱分布。而且，将本发明方法得到的产品做HPLC，也可看出，产品纯度可达到98.5％以上，这也是现有技术不能企及的。

本发明的有益效果是：胶原蛋白海绵具有低免疫性、组织亲和性强、止血性能好、生物降解性好、机械强度好、组织修复功能强等优点，是临床上使用的理想的止血修复生物材料，它可在体内自行降解吸收。决定胶原蛋白在临床应用中效果的最关键的因素是：胶原是否保持了三螺旋分子结构的完整性。将我公司的产品与国内一般胶原蛋白、明胶产品放在一起做SDS—PAGE电泳试验比较，可以看出：我公司的产品具备完整的三螺旋结构，保持了完整的生物活性结构，而明胶和其它一般胶原蛋白是变性蛋白，不具备生物活性，分子量呈现不规则散乱分布。决定胶原蛋白在临床应用中效果的最关键的因素是：胶原是否保持了完整的三螺旋分子结构。通过本发明所提取的胶原主要是可溶的胶原蛋白.且由于保持了完整的三螺旋结构使胶原蛋白的生理功能得到了充分的体现.

四、附图说明

图1是两种酶法提取方法样品的紫外吸收谱图的对比

图2是过滤压力与膜孔的过滤曲线

图3胶原蛋白的分析色谱图

图4本发明方法的样品的紫外吸收光谱图(吸收值—波长)

五、具体实施方式

主要是前处理→经乙酸酸化处理→提取(氯化钠示差沉淀)→纯化(过滤、层析)→浓缩(超滤、离子交换树脂、Akta、冷冻干燥)→切割→双层包装→消毒(г线)→成品。

1)前处理：将新鲜牛腱去除脂肪、筋膜后，4℃冷冻硬化后取出，再用手术刀刮除牛腱表面的残余筋膜，顺着牛腱纤维方向切成适当大小的薄片，称重，再用质量分数为0.1％的碳酸钠(CP)溶液浸泡4hr，用蒸馏水漂洗数次，用不锈钢丝网滤去水溶液，晾干备用。

2)胶原蛋白的提取：将上述预处理的牛腱放入三角烧瓶中，分别加入含不同酶质量配比的质量分数为0.3％乙酸(CP)溶液(pH＝2～3)适量，低温下控温缓慢搅拌3～5d，同时每隔一段时间用721型紫外分光光度计于540nm处测量酶水解的胶原蛋白吸光度，以吸光度作指标来分析最佳的酶加入量。然后用高速冷冻离心机离心，取上清溶液，即可得粗提胶原蛋白液。所述的酶是常用的蛋白酶(如胃蛋白酶、木瓜或无花果蛋白酶等常用型号的酶)。

具体而言：新鲜牛腱去除脂肪、筋膜后经4±2℃冷冻硬化后取出，再用手术刀刮除牛腱表面的残余筋膜，顺着牛腱纤维方向切成适当大小的薄片，再用质量分数为0.1％的碳酸钠(CP)溶液浸泡4hr，用蒸馏水漂洗数次，用不锈钢丝网滤去水溶液，晾干备用。

蛋白水解酶酶解时每隔一段时间用紫外分光光度计于540nm处测量酶水解的胶原蛋白吸光度，以吸光度作指标来分析最佳的酶加入量；

3)胶原蛋白的提纯：在粗提胶原蛋白溶液加入质量分数为1％的H₂O₂溶液混匀静置4h，用柠檬酸三钠溶液调节pH值5-6.5，离心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化钠，缓慢搅拌，4℃静置过夜保存，在此我们采用了氯化钠示差沉淀的方法，即运用不同的氯化钠的浓度对此蛋白液进行处理，(即在pH值4-6.的酸性条件下，NaCL的浓度为0.3mol/L。

然后取出盐析沉淀物用酸性溶液在4℃下浸泡24h，再将沉淀物装入透析袋中，用质量分数不等的乙酸溶液各透析1d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液2-3次，然后进行超滤浓缩，将浓缩液上阴离子交换树脂，在PH6.0，盐浓度为0.2mol/L进行提纯。经Akta分析表明，产品纯度可达到98.5％以上。最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水液。

浓缩时，用的是0.25-4M²的分子量在5-10KD的膜。以压差为驱动力的膜分离技术(属于超滤和纳滤的范畴)。选用不同孔径的不对称性微孔膜，按照截留分子量的大小，可分离生物大分子物质。溶质或悬浮物料按大小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。在操作过程中确保无相变化，不改变产品的性能和活性；以求适应胶原蛋白的分离要求。分离过程不添加任何化学药剂，无需加热，这也符合胶原的特性。在实验中将进口的压力在0.2MPA。切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)是防止浓差极化造成速度下降的最有效方法。TFF是指液体在泵的驱动下沿着与膜表面相切的方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过膜表面，将被膜截留的粒子和大分子冲走，避免它们在膜表面上堆积，造成膜堵塞和流速下降。在此，进口的压力、流速、流量等因素均会对分离的效果产生显著的影响。不同的流量在相同的时间间隔内形成的最大浓度比照图2。图2中黑线1代表最大的膜过滤，蓝线2代表最小的膜过滤，红线3代表中间的膜过滤。

进行阴离子交换树脂时，可选择在不同的离子浓度，不同的PH范围进行。控制蛋白的进料浓度在0.5g/L-5g/L。采用DEAE树脂。分别以pH值为6.0—8.0之间做出若干(如三至五个点)等分点，浓度为20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制，取氯化钠的浓度在0.2mol/L——0.8mol/L。用平衡好的DEAE树脂进行梯度分离。测定胶原蛋白的纯度以及其回收率，生产过程严格按照GMP的标准进行。

Claims

1、胶原蛋白的制备方法，其特征是步骤如下：1)原料前处理：将新鲜牛腱去除脂肪、筋膜，并经0.1±0.05％的碳酸钠(CP)溶液浸泡4±2h，用蒸馏水漂洗数次晾干；2)经预处理的牛腱加入蛋白水解酶，其质量配比为0.3±0.1wt％；并加入乙酸(CP)溶液(pH＝2～3)适量，在1-12℃条件下缓慢搅拌3～5d；然后用高速冷冻离心机离心，取上清溶液，粗提得胶原蛋白溶液；3)胶原蛋白的提纯：在粗提胶原蛋白溶液加入质量分数为1±0.5％的H₂O₂溶液混匀静置4±2h，用柠檬酸三钠溶液调节pH值到5±1，离心后，在剩余的溶液中加入一定量的氯化钠盐析，缓慢搅拌，4±2℃静置过夜保存，然后取出盐析沉淀物用酸性溶液在4±2℃下浸泡24±8h，再将沉淀物装入透析袋中，用乙酸溶液透析1±0.5d，再用蒸馏水透析3±1d，每天换透析液2-3次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水液。

2、根据权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是所述盐析沉淀采用氯化钠示差沉淀的方法，即运用不同的氯化钠的浓度对此蛋白液进行处理。

3、根据权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是乙酸溶液透析后进行超滤浓缩，将浓缩液上阴离子交换树脂，在PH6.0，盐浓度为0.2mol/L进行提纯。

4、根据权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是经Akta分析表明，产品纯度可达到98.5％以上，可溶的胶原蛋白是保持了完整的三螺旋结构使胶原蛋白。

5、根据权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是胶原蛋白的提取时酶解时在低温下控温缓慢搅拌3～5d，同时每隔一段时间用紫外分光光度计于540nm处测量酶水解的胶原蛋白吸光度，以吸光度作指标来分析最佳的酶加入量。