CN102586372A

CN102586372A - 一种鼠尾胶原蛋白的制备方法

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Publication number: CN102586372A
Application number: CN2012100070895A
Authority: CN
Inventors: 任海涛; 钟志勇; 唐小江; 邝少松; 刘科; 饶子亮; 严家荣; 郑佳琳; 王刚
Original assignee: GUANGDONG MEDICAL EXPERIMENTAL ANIMAL CENTER
Current assignee: GUANGDONG MEDICAL EXPERIMENTAL ANIMAL CENTER
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明涉及一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，采用酶法与酸法相混合的新型提取方案，采用不同盐浓度的溶液多次盐析与离心的方法在纯化步骤上大为简化。本发明所使用的制备方法可以从每条鼠尾提取干重为200mg的胶原蛋白，较传统提取的酸溶法每条鼠尾10mg相比可以提高20倍左右，避免了传统方法提取率低、纯化困难、破坏胶原蛋白生物活性等缺点和问题。获得的鼠尾胶原蛋白经过SDS-PAGE鉴定，获得了三条目的条带，与现有SIMGA公司的商业化鼠尾胶原蛋白进行了对比，图谱无差异。经过氨基酸含量分析，制备的鼠尾胶原蛋白质量高，纯度好。

Description

一种鼠尾胶原蛋白的制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种鼠尾胶原蛋白的制备方法。尤其涉及一种鼠尾胶原蛋白适合的工业化生产的制备方法。

【背景技术】

胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，胶原蛋白含有一种独有的氨基酸——羟脯氨酸(Hyp)，胶原蛋白与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑等密切相关，已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等领域，如医用胶囊、食用明胶、照相明胶、化妆品等。鼠尾胶原蛋白是胶原蛋白的一种，主要为I型胶原蛋白。I型胶原主要存在于真皮、腱、骨、牙本质。最普遍的以纤维形式形成胶原，由三股缠绕形成多肽链组。鼠尾胶原蛋白可用于包被细胞培养器皿，培养一些在普通细胞培养器皿中不易贴壁的细胞；也可以用于制备三维胶，模拟真实的生长环境，使细胞在三维环境中生长。目前，提取鼠尾胶原蛋白的研究并不多，主要采用的还是传统的方法，比如酸溶法、碱溶法、超声法、中性盐法、酶法等等，但是都有其缺点。其中酸溶法、碱溶法、超声法、中性盐法不仅存在提取得率低，还可能破坏胶原蛋白的三维立体结构。酶法应用较广，但是除去酶制剂需要酶抑制剂，且操作复杂，同时增加了后期分离纯化鼠尾胶原蛋白的难度。迄今为止，还没有针对鼠尾胶原蛋白进行过大规模制备的相关研究的报道。

【发明内容】

本发明的目的就是为了克服现有制备鼠尾胶原蛋白方法所存在的提取得率低、分离纯化工艺复杂、没有大规模生产的方法等缺点，提供一种工艺简单、提取率高、提取的产品纯度高的鼠尾胶原蛋白的制备方法。

本发明的制备方法包括如下步骤：

1、缓冲溶液的准备和配置：0.1-5mol/L NaCl溶液、0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液。

2、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与0-10℃下的0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状。

3、0-10℃下预处理4-36小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白。将处理过后的尾腱滤干水分，称重。以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液。

4、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小时加完。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状。酶解持续36-144小时。

5、将乳胶状溶液于0-10℃条件下离心10-40分钟，除去不呈现乳胶状的固化物。往乳胶溶液中以1∶0.5-1∶2的体积配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液。搅拌至胶状溶液成分混匀。

6、加入0.1-5mol/L NaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止。高速离心溶液20-50min。收集沉淀。将乳胶溶液以1∶0.5-1∶4的体积比的量加入0.1-5mol/L NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h。次日重复步骤6。

7、集中步骤6中收集到的沉淀。用0.01-2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1-5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白。高速离心溶液20-50min。收集沉淀。重复此步骤1-5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解。

8、将纯化完全的胶原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于万级分子量截留的透析袋中透析48-96h。每天换水2-8次。透析外液用双蒸水进行。

9、将透析完全的胶原蛋白溶液分装入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃条件下进行冷冻干燥48-144h。冻干产品即为鼠尾胶原蛋白冻干粉。

依照本发明专利使用的酸联合酶法提取工艺，每只鼠尾大约可以提取胶原蛋白200mg，与传统的酸溶法、碱溶法及中性盐法相比较(10mg)，提取率有了大幅度的提高。

本发明的鼠尾来自于成年各品系大鼠鼠尾(如ACI、BVF、F344、PA、M520、WAB、WAC、WKA、SD、RF、Wistar等品系)、各品系小鼠鼠尾等(C3H、CBA/N、C57BL/6、C57BL/10、C57L、DBA/2、A、AKR、BALB/c、RF、SWR等品系)。

为了保证制备的鼠尾胶原蛋白的质量，本发明涉及的鼠尾胶原蛋白的提取也可以来自于SPF级(无特定病原体)成年SD大鼠鼠尾。

前述步骤4中胃蛋白酶三次加入的时间和量分别是首次加入三分之一，后1-12小时后加入三分之一，12-36小时后加入剩余三分之一。

前述步骤4中胃蛋白酶的配比为1∶10000，酶解持续72小时。

前述步骤5中离心转速为1000-10000rpm/min，前述步骤6中高速离心转速为4000-12000rpm/min，前述步骤7中高速离心转速4000-12000rpm/min。

前述步骤8中，透析时，采用摇床，低速(1-5转/min)，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成。

本发明联合酸法提取的温和操作工艺及酶法操作的高效率，避开了使用单一提取方法所产生的提取率低、分离纯化困难等问题。联合使用此两种方法，并通过“分级盐析”、“微波萃取”等新工艺的方法简化了后期蛋白质分离纯化的工艺及操作流程。

本发明简化了提取工艺，每条大鼠鼠尾平均重5g，可以提取到干重为200mg的鼠尾胶原蛋白，提取率约为4％左右。较传统的方法提取率仅为0.2％，提取率提高了20倍以上。

本发明所提取的鼠尾胶原蛋白经过如下鉴定：(1)SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，其制备的鼠尾胶原蛋白以美国SIGMA公司的鼠尾胶原蛋白产品为对照，与现有SIMGA公司的商业化鼠尾胶原蛋白进行了对比，两者图谱无差异。从电泳结果上可以看出，制备的鼠尾胶原蛋白质量高，纯度好。其电泳结果一致。Maker检测，三条带的分子量分别为220KD，105KD，95KD。(2)样品经水解，经高压液相色谱检验(样品处理按GB/T 5009.124-2003水解，检测方法按JY/T 024-1996)，采用氨基酸分析仪，经广州市分析检测中心对本专利中制备的鼠尾胶原蛋白进行氨基酸含量分析表明，其含有①胶原蛋白特征氨基酸羟脯氨酸，含量约为8％左右；②其不含胱氨酸、色氨酸这两种氨基酸，与其自身特征相符；③甘氨酸含量接近总氨基酸含量的三分之一，与其自身特征相符。制备的鼠尾胶原蛋白质量高，纯度好。

【附图说明】

图1为本发明的SDS-PAGE电泳图，其中靠左边二条带为市售SIGMA公司鼠尾胶原蛋白的电泳带，第三、四条为实施例1的电泳带，第五、六条为实施例2的电泳带，靠右边二条带为实施例3的电泳带。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

【具体实施方式】

实施例1：鼠尾胶原蛋白的制备

本发明涉及的鼠尾胶原蛋白的提取来自于SPF级(无特定病原体)成年SD大鼠鼠尾。短颈处死大鼠。机械方法取下SD大鼠鼠尾。用医用剪刀抛开外部皮肤，取出整根裸露的大鼠尾。将大鼠尾骨分小段折断但不断开。用医用止血钳从鼠尾根部较粗的地方抽提鼠尾腱。本发明的鼠尾胶原蛋白提取包括以下步骤：

1、缓冲溶液的准备和配置：0.1-5mol/L NaCl溶液、0.01-0.2mol/LTris-HCl缓冲盐溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液。

2、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与4℃下的0.01-0.2mol/LTris-HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状。

3、0-10℃下预处理24小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白。将处理过后的尾腱滤干水分，称重。以每克鼠尾腱配置50mL，置于4℃下的0.5mol/L醋酸溶液。

4、以1∶10000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入(首次加入三分之一后1-12小时后加入三分之一，12-36小时后加入剩余三分之一)。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状。酶解持续72小时。

5、将乳胶状溶液于0-10℃条件下6000rpm/min离心30分钟，除去不呈现乳胶状的固化物。往乳胶溶液中以1∶0.5-1∶2的配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液。搅拌至胶状溶液成分混匀。

6、加入0.1-5mol/LNaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止。8000rpm/min高速离心溶液30min。收集沉淀。将乳胶溶液以1∶0.5-1∶4的量加入0.1-5mol/L NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h。次日重复步骤6。

7、集中步骤6中收集到的沉淀。用0.01-2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1-5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白。8000rpm/min高速离心溶液30min。收集沉淀。重复此步骤1-5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解。

8、将纯化完全的胶原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于万级分子量截留的透析袋中透析72h。每天换水2-8次。透析用双蒸水进行。采用摇床，低速(1-5转/min)，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成。

依照本发明专利使用的酸联合酶法提取工艺，每只鼠尾大约可以提取胶原蛋白200mg，与传统的酸溶法、减溶法及中性盐法相比较(10mg)，提取率有了大幅度的提高。

实施例2：将实施例1鼠尾胶原蛋白的制备工艺

将实施例1中步骤2的Tris-HCl缓冲盐溶液温度调整为0℃；步骤3的预处理时间调整为4小时，鼠尾腱置于0℃下的0.05mol/L醋酸溶液；步骤4胃蛋白酶配比为1∶1000，酶解持续36小时；步骤5乳胶状溶液于1000rpm/min离心40分钟；步骤6、7以4000rpm/min转速高速离心乳胶状溶液50min；步骤8中透析袋中透析48h，采用摇床，低速(1-5转/min)，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成，其余同实施例1。

实施例3：将实施例1鼠尾胶原蛋白的制备工艺

将实施例1中步骤2的Tris-HCl缓冲盐溶液温度调整为10℃；步骤3的预处理时间调整为36小时，鼠尾腱置于10℃下的2mol/L醋酸溶液；步骤4胃蛋白酶配比为1∶50000，酶解持续144小时；步骤5乳胶状溶液于8000rpm/min离心10分钟；步骤6、7以12000rpm/min转速高速离心乳胶状溶液20min；步骤8中透析袋中透析96h，采用摇床，低速(1-5转/min)，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成，其余同实施例1。

实施例4：本发明鼠尾胶原蛋白的重量检测、SDS-PAGE电泳试验和氨基酸含量分析

以大鼠鼠尾为原料，每条鼠尾平均重5g，使用本专利的方法可以提取到干重为200mg的鼠尾胶原蛋白，提取率约为4％左右。较传统的方法提取率仅为0.2％左右提高20倍以上。实施例1、2、3样品经水解，经高压液相色谱检验(样品处理按GB/T 5009.124-2003水解，检测方法按JY/T 024-1996)，采用氨基酸分析仪，经广州市分析检测中心对本专利中制备的鼠尾胶原蛋白进行氨基酸含量分析，测定鼠尾胶原蛋白的羟脯氨酸及其他氨基酸的含量，结果如表1；采用5％浓缩胶浓度，8％分离胶浓度的SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，其制备的鼠尾胶原蛋白以美国SIGMA公司的鼠尾胶原蛋白产品为对照，结果见图1。与现有SIMGA公司的商业化鼠尾胶原蛋白进行了对比，两者图谱无差异。从电泳结果上可以看出，制备的鼠尾胶原蛋白质量高，纯度好。胶原蛋白纯度已达SDS-PAGE纯度。Maker检测，三条带的分子量分别为220KD，105KD，95KD。

表1氨基酸含量分析表

Claims

1.一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)、缓冲溶液的准备和配置：0.1-5mol/L NaCl溶液、0.01-0.2mol/LTris-HCl缓冲盐溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液；

2)、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与0-10℃下的0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状；

3)、0-10℃下预处理4-36小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白；将处理过后的尾腱滤干水分，称重；以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液；

4)、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小时加完。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状；酶解持续36-144小时；

5)、将乳胶状溶液于0-10℃条件下离心10-40分钟，除去不呈现乳胶状的固化物；往乳胶溶液中以1∶0.5-1∶2的体积配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液；搅拌至胶状溶液成分混匀；

6)、加入0.1-5mol/L NaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止；高速离心溶液20-50min；收集沉淀；将乳胶溶液以1∶0.5-1∶4的体积比的量加入0.1-5mol/L NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h；次日重复步骤6；

7)、集中步骤6中收集到的沉淀，用0.01-2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1-5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白；高速离心溶液20-50min；收集沉淀；重复此步骤1-5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解；

8)、将纯化完全的胶原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解；灌注于万级分子量截留的透析袋中透析48-96h；每天换水2-8次；透析外液用双蒸水进行；

9)、将透析完全的胶原蛋白溶液分装入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃条件下进行冷冻干燥48-144h，冻干产品即为鼠尾胶原蛋白冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于鼠尾来自于成年各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。

3.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤4中胃蛋白酶三次加入的时间和量分别是首次加入三分之一，后1-12小时后加入三分之一，12-36小时后加入剩余三分之一。

4.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤4中胃蛋白酶的配比为1∶10000，酶解持续72小时。

5.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤5中离心转速为1000-10000rpm/min，步骤6中高速离心转速为4000-12000rpm/min，步骤7中高速离心转速4000-12000rpm/min。

6.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤8中，透析时，采用摇床低速转动，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成。

7.根据权利要求1或2所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于鼠尾来自于SPF级成年SD大鼠鼠尾。