CN104788559A - 一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，采用酸法与酶法相结合的工艺，保持恒低温无菌的环境，利用同样浓度的盐溶液进行两次盐析与离心，简化了提纯步骤。所用酸为低浓度酸溶液，并采用柠檬酸替代醋酸进行提纯。从提取原料到样品生成过程中，进行多次真空冷冻干燥，并经进一步处理获得含水率在3％以下的胶原蛋白微粉；最后由灭菌、无菌包装，成品胶原蛋白粉末的纯度在98％以上。本发明获得的胶原蛋白降低了蛋白的免疫原性，提高了产率和生物相容性，降低了成本，适用于生物医用材料，所得到的胶原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多，分布最广的蛋白质。胶原蛋白有着独特的三股螺旋结构，并含有独特的羟脯氨酸，具有良好的生物相容性和可生物降解性。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。鼠尾胶原蛋白是I型胶原蛋白，I型胶原蛋白广泛存在于动物的肌腱、皮肤、骨等组织中。I型胶原蛋白具有自组装成纤维特性，可用于细胞培养及制作组织工程中的三维支架材料，使细胞在接近真实环境中生长。目前对于胶原的提取方法依然停留在传统阶段，如酸溶法、碱溶法、酶法、超声法等，各有优缺点。传统方法不但提取率低，还容易破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，降低其生物功能性。提取的胶原蛋白要用于生物医药方面，必须考虑到无菌性、生物相容性、免疫原性等问题。针对这些问题，至今未有生物医用鼠尾胶原提取纯化工艺的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的为提供一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法。
本发明的目的通过如下技术实现：一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)将无组织纤维、脂肪和多糖残留的鼠尾腱，真空冷冻干燥备用；
(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200～400目；
(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为1克∶100mL～1克∶120mL，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；
(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为50∶1～100∶1，在4℃，48～74小时酶解，期间间歇性搅拌；
(5)将黏稠的胶体溶液进行高速冷冻离心处理，收集上清液；在冰水浴中，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；
(6)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，调节pH＝6.5，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；
(7)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，调节pH＝6.5；溶液依次通过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)将脱盐后的胶原蛋白溶液，-40至-20℃预冻2～4小时，然后真空冷冻干燥，冻干产品经进一步处理得到含水率在3％以下的胶原蛋白微粉，灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末。
本发明还据有如下技术特征：
1、如上所述步骤(3)中醋酸溶液浓度为0.04～0.1mol/L，溶胀1～2小时。
2、如上所述步骤(4)中胃蛋白酶的酶活力1∶10000。
3、如上所述步骤(4)(5)和(6)中高速冷冻离心处理，温度为4℃，转速为8000～15000r/min，离心时间为15～30分钟。
4、如上所述步骤(7)中依次通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂。
5、如上所述步骤(7)进行脱盐处理或用透析袋动态透析72小时，用硝酸银检测无沉淀析出，透析完成。
本发明所提供的胶原蛋白提取方法与现有技术相比，具有以下优点：
(1)、本发明从原料处理、提取过程、产品生成保证了试剂药品和操作环境无菌，从而确保了提取的生物医用胶原蛋白无菌无毒。
(2)、本发明中采用控制原料预冻，真空冷冻干燥的方法可以保证原料的长期贮存，适于工业化生产。两次冷冻干燥可以降低生物医用材料的抗原性，大大提升应用安全性。
(3)、本发明中所用的醋酸浓度低于传统提取浓度，保证了胶原蛋白在酸性环境中三股螺旋结构的稳定，从而保证胶原蛋白的生物功能性。
(4)、本发明在提取后换用柠檬酸代替醋酸进行样品的纯化，比传统方法提取的胶原蛋白，提高了其生物相容性，更适用于生物医用材料。
(5)、本发明简化了生产工艺，结合多种酸溶法、酶解法提升了成品的提取率。提取率达到75～80％，纯度达到98％以上，提取率有了显著的提高，可用于工业化生产。
(6)、本发明提取的生物医用鼠尾胶原蛋白可制成注射胶原，可取代常规整容中的硅胶等填充物，对疤痕组织进行填充性修复。对现有血管支架材料进行胶原修饰，可确保移植血管完全无血液漏出血管壁，进一步促进细胞和其它结缔组织成分在移植血管表面生长增殖，充当移植修复的临时支架。胶原精制而成的人工角膜，为盲人提供了更大希望。胶原缝线吸收好，是手术中的新材料。
附图说明
图1为胶原蛋白的傅里叶红外光谱分析。
图2为胶原蛋白的紫外光光谱分析。
图3为胶原蛋白的圆二色谱分析。
图4为胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析；
其中，a为本发明所获得的胶原蛋白，b为索莱宝蛋白marker。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
生物医用鼠尾胶原蛋白的提取
一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，步骤如下：
(1)取新鲜鼠尾1kg，置于1∶1000新洁尔灭液内浸泡10min～15min，取出后用生理盐水反复冲洗5次以上；分离鼠尾腱，去除鼠尾腱残留的组织纤维等。NH4Cl-生理盐水溶液浸泡24h，4℃保持低速搅拌24h，中间换两次液去除残留的脂肪和多糖。去离子水冲洗5次，-20℃预冻4h，真空冷冻干燥备用；所述鼠尾来自于成年海狸鼠、各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。
(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200～400目；
(3)在冰水浴中将鼠尾腱在0.06mol/L的醋酸溶液中溶胀2小时，期间不断搅拌，防止冻结成块；
(4)、取14克胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，酶活力1∶10000，在4℃，74h酶解，期间间歇性搅拌；
(5)将黏稠的胶体溶液用高速冷冻离心机4℃、12000r/min、离心30分钟，收集上清液。在冰水浴中，用的4mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、12000r/min、离心30分钟，收集沉淀；
(6)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5，用3mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、12000r/min、离心30分钟，收集沉淀；
(7)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5；溶液依次通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂，进行脱盐处理。
(8)、将脱盐后的胶原蛋白溶液，-40℃预冻2小时，进而在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冻干产品经进一步处理可得到胶原蛋白微粉(含水率在3％以下)，钴60辐照灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末，纯度达到98％以上。
实施例2
一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，步骤如下：
(1)、取新鲜鼠尾1kg，置于1∶1000新洁尔灭液内浸泡10min～15min，取出后用生理盐水反复冲洗5次以上；分离鼠尾腱，去除鼠尾腱残留的组织纤维等。NH4Cl-生理盐水溶液浸泡24h，4℃保持低速搅拌24h，中间换两次液去除残留的脂肪和多糖。去离子水冲洗5次，-40℃预冻2h，真空冷冻干燥备用；
(2)、冻干鼠尾经低温冻干粉碎至200目；
(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为1克∶100mL，醋酸溶液浓度为0.04mol/L，溶胀2小时，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；
(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为50∶1，在4℃，胃蛋白酶的酶活力1∶10000，48小时酶解，期间间歇性搅拌；
(5)、将黏稠的胶体溶液用高速冷冻离心机4℃、8000r/min、离心30分钟，收集上清液。在冰水浴中，用的6mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、8000r/min、离心30分钟，收集沉淀；
(6)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5，用3mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、8000r/min、离心30分钟，收集沉淀；
(7)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5；溶液用透析袋动态透析72小时，用硝酸银检测无沉淀析出，透析完成。
(8)、将脱盐后的胶原蛋白溶液，-20℃预冻4小时，进而在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冻干产品经进一步处理可得到胶原蛋白微粉(含水率在3％以下)，钴60辐照灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末，纯度达到98％以上。
实施例3
一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，步骤如下：
(1)、取新鲜鼠尾1kg，置于1∶1000新洁尔灭液内浸泡10min～15min，取出后用生理盐水反复冲洗5次以上；分离鼠尾腱，去除鼠尾腱残留的组织纤维等。NH4Cl-生理盐水溶液浸泡24h，4℃保持低速搅拌24h，中间换两次液去除残留的脂肪和多糖。去离子水冲洗5次，-40℃预冻2h，真空冷冻干燥备用；
(2)、冻干鼠尾经低温冻干粉碎至400目；
(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为1克∶120mL，醋酸溶液浓度为0.1mol/L，溶胀1小时，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；
(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为100∶1，胃蛋白酶的酶活力1∶10000，在4℃，74小时酶解，期间间歇性搅拌；
(5)、将黏稠的胶体溶液用高速冷冻离心机4℃、15000r/min、离心15分钟，收集上清液。在冰水浴中，用的6mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、15000r/min、离心15分钟，收集沉淀；
(6)、用0.03mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5，用3mol/L的NaCl溶液盐析，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4℃、8000r/min、离心30分钟，收集沉淀；
(7)、用0.03mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH＝6.5；溶液用透析袋动态透析72小时，用硝酸银检测无沉淀析出，透析完成。
(8)、将脱盐后的胶原蛋白溶液，-20℃预冻4小时，进而在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冻干产品经进一步处理可得到胶原蛋白微粉(含水率在3％以下)，钴60辐照灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末，纯度达到98％以上。
实施例4
对获得的鼠尾胶原蛋白进行蛋白特性的分析
选择实施例1获得的胶原蛋白进行蛋白特性的分析。
(1)、傅里叶红外光谱分析
对实施例1获得的胶原蛋白进行傅里叶红外光谱分析，结果如图1所示。从图中可以看出，胶原蛋白在3409cm-1有一个强而宽的吸收峰，该峰对应于胶原蛋白中N-H和O-H的振动。胶原蛋白在1700～1200cm-1之间，分别出现了三个吸收峰，它们是蛋白质的酰胺I(1655cm-1)，酰胺II(1550cm-1)，酰胺III(1234cm-1)的吸收带，这是蛋白质在红外光谱中的特征吸收峰。在1450～1200cm-1范围内的吸收峰与胶原蛋白的三股螺旋结构密切相关，其中1240cm-1与1450cm-1附近的峰值比可反映胶原蛋白的结构特征。有文献指出，具备完整三螺旋结构的胶原蛋白的比值约为1.013，本研究中所用胶原蛋白在室温时的比值为1.015，说明胶原蛋白的三股螺旋结构保持完整。
(2)、紫外光光谱分析
蛋白质分子通常具有3个明显不同的紫外吸收区域：①在250～280nm处有一峰，来源于芳香族残基；②在210～250nm有吸收，是由于多种因素，如芳香族和其他残基的吸收，某些氢键的吸收或与其他构象和螺旋有关的相互作用；③210nm以下有吸收是由于肽键及许多构象因素引起的。对实施例1获得的胶原蛋白进行紫外光光谱分析，结果如图2所示。胶原蛋白在280nm处没有吸收峰，表明胶原蛋白几乎不含Trp和Tyr等具有共轭双键的氨基酸，这符合胶原氨基酸组成的基本特征。胶原蛋白的最大紫外吸收波长在232nm附近，形成一个较陡峭的峰，与文献报道的I型胶原特征相符。
(3)、圆二色谱分析
胶原蛋白是一类光学活性蛋白，具有类似聚脯氨酸-II型的螺旋构象，从而圆二色谱特征是在190～200nm左右有一个负吸收峰，在210～230nm范围内有一个弱的正吸收峰。对实施例1获得的胶原蛋白进行圆二色谱分析，结果如图3所示。图中负吸收峰的位置为196nm，正吸收峰为220nm，说明其属于典型的三股螺旋构象特征。图中将胶原蛋白与明胶进行了表征区别。
(4)、SDS-PAGE凝胶电泳分析
采用5％的浓缩胶浓度和10％的分离胶浓度的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定实施例1获得的胶原蛋白，结果如图4所示。由图可知，将胶原蛋白与标样蛋白Maker比较，可以看出制备的生物医用鼠尾胶原纯度高，质量好。一条谱带位于200KDa处，两条分布在100KDa附近，可估算提取的生物医用鼠尾胶原蛋白分子量为300KDa，符合文献报道。
依照本发明专利的提取工艺，结合多种酸溶法、酶解法，成品的提取率大幅度提高。低温真空冷冻干燥有效的降低了产品的抗原性，使得产品能更好的应用于医用产品行业。
Claims (6)
1.一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将无组织纤维、脂肪和多糖残留的鼠尾腱，真空冷冻干燥备用；
(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200～400目；
(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为1克∶100mL～1克∶120mL，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；
(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为50∶1～100∶1，在4℃，48～74小时酶解，期间间歇性搅拌；
(5)将黏稠的胶体溶液进行高速冷冻离心处理，收集上清液；在冰水浴中，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；
(6)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，调节pH＝6.5，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；
(7)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，调节pH＝6.5；溶液依次通过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂进行脱盐处理；
(8)将脱盐后的胶原蛋白溶液，-40至-20℃预冻2～4小时，然后真空冷冻干燥，冻干产品经进一步处理得到含水率在3％以下的胶原蛋白微粉，灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末。
2.根据权利要求1所述的一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(3)中醋酸溶液浓度为0.04～0.1mol/L，溶胀1-2小时。
3.根据权利要求1所述的一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(4)中胃蛋白酶的酶活力1∶10000。
4.根据权利要求1所述的一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(4)(5)和(6)中高速冷冻离心处理，温度为4℃，转速为8000～15000r/min，离心时间为15～30分钟。
5.根据权利要求1所述的一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(7)中依次通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂进行脱盐处理。
6.根据权利要求1所述的一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(7)进行脱盐处理或用透析袋动态透析72小时，用硝酸银检测无沉淀析出，透析完成。
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