CN107261213A - 一种活性水凝胶及其制备方法和在手术创伤修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种活性水凝胶及其制备方法，包括：以剔除微血管和肌肉组织的大鼠腹股沟部脂肪组织为原料，制备脂肪间充质干细胞条件培养基；以壳聚糖和透明质酸为原料，在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖和透明质酸发生交联反应，制备壳聚糖‑透明质酸复合凝胶；将所述脂肪间充质干细胞条件培养基和所述壳聚糖‑透明质酸复合凝胶充分混匀，使所述脂肪间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在所述壳聚糖‑透明质酸复合凝胶上，再加入I型胶原并混匀，得到活性水凝胶。本发明提供的活性水凝胶可用于修复手术创伤中皮肤和肌肉的损伤，大大提高了皮肤和肌肉的再生效果，活性水凝胶的使用过程方便、安全性高、制备方法简单，易于产业化。

Description

一种活性水凝胶及其制备方法和在手术创伤修复中的应用
技术领域
本发明涉及破损的肌肉和皮肤修复技术领域，更具体地说，本发明涉及一种活性水凝胶，本发明还涉及一种活性水凝胶的制备方法，本发明还涉及一种活性水凝胶在手术创伤修复中的应用。
背景技术
手术创伤是经过手术后引起人体组织或器官的破坏。手术创伤可能会导致骨骼肌的大量损失和天然组织结构破坏。对于肌肉的损失，目前的疗法，主要包括手术肌瓣移植，物理治疗和康复，但无法有效恢复功能。并且供体组织的限制和排异反应影响了肌瓣手术的成功率和预后。感染、坏死、难愈合性伤口也是手术创伤易引起的并发症。难愈合性伤口的常规疗法包括敷料，压力卸载，局部和全身抗生素，高压氧和局部应用生长因子。超过一年的无愈合伤口的患者中，有50％的患者对目前的治疗方法并没有反应。对于深入真皮的伤口，可以应用其他策略，如皮肤自动移植和皮肤替代品。然而，由于供体组织的可用性有限，皮肤自动移植可能是具有挑战性的。皮肤替代品受到高成本，功效不足以及无法重建皮肤附属物的限制。对治疗非愈合性伤口的新策略的需求不断增长。因此，急需一种优化的治疗方法来降低手术创伤带来的肌肉和皮肤损伤。
最近，干细胞的治疗为促进皮肤和骨骼肌再生提供了一种有前景的治疗方法。脂肪干细胞(ASCs)已被广泛应用于再生医学。人脂肪间充质干细胞(hASCs)在与肌原性分化培养基或与成肌细胞共培养时表现出肌原性转换，表明hASCs在体外具有肌原性潜能(H.Mizuno,P.A.Zuk,M.Zhu,H.P.Lorenz,P.Benhaim and M.H.Hedrick,"Myogenicdifferentiation by human processed lipoaspirate cells,"Plast Reconstr Surg,vol.109,no.1,pp.199-209；discussion 210-191,2002.S.V.Forcales,"Potential ofadipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies,"Front AgingNeurosci,vol.7,pp.123,2015.)。此外，将ASC局部注射到杜氏肌营养不良小鼠体内，改善了小鼠肌肉再生，同时通过细胞融合和下调TGF-β降低了纤维化(Y.Zhang,Y.Zhu,Y.Li,J.Cao,H.Zhang,M.Chen,L.Wang and C.Zhang,"Long-term engraftment of myogenicprogenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration indystrophic mice,"Hum Mol Genet,vol.24,no.21,pp.6029-6040,2015.C.H.Pinheiro,J.C.de Queiroz,L.Guimaraes-Ferreira,K.F.Vitzel,R.T.Nachbar,L.G.de Sousa,A.L.de Souza-Jr,M.T.Nunes and R.Curi,"Local injections of adipose-derivedmesenchymal stem cells modulate inflammation and increase angiogenesisameliorating the dystrophic phenotype in dystrophin-deficient skeletalmuscle,"Stem Cell Rev,vol.8,no.2,pp.363-374,2012.)。也有研究发现移植脐带间充质干细胞有助于修复皮肤损伤(Zhang Y,Hao H,Liu J,et al.Repair and regeneration ofskin injury by transplanting microparticles mixed with Wharton's jelly andMSCs from the human umbilical cord.[J].International Journal of LowerExtremity Wounds,2012,11(4):264-270.)。然而，单纯的干细胞注射不足以在大量肌肉损失创伤中促进肌肉皮肤再生和功能恢复。
水凝胶是在水中膨胀并保持大量水分而又不溶解的聚合物，高分子水凝胶是由高分子骨架、水、交联剂组成的三维体系，具有复杂的空间网络结构。智能水凝胶对外界条件的刺激能产生相应体积变化，在药物释放系统，仿生材料、化学阀、生物医学、人造肌肉及酶改性等方面有着广阔的应用前景。壳聚糖来源广泛、容易制备，是自然界中唯一的亲水性杨离子聚合物，具有很好的成膜性和吸湿性，还具有生物相容性好、抗菌性和可生物降解等特点，用其制备的水凝胶具有许多独特性，但是壳聚糖凝胶脆性较大、黏弹性较弱、力学性能不足并且持水性能较弱。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供了一种活性水凝胶，其通过在脂肪间充质干细胞条件培养基加入壳聚糖和透明质酸交联形成的复合凝胶，并混合均匀后加入I型胶原以制成活性水凝胶，这种活性水凝胶可用于对手术创伤造成的皮肤和肌肉破损的修复，大大提高了皮肤和肌肉再生的效果。
本发明还有一个目的是提供了一种活性水凝胶的制备方法，具有方法简单，易于质量控制和易于产业化的优点。
本发明还有一个目的是使用活性水凝胶修复手术创伤造成的肌肉和皮肤的破损，具有使用过程简单和安全性高的优点。
为了实现上述目的，本发明提供了一种活性水凝胶，包括以下组分：
脂肪间充质干细胞条件培养基、以壳聚糖和透明质酸为原料并通过交联反应制备的壳聚糖-透明质酸复合凝胶以及I型胶原。
本发明还提供了一种活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、以剔除微血管和肌肉组织的大鼠腹股沟部脂肪组织为原料，培养脂肪间充质干细胞，进而制备脂肪间充质干细胞条件培养基；
步骤二、以壳聚糖和透明质酸为原料，在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖和透明质酸发生交联反应，制备壳聚糖-透明质酸复合凝胶；
步骤三、将所述脂肪间充质干细胞条件培养基和所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶充分混匀，使所述脂肪间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶上，再加入I型胶原并混匀，得到活性水凝胶。
优选的是，其中，所述步骤二中，所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶的制备过程为：
将壳聚糖和透明质酸溶于去离子水中，搅拌均匀后缓慢加入质量分数为2％的乙酸，使所述壳聚糖充分溶解在水中，得到混合液；
向所述混合液中加入交联剂戊二醛，搅拌均匀后在室温下静置24小时，即得到壳聚糖-透明质酸复合凝胶。
优选的是，其中，所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶的制备过程为：
将15g/L的壳聚糖和1g/L的透明质酸溶于去离子水中，搅拌均匀后缓慢加入质量分数为2％的乙酸，使所述壳聚糖充分溶解在水中，得到混合液；
向所述混合液中加入4.8g/L的交联剂戊二醛，搅拌均匀后在室温下静置24小时，即得到壳聚糖-透明质酸复合凝胶
优选的是，其中，所述步骤三中，将所述脂肪间充质干细胞条件培养基和所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶充分混匀，使所述间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶上，再加入2mg/mL的I型胶原并混匀，得到活性水凝胶。
优选的是，其中，所述步骤一中，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备过程为：
制备脂肪间充质干细胞：对剔除微血管和肌肉组织的大鼠腹股沟部脂肪组织进行无菌洗涤、剪碎以及使用无菌消化液消化大鼠腹股沟部脂肪组织中的组织块，并收集滤液；
将所述滤液与含有胎牛血清的低糖DMEM培养基等量中和，离心后弃掉上清液，得到沉淀物，并使用无血清培养基对其进行重悬后置于培养瓶中进行培养，当间充质干细胞生长至一定密度时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化间质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养；
选择第三代培养的间充质干细胞，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80％时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，得到脂肪间充质干细胞；
制备脂肪间充质干细胞条件培养基：将脂肪间充质干细胞在培养瓶中培养到50-60％融合，收集条件培养基，将条件培养基在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，使用袋式过滤器并在一定条件下透析，将透析后的条件培养基浓缩20倍，制得脂肪间充质干细胞条件培养基。
优选的是，其中，所述透析为使用7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000和4℃下对条件培养基进行透析。
本发明还提供了活性水凝胶的应用，其用于修复手术创伤引起的肌肉和皮肤缺损。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明所述的活性水凝胶能够修复手术创伤造成的皮肤和肌肉破损，大大提高了皮肤和肌肉的再生效果。
2、本发明所述的活性水凝胶的制备过程简单、易于质量控制，易于产业化。
3、本发明所述的活性水凝胶的使用过程方便、并且使用的安全性高。
4、本发明所述的活性水凝胶中的壳聚糖-透明质酸复合凝胶具有较好的机械强度、弹性和持水性能从而为活性水凝胶在手术创伤中的应用奠定了基础。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为使用H&E染色显示本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对缺损区域的肌肉样品的修复能力的照片；
图2为分别使用Masson Trichrome染色和Sirius Red染色显示本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对缺损区域的肌肉样品的修复能力的照片；
图3为使用qRT-PCR检测本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对缺损区域的肌肉样品修复5天后的炎症、血管发生及肌肉再生的mRNA表达图谱；
图4为使用qRT-PCR检测本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对缺损区域的肌肉样品修复2周后的炎症、血管发生及肌肉再生的mRNA表达图谱；
图5为以α-SMA为标记物使用IF染色显示本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对缺损区域的肌肉样品处的血管生成的照片；
图6为使用Western blot检测本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对破损区域的肌肉样品修复过程中的各种因子的表达量的图谱；
图7为使用HE染色切片显示本发明所述的活性水凝胶和未处理水凝胶对破损区域的肌肉样品的修复能力的照片。
具体实施方式
下面结合附图以及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供了一种活性水凝胶，其通过将脂肪间充质干细胞条件培养基加入壳聚糖-透明质酸复合凝胶，混合均匀后加入I型胶原而制得的，这种活性水凝胶用来修复手术创伤引起的肌肉和皮肤缺损。
以下将详细介绍活性水凝胶的制备过程：
一、脂肪间充质干细胞条件培养基的制备：通过制备脂肪间充质干细胞制备脂肪间充质干细胞条件培养基；
1、脂肪间充质干细胞的制备：
按照常规方法分离重60g-80g大鼠腹股沟部脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1立方毫米以下的糊状，添加无菌消化液(含有0.1％胶原酶Ⅰ型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM培养基)，37℃水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净；200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基等量中和，1500rpm离心10min，弃去上清液；以1×106个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪间充质干细胞，并接种于培养瓶中，37℃、体积分数为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪间充质干细胞生长至接近80％融合时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化脂肪间充质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养。脂肪间充质干细胞融合至不超过80％，1000rpm离心5min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬脂肪间充质干细胞，计数，按照1传1-1.5接种10cm培养皿。脂肪间充质干细胞培养融合70％左右时如上述方法传代培养。
选择第三代培养的脂肪间充质干细胞，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80％时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，采用细胞冻存液(90％胎牛血清和10％二甲亚砜(DMSO))重悬脂肪间充质干细胞，充分混匀，每管1mL分装于冻存管密封。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐保存。
脂肪间充质干细胞复苏的步骤为：取出脂肪间充质干细胞冻存管，立即浸入37℃温水中溶解；取适量无血清培养基混悬细胞并离心，弃去上清液；细胞重悬于无血清培养基中，并接种于培养皿中，于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。
2、脂肪间充质干细胞条件培养基的制备：
第3代脂肪间充质干细胞按照上述方法在T75培养瓶中培养到50-60％融合，收集条件培养基，将条件培养基在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，用一个7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000，4℃下透析，把条件培养基浓缩20倍，制得脂肪间充质干细胞条件培养基。
二、活性水凝胶的制备：
将15g/L的壳聚糖和1g/L的透明质酸溶于去离子水中(pH值为7-7.8)，搅拌均匀后缓慢加入质量分数为2％的乙酸，使壳聚糖充分溶解，之后加入4.8g/L交联剂戊二醛，搅拌均匀后在室温条件(25℃)下静置24h，得到壳聚糖-透明质酸复合凝胶。加入2mg/mL之前制得的脂肪间充质干细胞条件培养基，充分混均，使得脂肪间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在壳聚糖-透明质酸复合凝胶上。再加入2mg/mL I型胶原混均，即得到活性水凝胶(Hyd-CM)。
上述制备方法制备的活性水凝胶用于修复损伤的肌肉和皮肤，实验过程为：
SD大鼠处理：在无菌条件下，对SD大鼠皮肤进行纵向切口，用解剖刀在SD大鼠右侧小腿上肌肉的三分之一处产生约10×5×3mm(长×宽×深)的手术缺损。用简单的Vicryl缝合线缝合伤口，将活性水凝胶(Hyd-CM)和胶原水凝胶移植到创面。切除的缺损肌肉重量近似于总肌肉的20％。当活性水凝胶(Hyd-CM)和胶原水凝胶在pH7下成形时，将它们小心地移植到缺损的胫骨前肌，接着缝合皮肤。
实验结果：
(a)、活性水凝胶(Hyd-CM)能够促进血管生成和肌原纤维促进肌肉再生，同时减弱胶原和脂肪沉积：
将66只具有VML损伤的雄性SD大鼠随机分为2组，分别未处理水凝胶组(Hydrogel)和活性水凝胶组。获取缺损区域的肌肉样品，在5天，1周，2周，4周和8周对SD大鼠的损伤处进行H&E，Masson Trichrome和Sirius Red染色。图1所示的H&E染色显示炎症仍然存在1周，在4周和8周时观察到持续的肌肉再生，而未处理水凝胶组显示有积累的脂肪形成，这将阻碍肌肉修复。如图2所示，第5天的Sirius Red染色显示活性水凝胶组胶原蛋白沉积总量显著下降。如图2所示，8周的Masson Trichrome染色显示未处理水凝胶组比活性水凝胶组有更强烈的蓝色染色的胶原蛋白沉积。如图2所示，2周的激光多普勒测试表明，活性水凝胶组中，血流恢复明显升高，而损伤后2周的未处理水凝胶组无明显改善。
(b)、活性水凝胶(Hyd-CM)改善肌肉再生过程中的炎症和血管再生
如图3和图4所示，qRT-PCR检测5天和2周时的炎症，血管发生以及肌肉再生相关的mRNA表达。结果显示，在活性水凝胶组，促炎白细胞介素如IL1β，TNF-α和坏死因子如SIRT和PGC-1α显著降低，而抗炎白细胞介素(如IL4和IL10)升高。受伤部位的巨噬细胞在肌肉修复和再生中至关重要。活性水凝胶组的CD68和MCP-1表达高于水凝胶组，且Arg I，CD206和CD163升高，iNOS降低。该结果表明，活性水凝胶组中M2型巨噬细胞在伤口部位表达更高。qRT-PCR结果表明，eMHC和CCR7的表达量比未处理水凝胶组高得多；肌原纤维分化因子，如MyoD，Dystrophin和CTGF均在5天和2周升高；和其他修复相关因素，如纤维调节素(FMOD)，肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)在5天和2周时升高。
如图5所示，损伤后2周血管标志物α-SMA的IF染色显示，与未处理水凝胶组相比，活性水凝胶组血管生成明显升高。如图6所示，用Western blot检测各种因子的表达量，通过GAPDH的倍数来分析相对蛋白的表达，发现在活性水凝胶组中，α-SMA表达高于未处理水凝胶组；活性水凝胶组的Desmin(肌腱线蛋白)，HGF(肝细胞生长因子)，Col I(I型胶原纤维)和FMOD(纤调蛋白)表达增加；肌源性相关蛋白Myogenin，MyoD在Hyd-CM组上调；同时，在肌肉修复和再生过程中，pAKT/AKT比值升高。上述结果表明，rASCs-水凝胶移植到受损肌肉处可以通过调节一系列细胞因子和生长因子表达而增强巨噬细胞M2型转换，改善肌肉修复和重塑并促进血管生成。
(c)、活性水凝胶(Hyd-CM)促进皮肤愈合
如图7的HE染色切片所示，在受伤1周、4周和8周后，活性水凝胶治疗组SD大鼠伤口愈合率分别为25.9％，51.6.3％和91.5％。在未处理水凝胶组中，伤口愈合律为20.1％，38.7％和76.3％。与未处理水凝胶组相比，活性水凝胶组愈合率更高，治疗效果明显增强。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节与这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种活性水凝胶，其特征在于，包括以下组分：
脂肪间充质干细胞条件培养基、以壳聚糖和透明质酸为原料并通过交联反应制备的壳聚糖-透明质酸复合凝胶以及I型胶原。
2.一种制备根据权利要求1所述的活性水凝胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以剔除微血管和肌肉组织的大鼠腹股沟部脂肪组织为原料，培养脂肪间充质干细胞，进而制备脂肪间充质干细胞条件培养基；
步骤二、以壳聚糖和透明质酸为原料，在交联剂戊二醛的作用下，壳聚糖和透明质酸发生交联反应，制备壳聚糖-透明质酸复合凝胶；
步骤三、将所述脂肪间充质干细胞条件培养基和所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶充分混匀，使所述脂肪间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶上，再加入I型胶原并混匀，得到活性水凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶的制备过程为：
将壳聚糖和透明质酸溶于去离子水中，搅拌均匀后缓慢加入质量分数为2％的乙酸，使所述壳聚糖充分溶解在水中，得到混合液；
向所述混合液中加入交联剂戊二醛，搅拌均匀后在室温下静置，即得到壳聚糖-透明质酸复合凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶的制备过程为：
将15g/L的壳聚糖和1g/L的透明质酸溶于去离子水中，搅拌均匀后缓慢加入质量分数为2％的乙酸，使所述壳聚糖充分溶解在水中，得到混合液；
向所述混合液中加入4.8g/L的交联剂戊二醛，搅拌均匀后在室温下静置24小时，即得到壳聚糖-透明质酸复合凝胶。
5.根据权利要求4所述的一种活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，将所述脂肪间充质干细胞条件培养基和所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶充分混匀，使所述脂肪间充质干细胞条件培养基的活性因子粘附在所述壳聚糖-透明质酸复合凝胶上，再加入2mg/mL的I型胶原并混匀，得到活性水凝胶。
6.根据权利要求2所述的一种活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述脂肪间充质干细胞条件培养基的制备过程为：
制备脂肪间充质干细胞：对剔除微血管和肌肉组织的大鼠腹股沟部脂肪组织进行无菌洗涤、剪碎以及使用无菌消化液消化大鼠腹股沟部脂肪组织中的组织块，并收集滤液；
将所得滤液与含有胎牛血清的低糖DMEM培养基等量中和，离心后弃掉上清液，得到沉淀物，并使用无血清培养基对其进行重悬后置于培养瓶中进行培养，当间充质干细胞生长至一定密度时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化间质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养；
选择第三代培养的间质干细胞，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80％时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，得到脂肪间充质干细胞；
制备脂肪间充质干细胞条件培养基：将脂肪间充质干细胞在培养瓶中培养到50-60％融合，收集条件培养基，将条件培养基在3000rpm下离心10min，移除细胞碎片，使用袋式过滤器并在一定条件下透析，将透析后的条件培养基浓缩20倍，制得脂肪间充质干细胞条件培养基。
7.根据权利要求6所述的一种活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述透析为：使用7-kDa分子量截止袋式过滤器在PEG 20000和4℃下对条件培养基进行透析。
8.一种根据权利要求2所述的活性水凝胶的应用，其特征在于，所述活性水凝胶用于修复手术创伤引起的肌肉和皮肤缺损。
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