CN112494727B - 促vegf分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法和应用 - Google Patents

促vegf分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法和应用，属于生物组织医学工程技术领域。包括：多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶通过多巴胺粘附于丝素纳米纤维支架中，构成多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞的集成移植体；其中，多糖基水凝胶为自愈合可注射多糖基水凝胶。本发明将包埋神经干细胞的多糖基水凝胶通过多巴胺粘附于丝素纳米纤维支架间的空隙，构建所述多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞的集成移植体，能够促进细胞分泌VEGF，填充缺损部位，为神经干细胞粘附、增殖、定向分化成神经元提供所需的为微环境，实现能够应用于治疗脑缺血损伤，具有促进神经干细胞扩增分化领域的应用。

Description

促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体 及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物组织医学工程技术领域，涉及一种促VEGF分泌的水凝胶 /丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法和应用。
背景技术
脑缺血损伤是全球引起成年人死亡和残疾的主要原因之一，然而，目前尚 无有效的治疗方法。由于受伤的中枢神经系统自我修复的能力受到限制，外源 性神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)的功能性移植以补充或替代丢失和 受损的细胞被认为是脑缺血治疗最有希望的方法之一。神经干细胞是一种具有 长期自我更新和分化能力的原始细胞，具有产生多种表型细胞修复中枢神经系 统的内在能力，植入脑组织后可增殖、迁移、分化为组织修复需要的神经细胞， 促进大脑功能恢复。然而，临床治疗脑缺血损伤后神经修复十分困难，特别在 其慢性期，主要由于损伤区域的微环境十分不利于脑组织的修复再生。脑缺血 损伤后，梗死灶微环境恶化，组织塌陷，甚至液化形成空洞，十分不利于神经 干细胞的生存。
缺血微环境破坏是脑损伤修复的重要障碍。由于梗死区的微环境被破坏， 大多数移植的神经干细胞在参与谱系分化前已经凋亡或死亡，导致移植的神经 干细胞在缺血性脑损伤环境中的存活率很低。因此，单纯神经干细胞移植存活 率低下，丢失率高，对微环境改善作用不大，治疗效果不佳。将神经干细胞负 载于生物支架中，为神经干细胞移植提供合适的生存和定向分化微环境是一种 有效的解决方法。
神经系统疾病的细胞治疗不仅得益于神经干细胞的增殖和分化能力，还得 益于病变部位分泌的生物活性分子对纤维化、凋亡、炎症和血管生成等的影响。 脑血脑血管具有维持大脑乳酸稳态、调控成体神经发生和认知功能的重要生理 功能，因此，脑缺血诱导的神经发生与血管生成之间的耦合非常重要。脑血管 作为神经干细胞重要的微环境分泌细胞因子影响神经干细胞自我更新和分化。 血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)的表达与 神经前体细胞增殖、大脑皮质神经元生长增加和新生细胞存活密切相关。血管 内皮细胞生长因子是一种能刺激血管新生的蛋白，与血管生成密切相关。它直 接作用于血管内皮细胞，具有调控血管内皮细胞增殖、分化、迁移、以及促进 新血管生成等作用。血管内皮细胞生长因子参与神经元存活、血管生成和脑损伤恢复过程中的神经发生，在脑组织修复再生中发挥重要作用。因此，在生物 支架中引入VEGF是调控缺血性脑损伤微环境的策略之一。
然而，由于生长因子不稳定，具有半衰期很短，在游离的状态下极其容易 降解等缺点。在临床应用中，利用生长因子协助受损组织或器官的修复过程中， 生长因子很难保持长久的活性。此外，向体内运送生长因子，不仅花费高、效 率低，而且，可能影响正常组织器官的生长或功能，例如，大量的生长因子可 能会刺激肿瘤的生成，损伤组织和细胞。因此，为外源性神经干细胞的功能性 移植以及神经损伤修复再生创造有利的微环境仍然具有挑战性，需要制定新的 策略。研发能够刺激脑缺损部位的细胞在组织修复过程中自身分泌VEGF的生 物支架，从而激发细胞自身活性，促进脑缺血损伤修复，是一种有效的解决方案。为达到上述目的，需要设计一种更加合理的神经修复移植体系，既能够为 移植细胞提供一个模拟细胞外基质的三维微环境，同时又可以提供一个平台和 模板来桥接移植细胞和损伤区，从而改善整体脑缺血损伤微环境，引导神经干 细胞的增值、迁移、定向分化和促进VEGF分泌，促进神经组织修复再生。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种促VEGF分泌 的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法和应用，本发明保 证了神经干细胞在移植修复过程中的稳定性和生物活性，避免了现有生物支架 阻碍神经干细胞分泌生长因子的使用缺陷。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成 移植体，包括：丝素纳米纤维支架和多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶，多糖基水 凝胶/神经干细胞凝胶通过多巴胺粘附于丝素纳米纤维支架中，构成促VEGF分 泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体；
其中，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶中，多糖基水凝胶为自愈合可注射多 糖基水凝胶。
优选地，自愈合可注射多糖基水凝胶为N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚 糖水凝胶。
进一步优选地，N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶的质量分数为 1％～3％。
进一步优选地，N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶的力学剪切模量 为250～450Pa。
优选地，丝素纳米纤维支架的断裂应力为13MPa。
优选地，素纳米纤维支架的直径为601±68nm。
本发明还公开了上述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集 成移植体的制备方法，包括：采用静电纺丝法，将多巴胺与丝素/聚环氧乙烷的 混合溶液制成丝素纳米纤维支架；采用含有多巴胺的自愈合可注射多糖基水凝 胶对神经干细胞进行包埋，得到多糖基水凝胶/神经干细胞模块；
将所得多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶填充于所得丝素纳米纤维支架中，制 得促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
优选地，多巴胺水溶液与丝素/聚环氧乙烷溶液的混合体积比为1:10；
其中，多巴胺水溶液的质量浓度为2％，丝素/聚环氧乙烷溶液的质量浓度 为8％。
进一步优选地，丝素/聚环氧乙烷溶液中，丝素与聚环氧乙烷的体积比为 4:1。
优选地，当自愈合可注射多糖基水凝胶为N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘 聚糖水凝胶时，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备操作包括：
将氧化魔芋葡甘聚糖溶液与多巴胺混合，得到组分A；向N-羧乙基壳聚糖 溶液中加入神经干细胞，得到组分B；将所得组分A和所得组分B混合交联， 制得多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶。
进一步优选地，氧化魔芋葡甘聚糖的氧化度为50％～85％，N-羧乙基壳聚糖 的丙烯酸取代度为30％～50％。
进一步优选地，N-羧乙基壳聚糖溶液和氧化魔芋葡甘聚糖溶液的混合体积 比为18～3:1；其中，N-羧乙基壳聚糖溶液的浓度为1％w/v～3％w/v，氧化魔芋 葡甘聚糖溶液的浓度为10％w/v；
进一步优选地，多巴胺的混合质量为氧化魔芋葡甘聚糖溶液质量的2％。
本发明还公开了上述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集 成移植体在损伤组织修复中的应用。
本发明还公开了上述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集 成移植体用于制备损伤组织修复制剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体，本 发明通过含有多巴胺的自愈合可注射多糖基水凝胶包埋神经干细胞，所述多糖 基水凝胶/神经干细胞凝胶具有可体内降解的性能。包埋细胞的含有多巴胺的自 愈合可注射多糖基水凝胶注射至丝素纳米纤维支架的填充处后，负载细胞的水 凝胶微粒可快速自愈合形成多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶(数秒到几分钟)， 恢复水凝胶的结构和力学性能，此外，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶中水凝胶 微粒与微粒之间形成的连续微孔结构有利于扩大包埋于水凝胶微粒中的神经干 细胞与培养液的接触面积和营养运输，从而更有利于神经干细胞的新陈代谢， 维持神经干细胞活性。此外，随着神经干细胞扩增，水凝胶降解，能够为移植 的神经干细胞或损伤区残留的细胞、定向分化的神经细胞扩增提供足够的动态 生长空间即随着细胞数量增加，随着水凝胶的逐渐降解，可为细胞创造更多的 生长空间，从而更加有利于细胞生长，营养成分的运输和代谢产物的排出。
其中，本发明所述的丝素纳米纤维支架，具有良好的生物相容性和力学性 能，用于脑缺血缺损部位的填充，支撑塌陷区域，为细胞生存和分化提供有利 的三维环境。丝素纳米纤维的微观结构具有诱导神经干细胞在丝素纳米纤维支 架上定向分化，增殖，诱导突起生长定向排列并建立相互连接，引导细胞生长、 传递细胞生物活性分子，从而调控细胞的行为，促进神经修复再生。
本发明还公开了上述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集 成移植体的制备方法，本发明通过制备自愈合可注射多糖基水凝胶具有三维 (3D)包埋细胞，能为新移植的神经干细胞(NSCs)或损伤区残留的细胞扩增 提供足够的生长空间和更大的附着面积，同时有利于营养成分的进出和代谢产 物的排出，从而不引起细胞的生长抑制作用，促进细胞增殖。通过将多巴胺与 丝素/聚环氧乙烷(PEO)溶液混合，采用静电纺丝制备丝素纳米纤维支架，该 支架可根据实际需要满足各种形状，将该神经支架用于填补组织缺损及桥接神 经断端，其微观定向排列结构有助于神经的引导，具有定向分化神经细胞的能 力，从而促进神经损伤修复及功能恢复。通过将多糖基水凝胶/神经干细胞模块 填充于所得丝素纳米纤维支架内部，丝素纳米纤维支架表面的多巴胺通过分子 间相互作用力，实现多糖基水凝胶/神经干细胞模块与丝素纳米纤维支架构成叠 层支架的粘附性能，构建稳定的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞维集成移植体，为神经干细胞的粘附、增殖、定向分化提供三维细 胞微环境，促进神经修复再生。本发明适用范围广，原料来源简便，生产成本 低且工艺方法简单，具有推广应用价值。
本发明还公开了上述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集 成移植体用于神经组织损伤组织修复中的应用。通过负载神经干细胞的自愈合 可注射多糖基水凝胶与丝素纳米纤维支架集成制备的多糖基水凝胶/丝素纳米 纤维/神经干细胞集成种植体可用于治疗脑缺血损伤，同时，通过多巴胺粘附固 定生长因子，使凝胶与支架形成叠层双支架，有利于神经干细胞的增殖和定向 分化，恢复功能。经过应用测试可知，将本发明所述多糖基水凝胶/丝素纳米纤 维/神经干细胞集成种植体用于治疗大鼠脑缺血损伤，该多糖基水凝胶/丝素纳米 纤维/神经干细胞集成移植体结构稳定、填补缺损部位，有效利用组织工程学， 构建细胞增殖、迁移、定向分化，促进生长因子(VEGF)的分泌的三维微环 境，有利于神经干细胞的增殖和定向分化，修复再生脑损伤神经功能。
附图说明
图1为本发明所述促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成 移植体移植3d后大鼠不同组生长因子(VEGF)蛋白的生成对比图；其中，(a) 为VEGF表达Westernblot检测示意图，(b)为VEGF蛋白的生成数据；
图2为本发明集成种植体移植后大鼠神经行为学评分。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施 例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、 “第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应 该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施 例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和 “具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系 列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步 骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备 固有的其它步骤或单元。
本发明首先公开一种能够促进细胞分泌VEGF的多糖基水凝胶/丝素纳米 纤维/神经干细胞集成移植体的制备方法及其在治疗脑缺血损伤中的应用，包 括：丙烯酸与壳聚糖发生迈克尔加成反应制备N-羧乙基壳聚糖(CEC)；魔芋 葡甘聚糖与高碘酸钠发生氧化反应制备氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)；将神经干 细胞与N-羧乙基壳聚糖溶液混合，多巴胺与氧化魔芋葡甘聚糖溶液混合，通过 动态亚胺键制备具有自愈合可注射性能的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神 经干细胞凝胶，N-羧乙基壳聚糖中的氨基具有促进神经干细胞定向分化为神经 细胞的能力；将多巴胺与丝素/聚环氧乙烷(PEO)溶液混合，采用静电纺丝制 备丝素纳米纤维支架，该支架可根据实际需要满足各种形状，将该神经支架用 于填补组织缺损及桥接神经断端，支架中丝素纳米纤维微观定向排列结构有助 于神经定向引导信号传输功能。
本发明通过将自愈合可注射多糖基水凝胶注射填充于管状的丝素纳米纤维 支架内部，水凝胶和丝素纳米纤维支架表面的多巴胺通过分子间相互作用力实 现两者架构建叠层支架的相互作用，构建稳定的负载神经干细胞的活性多糖基 水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞维集成移植体，为神经干细胞的增殖、迁移、 定向分化和信号传输提供三维细胞微环境，促进神经修复再生。
本发明公开的促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植 体的制备方法，具体包括以下步骤：
1)丝素纳米纤维支架的制备
丝素是指丝素蛋白选自于天然柞蚕丝，经过溶解、脱胶等处理后，将质量 浓度为2％的多巴胺水溶液、质量浓度为8％的丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1) 溶液混合，其中，多巴胺水溶液为A组分，丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1) 溶液为B组分，A组分和B组分的混合体积比为1:10，置于静电纺丝设备，在 10千伏的电压、5mL/h的溶液流速和15厘米的投掷距离(收集器和针之间)(在 25～30℃和40％的相对湿度下)下进行，纺丝纤维直接收集在以100转/分钟旋转 的圆筒上，将获得的纳米丝素纤维支架。扫描电子显微镜观察丝素纳米纤维的 形态结构直径为601±68nm。测定丝素纳米纤维支架断裂应力为13MPa。神经 干细胞在丝素纳米纤维支架上可生长出突起并互相建立了连接。
2)负载神经干细胞(NSCs)的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备神经 干细胞(NSCs)
①通过高碘酸钠对魔芋葡甘聚糖(KGM)进行氧化得到氧化魔芋葡甘聚糖 (OKGM)，由碘量法可确定其氧化度为50％～85％；水溶性N-羧乙基壳聚糖 (CEC)则通过壳聚糖与丙烯酸在50℃下发生Michael加成反应得到，通过1H NMR计算其取代度为30％～50％。
②分别称取0.1mg～0.3mg的CEC和1mg的OKGM，使用无菌剪刀剪为碎 片，于紫外灯下照射灭菌30min，翻匀后重复照射一次。
③将灭菌后的CEC分别溶于1mL完全培养基中，配制浓度分别为1％～3％ (w/v)的CEC溶液，于50℃温箱密封溶解4小时，待完全溶解后，置于37℃ 保存待用；将灭菌后的1mgOKGM溶于1mL完全培养基中，配制浓度为10％ (w/v)的OKGM溶液，并加入2％的多巴胺(DA)，得到OKGMA-DA溶液， 4℃保存待用。
④将CEC和OKGM-DA溶液以18～3:1(v/v)比例混合时，交联发生，制 备质量分数为1％～3％的自愈合可注射水凝胶，成胶温度为25～45℃，成胶时间 为20～30秒。
⑤在上述③配置的CEC溶液中加入5×105个神经干细胞，与OKGM-DA 溶液混合制备得到负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶，经剪切力 测试仪测量其力学剪切模量在250Pa～450Pa之间。
3)促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的构建及 其在治疗脑缺血损伤中的应用
将步骤1)制得的丝素纳米纤维支架移植至大鼠脑缺血模型(pMCAO)， 将步骤2)制备得到的负载神经干细胞的自愈合可注射多糖基水凝胶注射于丝 素纳米纤维支架内部，形成的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶与丝素纳米纤维支 架之间通过多巴胺分子间相互作用力实现粘附结合，构建促VEGF分泌的水凝 胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
一、下面结合具体实施例对本发明做详细说明：
实施例1
1)丝素纳米纤维支架的制备
丝素蛋白选自于天然柞蚕丝，经过溶解、脱胶等处理后，将质量浓度为2％ 的多巴胺水溶液、质量浓度为8％的丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液混 合，其中，多巴胺水溶液为A组分，丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液为 B组分，A组分和B组分的混合体积比为1:10，置于静电纺丝设备，在10千 伏的电压、5毫升每小时的溶液流速和15厘米的投掷距离(收集器和针之间) (在25～30℃和40％的相对湿度下)下进行。纤维直接收集在以100转/分钟旋 转的圆筒上，将获得的纳米丝素纤维支架。扫描电子显微镜观察丝素纳米纤维 的形态结构直径为600nm。测定丝素纳米纤维支架断裂应力为13MPa。神经干 细胞在丝素纳米纤维支架上可生长出突起并互相建立了连接。
2)负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备
①通过高碘酸钠对魔芋葡甘聚糖(KGM)进行氧化得到氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)，由碘量法可确定其氧化度为50％；水溶性N-羧乙基壳聚糖(CEC) 则通过壳聚糖与丙烯酸在50℃下发生Michael加成反应得到，通过1H NMR计 算其取代度为30％。
②分别称取0.1mg的CEC和1mg的OKGM，使用无菌剪刀剪为碎片，于 紫外灯下照射灭菌30min，翻匀后重复照射一次。
③将灭菌后的CEC分别溶于1mL完全培养基中，配制浓度分别为1％(w/v) 的CEC溶液，于50℃恒温箱密封溶解4小时，待完全溶解后，置于37℃保存 待用；将灭菌后的1mgOKGM溶于1mL完全培养基中，配制浓度为10％(w/v) 的OKGM溶液，并加入2％的多巴胺，得到OKGMA-DA溶液，4℃保存待用。
④将CEC和OKGM-DA溶液以18:1(v/v)比例混合时，交联发生，制备 质量分数为1％的自愈合可注射水凝胶，成胶温度为45℃，成胶时间为20秒。
⑤在上述③配置的CEC溶液中加入5×105个神经干细胞，与OKGM-DA溶 液混合制备得到负载神经干细胞的自愈合可注射水凝胶，经剪切力测试仪测量 力学剪切模量在250Pa。
3)促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的构建
将步骤1.2制备得到的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶注 射于步骤1.1丝素纳米纤维支架内部，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶与丝素纳 米纤维支架之间通过多巴胺分子间相互作用力实现粘附结合，构建促VEGF分 泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
实施例2
1)丝素纳米纤维支架的制备
丝素蛋白选自于天然柞蚕丝，经过溶解、脱胶等处理后，将质量浓度为2％ 的多巴胺水溶液、质量浓度为8％的丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液混 合，其中，多巴胺水溶液为A组分，丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液为 B组分，A组分和B组分的混合体积比为1:10，置于静电纺丝设备，在10千 伏的电压、5毫升每小时的溶液流速和15厘米的投掷距离(收集器和针之间) (在25～30℃和40％的相对湿度下)下进行。纤维直接收集在以100转/分钟旋 转的圆筒上，将获得的纳米丝素纤维支架。扫描电子显微镜观察丝素纳米纤维 的形态结构直径为669nm。测定丝素纳米纤维支架断裂应力为13MPa。神经干 细胞在丝素纳米纤维支架上可生长出突起并互相建立了连接。
2)负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备
①通过高碘酸钠对魔芋葡甘聚糖(KGM)进行氧化得到氧化魔芋葡甘聚糖 (OKGM)，由碘量法可确定其氧化度为85％；水溶性N-羧乙基壳聚糖(CEC) 则通过壳聚糖与丙烯酸在50℃下发生Michael加成反应得到，通过1H NMR计 算其取代度为50％。
②分别称取0.3mg的CEC和1mg的OKGM，使用无菌剪刀剪为碎片，于 紫外灯下照射灭菌30min，翻匀后重复照射一次。
③将灭菌后的CEC分别溶于1mL完全培养基中，配制浓度分别为3％(w/v) 的CEC溶液，于50℃恒温箱密封溶解4小时，待完全溶解后，置于37℃保存 待用；将灭菌后的1mgOKGM溶于1mL完全培养基中，配制浓度为10％(w/v) 的OKGM溶液，并加入2％的多巴胺，得到OKGMA-DA溶液，4℃保存待用。
④将CEC和OKGM-DA溶液以3:1(v/v)比例混合时，交联发生，制备 质量分数为3％的自愈合可注射水凝胶，成胶温度为25℃，成胶时间为30秒。
⑤在上述③配置的CEC溶液中加入5×105个神经干细胞沉淀，与OKGM-DA 溶液混合制备得到负载神经干细胞的自愈合可注射水凝胶，经剪切力测试仪测 量力学剪切模量在450Pa。
3)促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的构建
将步骤1.2制备得到的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶注 射于步骤1.1丝素纳米纤维支架内部，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶与丝素纳 米纤维支架之间通过多巴胺分子间相互作用力实现粘附结合，构建促VEGF分 泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
实施例3
1)丝素纳米纤维支架的制备
丝素蛋白选自于天然柞蚕丝，经过溶解、脱胶等处理后，将质量浓度为2％ 的多巴胺水溶液、质量浓度为8％的丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液混 合，其中，多巴胺水溶液为A组分，丝素：聚环氧乙烷PEO(v/v＝4:1)溶液为 B组分，A组分和B组分的混合体积比为1:10，置于静电纺丝设备，在10千 伏的电压、5毫升每小时的溶液流速和15厘米的投掷距离(收集器和针之间) (在25～30℃和40％的相对湿度下)下进行。纤维直接收集在以100转/分钟旋 转的圆筒上，将获得的纳米丝素纤维支架。扫描电子显微镜观察丝素纳米纤维 的形态结构直径为533nm。测定丝素纳米纤维支架断裂应力为13MPa。神经干 细胞在丝素纳米纤维支架上可生长出突起并互相建立了连接。
2)负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备
①通过高碘酸钠对魔芋葡甘聚糖(KGM)进行氧化得到氧化魔芋葡甘聚糖 (OKGM)，由碘量法可确定其氧化度为70％；水溶性N-羧乙基壳聚糖(CEC) 则通过壳聚糖与丙烯酸在50℃下发生Michael加成反应得到，通过1H NMR计 算其取代度为40％。
②分别称取0.2mg的CEC和1mg的OKGM，使用无菌剪刀剪为碎片，于 紫外灯下照射灭菌30min，翻匀后重复照射一次。
③将灭菌后的CEC分别溶于1mL完全培养基中，配制浓度分别为2％(w/v) 的CEC溶液，于50℃温箱密封溶解4小时，待完全溶解后，置于37℃保存待 用；将灭菌后的1mg OKGM溶于1mL完全培养基中，配制浓度为10％(w/v) 的OKGM溶液，并加入2％的多巴胺，得到OKGMA-DA溶液，4℃保存待用。
④将CEC和OKGM-DA溶液以9:1(v/v)比例混合时，交联发生，制备 质量分数为2％的自愈合可注射水凝胶，成胶温度为30℃，成胶时间为25秒。
⑤在上述③配置的CEC溶液中加入5×105个神经干细胞沉淀，与 OKGM-DA溶液混合制备得到负载神经干细胞的自愈合可注射水凝胶，经剪切 力测试仪测量力学剪切模量在350Pa。
3)促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的构建
将步骤1.2制备得到的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶注 射于步骤1.1丝素纳米纤维支架内部，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶与丝素纳 米纤维支架之间通过多巴胺分子间相互作用力实现粘附结合，构建促VEGF分 泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
具体地，上述实施例1～实施例3中的神经干细胞，通过以下步骤培养获得：
1.1.1神经干细胞(NSCs)的原代培养
①取孕16天SD大鼠，水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位置于操 作盘内，无菌环境剪开腹腔，取出胚胎，立即放入预冷的0.01mol/L PBS缓冲 液中。
②冰上操作，培养皿1、2、3放入少量0.01mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲 盐溶液)冰上备用，取出胚胎整个大脑放至培养皿1中，用两把眼科尖镊分离 左右大脑半球，移至培养皿2，仔细剥离脑膜，轻柔操作，避免夹持损伤脑组 织，脑膜剥离完全后，仔细分出大脑皮质，放至培养皿3中。
③在培养皿3中，用移液器反复轻柔吹打，使组织分散直至无细胞团出现。 用200目筛网过滤器滤除未分散的组织，将收获的细胞悬液移入离心管中，配 平后以1000rpm离心3min，弃上清，用基础培养基DMEM/F12洗涤2次，弃 上清，留细胞沉淀。
④将3mL完全培养基重悬细胞，倒置显微镜下台盼蓝染色，细胞计数板计 数，调整细胞密度为5×105个/mL，按5mL/瓶种入T25培养瓶中，标注日期， 置于37℃，5％CO2培养箱中培养。次日每瓶补加1mL完全培养基，培养3～5 天后进行传代培养。
其中，神经干细胞完全培养基组分包括DMEM/F12、N2无血清添加剂、 B27无血清添加剂、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、链霉素、青霉素。
1.1.2神经干细胞(NSCs)的传代培养
①原代培养细胞生长3～5天后，于倒置显微镜下观察瓶内细胞球的数量大约 占培养瓶的80％，细胞聚集比较密集后，需进行细胞传代。
②将原代培养的细胞从培养瓶中移入15mL离心管中，配平后25℃离心， 1000rpm/min，3min，弃上清。每个离心管中加入3mL预热的PBS缓冲液和200μL 胰蛋白酶消化液，混匀后置于37℃水浴锅中，消化3～5min，用吸管轻柔吹打100 次，加入基础培养基DMEM/F12终止胰酶活性，配平离心，25℃1000rpm/min， 3min，弃上清，用基础培养基DMEM/F12继续洗涤细胞2次，弃上清，留细胞沉 淀。
③完全培养基重悬细胞沉淀，调整神经干细胞密度为5×105个/mL，按具体 实验要求种入T25细胞培养瓶、24孔板或96孔板中，放入37℃，5％CO2培养箱 中培养，24h后可进行实验研究。本实验多采用贴壁培养的方法，细胞种植前使 用多聚赖氨酸(PLL)与层粘连蛋白(laminin)处理盖玻片，使NSCs易于贴壁： 8×8mm的盖玻片经过高压灭菌后置入24孔板中，1片/孔；每孔加入400μL PLL (20μg/mL)，于37℃温箱作用2h，灭菌去离子水洗两遍，自然晾干；将45μL laminin(10μg/mL)加在晾干的盖玻片上，不可溢出，于37℃温箱作用2～3h， 吸掉表层液态laminin，根据实验要求调整细胞密度，种入细胞悬液，置于37℃， 5％CO2培养箱中培养。
二、应用测试
2.1CEC/OKGM水凝胶的力学剪切模量检测
2.1.1N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖(CEC/OKGM)水凝胶的制备
采用如多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶制备方法中的上述方法，通过交联反 应形成浓度分别为1％～3％的N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖(CEC/OKGM) 水凝胶，即本发明技术方案中所用的自愈合可注射多糖基水凝胶，成胶时间为 约20～30秒。
2.1.2CEC/OKGM水凝胶的力学剪切模量检测
①取250g左右成年雄性SD大鼠，水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，空 气栓塞法快速处死，断头取脑，获得新鲜脑块，经剪切力测试仪测量力学剪切 模量为200～500Pa。
②采用2.11所述制备方法制得不同浓度的水凝胶，取浓度分别为1％、2％、 3％的CEC/OKGM水凝胶，经剪切力测试仪测量力学剪切模量分别约为250Pa、 400Pa、450Pa。
经剪切力测试仪测量力学剪切模量测量可知，新鲜成年大鼠脑组织的力学 模量约为200～500Pa，因此，经过对比上述实施例1～实施例3制得的三种不同 浓度的CEC/OKGM水凝胶的力学模量测定结果(对应于浓度分别为1％、2％、 3％的CEC/OKGM水凝胶，其力学剪切模量分别为250Pa、400Pa、450Pa)，即 其力学模量与新鲜成年大鼠脑组织范围相近，达到匹配。
2.2包埋神经干细胞的CEC/OKGM水凝胶的生物相容性测定
①浓度为3％(w/v)的CEC溶液注入24孔板，每组设6孔，54μL/孔，剩 余6孔设为细胞组；后将10％(w/v)的OKGM溶液按3:1(v/v)比例加入各 组CEC溶液中，混合均匀，避免气泡产生，约30s后形成透明状凝胶。
②取第3代NSCs，经胰酶消化后，1000r/min离心3min，完全培养基重悬 细胞沉淀，细胞计数，调整神经干细胞浓度为5×104个/mL，将NSCs悬液以5 ×104/ml浓度接种于已成固态的CEC/OKGM水凝胶表面，细胞组以相同的细 胞密度接种于不含胶的PLL包被的玻片上，每孔加入500μL完全培养基，置于 37℃，5％CO2条件下常规培养，每天换液。换液时一次换2/3或3/4量液体， 避免损伤水凝胶的表面结构。
③在接种1、3、5天后用MTT法检测。每次取不同平行样各5个，弃原 培养液，每孔加入MTT(5g/L)50μL，1mL无血清培养液，置于37℃恒温培 养箱中孵育4h，后1200r/min离心3min，加DMSO溶液400μL/孔，室温充分 进行溶解10min，吸取该溶解液200μL至96孔板中。用酶标仪在波长450nm 测量吸光度，OD值与细胞活性成正比。
CEC/OKGM水凝胶包埋培养条件下，各组NSCs OD值随培养时间延长而 升高，同一时间点各组间比较无统计学差异(P＞0.05)，实验重复三次。
2.3促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的构建及 其在治疗脑缺血损伤中的应用
将丝素纳米纤维支架移植大鼠脑缺血模型(pMCAO)，将本发明制得的制 备得到的负载神经干细胞的多糖基水凝胶/神经干细胞模块注射于丝素纳米纤 维支架内部，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶与丝素纳米纤维支架之间通过多巴 胺分子间相互作用力实现粘附结合，构建促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维 /神经干细胞集成移植体。
BrdU是一种胸腺嘧啶类似物，用来标记新增殖细胞，移植14d后病灶移植 区BrdU免疫荧光染色发现H+NSCs组、SFN+NSCs组和SFN+H+NSCs组BrdU 阳性细胞数和移植细胞增殖率均高于NSCs组(P﹤0.05)。在移植后42d进行 BrdU免疫荧光染色，各组均未观察到BrdU阳性细胞，说明在缺血后期神经干 细胞已不再增殖，可能已经分化成为具有功能的神经细胞。
观察移植区的胶质瘢痕形成以及移植的神经干细胞在脑缺血后42d的分化 情况，采用GFAP免疫荧光染色进行观察。
为了观察移植区的神经元数量以及移植的神经干细胞在脑缺血后6w的分 化情况，采用Neun免疫荧光染色进行观察，每组随机取三个视野，计数 Neun/MIRB阳性细胞。NSCs组神经元数量较少且聚集在缺血半暗带，分化形 态不良；H+NSCs组和SFN+NSCs组神经元数量较多，SFN+H+NSCs组神经元 数量香显著增多，均匀分散于水凝胶中，且发出突起；与NSCs组相比，各组 移植的神经干细胞分化为神经元的比例均较多(P﹤0.05)。
采用Western-blot的方法对脑缺血移植后不同时间点移植区casepase-3、 VEGF、GFAP的蛋白含量进行了检测，结果可见，移植后1d H+NSCs组和 SFN+NSCs组casepase-3含量在均低于NSCs组，SFN+H+NSCs组的casepase-3 含量低于H+NSCs组SFN+NSCs组和NSCs组，有显著性差异(P<0.05)。
移植后7d H+NSCs组和SFN+NSCs组大鼠脑组织移植区GFAP含量均低于 NSCs组，SFN+H+NSCs组的GFAP含量低于H+NSCs组SFN+NSCs组和NSCs 组，有显著性差异(P<0.05)。
移植后3d H+NSCs组和SFN+NSCs组VEGF含量在均高于NSCs组， SFN+H+NSCs组的VEGF含量G高于H+NSCs组SFN+NSCs组和NSCs组， 差异具有显著性(P<0.05)。参见图1可知，与NSCs组相比，P﹤0.05；#与H+NSCs 组相比，P<0.05；▲与SFN+NSCs组相比，P<0.05。
神经功能缺损评分结果显示，各组大鼠随时间推移神经功能评分均呈不同 程度的下降趋势，移植后1d各组比较均无显著性差异(P>0.05)；在移植后3d 和7d，SFN+H+NSCs组的神经功能评分低于NSCs组和SFN+NSCs组(P﹤ 0.05)；14d、21d、28d、35d、42d各时间点SFN+H+NSCs组动物神经功能评分 明显低于NSCs组、H+NSCs组和SFN+NSCs组，差异有统计学意义(P﹤0.05)， 表明丝素纳米纤维支架和多糖基水凝胶/神经干细胞模块联合神经干细胞移植 治疗可以改善大鼠pMCAO后的神经功能障碍(如图2所示)。
图1和图2中，NSCs为神经干细胞组；H+NSCs为多糖基水凝胶+神经干 细胞组；SFN+NSCs为丝素纳米纤维(支架)+神经干细胞组；SFN+H+NSCs 为丝素纳米纤维(支架)+多糖基水凝胶+神经干细胞组，即本发明所述多糖基 水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体。
本实验采用自主研发集成种植体由改性后的CEC/OKGM水凝胶负载神经 干细胞与丝素纳米纤维支架构建管状填充结构，优化机械强度与亲水性，原料 来源简单易获得，同时保持快速成胶的特点，能够在20～30秒内凝胶化，且多 糖基水凝胶/神经干细胞模块的凝胶化采用在生理环境中形成动态共价键的交 联方法，所需条件简单易行，所制备的多糖基水凝胶/神经干细胞模块中的N- 羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶具有定向诱导神经干细胞向神经元分 化的功能，活性集成定向排列的纳米纤维素支架具有引导神经传递功能。因此， 本发明公开的多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体可促进VEGF生长因子分分泌。
脑缺血损伤后，梗死灶微环境恶化，组织塌陷，甚至液化形成空洞，十分 不利于NSCs的生存，单纯NSCs移植存活率低下，丢失率高，难以达到治疗 效果。本发明公开的多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的植入 使NSCs均匀分散于梗死灶的水凝胶中，形态正常，与宿主组织融合较好。NSCs 流失较少，说明本发明公开的多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植 体提供的支架与微环境可更好的网罗细胞，减少流失和死亡，免疫荧光检测结 果显示移植区与侧脑室区的NSCs增殖情况良好。同时梗死灶周围的宿主组织 及侧脑室区均有移植的NSCs的迁移，说明本发明公开的多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体促进和诱导移植NSCs的增殖和迁移。
缺血性脑损伤的治疗和功能恢复很大程度上基于移植后细胞的存活、增殖、 分化及迁移等能力，故本部分实验通过移植后细胞的增殖、迁移及分化情况评 估自愈合可注射水凝胶与NSCs 3D包埋在体移植的可行性。
本发明公开的促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植 体减轻了脑缺血损伤所致的胶质反应，粘附与融合宿主细胞，改善了损伤区的 微环境。移植入的NSCs均匀分散于梗死灶的水凝胶中，形态正常，与宿主组 织融合较好。NSCs流失较少，说明移植体提供的支架与微环境可更好的网罗 细胞，减少流失和死亡，说明CEC/OKGM水凝胶不影响并在一定程度上促进 和诱导移植NSCs的增殖和迁移。
综上所述，本发明提供了一种能够促进VEGF分泌的多糖基水凝胶/丝素纳 米纤维/神经干细胞集成移植体及其制备方法，以及所述多糖基水凝胶/丝素纳米 纤维/神经干细胞的集成移植体在治疗脑缺血损伤中、用于制备损伤组织修复药 物中的应用，本发明经包埋神经干细胞与多糖基水凝胶通过多巴胺粘附于丝素 纳米纤维支架间的空隙，构建所述多糖基水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞的集 成移植体，能够促进细胞分泌生长因子(VEGF)，填充缺损部位，为神经干细 胞粘附、增殖、定向分化成神经元提供所需的为微环境，实现能够应用于治疗 脑缺血损伤，具有促进神经干细胞扩增分化领域的应用。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围， 凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入 本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体，其特征在于，包括：丝素纳米纤维支架和多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶通过多巴胺粘附于丝素纳米纤维支架中，构成促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体；
其中，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶中，多糖基水凝胶为自愈合可注射多糖基水凝胶，自愈合可注射多糖基水凝胶为N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶，N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶的质量分数为1%~3%，丝素纳米纤维支架的直径为601±68nm。
2.权利要求1所述的促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体的制备方法，其特征在于，包括：
采用静电纺丝法，将多巴胺水溶液与丝素/聚环氧乙烷溶液的混合溶液制成丝素纳米纤维支架；采用含有多巴胺的自愈合可注射多糖基水凝胶对神经干细胞进行包埋，得到多糖基水凝胶/神经干细胞模块；
将所得多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶填充于所得丝素纳米纤维支架中，制得促VEGF分泌的水凝胶/丝素纳米纤维/神经干细胞集成移植体；
所述多巴胺水溶液与丝素/聚环氧乙烷溶液的混合体积比为1:10；其中，多巴胺水溶液的质量浓度为2%，丝素/聚环氧乙烷溶液的质量浓度为8%；
当自愈合可注射多糖基水凝胶为N-羧乙基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶时，多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶的制备操作包括：
将氧化魔芋葡甘聚糖溶液与多巴胺混合，得到组分A；向N-羧乙基壳聚糖溶液中加入神经干细胞，得到组分B；将所得组分A和所得组分B混合交联，制得多糖基水凝胶/神经干细胞凝胶；所述氧化魔芋葡甘聚糖的氧化度为50%~85%，N-羧乙基壳聚糖的丙烯酸取代度为30%~50%，N-羧乙基壳聚糖溶液和氧化魔芋葡甘聚糖溶液的混合体积比为18~3:1；其中，N-羧乙基壳聚糖溶液的浓度为1% w/v ~3% w/v，氧化魔芋葡甘聚糖溶液的浓度为10% w/v。
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