CN115770324B

CN115770324B - 一种促进神经再生的活体静电纺丝支架的制备方法

Info

Publication number: CN115770324B
Application number: CN202211522501.7A
Authority: CN
Inventors: 顾勇; 陈亮; 郗焜; 崔文国; 唐锦程; 徐敬之; 王文博
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115770324A

Abstract

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备。本发明公开了一种促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，通过将胶原‑BMSCs悬液滴在定向微溶胶静电纺丝纤维束上，然后恒温孵育得到促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。该促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架早期通过所负载的干细胞调控急性脊髓损伤后局部炎症微环境，维持了M1和M2型巨噬细胞之间的动态平衡，长期来看，支架所释放的脑源性神经生长因子进一步调控干细胞的分化方向，促进神经元再生，填补脊髓缺损，提高神经功能恢复。本发明公开的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架能够为脊髓损伤局部炎症过激微环境下活体生物材料的再生应用提供了一种新思路。

Description

一种促进神经再生的活体静电纺丝支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备。

背景技术

活体生物材料是一种融合了活性元素和非活性成分的复合材料，其目标在于以直接利用生命体本身的方式使材料表现出生命特有的特征和功能，使之广泛应用于生物医学等多个领域。与传统材料不同，活体生物材料以活体生物为结构单体组装材料，重新设计生命系统，使之成为新兴的多功能动态响应材料。各种生物，包括细菌、真菌、藻类和动物细胞，已经被加入到纺丝、水凝胶等材料中，来设计具有各种功能的活体生物材料。特别是包封活体细胞的生物材料，将工程化活细胞组装、裁剪成具有生物系统特性的活体功能材料，借此将活体细胞的自我修复能力、进化能力、重编程能力、对环境的响应能力等融入材料。由此可见，活体生物材料耦合了活体生物与材料的优势，其丰富多样的结构和功能特征为组织修复提供了无限的可能性，有望实现材料“取之于体，用之于体”的目标。

脊髓损伤修复是世界性的医学难题，常会造成重度和永久性残疾。脊髓损伤后巨噬细胞快速聚集，并在促炎因子的作用下极化为“经典激活的巨噬细胞(M1)”，形成一个不利于神经再生的复杂炎症微环境。然而，脊髓损伤后炎症风暴的机制错综复杂，针对其中单一的靶点难以达到整体上满意的治疗效果。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有炎症反应的感受器和调节器双重作用。其细胞分泌组在免疫调节中扮演重要角色，脊髓损伤微环境中的炎症信号被BMSCs感知，作为响应，产生IDO、PGE2、IL-10等可溶性介质来调节巨噬细胞表达其抗炎表型，介导巨噬细胞由促炎的 M1型巨噬细胞向抗炎的M2型巨噬细胞极化，并通过细胞之间的发馈不断调整自己的行为以应对环境的变化，高度动态的维持局部微环境，为后期神经组织的修复提供有利的条件。但是，目前移植干细胞的策略依旧存在细胞凋亡和从注射部位扩散的缺陷，这极大的限制了干细胞治疗的效率。因此，本发明期望构建一种活体生物材料，不仅能够在早期为干细胞提供良好的黏附表面、三维生长空间以及充足的细胞外基质，利于植入的干细胞生长，而且在炎症得以控制后，材料本身还能够指导移植干细胞的分化命运，促进其向神经组织分化，这有望突破当前急性脊髓损伤治疗的瓶颈。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的困境，基于天然脊髓组织在外形结构以及细胞分布具有一定的空间顺序，定向静电纺丝纤维可以模拟中枢神经的三维结构，准确控制细胞的空间排布，桥接和接触引导轴突连接，已成为有效治疗脊髓损伤的关键。本发明利用微溶胶静电纺丝技术和胶原自组装技术，均匀载入活体间充质干细胞，设计构建了一种可调节干细胞旁分泌和分化的活体定向纤维束，以满足脊髓损伤急性阶段抑制炎症和后期神经再生的特殊需求。

首先，BDNF被包裹在透明质酸(HA)水溶胶中，然后将HA水溶胶分散在纺丝溶液中形成乳液，乳液中的微滴称为微溶胶粒子。本发明将该体系定义为微溶胶电纺法。在电纺过程中，HA微溶胶粒子被包裹到PLLA纤维中，形成核壳结构，在体内缓慢释放BDNF，用于调节干细胞的神经分化。其次，将负载BMSCs的I型胶原溶液组装到电纺纤维表面，胶原蛋白良好的粘附性、生物相容性及其蜘蛛网状的纳米纤维结构。植入早期，干细胞可以被胶原纤维栓系于纺丝支架中，避免它们扩散的同时促进细胞黏附生长，有效提高了BMSCs的移植率，间接增强支架的免疫调控性能。在炎症控制后，被HA微溶胶粒子包裹的BDNF从支架中长期稳定的释放，促进BMSCs向神经元方向分化。最终，成功构建干细胞工程化的活体定向纤维支架，在大鼠脊髓半横断模型中，该活体支架早期通过BMSCs调控急性SCI后局部炎症微环境，维持了M1和M2型巨噬细胞之间的动态平衡，长期来看，支架所释放的BDNF进一步调控干细胞的分化方向，促进神经元再生，填补脊髓缺损，提高神经功能恢复。

本发明受脊髓损伤后局部免疫炎症浸润和缺血引起酸性病理微环境启发，首先通过微溶胶静电纺丝技术，制备出负载脑源性神经生长因子（BDNF）的定向微溶胶静电纺丝支架（MS）；其次，通过胶原的自组装特性，将负载骨髓间充质干细胞（BMSCs）的I型胶原溶液组装到电纺纤维表面，构建了一种可调节干细胞旁分泌和分化的活体定向纤维束，以满足脊髓损伤急性阶段抑制炎症和后期神经再生的特殊需求。通过一系列材料学测试、细胞实验及动物研究，证明该活体纤维支架在炎症早期通过活体干细胞旁分泌的方式，释放多种抑炎因子，解决炎症微环境的问题，同时在炎症环境纠正后，活体干细胞又可以在微溶胶静电纺丝所缓释的脑源性神经生长因子的作用下分化为神经元，填补缺损的脊髓组织，连接脊髓断端。

为了实现上述目的，具体的，本发明提供以下技术方案：

本发明第一个方面公开了一种促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，通过将胶原-BMSCs悬液滴在定向微溶胶静电纺丝纤维束上，然后恒温孵育得到促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。

优选的，所述定向微溶胶静电纺丝纤维束的制备方法，包括：

S1：制备HA微溶胶；

S2：将BDNF混合到HA微溶胶中，形成均匀的负载BDNF的HA微溶胶；

S3：将含有二氯甲烷和Span-80的溶剂混合物与负载BDNF的HA微溶胶混合，得到含有均匀微溶胶粒子的油包水乳状液；

S4：将PLLA和DMF溶解在所述油包水乳状液中，得到负载BDNF的微溶胶电纺溶液；

S5：将负载BDNF的微溶胶电纺溶液通过静电纺丝制备得到定向静电纺丝纤维束。

更优选的，制得0.5-2wt%HA微溶胶，然后将5-20µl BDNF(100µg/ml)混合到10-20µl HA微溶胶中，形成均匀的0.5-2%HA-BDNF微溶胶，所述BDNF浓度为8-120µg/ml；

接着将含有3-5ml二氯甲烷和0.005-0.02g的Span-80的溶剂混合物与负载BDNF的HA微溶胶混合，高速搅拌后得到含有均匀微溶胶粒子的油包水(W/O)乳状液；接着，将0.3-0.6g PLLA和1-3g DMF溶解在乳液中，得到负载BDNF的微溶胶电纺溶液，最后将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维束。

更优选的，在S5中，静电纺丝的具体条件为：推进泵速度为60μL/min，电压15-18kV，针头距平行电极接收器15cm。

优选的，将I型胶原蛋白溶于乙酸中，然后在冰浴中将I型胶原蛋白溶液稀释在磷酸盐缓冲液中，调节pH值至6.8-7.5，得到胶原溶液，将BMSCs消化后离心，用所述胶原溶液重悬BMSCS，得到胶原-BMSCs悬液。

更优选的，将冻干后的I型胶原蛋白以3 mg/mL的浓度溶于0.1M乙酸中；然后在冰浴中将I型胶原蛋白溶液以6：1的比例稀释在磷酸盐缓冲液中，并用0.1M氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，得到胶原溶液；再将BMSCs消化后离心，用所述胶原溶液重悬BMSCS，得到胶原-BMSCs悬液。

优选的，将胶原-BMSCs悬液需均匀的滴加于定向微溶胶静电纺丝纤维束上；然后将其放入37°C的细胞培养箱中孵育20-40分钟，得到促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。

本发明第二个方面公开了上述的制备方法制备得到的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。

本发明第三个方面公开了上述的制备方法或者上述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架在生物医用材料技术领域中的应用。

优选的，所述应用为在神经再生领域中的应用。

在本发明的优选具体实施例公开了促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）定向微溶胶静电纺丝的制备

首先将10 mg HA溶解在990µl去离子中，制得1wt.%HA微溶胶。然后将10µl BDNF(100µg/ml)混合到50µl HA微溶胶中，形成均匀的1%HA-BDNF微溶胶。最后，将含有4ml二氯甲烷(DCM)和0.01g Span-80的溶剂混合物与负载BDNF的HA微溶胶混合，高速搅拌后得到含有均匀微溶胶粒子的油包水(W/O)乳状液。最后，将0.5gPLLA和2gDMF溶解在乳液中，得到负载BDNF的微溶胶电纺溶液，最后将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维束。

（2）胶原-BMSCs悬液的制备

冻干后的I型胶原蛋白以3 mg/mL的浓度溶于0.1M乙酸中，使用前4°C冰箱保存。然后在冰浴中将I型胶原蛋白溶液以6：1的比例稀释在磷酸盐缓冲液(PBS，10倍浓度)中，并用0.1M氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0。再将事先培养好的BMSCs消化后离心，并用中和后的pH=7.0的胶原溶液重悬BMSCs，得到了负载干细胞的胶原溶液。

（3）干细胞工程化活体定向纤维支架的制备

将步骤（1）制得的定向静电纺丝纤维束置于培养皿中，用75%的乙醇杀菌30min，然后用去离子水冲洗3次以去除残留的乙醇。将步骤（2）所制胶原-BMSCs悬液均匀的滴在MS纤维束上。最后，将样品放入37°C的恒温干燥箱中孵育30分钟，使胶原蛋白充分自组装。获得的样品用去离子水洗涤三次，即可得到负载BMSCs的MS@C-MC活体纤维束。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：

本发明针对原发性脊髓损伤后局部形成复杂的炎症微环境以及损伤后的脊髓空洞缺乏新生的神经元填补，无法连接脊髓断端这两大难题。通过胶原自组装技术将兼具免疫调节功能以及神经分化功能的干细胞与神经修复生物材料结合，在炎症早期通过活体干细胞旁分泌的方式，释放多种抑炎因子，解决炎症微环境的问题，同时在炎症环境纠正后，活体干细胞又可以在微溶胶静电纺丝所缓释的脑源性神经生长因子的作用下分化为神经元，填补缺损的脊髓组织，连接脊髓断端。本发明克服了脊髓损伤的炎症微环境以及脊髓空洞两大难题，将活体干细胞的优势与传统生物材料结合，为活体干细胞治疗在脊髓损伤修复研究领域提供新策略，并有较好的科研及临床应用前景。

附图说明

图1 中（A）制备负载BDNF的微溶胶电纺丝及其核壳结构的形成原理；（B-C）为干细胞工程化微/纳米纤维结构的构建过程以及组装机制的说明；（D）构建脊髓半切模型；（E）脊髓损伤后纤维支架在炎症高峰期、炎症平台期、神经恢复期的作用。

图2为纤维支架性能表征示意图：（A）不同纤维支架的SEM图像；（B）BSA-FITC在微溶胶电纺丝中的分布；（C）两种纤维的TEM对比；（D）不同纤维支架的EDS结果；（E）不同纤维支架水接触角（亲水性）表征；（F-G）材料拉伸大体照及对应的应力-应变曲线；（H）不同纤维支架的FTIR表征。

图3为不同纤维支架上细胞黏附及生物相容性表征示意图：（A）各组纤维膜种植BMSCs3天后Integrinβ1免疫荧光染色图片；（B）各组纤维膜种植BMSCs3天后Vinculin免疫荧光染色图片；（C）各组纤维支架种植BMSCs3天后活死染色图片；（D-F）Integrinβ1、Vinculin及LIVED荧光半定量分析。

图4为体外血管生成及神经元生成测定示意图：（A-B）是3h及6h形成的血管网络；（C -D）是5天及14天不同纤维支架上BMSCs成神经分化后Tuj-1、NF-200蛋白免疫荧光染色；（E）每高倍视野总长度(HPF)半定量分析；（F）每高倍视野内血管连接点数量半定量分析；（G-H）对应荧光半定量分析；（I-L）四种神经元相关基因表达。

图5为体外免疫调控示意图：（A）免疫荧光标记巨噬细胞标志物F4/80（红色荧光）和M1型巨噬细胞标志物iNOS（绿色荧光）；（B）免疫荧光标记巨噬细胞标志物F4/80（红色荧光）和M2型巨噬细胞标志物CD206（绿色荧光）；（C）Transwell共培养体系；（D-E）INOS和CD206荧光半定量分析；（F-I）四种炎症相关基因表达。

图6为动物实验时间轴和运动功能评分示意图：（A）脊髓半切模型示意图；（B）纤维束植入大鼠T9脊髓半切模型手术流程图。(a) 暴露椎板；(b) 打开椎板暴露T9脊髓；(c) 切除T9脊髓右侧4mm；(d) 移植纤维束；(e)活体纤维束大体观；(f)、(g)、(h) 分别表示大鼠术后7天、术后4周和术后8周；（C）术后4周和8周分别对脊髓进行H&E染色；（D）大鼠手术后下肢BBB评分；（E）大鼠运动功能IPT评分；（F）术后4周、8周定量分析各组脊髓空洞面积。

图7为体内免疫调控测定示意图：（A）流式细胞术分析CD11b/CD86阳性细胞和CD11b/CD206阳性细胞；（B）eGFP标记的BMSCs植入小鼠脊髓断端7天后示踪；（C-D）eGFP和CD206荧光半定量分析；（E-F）CD11b/CD86及CD11b/CD206对应阳性率统计分析；（G-J）炎症相关基因qRT-PCR。

图8为脊髓组织荧光染色和半定量分析示意图：（A-B）表示4周、8周红色荧光标记活化的星形胶质细胞和绿色荧光标记的胶质瘢痕组织；（C -D）表示4周8周红色荧光标记轴突萌芽；（E-G）对应的半定量分析。

图9为脊髓组织免疫荧光染色示意图：（A-B）分别表示4周/8周绿色荧光标记的神经祖细胞以及红色荧光标记的再生神经元；（C-D）分别表示4周/8周绿色荧光标记血管内皮细胞，红色荧光标记新生血管；（E-F）对应的荧光半定量分析。

图10为各组纤维直径分析图。

图11中（A）为微溶胶电纺液体放大照；（B）为HA微溶胶粒子粒径分析。

图12为降解与释放曲线示意图：（A）各组支架降解曲线；（B）微溶胶纺丝支架中BDNF释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）定向微溶胶静电纺丝的制备

首先将10 mg HA溶解在990µl去离子中，制得1wt.%HA微溶胶。然后将10µl BDNF(100µg/ml)混合到50µl HA微溶胶中，形成均匀的1%HA-BDNF微溶胶。最后，将含有4ml二氯甲烷(DCM)和0.01g Span-80的溶剂混合物与负载BDNF的HA微溶胶混合，高速搅拌后得到含有均匀微溶胶粒子的油包水(W/O)乳状液。最后，将0.5gPLLA和2gDMF溶解在乳液中，得到负载BDNF的微溶胶电纺溶液，最后将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维束。工艺参数：推进泵速度为60μL/min，电压15-18kV，针头距平行电极接收器15cm。

（2）胶原-BMSCs悬液的制备

（3）干细胞工程化活体定向纤维支架的制备

以上所述的制备方法制得的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架

实施例2

一、活体纤维支架的表征

1. 粒度仪（DLS）

将HA微溶胶溶于二氯甲烷中，高速搅拌后得到含有均匀微溶胶粒子的油包水(W/O)乳状液。通过粒度仪分析HA微溶胶粒子在二氯甲烷中的粒径分布。

2. 扫描电子显微镜（SEM）

将不同组别的纤维膜裁剪成合适大小后，通过导电胶将样品粘贴于SEM样品台上，使用离子溅射镀膜仪完成喷金过程后，用SEM观察纤维膜形态并拍摄图片，加速电压为10kV。通过Image J软件分别随机计数100根各组别纤维的直径，结果用纤维直径的分布图和平均直径表示。

3. 透射电镜（TEM）

纺丝过程中用铜网迅速收集少量静电纺丝纤维，通过透射电镜在120KV电压下观察单根纤维内部结构。

4. 能谱仪（EDS）

将不同组纤维膜裁剪至合适大小，通过EDS能谱分析仪进行纤维束表面化学元素组分研究，评估胶原自组装后纤维支架的表面元素变化。

5. 力学拉伸测试

在进行力学测试前，使用磨具将纤维膜制成条状（15.0 × 3.0 × 0.1 mm）备用。将纤维膜固定于力学测量仪的夹具上，以10mm/min的速度进行拉伸。根据所测得的拉伸数据，绘制相应的应力-应变曲线。

6. 降解性能检测

将各组纤维支架浸泡于装有30mL PBS的50mL离心管中，放置在37°C恒温摇床中，并且每天更换离心管中的PBS，固定时间点取样称重，并绘制相应降解曲线。

7. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

各样品经过溴化钾研磨制备成片状，之后扫描128次，分辨率4cm^-1，范围在500~4000cm^-1，检测胶原自组装后与PLLA纺丝之间形成的化学键。

8. 水接触角（WCA）

各组样品收集于细胞爬片上，在接触角仪表面分析系统上通过测量10s后的水接触角来评价支架的亲/疏水性。

9. 脑源性神经生长因子的体外释放

将10mg MS纤维束(理论上含有20ng BDNF)置于50ml离心管中，加入10mL含1%牛血清白蛋白(BSA)的 PBS浸泡。离心管被放置在37°C恒温摇床中，在不同时间点从离心管中收集浸出液，-20°C保存，并重新加入10mLPBS。用BDNF ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)测定MS纤维束中BDNF的释放量。根据BDNF在MS纤维中的初始包封量，绘制了释放曲线。

10. 微溶胶电纺丝核壳结构验证

为了观察细胞因子在HA芯内的存在和分布，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的BSA代替BDNF制备了更容易获得的带有荧光的电纺纤维。将电纺纤维收集在玻片上，并用自动荧光显微镜在明场和荧光下进行观察。

神经组织工程生物材料的纳米拓扑结构是影响细胞行为的重要因素之一，以上三组支架纤维均匀、取向高度统一，为轴突定向生长和引导神经纤维延伸提供了平台。PLLA为普通的电纺纤维，MS为负载BDNF的微溶胶电纺纤维束，MS@C为I型胶原自组装后的MS纤维束(图2A-B)(由于活体细胞主要发挥生物学作用，且加入后会对后续的部分表征造成干扰，因此在评价活体纤维支架的表面特征时，仅使用单纯的1型胶原蛋白)。分别从形貌、组成、水接触角和力学性能等方面进行了表征。从TEM图像可以看出，以均匀HA核为中心的MS纤维与纯的PLLA纤维明显不同，HA核的内径为0.15±0.03μm(图2C)。由于微溶胶电纺纤维的缓释能力在很大程度上依赖于其核壳结构，因此用FITC标记牛血清白蛋白(BSA)，并将其包裹到HA水溶胶中，示踪BDNF在MS纤维中的分布。发现异硫氰酸荧光素(FITC)标记的BSA呈相对均匀的分布于所有纤维中，为BDNF的缓慢稳定释放奠定了基础（图1 示意图中（A）制备负载BDNF的微溶胶电纺丝及其核壳结构的形成原理；（B-C）为干细胞工程化微/纳米纤维结构的构建过程以及组装机制的说明；（D）构建脊髓半切模型；（E）脊髓损伤后纤维支架在炎症高峰期、炎症平台期、神经恢复期的作用）。通过ELISA检测不同时间点BDNF浓度得出：4d内早期突释率为47.17±1.28%，随后缓慢持续释放4周。释放的BDNF总量为初始量的80%以上（图12A-B）。此外，从扫描电镜图像中随机选择了100根纤维，并对纤维直径分布进行了分析，结果显示PLLA和MS的平均直径分别为0.63±0.13μm和0.64±0.11μm，两者之间无显著差异(图10)，表明HA的加入对PLLA纤维的直径无明显影响。当MS纤维与I型胶原蛋白组装后，形成微米/纳米纤维的层次化结构，纤维平均直径较前者增粗至0.71±0.15μm，表明自组装的过程使胶原蛋白均匀的结合在MS纤维的表面，蜘蛛网状的胶原纤维更利于细胞的黏附爬行。用粒度仪(DLS)测量了分散在二氯甲烷溶液中的HA微溶胶粒子的尺寸分布，结果显示，微溶胶粒子的平均粒径为301.5nm，PDI指数为0.211，表明粒子的均匀性(图11B)。图11A为微溶胶电纺液体放大照。此外，粒径分布在2h内没有明显变化，说明微溶胶粒子在二氯甲烷溶液中是稳定的。然后，用傅立叶变换红外光谱(FTIR)对HA、I型胶原以及三种纤维支架的化学键进行了鉴定(图2H)。PLLA纤维支架红外光谱的特征是1750 cm^-1处C=O带的伸缩振动，MS纤维支架的红外光谱与PLLA纤维支架基本相同，没有出现特征HA带。因此，它们不能在红外光谱上被鉴别。单纯I型胶原有两个主要的特征带，分别在1650 cm^-1处有酰胺I(C=O)带，在1550 cm^-1处有酰胺II(N-H)带。同时，I型胶原与MS纤维自组装后在MS@C表面也发现了Col-I的两个特征峰，说明I型胶原与MS纤维束以酰胺键自组装成功。通过能量色散光谱(EDS)对PLLA、MS和MS@C表面元素含量的比较，评估了I型胶原蛋白自组装的情况(图2D)。正如预期的那样，与未加入I型胶原蛋白的两组纤维相比，MS@C中N元素(8.36%)的含量明显增加，这是因为胶原蛋白的元素组成中含有部分N元素，也进一步证明了纺丝与胶原形成的微纳米纤维束成功构建。

生物材料应在为组织修复和再生提供支持后逐渐降解，不应阻碍组织再生，因此可降解性是生物材料的重要特性。在体外降解研究中发现，三组支架都具备一定的降解能力，而MS@C支架的重量在第8天下降到72.99±2.58%，降解速度明显快于无胶原组支架。这是由于MS@C表面的胶原蛋白具有更加优异的降解能力。作为组织工程中最重要的因素之一，材料的疏水性/亲水性对生物相容性有很大的影响。PLLA纤维和MS纤维的水接触角分别为126.78±2.99°和125.34±2.15°，两者无显著差异。而胶原蛋白组装后，MS@C的表面接触角均显著降低约50°，约为74.02±1.74°(图2E)，表明I型胶原纳米纤维具有明显的亲水性。为了探索三组纤维支架的力学性能，进行了应力-应变测量，结果显示PLLA、MS、和MS@C纤维束的拉伸强度分别为2.75±0.26MPa、2.97±0.37MPa、和3.86±0.44MPa（图2F-G）。与PLLA纤维相比，MS纤维束的最大拉伸强度略有上升，可能是由于HA与PLLA形成的核壳结构。然而，在MS@C纤维束中发现机械容量显著增加，这可以归因于胶原纳米纤维的沉积。

实施例3

细胞在活体纤维表面的生长及分化

1. 细胞研究准备

大鼠骨髓间质细胞（BMSCs）是从4周龄雄性SD大鼠股骨和胫骨骨髓中提取的，骨髓来源巨噬细胞(BMM)是从6周龄雌性C57小鼠股骨和胫骨骨髓中提取的（已通过苏州大学附属第一医院伦理委员会批准）。在细胞培养前，首先用75%的乙醇浸泡收集在直径15 mm细胞爬片上的电纺纤维灭菌30min，然后如上所述进行胶原蛋白自组装，并在培养基(Gibco，USA)中浸泡过夜。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)消化计数三次，取其平均值，在不同的实验条件下，以不同细胞浓度接种于24孔培养板中的材料上。培养皿置于37°C、相对湿度为95%、CO₂分压为5%的细胞培养箱中。培养基每两天更换一次。

2. 细胞活/死荧光染色检测

为了评估不同组别上的细胞的活力，本发明在24孔板中以1×10⁵个细胞/毫升的浓度播种细胞（MS@C-MC组也在胶原蛋白溶液中加载相同数量的细胞），培养3天后，在室温下用活/死工作液染色30min，然后用正置荧光显微镜对染色的细胞拍摄。

将骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种于三组纤维支架上，通过检测细胞的活性、增殖、铺展和黏附来评价其生物相容性。首先通过活/死染色检测细胞活性，培养3d后用正置荧光显微镜评估BMSCs在纤维束表面的存活情况(图3C)。由于PLLA材料本身的疏水性，PLLA纤维束上的活细胞较少，死亡细胞较多，添加BDNF的MS纤维与PLLA纤维相同。虽然种植在组织培养板(TCP)上的细胞显示出最好的细胞活性，但MS@C-MC支架仍然比纯PLLA支架展示出更好的生物相容性。通过CCK8试剂盒进行细胞增殖实验，在培养1d、3d、5d后，检测BMSCs在不同支架上的增殖情况。总体而言，各组细胞增殖从1d到5d持续增加。此外，添加BDNF的MS组对BMSCs的增殖没有影响，这可能与培养时间相对较短有关。其余对比结果均与以往的细胞活力测定结果一致。此外，细胞生长状况的显著改善也反映了细胞存活率和增殖能力的差异。细胞骨架染色图像显示，骨髓间充质干细胞在PLLA和MS支架上的铺展情况无明显差异，均呈细长的形状，且伪足较少。而MS@C-MC支架表面的胶原蛋白形成的纳米级线性结构为BMSCs的铺展提供优越的条件，MS@C-MC组的细胞铺展面积与组织培养板(TCP)上的细胞相仿(图3A-3B)。

3. 细胞黏附性表征

为了证实I型胶原蛋白引起黏附改变的潜在机制，本发明把BMSCs在纤维支架上培养不同时间后，用4%多聚甲醛固定细胞，用含有0.5%Triton X-100（Sigma-Aldrich，美国）的溶液穿透细胞膜。为了避免非特异性染色，在4°C下用5%牛血清白蛋白(BSA，BioSharp，中国上海)封闭过夜。再用PBS冲洗后，用抗Integrinβ1的一抗或抗Vinculin的一抗在4°C孵育过夜，再分别用对应的二抗在室温下染色。最后，肌动蛋白和细胞核分别用鬼笔环肽和DAPI染色。取出样本在正置荧光显微镜下观察。用Image J软件对平均荧光强度进行半定量。

由于胶原上存在多种intergrin识别配体，如GFOGER和RGD，为了探讨其作用机制，本发明通过免疫荧光定量分析对intergrinβ1的表达进行了评估。由于缺乏I型胶原，在PLLA和MS支架上培养的细胞只表达少量的intergrinβ1，两者之间没有显著差异，而添加胶原蛋白的MS@C-MC支架的intergrinβ1的红色荧光信号明显增强，但三者都低于Control组，这是由于细胞培养皿具有更高的细胞外基质机械强度，能够为细胞提供更好的生物机械应力(图3A-B)。Vinculin作为Intergrin促进局灶性黏附(FA)的关键蛋白，可与细胞质中的肌动蛋白纤维结合，增强细胞与细胞、细胞与基质的黏附，传递细胞活动的机械信号。结果显示，在细胞边缘的丝状伪足和片状伪足的末梢中均有Vinculin的表达，表现为致密的点状绿色荧光。相反，PLLA和MS支架上的细胞几乎没有表达Vinculin信号（图3C）。然后，对平均荧光强度进行了半定量分析，三种支架的变化趋势与预期一致（图3D-F）。综上所述，MS@C-MC活体纤维支架中的I型胶原蛋白可在脊髓损伤后炎症早期促进BMSCs的生长黏附，减少细胞的扩散及死亡，极大的提高干细胞的移植率。

4. 成血管作用表征

为了评价MS@C-MC支架所负载的BMSCs的分泌组促进血管生成的能力，将250μl低生长因子的Matrigel基质胶加入到24孔板的每个孔中，轻轻摇动，防止气泡，然后置于37℃的细胞培养箱中1小时以形成凝胶。提前将PLLA、MS以及MS@C-MC支架放入高糖培养基，37℃浸泡48小时，获得培养基浸出液。每孔接种5×10⁴个的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并加入不同组别的浸出液培养基。然后将24孔板放在37°C和5%CO₂条件下孵育形成血管。分别培养3h和6h后，用4%多聚甲醛溶液固定HUVECs，用PBS清洗3次。用罗丹明标记的鬼笔环肽和DAPI分别对细胞肌动蛋白和细胞核进行染色。用倒置荧光显微镜拍摄荧光标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，并用Image J软件对3个随机区域的血管节点数量以及血管长度进行量化。

由于脊髓损伤破坏了脊髓原本的的血液供应，明显加重组织损伤，因而缺血成为继发性损伤的一大特征，脊髓微血管网络的重建会明显促进神经功能的恢复。多项研究证明间充质干细胞分泌组对血管形成起到了关键性的作用。通过Matrigel低生长因子基质胶上的血管形成实验检测血管生成，结果显示，血管内皮细胞孵育3h和6h后，PLLA组及MS组仅观察到少数管状结构(图4A-B），诱导出由细胞聚集体放射出的管状结构组成的初级血管样网络结构。通过计算不同时间点的平均管结长度和管长，进一步研究了MS@C-MC纤维所负载的BMSCs诱导成血管的能力。结果显示：MS组3h和6h的平均管长分别为3223.00±329.55µm和4838.67±187.48µm，MS@C-MC组3h和6h的平均管长分别为5793.67±232.29µm和8062.33±304.20µm，明显高于MS组(图4E-F)。MS@C-MC组与未负载BMSCs组相比，MS@C-MC组的平均管结长度和管长明显高于其他三组，这可能是由于间充质干细胞分泌的血管内皮生长因子，通过与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) 结合，抑制Caspase9 的活性，从而起到促进血管内皮细胞增殖、迁移和存活的作用。

5. 免疫调控作用表征

将支架和骨髓巨噬细胞（BMMs）通过Transwell进行共培养，以模拟纤维支架对SCI微环境中细胞间互动的影响。按照上述方法先用抗F4/80的一抗标记BMMs，再分别用抗INOS的一抗或抗CD206的一抗分别标记不同亚型的M1和M2巨噬细胞，用对应的二抗在室温下染色。最后，用DAPI给细胞核染色。取出样本在正置荧光显微镜下观察。用Image J软件对平均荧光强度进行半定量。通过QRT-PCR技术来评估炎症基因的表达水平。

急性脊髓损伤可诱导复杂的神经炎性微环境的产生，导致脊髓损伤的恢复受阻和进行性组织变性。先前的研究表明M2巨噬细胞对于组织愈合和再生是必不可少的。本发明通过Transwell共培养体系将三组纤维支架与骨髓巨噬细胞(BMMs)混合培养，模拟脊髓损伤微环境中纤维支架对细胞间相互作用的影响，评价神经纤维支架的生物学特性(图5C)。共培养7d后，采用qRT-PCR技术检测BMMs促炎和抗炎基因的表达。结果显示MS@C-MC组促炎基因IL-1β和TNF-α的表达相较于未负载BMSCs组下降明显，同时，抗炎基因IL-10、TGF-β的表达较其余两组及对照组有大幅度上升，与各组比较有显著性差异(图5F-I)。说明Transwell下室的BMSCs具有一定的免疫响应调节功能，可将M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞，抑制炎症基因的表达。因此得出结论：所构建的活体纤维支架对脊髓损伤炎症微环境有较高的响应性，支架所负载的BMSCs及时释放抗炎因子，诱导巨噬细胞极化为M2型。免疫荧光染色也发现类似趋势，各组BMMs标志物F4/80(红色荧光)均有高表达，表明BMM纯度较高。M1亚型标志物诱导型一氧化氮合酶INOS（绿色荧光）测定显示，MS@C-MC组的荧光半定量值为3.11±0.73，明显低于其他组(图5A，5D)。M2标记物CD206（绿色荧光）在MS@C-MC组呈高表达，荧光半定量值为14.84±1.09，明显高于其他组(图5B，5E)。证实在模拟脊髓损伤后炎症微环境下，MS@C-MC支架可以响应局部炎症，诱导BMMs分化为M2亚型。结合上述qRT-PCR和免疫荧光染色结果，该活体纤维支架能显著抑制BMMs促炎因子的分泌，促进抗炎因子的分泌，为后续神经以及血管再生创造良好的免疫微环境。

6. 细胞神经分化表征

为评价纤维支架对BMSCs神经分化的促进作用，分别对第5天和第14天纤维束上培养的BMSCs进行神经元特异性标志物染色。去除培养基，用上述方法固定，破膜，封闭，清洗后，加入Tuj-1（1:500，美国Abcam公司）和NF-200（1:200，美国Abcam公司）的一抗，4℃孵育过夜。PBS洗涤3次后，与二抗(1:400，Abcam，美国)室温孵育1h。细胞骨架和细胞核用鬼笔环肽和DAPI染色。用荧光显微镜观察和拍摄染色结果，并用ImageJ软件进行荧光半定量分析。同时采用QRT-PCR技术检测干细胞分化后神经元特异性标志物Tuj-1，NF-200，NSE和Tau蛋白的表达水平。细胞培养 5d，14d后分别提取总 RNA，逆转录成互补 DNA（cDNA）后进行基因表达分析。

脑源性神经生长因子（BDNF）作为一种广泛应用的生物活性因子，是神经营养因子家族的重要成员，能促进神经干细胞的增殖，提高神经轴突的生长能力，诱导神经干细胞分化为神经元。然而，BDNF作为大分子蛋白，存在生物半衰期短、稳定性差、不能通过血脑屏障等缺点，在脊髓修复过程中难以维持长期活性并达到理想的药代动力学特性，因此，通过微溶胶静电纺丝技术来实现BDNF的缓释，希望达到持续有效的促进干细胞向神经元方向分化的效果。采用骨髓间充质干细胞模拟脊髓内源性干细胞，来研究负载BDNF的电纺纤维的神经生物学效应。将BMSCs在不同纤维支架上分别培养5d、14d后，采用免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测神经元样细胞中类神经元细胞的神经丝蛋白NF-200和神经元细胞特异性分化微管蛋白(Tuj-1)的表达，以评价三组纤维支架的神经发生活性。免疫荧光染色图像(图4C-D)显示：培养5天后，BMSCs沿着纤维伸展方向有序生长，三组支架分别表现出不同程度的神经源性标志物的表达。MS组和MS@C-MC组两种BDNF负载的纤维支架均表现出典型的神经发生效应，干细胞表现出神经元样变，表现为胞体周围的轴突和树突状突起并且细胞内可捕捉到较强的绿色荧光信号，而非负载纤维(PLLA)和对照组细胞内的绿色荧光信号较弱。荧光信号的半定量分析也显示神经源性标志物在BDNF负载组的表达水平显著升高(图4G-H)。培养14天后，两组BDNF负载的纤维支架上细胞的轴突和树突状突起更加明显，并且细胞内的绿色荧光信号也比之前更加强烈，这也证明微溶胶电纺纤维具有保护并缓慢释放BDNF的功能，并能持续促进间充质干细胞的神经分化。同时，通过qRT-PCR(图4I-L)也可以发现类似的趋势，BDNF负载组神经元特异性标记基因的表达相较于非负载组显著增加，进一步证明了负载了BDNF的MS纤维的神经发生作用。综上所述，该活体纤维支架被证明能够指导BMSCs的细胞行为，包括粘附、增殖和进一步分化，这些都是体内诱导干细胞成神经分化所必需的。

实施例4

活体纤维支架的体内评价

1. 大鼠脊髓半横断模型建构建

共有100只雌性SD大鼠（约220-250克）购自JOINN实验室（中国苏州），并被随机分为五组。动物管理和手术均按照苏州大学附属第一医院伦理委员会批准的计划进行。本发明选择脊髓半横断模型来研究支架的体内性能。简而言之，本发明在大鼠腹腔注射戊巴比妥（50mg/kg）进行麻醉，麻醉成功后以T9为中心纵向切开３cm长度切口，分离椎旁肌肉，打开椎管，暴露T8-T10段脊髓，进行右侧脊髓半切形成长约4mm脊髓缺损，生理盐水冲洗后在缺损处分别放入修剪合适的三组纤维束支架，空白对照组不放入支架，假手术组不损伤脊髓组织。手术结束后连续肌注抗生素３天，由于排尿反射消失，每12小时人工按摩膀胱促进排尿，直至排尿反射恢复。

2. 体内示踪BMSCs与巨噬细胞表型的关系

首先将eGFP转染的BMSCs装入支架并移植到SD大鼠脊髓的断端。然后，在术后7天收集脊髓标本进行冷冻切片（MS@C-MC组为实验组，MS-MC组和MS组为对照组）腹腔麻醉后，将4%多聚甲醛和生理盐水分别注入大鼠左心室，快速收集脊髓标本，浸泡于4%多聚甲醛中过夜。脊髓标本在30%蔗糖冷冻保护剂中浸泡过夜后，冰冻切片，纵向厚度15μm，用CD206抗体进行免疫荧光染色，并用DAPI进行细胞核共染色。

3. 脊髓损伤局部免疫调控表征

各组支架植入一周后，按上述方法收集损伤部位的脊髓样本。以损伤部位为中心切取5 mm的损伤脊髓组织切片，切成小块，用100μm细胞过滤器机械分离。各组细胞悬液在4°C，300×g离心10min后加入抗体，4°C孵育30min，1%多聚甲醛固定。采用CD11b-PE-Cy7，CD86-APC，CD206-PE 3种抗体分别标记M0、M1、M2巨噬细胞，随后在流式细胞仪上对细胞进行分析，结果用FlowJo 7.6软件进行分析，每组随机抽取3份样品进行检测(n=3)。为了评估纤维束植入后的免疫调节功能，将术后7天收集的脊髓标本在乙醇中脱水，然后用二甲苯脱水。使用RNAprep Pure FFPE试剂盒（TIANGEN BIOTECH，中国）分离脊髓的总RNA。使用Hiscript II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒（Vazyme，中国南京）合成cDNA。通过QRT-PCR技术来评估炎症基因的表达水平。

4. 动物运动功能评估

应用旷场试验（open field test）BBB（Basso，Beattie，Bresnahan）法和斜扳试验（inclined plane test）对六组大鼠进行后肢神经运动功能恢复评价。BBB量表评分范围为0至21，0代表未见后肢运动，21表示运动功能正常。在每次测试期间，由两名不知情的检查者在术后1、2、3、4、6、8周单独进行评估。斜扳试验作为BBB评分试验的补充研究，能够提高评分的有效性和敏感性。具体实施方法：将大鼠放置于橡胶垫的斜板上，保持大鼠纵轴与斜板纵轴平行，头部朝向抬高一侧，从0°开始每次抬高5°停留5s，记录大鼠停留的最高角度5次记为测定值。角度越大，说明下肢承重能力越强。

5. 脊髓组织学分析

每组20只大鼠，随机分为4周组和8周组，在规定时间处死。采用上述方法，取脊髓长轴方向的5-μm切片，用HE染色试剂盒染色，在明视场显微镜下观察并拍照。用ImageJ软件测量各组脊髓腔面积，随机抽取3个视野进行统计学分析(n=3)。至于免疫组化评估，用0.3%过氧化氢修复抗原，用5%BSA封闭非特异性抗原。加入一抗，4°C孵育过夜，PBS洗涤后室温孵育1h。在荧光显微镜下观察和拍摄样品，并用ImageJ软件进行荧光强度分析。每组随机抽取3幅图像进行统计分析(n=3)。

尽管体外研究取得了很大的进展，但生物材料治疗脊髓损伤的体内性能仍然受到多种复杂的级联反应因素的影响。为了验证预想的脊髓神经再生，本发明引入了大鼠脊髓半离断模型，切断一侧脊髓，造成3 mm的脊髓半横断缺损，然后将神经支架放入缺损部位（图6A-B）。脊髓切片H&E染色显示，术后4周和8周，对照组缺损区边缘空洞均明显多于三种纤维支架组。其中PLLA、MS、MS@C-MC三组支架内及周围有较多的组织保存和纤维分布，并且细胞核呈长梭状改变，此外，MS@C-MC纤维支架上的BMSCs由于响应损伤局部急性炎症而发挥免疫调节作用，明显抑制损伤部位周围胶质细胞形成，并且在4周和8周两个时间点内的脊髓空洞均小于其他各组（图6C-D、图6G）。由此得出：活体纤维支架在脊髓损伤干细胞治疗中发挥了重要作用，如在损伤部位保留细胞，支持细胞生长，填补缺损，重建神经回路等。而BMSCs的免疫响应功能也在减少空洞形成中起重要作用。与之前体外研究结果一样，纤维支架都会随时间降解，其中MS@C-MC组支架周围未发现浸润的中性粒细胞和淋巴细胞，而PLLA组以及MS组支架周围均有浸润的中性粒细胞和淋巴细胞。这表明可完全降解的I型胶原蛋白在体内具有良好的生物相容性。

脊髓损伤后炎症引发的继发性损伤和胶质细胞的慢性包裹使得再生神经元和轴突很难突破瘢痕屏障并重建受损的组织，这是目前许多神经支架所遇到的一个难题。在本研究中，本发明将活体干细胞和神经源性营养因子同时引入，期待可以控制脊髓损伤早期炎症风暴，抑制瘢痕组织的形成并促进神经再生。巨噬细胞和小胶质细胞一般在脊髓损伤后7d内达到募集高峰，活体纤维支架应在此时间段内发挥免疫响应调节作用。在术后第7天，本发明首先采用流式细胞术测试它们是否可以诱导局部免疫细胞亚型的变化(图7A)。非活体纤维支架CD11b/CD86阳性巨噬细胞数略低于空白对照组，而负载干细胞的活体纤维支架不仅CD11b/CD86阳性巨噬细胞比例显著降低，而且CD11b/CD206阳性巨噬细胞比例明显增加（图7E-F）。与之前的体外免疫响应研究进行对比，体内纤维束对巨噬细胞极化的调节与体外实验结果略有不同，即非免疫调节纤维支架在体外研究中M1、M2型巨噬细胞比例与空白对照组无显著差异，但是在体内免疫响应研究中非免疫纤维组CD11b/CD206阳性巨噬细胞比例高于空白对照组。这一结果可能归功于三种纤维支架本身的拓扑结构特性，以前的研究表明，生物材料表面的拓扑结构也能影响细胞的发展轨迹。所以，本发明推测三组纤维支架表面的拓扑结构可促使巨噬细胞的形态从圆形向长梭形变化，同时细胞表型也向M2型巨噬细胞偏移。为了进一步验证本发明的猜想，通过qRT-PCR技术检测损伤后脊髓组织的BMMs促炎和抗炎基因的表达。结果显示MS@C-MC组促炎基因IL-1β和TNF-α的表达相较于未负载BMSCs组下降明显，同时，抗炎基因IL-10、TGF-β的表达较其余两组及对照组有大幅度上升，与各组比较有显著性差异（图7G-J）。总而言之，流式细胞仪分析以及qRT-PCR结果表明，体内植入三组纤维束都或多或少可促进局部BMM向M2表型极化，其中负载BMSCs的活体纤维支架效果最佳。

此外，为了更深入的研究支架所负载的BMSCs与巨噬细胞的相互作用关系，本发明将eGFP转染的BMSCs通过支架植入动物体内，7d后脊髓组织冰冻切片荧光染色显示：MS@C-MC组由于I型胶原蛋白的存在，脊髓组织中观察到了较强的绿色荧光，MS-MC组则是直接将细胞种植于MS纤维表面并植入体内，缺少I型胶原蛋白的作用，所以只观察到少量微弱的绿色荧光，而MS组没有检测到绿色荧光（图7B）。这可以充分证明I型胶原蛋白在炎症早期有利于干细胞黏附生长，大大提高干细胞的移植率和存活率。同时，3组脊髓组织内均可见CD206（红色荧光）标记的M2巨噬细胞分布，半定量分析显示：与含有BMSCs的MS@C-MC组相比，未负载干细胞的MS组的CD206水平显著降低，而MS-MC组由于干细胞移植率较低，故CD206水平与MS组相近(图7C-D)。上述结果证实随着支架移植入体内的干细胞可以长时间的存活并驻留在损伤部位，并积极响应炎症微环境，调节巨噬细胞向抑制炎症的方向极化。为进一步评估免疫调控复合纤维抗胶质瘢痕作用，本发明采用免疫荧光染色的方法，通过抗GFAP抗体（红色荧光）和抗NG2抗体（绿色荧光）分别标记术后4周及8周脊髓样本中活化星形胶质细胞和胶质瘢痕组织（图8A-D）。结果显示纤维支架移植组（PLLA、MS、MS@C-MC）在术后4周和8周两个时间点上活化的星形胶质细胞和瘢痕组织明显少于空白对照组(p<0.05)。荧光半定量结果（图8E-G）显示MS@C-MC组中活化星形胶质细胞和瘢痕组织荧光密度明显低于其他两个纤维移植组和空白对照组（p<0.05），证明载有BMSCs的活体纤维支架可以响应损伤后炎症反应，减少瘢痕组织的形成，更有利于内源性干细胞具有向损伤部位迁移，促使新生的神经元跨越脊髓断端，填补脊髓缺损。随后本发明又通过Nestin抗体（绿色荧光）标记损伤区域内内源性神经祖细胞归巢作用，以此来间接评价活体纤维支架的免疫调节功能。分别于术后4周和8周观察Nestin标记的细胞在损伤部位的分布（图9A-C）。Sham组神经祖细胞低于其他各组，可能是由于生理条件下，脊髓中室管膜细胞的低分化特性以及缺乏对Nestin蛋白的特异性结合。荧光半定量结果显示：在相同的时间点，MS@C-MC组比其他对照组能产生明显更多的Nestin阳性的细胞（图9E-H）。间接证明活体纤维支架在炎症急性期可通过免疫调节作用显着抑制周围瘢痕组织对内源性干细胞的抑制作用。

为评估各组纤维支架促进内/外源性干细胞成神经分化能力，本发明分别用TUJ-1和GAP-43对已分化的神经元和新生的轴突进行荧光标记。在术后4周和8周的时间点，BDNF从微溶胶电纺纤维中持续缓慢释放，并且诱导迁移来的内源性干细胞以及纤维支架上负载的外源性干细胞持续向神经细胞分化，因此在上述两组微溶胶电纺纤维支架中能够观察到大量Tuj-1标记的神经元（图9A-B），并且与空白对照组和PLLA组具有显著统计学差异。同时，两组负载BDNF的纤维支架在8周时的荧光强度均明显高于4周时的荧光强度，这一结果进一步证明该微溶胶静电纺丝纤维具有持续释放BDNF促进神经再生的功能。值得一提的是，由于MS@C-MC组在脊髓损伤炎症急性期具有免疫调节作用，瘢痕组织的形成明显减少，内源性干细胞迁移明显增多，因此在两个时间点，MS@C-MC组已分化神经元数量明显多于其他实验组。GAP-43标记的新生轴突荧光染色结果显示：Sham组的荧光强度低于其他各组。这是由于在正常生理条件下仅需维持脊髓的正常功能，故GAP-43表达较低，而在神经发育和再生过程中，需要GAP-43的高表达来调节轴突伸展，增强神经可塑性，释放神经递质。同时，MS@C-MC组GAP-43的荧光强度明显高于其他实验组，证明急性脊髓损伤时针对局部炎症反应的免疫调节可长期促进神经再生。此外，MS组以及MS@C-MC组在同一时间点均明显优于其他各组，提示持续补充BDNF明显有利于神经元的再生。有趣的是，随着时间的推移，除Sham组外，其余实验组4周的GAP-43表达均显著高于8周，这提示本发明，急性脊髓损伤后的早期是神经修复的黄金时期，在损伤急性期进行免疫干预，减轻炎性损伤，才能更好地促进神经再生。

神经纤维支架促进血管生成的能力也是脊髓修复的重要保证。研究表明，脊髓损伤区域新生血管的形成可以加快神经再生。在这里，本发明用CD31（绿色荧光）标记血管内皮细胞，用VWF（红色荧光）标记新生的血管来评估活体纤维支架的成血管能力（图9C-D）。结果显示，MS@C-MC组CD31标记的血管内源性细胞数量明显多于其他对照组，并且8周时血管内皮细胞明显多于4周。巧合的是，对VWF标记的新生血管半定量分析显示，MS@C-MC组在同一时间的荧光强度明显高于其他组，同样术后4周新生血管荧光强度显著低于8周（图9E-H）。证明了活体纤维支架在体内也可以通过BMSCs分泌的血管内皮生长因子，促进血管形成，为脊髓组织再生提供良好的条件。

最后本发明采用Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)和斜面试验(IPT)评定脊髓损伤后后肢运动功能障碍的恢复情况（图6E-F）。结果显示：随着时间的延长，各组大鼠的后肢运动功能均有不同程度的恢复。MS@C-MC组运动功能恢复明显优于其他组，BBB评分和IPT评分在脊髓损伤后各时间点均显著高于其他组。综上所述，活体纤维支架的植入可有效抑制脊髓损伤后的急性炎症反应，改善细胞生存的微环境，同时可以诱导内源性以及外源性干细胞分化为新的神经元，增加了损伤处的神经联系，促进继发性脊髓损伤后的神经修复。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，通过将胶原-BMSCs悬液滴在定向微溶胶静电纺丝纤维束上，然后恒温孵育得到促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架；

所述定向微溶胶静电纺丝纤维束的制备方法，包括：

S1：制备HA微溶胶；

2.根据权利要求1所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，制得0.5-2wt%HA微溶胶，然后将浓度为100µg/mL的5-20µL BDNF混合到10-20 µL HA微溶胶中，形成均匀的0.5-2%HA-BDNF微溶胶，所述BDNF浓度为8-120µg/mL；

接着将含有3-5mL二氯甲烷和0.005-0.02g的Span-80的溶剂混合物与负载BDNF的HA微溶胶混合，高速搅拌后得到含有均匀微溶胶粒子的油包水(W/O)乳状液；接着，将0.3-0.6gPLLA和1-3g DMF溶解在乳液中，得到负载BDNF的微溶胶电纺溶液，最后将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维束。

3.根据权利要求1所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，在S5中，静电纺丝的具体条件为：推进泵速度为60μL/min，电压15-18kV，针头距平行电极接收器15cm。

4.根据权利要求1所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，将I型胶原蛋白溶于乙酸中，然后在冰浴中将I型胶原蛋白溶液稀释在磷酸盐缓冲液中，调节pH值至6.8-7.5，得到胶原溶液，将BMSCs消化后离心，用所述胶原溶液重悬BMSCS，得到胶原-BMSCs悬液。

5.根据权利要求4所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，将冻干后的I型胶原蛋白以3 mg/mL的浓度溶于0.1M乙酸中；然后在冰浴中将I型胶原蛋白溶液以6：1的比例稀释在磷酸盐缓冲液中，并用0.1M氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，得到胶原溶液；再将BMSCs消化后离心，用所述胶原溶液重悬BMSCS，得到胶原-BMSCs悬液。

6.根据权利要求1所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，将胶原-BMSCs悬液需均匀的滴加于定向微溶胶静电纺丝纤维束上；然后将其放入37°C的细胞培养箱中孵育20-40分钟，得到促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架。

8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架或者权利要求7所述的促进神经再生的干细胞工程化活体定向静电纺丝支架在制备生物医用材料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备神经再生材料中的应用。