CN111494723A - 一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法 - Google Patents

一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：（1）醛基化阳离子脂质体的制备；（2）装载eGFP‑IL‑4质粒的脂质体的制备；（3）定向静电纺丝纤维膜的制备；（4）微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备。该微纳米纤维能够降低炎症反应、下调胶质纤维酸性蛋白分泌，减少瘢痕组织形成，促进血管生成，并持续释放NGF促进内源性干细胞神经分化能力及功能恢复。因此，该微纳米纤维是一种优先对脊髓损伤局部微环境免疫调控，而后为内源性干细胞提供神经分化平台为治疗目的的创新性响应性序贯式免疫调控和促神经再生的功能性生物支架，其为组织工程治疗脊髓损伤提供一种新策略。

Description

一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备 方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法。
背景技术
脊髓损伤导致损伤平面以下感觉和运动功能永久性改变甚至丧失，目前仍是人类医学进程中无法攻克的难题。原发性脊髓损伤后局部组织缺血坏死、炎症浸润、自由基氧化应激反应造成H+浓度升高形成酸性环境进一步破坏周围组织，同时炎症因子侵入引起继发性脊髓损伤逐步加重损伤程度。继发性脊髓损伤累及病变范围远超过原发性脊髓损伤，其中中枢神经系统激活的小胶质细胞和外周来源巨噬细胞是该免疫炎症反应主要参与者，研究表明脊髓损伤后活化的小胶质细胞和巨噬细胞在脊髓损伤后3天局部达到峰值，并且可极化为“经典活化”M1型和“替代活化”M2型两个细胞亚群，由于M1型巨噬细胞分泌炎症因子，因此被称为促炎细胞，M2型巨噬细胞分泌抑制炎症因子，被描述为抑炎细胞，所以小胶质细胞和巨噬细胞的精准调控在脊髓损伤修复过程中十分重要。因此，如何能在原发性脊髓损伤前期进行免疫调控避免或减轻继发性脊髓损伤，并持续为干细胞提供神经分化平台成为目前的挑战。组织工程提出生物材料、种子细胞、生物因子三大要素，其中生物材料不仅为种子细胞粘附、增殖、分化提供理想平台，而且作为生长信息媒介成为核心部分。具有仿生结构的定向静电纺丝纤维被多次应用于神经组织修复研究中，但是静电纺丝仍然存在负载药物突释，药物流失过快、浓度过低等难题。前期，我们课题组开发的微溶胶静电纺丝技术与乳液电纺和同轴电纺相比具有显著优势：设备简单、过程稳定、载药率达80％、释放可达6周以上，为水溶性药物和蛋白类分子缓释开辟了一条新途径。此外，阳离子脂质体具备类细胞膜结构，可直接通过脂质交换、吸附、内吞等作用进入细胞内部为非病毒基因载体提供一新平台，而且非病毒基因转染载体介导的瞬时转染具有明显降低毒性和免疫反应，携带基因不整合到宿主基因组等优势。更重要的是有研究表明将静电纺丝技术与阳离子脂质体结合在组织再生和修复过程中更有成效。
除了生物材料，生物因子作为组织工程中引导和协调组织内部活动的重要成员。白细胞介素-4(IL-4)是趋化因子家族的一员，由白细胞分泌并在白细胞之间发挥调节作用的细胞因子，可与巨噬细胞表面受体结合使STAT6磷酸化，通过PI3K/AKT信号通路诱导Th2型免疫反应，能够促进组织修复和减轻炎症免疫应答。更有文献报道，IL-4可为中枢神经系统保护作用和促进内源性干细胞迁移至损伤部位为神经修复创造更有利微环境，并且IL-4在神经系统中可间接促进施旺细胞迁移、合成和释放神经生长因子。神经生长因子(NGF)具有营养神经元和促进轴突生长双重生物学作用，并在促进内源性干细胞向神经分化中扮演重要角色。在脊髓损伤所致病理条件下，局部神经生长因子消耗殆尽导致保护神经元和促进神经再生特性受损，因此在修复脊髓损伤时持续供应神经生长因子势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，该微纳米纤维的制备受脊髓损伤病理酸性微环境启发，采用酸敏感性席夫碱键成功将负载NGF的氨基化定向微溶胶静电纺丝纤维束与负载IL-4质粒的醛基化阳离子脂质体组装，构建出响应脊髓损伤微环境序贯免疫调控和促神经再生的功能性微纳米纤维支架。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：
(1)醛基化阳离子脂质体的制备
采用逆向蒸发法制备醛基化阳离子脂质体，首先将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基(DSPE-PEG-CHO)溶解于三氯甲烷中，加入溶解于三氯甲烷的十八胺进行超声混合得到均匀乳液，然后于旋转蒸发器中去除有机溶剂，得到胶体产物，最后加入去离子水进行水化处理，制备出脂质体乳液；将脂质体乳液经超声后通过聚碳酸酯膜过滤得到醛基化阳离子脂质体；
(2)装载eGFP-IL-4质粒的脂质体的制备
将Opti-MEM培养基加入离心管中，再加入eGFP-IL-4质粒和醛基化阳离子脂质体，轻微晃动后室温下静置配置成混合溶液，即制得装载eGFP-IL-4质粒的脂质体溶液；
(3)定向静电纺丝纤维膜的制备
将透明质酸钠水溶液和β-NGF的BSA溶液制备透明质酸钠-β-NGF水溶胶，再向其中加入Span-80和DCM，于室温高速搅拌得到负载有β-NGF的透明质酸钠微溶胶颗粒的油包水乳液体系，最后依次加入aPLA和DMF制得微溶胶静电纺丝液；将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维膜；
(4)微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备
将步骤(3)制得的定向静电纺丝纤维膜浸入步骤(2)制得的装载eGFP-IL-4质粒的脂质体溶液中，于37℃烘箱中孵育不小于24h，装载eGFP-IL-4质粒的脂质体接枝在定向静电纺丝纤维膜的表面，即制得微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维。
进一步的，所述步骤(1)的具体条件为：采用逆向蒸发法制备醛基化阳离子脂质体，首先160mg大豆卵磷脂、40mg胆固醇、4mg醛基磷脂溶解于5mL三氯甲烷中，称取5mg十八胺溶解在1mL三氯甲烷中，将两者混合后进行超声得到均匀乳液，之后于旋转蒸发器中去除有机溶剂，得到胶体产物，最后加入去离子水进行水化处理，制备出脂质体乳液，经过超声和450nm、220nm聚碳酸酯膜过滤得到醛基化阳离子脂质体。
进一步的，所述步骤(2)中eGFP-IL-4质粒和醛基化阳离子脂质体的质量体积比以μg/μL计为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
进一步的，所述步骤(3)中微溶胶静电纺丝液的具体制备条件为：制备质量分数为1wt％的透明质酸纳溶液，β-NGF重悬于0.1wt％BSA溶液中最终浓度为100μg/mL，将10μLβ-NGF与50μL 1wt％透明质酸纳溶液混合制得透明质酸纳-β-NGF水溶胶，再加入0.01g Span-80和4g DCM，室温下高速搅拌30min，得到负载有β-NGF的透明质酸纳微溶胶颗粒的油包水乳液体系；最后依次加入0.5g aPLA和2g DMF制得微溶胶纺丝溶液。
进一步的，所述步骤(3)中静电纺丝的具体条件为：推进泵速度为70μL/min，电压15-18kV，针头距平行电极接收器15cm。
以上所述的制备方法制得的微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维。
有益效果：本发明提供了一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，在本研究中受脊髓损伤后局部呈炎症酸性环境启发，采用酸敏感性化学键席夫碱将醛基磷脂修饰的负载IL-4质粒(pDNA)的阳离子脂质体嫁接到负载神经生长因子(NGF)的氨基化定向微溶胶静电纺丝纤维束表面，使用该方法制备的微纳米纤维通过一系列材料学测试、细胞实验及动物研究，证明该微纳米纤维支架具有快速响应微环境进行免疫调控，显著性降低炎症反应、下调胶质纤维酸性蛋白分泌，减少瘢痕组织形成，促进血管生成，并持续释放NGF促进内源性干细胞神经分化能力及功能恢复。因此，本发明制得的微纳米纤维是一种优先对脊髓损伤局部微环境免疫调控，而后为内源性干细胞提供神经分化平台为治疗目的的创新性响应性序贯式免疫调控和促神经再生的功能性生物支架，其为组织工程治疗脊髓损伤提供一种新策略。
附图说明
图1(A)为仿生免疫调控微纳米纤维制备示意图；(B)为微纳米纤维微环境响应免疫调节和促进神经分化作用示意图。
图2(A)为醛基化阳离子脂质体TEM图；(B)为不同比例IL-4质粒/醛基化阳离子脂质体复合物粒径分布和PDI分析图；(C)为不同比例IL-4质粒/醛基化阳离子脂质体复合物表面电荷分析图；(D)为不同比例IL-4质粒/醛基化阳离子脂质体复合物包封率检测结果图。
图3为不同比例IL-4质粒/醛基化阳离子脂质体复合物转染效率测定及筛选结果图，(A)为转染BMSCs 72h后GFP绿色荧光图；(B)转染荧光共定位分析图；(C)ELISA检测转染后IL-4分泌量结果图。
图4为微纳米纤维束形貌表征图，(A)为席夫碱键将醛基化阳离子脂质体与氨基化聚乳酸微溶胶静电纺丝纤维组装示意图；(B-D)不同纤维SEM图；(E-G)不同纤维粒径分布图；(H-J)不同纤维TEM图；(K-M)不同纤维XPS分析图；(N-P)不同纤维AFM分析图。
图5为微纳米纤维理化性能表征图，(A)各纤维力学拉伸特性分析图；(B)各纤维降解性能分析图；(C)各纤维FITR分析测试图；(D)IL-4质粒接枝前后浓度变化分析图；(E)不同pH环境中IL-4质粒释放曲线图；(F)不同pH环境中NGF释放曲线图。
图6为细胞增殖分析图，(A)BMSCs活死染色图；(B)活细胞染色荧光定量分析图；(C)CCK-8检测细胞增殖图。
图7为细胞粘附表征图，(A)不同纤维Integrinβ1荧光染色图；(B)荧光染色半定量分析图；(C-F)各组纤维上BMSCs黏附形貌SEM图。
图8为不同pH培养环境中微纳米纤维免疫调控骨髓巨噬细胞极化PCR分析图，(A-C)各组IL-1β基因表达图；(D-F)各组TNF-α基因表达图；(G-I)各组IL-10基因表达图；(J-L)各组TGF-β基因表达图。
图9为不同pH培养环境中微纳米纤维免疫调控骨髓巨噬细胞极化ELISA检测图，(A-C)各组IL-1β分泌检测图；(D-F)各组TNF-α分泌检测图；(G-I)各组IL-10分泌检测图；(J-L)各组TGF-β分泌检测图。
图10为各组纤维神经特异性标记物荧光染色图，(A-C)各组纤维上BMSCs神经分化后NF-200染色图，荧光定量分析和相应基因表达图；(D-F)各组纤维上BMSCs神经分化后NSE染色图，荧光定量分析和相应基因表达图；(G-I)各组纤维上BMSCs神经分化后Tau蛋白染色，荧光定量分析和相应基因表达图；(J-L)各组纤维上BMSCs神经分化后Tuj-1染色，荧光定量分析和相应基因表达图。
图11为大鼠体内实验取材时间轴及运动功能评分图，(A)动物脊髓损伤模型构建图：(a)免疫调控微纳米纤维图；(b)充分暴露T9脊髓；(c)T9脊髓半切；(d)纤维移植；(e-h)大鼠分别术后、术后7天、术后4周、术后8周图；(B)术后大鼠运动功能BBB评分；(C)术后大鼠运动功能IPT评分。
图12为大鼠术后7天免疫调控表征图，(A)IL-4荧光单标和TNF-α、IL-10荧光双标图；(B)IL-4荧光半定量分析图；(C)IL-10和TNF-α荧光半定量分析图。
图13为大鼠术后4周和8周活化星形胶质细胞和瘢痕组织荧光染色图，(A、C)活化星形胶质细胞荧光染色图及相应荧光定量分析图；(B、D)脊髓瘢痕组织荧光染色图及相应荧光定量分析图。
图14为大鼠术后4周和8周神经干细胞和神经元免疫荧光染色图，(A、C)神经干细胞免疫荧光染色及相应荧光定量分析图；(B、D)神经元免疫荧光染色剂相应半定量分析图。
图15为大鼠术后4周和8周血管内皮细胞免疫荧光染色及相应荧光定量分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：
(1)醛基化阳离子脂质体的制备
采用逆向蒸发法制备醛基化阳离子脂质体，首先160mg大豆卵磷脂、40mg胆固醇、4mg醛基磷脂溶解于5mL三氯甲烷中，称取5mg十八胺溶解在1mL三氯甲烷中，将两者混合后进行超声得到均匀乳液，之后于旋转蒸发器中去除有机溶剂，得到胶体产物，最后加入去离子水进行水化处理，制备出脂质体乳液，经过超声和450nm、220nm聚碳酸酯膜过滤得到醛基化阳离子脂质体。
(2)装载eGFP-IL-4质粒的脂质体的制备
准备5个1mL离心管，编号A-E，每管中加入100μL Opti-MEM培养基，之后如表1所示剂量，分别加入eGFP-IL-4质粒(pDNA)和醛基化阳离子脂质体(aLiposome)，轻微晃动后室温下静置30min配置成pDNA/aLiposome比为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3的混合溶液(aL/p)。
表1 pDNA/aLiposome分组
Figure BDA0002461633030000051
筛选pDNA/aLiposome转染效率：
将SD大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs按密度2.5×104/孔种植于24孔板，待融合率约70％，吸出培养基PBS洗涤3次，各孔加入100μL上述负载不同比例aL/p溶液，之后每孔再加Opti-MEM 400μL。6h后更换培养液为含血清培养液(10％FBS)，每孔500μL。72h后用PBS清洗3次，加入200μL hoechst33342染色液进行活细胞核染色，37℃培养箱中孵育30min，PBS清洗后在荧光显微镜下观察拍摄eGFP基因表达荧光图片，并通过ImageJ1.8.0(USA)软件进行荧光共定位分析，评估各浓度aL/p转染效率。同时对BMSCs转染1、3、5、7天时收集培养液并4℃速度1200rpm离心15分钟，之后收集上清存放于-80℃环境中，用IL-4ELISA试剂盒(Abcam，ab100770)定量各浓度aL/p转染BMSCs后分泌IL-4，筛选转染效率最高，IL-4分泌量最大浓度aL/p，进行后续研究。
(3)定向静电纺丝纤维的制备
聚乳酸静电纺丝液制备：称取0.5g aPLA加入4g二氯甲烷(DCM)中，室温下用磁力搅拌器进行高速旋转搅拌直到形成均一稳定溶液，之后加入2g N-N二甲基甲酰胺(DMF)继续搅拌，制备出透明均一的纺丝溶液。
微溶胶静电纺丝液制备：称取0.1g透明质酸钠(HA)颗粒溶解于9.9g去离子水中，室温下旋转至完全溶解制成质量分数为1wt％透明质酸溶液；β-NGF重悬于0.1wt％BSA溶液中最终浓度为100μg/mL，将10μL β-NGF与50μL1wt％透明质酸溶液混合，得到均匀1％HA-β-NGF水溶胶，再加入0.01g Span-80和4g DCM，室温下高速搅拌30min，得到均一稳定负载有β-NGF的HA微溶胶颗粒的油包水(W/O)乳液体系。最后依次加入0.5g aPLA和2g DMF制得微溶胶(MS)静电纺丝溶液。
不同静电纺丝定向纤维制备：将上述两种纺丝液分别加入接有长度10cm，内径0.9mm钢针的10mL注射器中，设置推进泵速度70μL/min，电压约15-18kV，针头距平行电极接收器约15cm，获得传统静电纺丝定向纤维(aP)和微溶胶静电纺丝定向纤维(MSaP)。后续研究中定向纤维膜应用于体外研究中，纤维束用于动物体内研究。所制备的静电纺丝支架为去除表面残留的溶剂，在使用前都经过过夜真空干燥。
(4)微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备
将微溶胶静电纺丝纤维膜(MSaP)浸入5mL上述筛选出脂质体溶液中，放置在37℃烘箱内，设置接枝时间至少24h，制得MSaP-aL/p，即为微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维。
实施例2
一、醛基化阳离子脂质体理化特性表征及筛选
1.透射电镜(TEM)
取醛基化阳离子脂质体2μL滴在铜网上，并在室温下干燥4h应用透射电镜(TEM，HitachiHT7700)电压在120kV时观察醛基化阳离子脂质体表面形态。
2.醛基化阳离子脂质体粒径及表面电荷检测
分别取2mL各比值阳离子脂质体和质粒复合溶液，使用动态光散射粒度分析仪(DLS)检测大小、多分散性指数、动电位。
3.包封率检测
分别将1mL阳离子脂质体和质粒复合溶液样品加入超滤离心管中，设置离心机速度为5000rpm，离心5min。之后加入500μL去离子水重复离心三次。收集底部液体，使用dsDNA试剂盒定量未包封pDNA，之后按下列公式计算：
Figure BDA0002461633030000071
构建筛选并组装仿生微纳米结构生物材料作为研究出发点。用醛基磷脂修饰和十八胺改性脂质体作为非病毒转染载体，通过酸敏感性化学键-席夫碱接枝氨基化聚乳酸微溶胶静电纺丝定向纤维，以实现率先调节脊髓损伤免疫微环境和持续释放NGF促神经再生。首先，制备醛基化空白阳离子脂质体(aL)通过透射电镜(TEM)(图2A)观察，表明具有磷脂双分子层类细胞膜结构。配置不同比例pDNA/aLiposome后，通过动态光散射粒度分析仪检测发现随pDNA占比下降，脂质体粒径减小而表面电荷增大，但多分散性指数无明显改变(图2B,C)，这是由于带正电荷脂质体与负电荷pDNA存在相互静电吸附作用，因此当pDNA被负载到阳离子脂质体内部时也会吸附在脂质体表面增加脂质体整体粒径并降低其表面电荷，该现象正如阳离子脂质体与带负电细胞膜或核算之间静电相互作用一样，多分散性指数较稳定证明各组pDNA/aLiposome溶液粒径分布均一。本研究中所使用的pDNA分子量为10.4kb，因此选择500kDa超滤离心管通过透析法测定不同比例pDNA/aLiposome包封率(图2D)，表明当pDNA占比下降，包封率分别为50.79±0.69％，56.24±1.91％，65.09±1.56％，72.86±0.72％，75.77±1.56％，呈逐渐下降态势，推测这一结果是因如上述pDNA比例较高时，阳离子脂质体表面所带电荷数下降，二者静电吸附作用减弱所致。
4.转染效率检测及筛选
将SD大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs按密度2.5×104/孔种植于24孔板，待融合率约70％，吸出培养基PBS洗涤3次，各孔加入100μL上述负载不同比例aL/p，之后每孔再加Opti-MEM400μL。6h后更换培养液为含血清培养液(10％FBS)，每孔500μL。72h后用PBS清洗3次，加入200μLhoechst33342染色液进行活细胞核染色，37℃培养箱中孵育30min，PBS清洗后在荧光显微镜下观察拍摄eGFP基因表达荧光图片，并通过ImageJ1.8.0(USA)软件进行荧光共定位分析，评估各浓度aL/p转染效率。同时对BMSCs转染1、3、5、7天时收集培养液并4℃速度1200rpm离心15分钟，之后收集上清存放于-80℃环境中，用IL-4ELISA试剂盒定量各浓度aL/p转染BMSCs后分泌IL-4，筛选转染效率最高，IL-4分泌量最大浓度aL/p，进行后续研究。
虽然非病毒载体具有低毒性、低免疫原性，目的基因不整合到宿主基因组中的优势，但转染效率较低是其不可忽视的缺陷，因此加入十八胺改性脂质体使其表面带正电荷，优势有二：1.提高带负电荷pDNA包封率；2.通过静电吸附作用更易与负电荷细胞膜或核酸相互作用，提高转染率。对BMSCs转染72h观察eGFP荧光强度并进行细胞核与eGFP荧光共定位重复率分析(图3A,B)显示各组间转染差异较大，其中比例在1:2.5时，荧光共定位重复率最高(0.69±0.005％)。同时，在不同时间点检测IL-4的分泌量(图3C)，提示比例在1:2.5时IL-4保持最大分泌量，第5天分泌量达到顶峰(922.12±63.99pg/mL)，与上述荧光共定位结果相同，证实pDNA/aLiposome比为1:2.5时具有最高转染效率。
二、响应性免疫调控微纳米纤维的理化特性表征
1.扫描电子显微镜(SEM)
将不同组别的纤维膜裁剪成合适大小后，通过导电胶将样品粘贴于SEM样品台上，使用离子溅射镀膜仪完成喷金过程后，用SEM观察纤维膜形态并拍摄图片，加速电压为10kV。通过Image J软件分别随机计数100根各组别纤维的直径，结果用纤维直径的分布图和平均直径表示。
2.透射电镜(TEM)
纺丝过程中用铜网迅速收集少量静电纺丝纤维，通过透射电镜在120KV电压下观察单根纤维内部结构。
3.X射线光电子能谱分析(XPS)
将不同组纤维膜裁剪至合适大小，通过X射线光电子能谱分析仪进行纤维束表面化学元素组分研究，评估脂质体与纺丝膜接枝后表面元素变化。
4.原子力学显微镜(AFM)
裁剪各组纤维膜至合适大小，放置于原子力学显微镜托盘中进行纤维束表面拓扑形貌观察，分析纤维束表面粗糙度评估脂质体接枝在纤维束上。
通过扫描电镜(SEM)观察各纤维形貌，其中MSaP-aL/p纤维表面具有明显接枝的脂质体，但是部分纤维发生融合，推测可能是由于aPLA及磷脂都属于脂溶性物质，因此在接枝过程中发生邻近纤维融合。同时说明经过平行电极接收装置，可以收集到较规则定向纤维(图4B,C,D)。此外，通过ImageJ软件在所摄SEM图中随机选择100根纤维进行粒径统计并绘图(图4E,F,G)，发现各组纤维粒径分布为0.54±0.17μm、0.56±0.13μm、0.57±0.19μm，提示各组粒径分布无统计学差异(p＞0.05)，表明接枝过程中对纤维粒径分布无明显影响。
微溶胶静电纺丝显著优势在于制备核壳结构纺丝设备简单、载药率高和延长释放周期，因此评估其内部结构特性至关重要。通过透射电镜(TEM)对各组纤维内部结构分析显示(图4H,I,J)，MSaP和MSaP-aL/p组具有明显核壳结构，同时MSaP-aL/p表面存在脂质体。
氨基化聚乳酸通过微溶胶静电纺丝技术加工以及接枝脂质体后，表面化学性质发生改变，为明确并定量各纤维支架表面化学元素成分，通过X射线光电子能谱(XPS)分析(图4K,L,M)，显示aP和MSaP纤维表面碳峰(C 284.9eV)、氮峰(N 398.8eV)、氧峰(O 533.4eV)无明显增加，提示纤维表面基本不存在加入HA微溶胶颗粒。但是在MSaP-aL/p纤维表面碳峰、氮峰、氧峰均明显升高，并且出现磷峰(P 133.0eV)，提示醛基化阳离子脂质体接枝在聚乳酸微溶胶静电纺丝表面。
利用Nanoscope Analysis 1.7软件对原子力学显微镜(AFM)图像测量表面平均粗糙度(Ra，roughness)，在图4N,O,P高度图显示微纳米纤维(aP、MSaP)表面的Ra分别为249nm、440nm，而MSaP-aL/p纤维Ra为648nm，并且进一步观察相图可发现MSaP-aL/p纤维表面存在圆形凸起的脂质体。综合上述结果证实构建的仿生支架表面确实存在脂质体。
5.力学拉伸测试
在进行力学测试前，使用磨具将纤维膜制成条状(15.0×3.0×0.1mm)备用。将纤维膜固定于力学测量仪的夹具上，以10mm/min的速度进行拉伸。根据所测得的拉伸数据，绘制相应的应力-应变曲线。
6.降解性能检测
将各组纤维膜浸泡于装有30mL的50mL离心管中，每天取样称重，并绘制相应降解曲线。
7.傅里叶变换红外光谱(FTIR)
各样品经过溴化钾研磨制备成片状，之后扫描128次，分辨率4cm-1，范围在500～4000cm-1，检测醛基化阳离子脂质体与氨基化聚乳酸静电纺丝支架之间形成酸敏感性席夫碱键。
8.pDNA装载率分析
将接枝有脂质体的纤维支架浸入含有0.5％Triton的去离子水溶液中溶解磷脂，如前所述应用dsDNA试剂盒定量pDNA通过脂质体固定在纤维支架的装载量，与原始pDNA浓度和脂质体包封率比较，计算pDNA接枝在纤维支架的装载率。
9.阳离子脂质体酸敏感性体外释放
将脂质体接枝的纤维支架分别浸泡于装有10mL PH＝7.4、PH＝6.6、PH＝5.8PBS的50mL离心管中。所有离心管都放置于37℃，120cycles/min的恒温振动器中来研究不同酸性环境对席夫碱影响。分别在第3、6、7、12、15、18、21、24h时间点上收集释放液存放在-20℃，并且重新加入新鲜的10mL PBS。通过磷脂检测试剂盒，测量释放液中脂质体含量，绘制脂质体敏感性释放曲线。
10.神经生长因子的体外释放
将各组纤维膜浸泡于装有10mL PH＝7.4、PH＝6.6、PH＝5.8PBS的50mL离心管中。所有离心管都放置于37℃，120cycles/min的恒温振动器中来研究不同酸性环境对微溶胶静电纺丝核壳结构中NGF释放影响。通过ELISA法，测量释放液中NGF的含量并绘制相应释放曲线。在仿生支架植入后无椎管保护，易受到周围组织牵拉作用影响，因此支架的机械应力和弹性对维持自身的稳定非常重要。如图5A所示，所有纤维支架的应力-应变曲线都表现出一定的抗拉强度。由于氨基化聚乳酸以及HA核壳存在，导致MSaP最大拉伸强度有所下降。但是MSaP-aL/p最大拉伸强度得到提升，主要原因是脂质体介入后二者通过化学键连接，并且两种脂溶性物质发生部分融合，因此不但增强了支架力学性能，而且可为干细胞提供更为良好的生物机械硬度。
生物材料植入后，为组织提供修复和再生支持后应逐步降解，不应阻碍组织再生，因此可降解性是生物材料的重要属性。体外降解研究中(图5B)，发现MSaP-aL/p在第6天重量下降到89.48±0.59％，降解速率明显大于其他支架(p＜0.05)。这是由于亲水基团氨基改善聚乳酸疏水性质，加快主链上酯键水解反应，此外具有亲水特性的脂质体更加快这一作用。
从上述纤维扫描电镜形貌表征中可明显观察到醛基化阳离子脂质体存在于氨基化聚乳酸微溶胶静电纺丝纤维表面，发挥响应性作用的酸敏感性化学键席夫碱通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)检测如图5C所示。与单纯PLA纤维相比，氨基化聚乳酸在3420cm-1处出现明显NH2条带，从图中可以看出在aPLA与MSaP两个纤维膜红外光谱相同，没有出现HA特征波段，证明在微溶胶纺丝过程中所有微溶胶颗粒纳入纺丝内部。在引入无醛基化脂质体后1720cm-1处出现C＝0条带，对比醛基化脂质体整合后未观察到C＝O条带，但在1655cm-1出现一个新的条带(-C＝N-)，证实酸敏感性化学键席夫碱成功将醛基化阳离子脂质体稳定接枝在氨基化聚乳酸微溶胶纤维膜表面。
pDNA整合在纤维膜表面有部分损耗，因此明确接枝效率十分重要。将筛选比例负载pDNA的醛基阳离子脂质体接枝后去离子水清洗3次，通过TritonX-100破乳及dsDNA试剂盒检测如图5D所示，pDNA初始浓度为1.16±0.06μg/μL，而整合在纤维膜表面的pDNA浓度约0.22±0.01μg/μL，因此纤维膜携带pDNA约为初始浓度19％。
脊髓神经细胞受损后表达损伤相关分子模式(DAMPS)，由损伤部位细胞释放的小分子和蛋白质，主要作用是促进炎症细胞归巢，多种免疫细胞短时间内出现在损伤局部，其中巨噬细胞在12-24h内出现，随后分泌大量炎性因子以及损伤处局部血管遭受严重破坏并诱使局部pH下降，导致损伤局部呈现酸性环境，因此响应性纤维支架敏感性通过浸入不同pH的PBS评估(图7E,F)。在pH5.8和pH6.6的酸性环境中，释放的脂质体随时间逐渐升高，并且pH5.8PBS中脂质体9h达61.66±1.38％，在24h内释放量趋于完全，其释放速率明显大于其他纤维支架(p＜0.05)。表明MSaP-aL/p对酸性环境可快速做出响应。微溶胶纤维支架释放NGF特性同时进行评测，结果显示在pH5.8的酸性环境中释放速率得到小幅提升，在第10天释放量达到71.64±1.82％，能够快速为归巢的神经祖细胞提供分化信息，释放时间依然可以持续约40天。证明微溶胶纤维对酸性微环境发生轻度响应，与对照组无统计学差异(p>0.05)，可持续为神经祖细胞分化提供理想平台。同时经检测，本研究中所构建微溶胶静电纺丝负载NGF包封率为79.53±1.44％。
实施例3细胞在微纳米纤维表面的生长及分化
1.细胞研究准备
在细胞研究前，将收集在直径为15mm，厚度100μm盖玻片上的纤维支架轻柔放置在Transwell板底部并通过辐照灭菌处理，之后按如上所述方法接枝负载pDNA的醛基化阳离子脂质体，并放置于37℃细胞培养箱内。按密度为1×104/孔的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)种植于纤维支架上，上层小室种植密度为5×103/孔的SD大鼠骨髓巨噬细胞(BMM)，将Transwell板置于37℃，相对湿度95％，CO2分压5％培养箱中进行共培养。培养基每2-3天更换一次。将无纤维支架组(Control)，传统纤维支架(aP)、微溶胶纤维支架(MSaP)、空白脂质体接枝的微溶胶纤维支架(MSaP-aL/p)作为对照组。
2.细胞活/死荧光染色检测
使用活死染色试剂盒对培养三天的BMSCs染色评估在不同纤维支架的生存能力。染色的细胞通过荧光显微镜观察拍摄。最后使用ImageJ软件对荧光图片进行半定量分析。
3.CCK-8细胞增殖实验
配置细胞计数试剂盒-8与培养基体积比为10％的混合培养基，分别对种植后1、3、5天的BMSCs增殖情况检测。4小时孵育后，吸取100μL混合培养基到96孔板中，使用酶标仪设定检测波长为450nm。所有试验都重复三次。
对细胞生存和增殖情况进行相应评估中，随机选取10个不同视野统计纤维膜上培养3天后活细胞和死细胞数目，由于细胞培养板较氨基化聚乳酸纤维更能为细胞提供更良好机械应力，因此在各纤维膜中活细胞荧光数较Control组低(p<0.05)(图6A,B)。细胞增殖研究CCK8结果显示(图6C)，在1天和3天时各组间吸光度无显著性差异(p>0.05)，但第5天时由于良好的机械硬度和无生物因子干扰，空白对照组中细胞增殖速率明显提升(p<0.05)，同时MSaP-aL/p组吸光度(2.23±0.06)较其他组下降，这可能是因为部分纤维上部分脂质体释放发挥转染作用所致，但与其他纤维组无显著性统计学差异(p>0.05)。
4.细胞黏附性表征
采用免疫荧光法表征细胞黏附性能。共培养一天后固定BMSCs，加入含0.5％Triton的PBS溶液进行细胞膜打孔。为避免非特异性染色，使用牛血清白蛋白(5％w/v)对细胞进行4℃过夜封闭处理。第二天用PBS冲洗细胞三遍后，加入一抗Integrinβ1 4℃过夜，在室温下加入山羊抗兔二抗孵育1h，最后使用鬼笔环肽和苯基吲哚对细胞骨架和细胞核着色。将盖玻片从培养板中取出，在荧光显微镜上观察拍摄，并使用ImageJ软件进行荧光半定量分析。共培养三天后，使用PBS冲洗培养在各纤维支架的细胞三次后，每孔加入500μL 4％多聚甲醛室温下固定30min，之后将配置体积比为10％、20％、35％、50％、70％、85％、100％的乙醇梯度脱水处理，行临界点干燥和表面喷金处理完成后行SEM观察拍照。
Integrin(整合素)是一种跨膜蛋白受体，在细胞外基质和细胞骨架间信号传导中发挥关键作用。图7A中显示在不同纤维膜上BMSCs伸展形态受定向纤维膜结构影响，方向呈现相对一致性。此外在各纤维膜的细胞表达绿色荧光，表明纤维膜能够促进细胞integrinβ1亚单位表达，说明纤维膜可为细胞提供良好的黏附平台，并且荧光半定量分析(图7B)显示各纤维支架间无显著差异(p＞0.05)，但都低于Control组(p<0.05)，这是由于细胞培养皿具有更高的细胞外基质机械强度，能够细胞提供更好的生物机械应力。SEM观察细胞黏附形态如图7C,D,E,F所示，各纤维膜中细胞铺展粘附形态同Integrin染色相似，均与纤维膜方向保持一致，并且生长状况良好。
5.免疫调控作用表征
通过浓盐酸(HCL)和氢氧化钠(NaOH)并在PH测试仪(EZDO，Taiwan，China)精确调节下，配置α-mem培养基PH分别在5.8、6.6、7.4，以模拟脊髓损伤微环境，在培养1、3、5、7天通过qRT-PCR方法分析BMM基因表达情况。qRT-PCR来评价在不同酸性环境中BMM受IL-4影响发生极化后，促炎相关的IL-1β、TNF-αmRNA和抑炎相关的IL-10、TGF-βmRNA表达水平。在相同的时间点收集BMM培养液，用ELISA方法评价BMM促炎因子和抑炎因子分泌情况，以评估在脊髓损伤微环境中发挥免疫调控作用。
为了评估复合纤维支架能否在酸性环境中响应性发挥免疫调节功能，我们将复合纤维支架、骨髓间充质干细胞(BMSCs)和骨髓巨噬细胞(BMMs)通过Transwell细胞培养板共培养，分别在培养1、3、5、7天时采用qRT-PCR方法评价BMMs的炎症基因表达情况。如图8所示。培养液pH5.8环境中，MSaP-aL/p组中促炎基因IL-1β和TNF-α表达量随时间逐渐下降，第7天时表达量在检测时间点范围内降到最低分别9.63±0.80、0.30±0.03(p<0.05)(图8A,D)。同时，抑炎基因IL-10和TGF-β表达量在1、3、5、7天分别为3.42±0.07、11.59±0.09、27.02±0.45、29.30±0.51和2.85±0.06、7.99±0.07、22.52±0.37、27.47±0.59，均呈上升趋势(图8G,J)，与其他组对比具有显著性差异(p＜0.05)。pH6.6共培养环境中，随时间变化，MSaP-aL/p组中炎症因子基因IL-1β、TNF-α以及抑炎因子基因IL-10和TGF-β在第5天时与其他组相比具有统计学意义(p<0.05)，这是因为MSaP-aL/p组同样表现出对酸性环境响应性，但pH升高后希夫碱对酸性环境响应性也相对下降，因此，促炎和抑炎基因表达量变化趋势均没有pH5.8中明显(图8B,E,H,K)。pH7.4环境中，各时间点促炎和抑炎变化趋势相对较小，但促炎基因IL-1β和TNF-α同样表现出下降趋势，抑炎基因IL-10和TGF-β呈现上升态势(图8C,F,I,L)，这是因为共培养过程中下室内BMSCs具有免疫调节功能，同时诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，并抑制炎症基因表达和细胞因子释放。
上述在不同pH环境中共培养BMSCs和BMMs，免疫细胞因子基因表达量结果具有差异性，我们在相同时间点收集BMMs培养上清进行ELISA定量检测促炎和抑炎细胞因子。结果如图9所示，在pH5.8环境中，促炎因子IL-1β和TNF-α呈下降趋势，而抑炎因子IL-10和TGF-β分泌量逐渐增多。在pH6.6和pH7.4的培养条件下，得到与qRT-PCR类似结果。进一步证明所构建复合纤维支架对酸性微环境响应性较高，快速释放负载IL-4质粒脂质体发挥转染作用，诱导BMMs向M2方向极化分泌抑炎细胞因子。
6.细胞神经分化表征
对培养在纤维支架上第10天的BMSCs进行神经元特异性标记物染色。具体方法如下：吸净培养液后使用提前预热至37℃的PBS清洗3遍，每次5min，之后用4％多聚甲醛室温下固定30min，并再次使用PBS清洗3遍。加入0.3％TritonX-100进行细胞膜打孔30min后用PBS清洗三遍，再用含5％BSA溶液过夜封闭处理。次日吸出BSA溶液后，加入一抗(Rabbitanti-Tuj-1)4℃过夜。样本经PBS清洗3次后，加入二抗(Goat anti-Rabbit IgG)，室温下孵育1h，最后PBS清洗3次，依次加入鬼笔环肽和苯基吲哚进行细胞骨架和细胞核染色。使用荧光显微镜对染色结果观察拍摄，并在ImageJ软件中进行荧光半定量分析。采用上述相同方法进行NSE，Tau蛋白和NF-200染色，其中Tau蛋白和NF-200免疫荧光染色使用二抗是Goatanti-mouse。采用qRT-PCR评估细胞诱导分化后神经元特异性标记物Tuj-1、NSE、Tau蛋白、NF-200四种基因表达水平。
通过复合纤维支架缓释NGF，促进BMSCs模拟内源性干细胞成神经分化，四种神经元特异性标记物分别对诱导10天后的类神经元细胞的神经丝蛋白(NF-200)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经细胞骨架微管蛋白(Tau蛋白)以及神经元细胞特异性分化的微管蛋白(Tuj-1)免疫荧光染色和相关基因表达检测(qRT-PCR)，评估复合纤维支架促神经分化能力。免疫荧光染色(图10A)结果显示，各纤维支架BMSCs经鬼笔环肽肌动蛋白染色后，各纤维支架细胞形态沿纤维分布方向呈定向排列。响应性纤维支架(MSaP-aL/p)与其他同样负载NGF的微溶胶纤维支架组(MSaP、MSaP-aL)具有相同诱导作用，三组中细胞胞体都呈类神经元样改变，胞体周围有类轴突和树突样树枝状突起，并且各神经元特异性标记物染色后表现强烈绿色荧光，通过荧光半定量分析(图10B,E,H,K)，负载NGF纤维支架三组(MSaP、MSaP-aL、MSaP-aL/p)荧光量明显高于未负载组(Control、aP)，具有显著统计学差异(p＜0.05)。提示构建的微溶胶静电纺丝纤维支架具有缓慢释放NGF功能可持续促进干细胞成神经分化。同时，对不同神经元特异性标记物基因表达检测出现相似结果(图10C,F,I,L)，负载NGF组各神经特异性标物基因呈高表达，且具有统计学意义(p＜0.05)。进一步证明复合纤维支架对干细胞具有促神经分化作用，表明进行动物体内研究具有可行性。
实施例4免疫调控微纳米纤维的体内评价
1.大鼠脊髓损伤模型建构建
通过腹膜内注射戊巴比妥麻醉大鼠。以T9为中心纵向切口3cm，钝性分离椎旁肌肉，咬除T9椎板充分暴露椎管后，剪去右半边脊髓形成3mm脊髓缺损模型，移植MSaP-aL/p到缺损区域为实验组，将单纯暴露脊髓作为假手术组，脊髓半切后支架未植入作为空白对照组，aP、MSaP、MSaP-aL作为阴性对照组。用缝合线逐层缝合筋膜和皮肤。手术后，每只大鼠肌内注射抗生素20万单位持续5天，并且每12小时进行手动排空膀胱护理。
2.脊髓损伤局部免疫调控表征
术后1w从每组随机选择15只大鼠安乐死，切开胸腔，用50mL注射器插入左心室，同时切开下腔静脉，分别用100mL生理盐水和100mL4％多聚甲醛从左心室推入，取下移植部位的脊髓标本。浸泡于4％多聚甲醛24h后进行石蜡包埋，之后制作沿长轴约5μm厚度切片。使用二甲苯和乙醇脱蜡后，用0.3％过氧化氢来阻断内源性过氧化物酶活性，随后加入一抗(IL-4、IL-1β、TNF-α)4℃孵育过夜。用PBS清洗三次后，加入相应二抗孵育1h，通过荧光显微镜拍摄，并使用ImageJ软件荧光半定量分析。
3.动物运动功能评估
应用旷场试验(open field test)BBB(Basso，Beattie，Bresnahan)法和斜扳试验(inclined plane test)对六组大鼠进行后肢神经运动功能恢复评价。BBB量表评分范围为0至21，0代表未见后肢运动，21表示运动功能正常。在每次测试期间，由两名不知情的检查者在术后1、2、3、4、6、8周单独进行评估。斜扳试验作为BBB评分试验的补充研究，能够提高评分的有效性和敏感性。具体实施方法：将大鼠放置于橡胶垫的斜板上，保持大鼠纵轴与斜板纵轴平行，头部朝向抬高一侧，从0°开始每次抬高5°停留5s，记录大鼠停留的最高角度5次记为测定值。角度越大，说明下肢承重能力越强。
4.脊髓组织学分析
分别在术后4w和8w后，将大鼠安乐死。按上述方法同样制作沿长轴约5μm厚度切片。经二甲苯和乙醇脱蜡后，用苏木精和伊红(HE)染色来评估神经组织修复。在明场显微镜下观察并拍摄。同时在二甲苯和乙醇脱蜡处理后，用0.3％过氧化氢进行抗原修复，之后加入5％BSA非特异性抗原封闭处理。加入一抗用于神经元染色的Tuj-1，用于对神经干细胞染色的Nestin、染星形胶质细胞的GFAP、胶质瘢痕染色的CSPG、用于血管内皮细胞染色的CD31。
通过将复合纤维支架移植入大鼠脊髓T9半切模型，评估其体内生物学功能(图11A(a、b、c、d))。术后每周固定时间点，采用BBB评分和IPT评分评估大鼠下肢运动功能恢复情况。如图11B,C所示，各组大鼠运动功能术后都在一定程度上得到恢复，其中在术后4周及之后各时间点上，MSaP-aL/p组BBB评分和IPT评分与其他组出现显著性统计学差异(p<0.05)。术后第8周时，MSaP-aL/p组BBB评分达到13.71±1.11，IPT评分为55.86±4.67°，两项数据都明显高于其他组。因此，运动功能评分结果提示免疫调控纤维束(MSaP-aL/p)在植入后能够保护存活运动神经元进一步受到脊髓损伤急性期剧烈炎症反应损害，并且在较快时间内促进神经修复。
仿生复合纤维束在急性期脊髓损伤发挥免疫调控功能是基于能够促进局部组织分泌IL-4细胞因子。因此我们首先通过免疫荧光技术标记损伤部位IL-4细胞因子。如图12A，B，IL-4荧光半定量显示MSaP-aL/p组中IL-4光密度明显高于其他组(p<0.05)。同时，损伤局部免疫细胞亚型转变必定引起炎症细胞分泌情况发生变化。所以荧光标记巨噬细胞亚型特异性细胞因子TNF-α和IL-10实验结果中显示(图12A，C)，M1型标志性细胞因子TNF-α在无免疫调控功能纤维支架组(ap、MSaP、MSaP-aL)和空白对照组中荧光密度高于MSaP-aL/p组(p<0.05)。而且M2型巨噬细胞分泌的IL-10荧光密度分析中，MSaP-aL/p组显著高于其他对照组(p<0.05)。同样可以发现，由于定向静电纺丝纤维具有大比表面积和大孔隙率的特点，无免疫调控功能的纤维支架组上巨噬细胞表现出向M2型极化的趋势。此外，空白对照组无生物材料填充和生物学作用，出现大量脊髓空洞，炎症因子聚集在空洞组织周围。
脊髓损伤后由于中枢神经系统内特有的星形胶质细胞活化，合并局部复杂病理环境改变，损伤附近大量胶质组织沉积形成致密胶质瘢痕，能够明显抑制轴突延伸。为进一步评估免疫调控复合纤维抗胶质瘢痕作用，我们通过抗GFAP抗体和抗NG2抗体荧光标记脊髓样本中活化星形胶质细胞和胶质瘢痕组织，如图13A，C所示。结果显示纤维支架移植组(ap、MSaP、MSaP-aL和MSaP-aL/p)在术后4周和8周两个时间点上活化的星形胶质细胞和瘢痕组织明显少于空白对照组(p<0.05)。另外，根据两项荧光半定量结果提示MSaP-aL/p组中活化星形胶质细胞和瘢痕组织荧光密度低于其他三个纤维移植组和空白对照组(p<0.05)(图13B,D)，证明仿生复合纤维束具有改善脊髓损伤免疫微环境的作用。
研究显示中枢神经系统内存在大量神经祖细胞，在脊髓损伤发生后能够自发向损伤区域内迁移。上述免疫组化结果直接证实了复合纤维束能够减少活化星形胶质细胞和胶质瘢痕组织形成，降低机械屏障作用。因此，现通过nestin抗体荧光标记损伤区域内内源性神经祖细胞归巢作用，能够间接评价复合纤维束免疫调节功能。如图14A所示，损伤后4周和8周时所有脊髓损伤组中都能观察到迁移而至的内源性神经祖细胞。但是在假手术组(sham组)中，内源性神经祖细胞明显少于其他组(p<0.05)，这可能是由于生理条件下，脊髓中室管膜细胞的低分化特性以及缺乏对nestin蛋白的特异性结合。在MSaP-aL/p组中，相同时间点神经祖细胞荧光半定量结果显示显著高于其他对照组(p<0.05)(图14C)，间接证明仿生复合纤维束通过免疫调控功能明显降低损伤周围瘢痕组织对神经祖细胞迁移的抑制作用。在术后4周和8周，神经祖细胞受到微溶胶静电纺丝(MSaP、MSaP-aL、MSaP-aL/p)支架持续释放的NGF调节，因此在上述三组中能够观察到大量Tuj-1标记的神经元(图14B)，并且与空白对照组和aP组具有显著统计学差异(p<0.05)(图14D)。同时，术后8周的微溶胶静电纺丝三组中Tuj-1荧光密度显著高于术后4周，提示仿生纤维束具有持续释放NGF促进神经再生功能。此外，由于MSaP-aL/p组在脊髓损伤急性期具有免疫调节功能，有效降低中枢神经系统中物理或化学抑制神经再生作用，所以在同一时间点(4周、8周)，MSaP和MSaP-aL组中荧光密度都低于MSaP-aL/p组(p<0.05)。上述实验结果证明仿生纤维束不仅具有在急性脊髓损伤免疫调控作用，而且正如文献报道，微溶胶静电纺丝纤维内部的核壳结构具有保护NGF生物活性作用，因此在损伤后8周依旧能观察到再生的神经元。
新生血管能够形成和长入损伤组织是生物材料能否长期促进脊髓修复的重要因素之一。有研究表明如果在脊髓损伤部位能够形成新生血管，可以显著加快神经再生。在荧光半定量分析结果显示，损伤后4周和8周时，MSaP-aL/p组中出现大量CD31标记的血管内皮细胞，并与其他组对比具有显著性统计学差异(p<0.05)(图15A，B)。

Claims (6)

1. 一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）醛基化阳离子脂质体的制备
采用逆向蒸发法制备醛基化阳离子脂质体，首先将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基解于三氯甲烷中，加入溶解于三氯甲烷的十八胺进行超声混合得到均匀乳液，然后于旋转蒸发器中去除有机溶剂，得到胶体产物，最后加入去离子水进行水化处理，制备出脂质体乳液；将脂质体乳液经超声后通过聚碳酸酯膜过滤得到醛基化阳离子脂质体；
（2）装载eGFP-IL-4质粒的脂质体的制备
将Opti-MEM培养基加入离心管中，再加入eGFP-IL-4质粒和醛基化阳离子脂质体，轻微晃动后室温下静置配置成混合溶液，即制得装载eGFP-IL-4质粒的脂质体溶液；
（3）定向静电纺丝纤维膜的制备
将透明质酸钠水溶液和β-NGF的BSA溶液制备透明质酸钠-β-NGF水溶胶，再向其中加入Span-80和DCM，于室温高速搅拌得到负载有β-NGF的透明质酸钠微溶胶颗粒的油包水乳液体系，最后依次加入aPLA和DMF制得微溶胶静电纺丝液；将微溶胶静电纺丝液通过静电纺丝制得定向静电纺丝纤维膜；
（4）微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备
将步骤（3）制得的定向静电纺丝纤维膜浸入步骤（2）制得的装载eGFP-IL-4质粒的脂质体溶液中，于37℃烘箱中孵育不小于24h，装载eGFP-IL-4质粒的脂质体接枝在定向静电纺丝纤维膜的表面，即制得微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体条件为：采用逆向蒸发法制备醛基化阳离子脂质体，首先160mg大豆卵磷脂、40mg胆固醇、4mg醛基磷脂溶解于5mL三氯甲烷中，称取5mg十八胺溶解在1mL三氯甲烷中，将两者混合后进行超声得到均匀乳液，之后于旋转蒸发器中去除有机溶剂，得到胶体产物，最后加入去离子水进行水化处理，制备出脂质体乳液，经过超声和450nm、220nm聚碳酸酯膜过滤得到醛基化阳离子脂质体。
3.根据权利要求1所述的一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中eGFP-IL-4质粒和醛基化阳离子脂质体的质量体积比以μg/μL计为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
4. 根据权利要求1所述的一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中微溶胶静电纺丝液的具体制备条件为：制备质量分数为1wt%的透明质酸纳溶液，β-NGF重悬于0.1wt%BSA溶液中最终浓度为100μg/mL，将10μL β-NGF与50μL 1wt%透明质酸纳溶液混合制得透明质酸纳-β-NGF水溶胶，再加入0.01g Span-80和4g DCM，室温下高速搅拌30min，得到负载有β-NGF的透明质酸纳微溶胶颗粒的油包水乳液体系；最后依次加入0.5g aPLA和2g DMF制得微溶胶纺丝溶液。
5.根据权利要求1所述的一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中静电纺丝的具体条件为：推进泵速度为70μL/min，电压15-18kV，针头距平行电极接收器15cm。
6.权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维。
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