CN101647778A - 替米考星脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
替米考星脂质体的制备方法，方案为：每3g替米考星原粉经下述步骤制成替米考星脂质体：1)配制pH6.5～7.5的PBS缓冲液；2)蛋黄卵磷脂、胆固醇、十八胺、吐温－80、乙醚按比例混合成溶液；3)替米考星原粉与步骤1)的PBS缓冲液混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀，并用超声粉碎成至少5min不分层的混悬液；4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中进行减压旋蒸，使之凝到器壁上形成脂膜；5)用步骤1)的PBS溶液将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。该方法步骤简单、可操作性强，制成的替米考星脂质体注射到畜禽机体中更易被吸收，且不易产生局部肿包现象。
Description
技术领域
本发明属于抗生素制剂领域，具体涉及替米考星脂质体剂型的制备方法。
背景技术
替米考星(Tilmicosin)是英国Elanco公司于20世纪80年代开发的半合成大环内酯类畜禽专用抗生素，在国外已经被批准用于治疗猪、牛、羊、鸡等动物的感染性疾病，特别是畜禽呼吸道感染，如家畜放线杆菌性胸膜肺炎、巴氏杆菌病以及鸡霉形体病等，对革兰氏阳性菌、部份革兰氏阴性菌、霉形体及螺旋体均有抑制作用。与泰乐菌素相比，替米考星的抗菌活性更强，具有用药量少(据报道皮下或静脉注射量10～20mg/Kg体重，一次见效)、作用持久等优势，是一种经济有效的畜禽常用抗菌和促生长药物。目前，主要药用的是替米考星的磷酸盐，常见可溶性粉、口服溶液、注射液等剂型。虽然替米考星相对于其他畜禽抗生素而言毒副作用较小，但有研究表明，用药量过大或采用静脉注射的给药方式也会对动物的心血管或肾脏造成一定的损伤。
脂质体作为一种靶向药物载体，可以将药物包埋在直径为亚微米或纳米级的脂质微粒中。这种微粒具有类似生物细胞膜结构，在体内可以生物降解，无免疫原性。脂质体的靶向和缓释作用能够延长药物的半衰期，提高药物的治疗指数，减少药物用量，降低药物的毒副反应。因此，为了在不增加药物剂量的情况下进一步提高替米考星的疗效，脂质体无疑是一种理想的选择。
近年来，国内外报道了较多关于阿米卡星、氟苯尼考等药物脂质体的研究，而关于替米考星脂质体的报道则非常少，制备方法还比较单一。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种畜禽用抗生素--替米考星脂质体的制备方法，该方法步骤简单、可操作性强，制成的替米考星脂质体用于畜禽注射不易产生局部肿包现象。
基于上述目的，本发明采用了如下技术方案：替米考星脂质体的制备方法，每3g替米考星原粉经下述步骤制备成替米考星脂质体：
1)配制pH为6.5～7.5的PBS(Phosphate Buffered Saline)缓冲液；
2)取1～2g蛋黄卵磷脂、0.3～0.4g胆固醇、0.05～0.1g十八胺、0.3～0.7ml吐温-80、42～48ml乙醚混合，制成溶液；
3)取3g替米考星原粉、48～52ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀，然后对搅拌均匀的混合液进行超声粉碎处理，使之分散成至少5min不分层的混悬液；
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中进行减压旋蒸，控制温度和压力使混悬液在旋蒸过程中不起泡、不沸腾并在2min～5min内全部凝到器壁上形成凝胶状的脂膜；
5)用步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
步骤4)的减压旋蒸共进行10～20min。
步骤5)中用49～52ml步骤1)的PBS溶液冲洗器壁。
步骤2)中配制溶液时为促进原料溶解需对体系进行加热，温度为55～75℃。
所述超声粉碎处理在细胞裂解仪中进行，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min。
用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制。
所述的精制过程为：a)葡聚糖凝胶G-50用步骤1)的PBS溶液溶胀好后装入直径1cm、高15cm的层析柱中，装填好的柱子上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
所述的层析柱为10ml一次性注射器；葡聚糖凝胶G-50的用量为3.5g，用35～50ml所述的PBS溶液将其溶胀。
对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
本发明中的PBS缓冲液可参考如下方法配制：称取71.6g Na2HPO4·12H2O配置成1000ml的水溶液；称取31.2gNaH2PO4·2H2O配置成1000ml的水溶液；分别取62ml配好的Na2HPO4溶液和38ml NaH2PO4溶液混合均匀，过滤，121℃灭菌15min，即成pH为7.0左右的PBS缓冲溶液。
本发明的替米考星脂质体制备方法采用常见原料和设备即可完成，步骤简单，可操作性强。用来包裹替米考星的蛋黄卵磷脂在生物体内可降解、对机体无害，制成的脂质体粒度较小，随血液循环进入机体的靶器官或靶细胞后产生作用，能够提高药物的疗效。替米考星脂质体注射到动物机体内更易被吸收，具有稳定性强、安全可靠、无毒副作用和无污染环境等特点。此外，畜禽注射传统替米考星注射液后易产生局部肿包现象。临床试验证明，本发明制备出的替米考星脂质体能够成功解决这一问题。
制备出的替米考星脂质体的产品4℃保存。使用时可皮下注射、肌肉注射或乳管内注入；皮下注射或肌肉注射，牛、猪一次用药量10～20mg替米考星/kg体重，1次/天；奶牛乳管内注入，一次量300mg替米考星/每一乳室。
具体实施方式
实施例1
替米考星脂质体的制备方法，包括下述步骤：
1)配制pH为7.0的PBS缓冲液。
2)取1.5g蛋黄卵磷脂、0.35g胆固醇、0.08g十八胺、0.5ml吐温-80、45ml乙醚混合，水浴加热到60℃以促进原料溶解成溶液。
3)取3g替米考星原粉、50ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀。把搅拌均匀的混合液置于细胞裂解仪中进行超声粉碎处理，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min，最终使混合液分散成至少5min不分层的混悬液。
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中减压旋蒸15min。旋蒸过程中温度控制在70℃，观察到蒸发器内欲起泡时及时拔掉塞子泄压，使混悬液在2min～5min内全部凝到器壁上形成凝胶状的脂膜。
5)用50ml步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
6)用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制：
a)取3.5g葡聚糖凝胶G-50用40ml步骤1)的PBS溶液将其溶胀，溶胀好后装入10ml一次性注射器中，装填好的注射器上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；
b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
7)对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
实施例1的效果实验
实验在河南省郑州市某约有生猪5000头的养猪场进行。2008年5月中旬，猪群中有约100头160日龄的猪表现体温升高、呼吸困难、食欲减退等病理症状。解剖病死猪，病变有：黏膜、浆膜、淋巴结有出血性病变，肺有不同程度肝变区、周围伴有水肿和气肿，肺切面呈大理石纹理；胸膜有纤维素性附着物；胸腔及心包积液；支气管、气管内含有多量泡沫状粘液。病料组织或体液涂片革兰氏染色为阴性，可见两端钝圆，中央微凸的短杆菌，经细菌鉴定仪鉴定为巴氏杆菌。各取50头分别用市售替米考星注射液和替米考星脂质体进行治疗，用药量均以替米考星计，实验结果如下表所示：
表1市售替米考星注射液与替米考星脂质体的效果对比
| 药物 | 病猪(头) | 注射方式 | 使用剂量 | 病情好转时间 | 治愈例 | 注射部位变化 |
| 替米考星注射液(100ml:30g替米考星) | 50 | 肌肉注射 | 15mg/次，1次/天，连用5天 | 第5天开始 | 33例 | 注射后10min内出现肿块，治愈后一周左右肿块消失。 |
| 替米考星脂质体(100ml:30g替米考星) | 50 | 肌肉注射 | 15mg/次，1次/天，连用5天 | 第3天开始 | 47例 | 注射后20min内有微小肿起，1h内消失。 |
实施例2
替米考星脂质体的制备方法，包括下述步骤：
1)配制pH为6.5的PBS缓冲液。
2)取1g蛋黄卵磷脂、0.3g胆固醇、0.05g十八胺、0.3ml吐温-80、42ml乙醚混合，水浴加热到55℃以促进原料溶解成溶液。
3)取3g替米考星原粉、48ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀。把搅拌均匀的混合液置于细胞裂解仪中进行超声粉碎处理，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min，最终使混合液分散成至少5min不分层的混悬液。
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中减压旋蒸10min。旋蒸过程中温度控制在68℃，观察到蒸发器内欲起泡时及时拔掉塞子泄压，使混悬液在2min～5min内全部凝到器壁上形成凝胶状的脂膜。
5)用49ml步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
6)用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制：
a)取3.5g葡聚糖凝胶G-50用35ml步骤1)的PBS溶液将其溶胀，溶胀好后装入10ml一次性注射器中，装填好的注射器上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；
b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
7)对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
实施例3
替米考星脂质体的制备方法，包括下述步骤：
1)配制pH为7.5的PBS缓冲液。
2)取2g蛋黄卵磷脂、0.4g胆固醇、0.1g十八胺、0.7ml吐温-80、48ml乙醚混合，水浴加热到75℃以促进原料溶解成溶液。
3)取3g替米考星原粉、52ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀。把搅拌均匀的混合液置于细胞裂解仪中进行超声粉碎处理，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min，最终使混合液分散成至少5min不分层的混悬液。
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中减压旋蒸20min。旋蒸过程中温度控制在72℃，观察到蒸发器内欲起泡时及时拔掉塞子泄压，使混悬液在2min～5min内全部凝到器壁上形成凝胶状的脂膜。
5)用52ml步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
6)用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制：
a)取3.5g葡聚糖凝胶G-50用50ml步骤1)的PBS溶液将其溶胀，溶胀好后装入直径1cm、高15cm的层析柱中，装填好的柱子上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；
b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
7)对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
实施例4
替米考星脂质体的制备方法，包括下述步骤：
1)配制pH为7.2的PBS缓冲液。
2)取1.8g蛋黄卵磷脂、0.4g胆固醇、0.08g十八胺、0.6ml吐温-80、50ml乙醚混合，水浴加热到70℃以促进原料溶解成溶液。
3)取3g替米考星原粉、50ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀。把搅拌均匀的混合液置于细胞裂解仪中进行超声粉碎处理，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min，最终使混合液分散成至少5min不分层的混悬液。
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中减压旋蒸18min。旋蒸过程中温度控制在65℃，观察到蒸发器内欲起泡时及时拔掉塞子泄压，使混悬液在2min～5min内全部凝到器壁上形成凝胶状的脂膜。
5)用50ml步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
6)用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制：
a)取3.5g葡聚糖凝胶G-50用45ml步骤1)的PBS溶液将其溶胀，溶胀好后装入10ml一次性注射器中，装填好的注射器上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；
b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
7)对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
Claims (9)
1、替米考星脂质体的制备方法，其特征是，每3g替米考星原粉经下述步骤制备成替米考星脂质体：
1)配制pH为6.5～7.5的PBS缓冲液；
2)取1～2g蛋黄卵磷脂、0.3～0.4g胆固醇、0.05～0.1g十八胺、0.3～0.7ml吐温-80、42～48ml乙醚混合，制成溶液；
3)取3g替米考星原粉、48～52ml步骤1)的PBS缓冲液，混合后倒入步骤2)制得的溶液中搅拌均匀，然后对其进行超声粉碎处理，使之分散成至少5min不分层的混悬液；
4)将步骤3)的混悬液转入旋转蒸发器中进行减压旋蒸，使混悬液在旋蒸过程中不起泡、不沸腾并在2min～5min内全部凝到器壁上形成脂膜；
5)用步骤1)的PBS溶液反复冲洗器壁，将脂膜完全冲洗下来后继续减压蒸发直至抽干乙醚，即得替米考星脂质体粗品。
2、如权利要求1所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，步骤4)的减压旋蒸共进行10～20min。
3、如权利要求2所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，步骤5)中用49～52ml步骤1)的PBS溶液冲洗器壁。
4、如权利要求1-3任一所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，步骤2)配制溶液时的温度为55～75℃。
5、如权利要求4所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，所述超声粉碎处理在细胞裂解仪中进行，超声频率60HZ，执行的是工作时间2s、间隙时间3s的间歇式工作模式，处理温度35℃，总处理时间17min。
6、如权利要求1或2或3或5所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，用葡聚糖凝胶G-50柱层析法对所述的替米考星粗品进行精制。
7、如权利要求6所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，所述的精制过程为：
a)葡聚糖凝胶G-50用步骤1)的PBS溶液溶胀好后装入直径1cm、高15cm的层析柱中，装填好的柱子上端封口后于4℃下静置过夜以除去多余的PBS溶液；
b)将所述的替米考星粗品放置到层析柱床面上，用纯化水淋洗，收集前10ml滴出液，即为替米考星脂质体精制品。
8、如权利要求7所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，所述的层析柱为10ml一次性注射器；葡聚糖凝胶G-50的用量为3.5g，用35～50ml所述的PBS溶液将其溶胀。
9、如权利要求8所述替米考星脂质体的制备方法，其特征是，对所述的替米考星脂质体精制品进行无菌分装，4℃保存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100217 |