CN110327498A - 一种基于脂质体的活性小分子控释方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于脂质体的活性小分子控释方法及其应用，采用薄膜分散法制备包载活性小分子的脂质体，包括以下步骤：(1)将活性小分子和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载活性小分子的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；(3)将多巴胺溶液加入到生物材料中，轻轻摇匀过夜；在无菌蒸馏水中进行超声清洗；(4)加入载有活性小分子的脂质体静置反应；再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可获得活性小分子的脂质体修饰的培养板表面。该方法将活性小分子脂质体共价接枝在聚苯乙烯表面，使脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放。

Description

一种基于脂质体的活性小分子控释方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于脂质体的活性小分子控释方法及其应用，属于药物控制释放和生物材料技术领域。
背景技术
脂质体结构上自我封闭，能够分别或者同时包载水溶性和脂溶性物质(脂溶性分子包载在脂质体双层膜中间，水溶性分子包载在脂质体最内部)，并可防止药物降解，因此广泛用于控制药物的装载、传递和释放。目前，脂质体药物递送系统主要有四种类型，包括传统的脂质体、空间稳定的脂质体、配体靶向的脂质体以及诊疗性脂质体。作为一种成熟的保护和递送药物的载体，游离脂质体已被广泛用于将药物输送到肿瘤等病理部位和炎症/感染区域；此外，脂质体作为基因传递的载体也被广泛研究。脂质体作为药物载体具有良好的生物相容性，可以在体内实现药物的被动靶向和主动靶向；局部使用载药脂质体可提高损伤部位的药物浓度，提高药物吸收及作用效果，减少药物使用剂量从而避免与过量药物剂量相关的不良毒副作用；载药脂质体还可以控制药物在体内的分布和清除率。
那么，是否可以将载药脂质体共价修饰于固体基底表面，进一步拓宽脂质体的应用范围呢？Dimitrievski和Kasemo分析了脂质囊泡在固体基底表面存在的三种可能方式，并指出其在固体表面的存在方式取决于脂质的组分(如不同电荷或中性脂质的混合)、水化液的特性(如pH、离子类型、浓度等)和固体材料表面的特性(如电荷密度)。Mourtas等利用两步酰胺键形成法将脂质体共价固定于等离子体处理后的金属表面，在确保脂质体于金属表面保持完整的条件下，对不同的脂质体附着条件进行了评价及优化。López-Noriega等制备了一种可控释药物的功能化胶原/HA支架，该支架由热敏脂质体包载PTHrP 107-111(一种进入细胞内发挥促成骨和抗破骨活性的五肽)共价修饰于表面组成。
研究结果表明，应用外部热刺激(42℃，20min)可以改变药物从支架释放的动力学，随着PTHrP 107-111的释放，支架表现出明显的促成骨分化作用。Monteiro等提出将包载庆大霉素的脂质体共价接枝在壳聚糖纳米纤维表面；该表面在24h内可持续释放庆大霉素；体外抑菌实验证实，纳米纤维表面脂质体释放的庆大霉素对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌活性。Mourtas等使用脂质体包载妥布霉素并将其共价修饰于不锈钢表面，体外研究发现该表面的抗菌活性增强。使用包载抗菌药物的脂质体进行材料表面改性的优点包括：有助于减少药物使用剂量，降低药物毒副作用；降低耐药性；保护药物的生物活性；有效地控制药物释放等。De Leo等指出，利用脂质体共价修饰钛表面的优势是可以将极性不同的药物(如抗生素、消炎药等)、蛋白质(如生长因子、成骨多肽等)和其他治疗制剂以有效和持续的浓度直接递送到目标组织，这对于进入细胞内起作用的物质尤为重要。综上所述，使用载药脂质体共价修饰固体基底是一种极具应用前景的方法。
聚多巴胺(pDA)涂层作为一种易于操作的表面改性方法，近年来引起了广泛的关注。通过在弱碱性水环境中简单浸泡方式，多巴胺几乎可以在所有材料表面(无需预处理)形成结构稳定的pDA薄膜；而且，pDA的邻苯二酚结构可以进一步连接含氨基或巯基的生物活性分子，进而实现材料表面的二次修饰；该方法已被广泛用于各种生物材料的功能化。不同的功能组分(如生物大分子、长链分子和金属膜等)通过引入pDA可以赋予基底材料表面不同的功能。因此，利用pDA的通用附着力和高反应活性，可方便地在各种材料表面引入多功能涂层。
但是，pDA不适合直接固定进入细胞内发挥作用的生物活性小分子，如Mino(一种广谱四环素类抗生素)和Dex(一种具有抗炎和促成骨作用的糖皮质激素)。通过pDA共价修饰的生物活性小分子不能游离释放，故而会影响在细胞内发挥作用的小分子的应用。因此，是否可以借助药物运输载体，利用pDA技术表面修饰作用于细胞内的小分子，仍需进一步研究。
另外，目前生物医用植入材料表面修饰多功能化的需求，但是，目前此方面的研究较少。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种基于脂质体的活性小分子控释方法及其应用，使用脂质体作为药物运输载体同时包载活性小分子，利用聚多巴胺涂层作中间介质实现共价接枝，将活性小分子脂质体共价接枝在生物材料表面，利用脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种基于脂质体的活性小分子控释方法，采用薄膜分散法制备包载活性小分子的脂质体，包括以下步骤：
(1)将活性小分子和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载活性小分子的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；
(3)将多巴胺溶液加入到生物材料中，轻轻摇匀过夜；在无菌蒸馏水中进行超声清洗；
(4)加入载有活性小分子的脂质体静置反应；再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可获得活性小分子的脂质体修饰的生物材料。
进一步地，步骤(1)中，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；
进一步地，步骤(2)中，所述水化液为磷酸盐缓冲液或无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为47℃，时间为5min；所述多孔聚碳酸酯膜的孔径为依次为450nm、220nm和100nm，或220nm和100nm；透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，温度为4℃；
进一步地，步骤(3)中，所述生物材料为植入物、支架、培养板；将多巴胺溶液加入到生物材料是在pH＝8.5的弱碱性条件下，多巴胺溶液的终浓度为2mg/mL，在37℃下轻轻摇匀过夜；
进一步地，步骤(3)中，还包括加入N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液活化后弃去活化液的步骤；
进一步地，步骤(4)中，静置反应在37℃条件下进行过夜；无菌磷酸盐缓冲液清洗三次；
进一步地，步骤(4)中，还包括直接加入活性小分子接枝到生物材料的步骤。
优选地，步骤(3)中，所述培养板为聚苯乙烯为基底的细胞培养板。
更优选地，修饰聚苯乙烯为基底的细胞培养板所用包载活性小分子的脂质体的最佳浓度为1.0mg/mL。
进一步地，所述活性小分子可以为具有生物活性的脂溶性和/或水溶性小分子中的一种或多种。
优选地，所述活性小分子可以为硫酸庆大霉素、表阿霉素、布洛芬、米诺环素、地塞米松、阿司匹林和BFP-1多肽中的一种或两种。
优选地，所述活性小分子为两种时，步骤(2)中透析具体如下：使用透析液4℃过夜透析第一种活性小分子脂质体，后与适量第二种活性小分子储液混合，50℃条件下振摇30min使第二种活性小分子载入脂质体水相中，即得到载有两种活性小分子的脂质体，使用透析液过夜透析后，4℃保存备用。
本发明提供一种阿司匹林脂质体缓释体系，通过以下步骤制备：采用薄膜分散法制备脂质体包载阿司匹林，透析过夜后，加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，37℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
进一步地，所述薄膜分散法将阿司匹林和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
优选地，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；
进一步地，所述薄膜分散法包括使用水化液水化脂质膜和水浴超声；所述水化液为磷酸盐缓冲液或无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为47℃，时间为5min；
进一步地，透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，温度为4℃；
进一步地，PDA修饰的PS细胞培养基为在pH＝8.5的弱碱性条件下将多巴胺溶液加入到聚苯乙烯为基底的细胞培养板中，多巴胺溶液的终浓度为2mg/mL，37℃轻轻摇匀过夜；并需经过无菌蒸馏水中进行超声清洗；
优选地，PDA修饰的PS细胞培养基还经过N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液活化后弃去活化液的步骤；
所述阿司匹林脂质体缓释体系粒径大小为198.6±1.37nm；PDI值均在0.2左右；ζ电势几乎是中性的；该缓释体系能够保留阿司匹林自身的抗炎及促成骨分化特性，且由于脂质体的缓释效应，阿司匹林的作用时间及作用效果均有所提升，有助于将阿司匹林进一步更好的应用于骨组织工程。
本发明提供一种阿司匹林脂质体/BFP-1缓释体系，通过以下步骤制备：采用薄膜分散法制备脂质体包载阿司匹林，透析过夜后，加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，并接枝BFP-1多肽，4℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
其中，阿司匹林被包裹到了脂质体中，而BFP-1是直接接枝在PS表面上；
进一步地，所述阿司匹林脂质体与BFP-1多肽成功整合到PS培养板基底材料上，阿司匹林脂质体与BFP-1多肽的最佳接枝比例为3:7；
进一步地，所述薄膜分散法将阿司匹林和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
优选地，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；
进一步地，所述薄膜分散法包括使用水化液水化脂质膜和水浴超声；所述水化液为磷酸盐缓冲液或无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为47℃，时间为5min；
进一步地，透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，温度为4℃；
进一步地，PDA修饰的PS细胞培养基为在pH＝8.5的弱碱性条件下将多巴胺溶液加入到聚苯乙烯为基底的细胞培养板中，多巴胺溶液的终浓度为2mg/mL，37℃轻轻摇匀过夜；并需经过无菌蒸馏水中进行超声清洗；
优选地，PDA修饰的PS细胞培养基还经过N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液活化后弃去活化液的步骤；
该缓释体系将Asp@Lipo与BFP-1联合应用在复杂的骨修复过程中取得更好的治疗效果。
本发明提供一种地塞米松/米诺环素脂质体缓释体系，通过以下步骤制备：采用薄膜分散法制备脂质体包载地塞米松，透析过夜后，与米诺环素储液混合，透析过夜加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，37℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
进一步地，所述薄膜分散法将阿司匹林和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
优选地，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；其与地塞米松的比例为二棕榈酰磷脂酰胆碱：胆固醇：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基：地塞米松＝1.85∶1∶0.15∶0.25；
进一步地，所述薄膜分散法包括使用水化液水化脂质膜和水浴超声；所述水化液为磷酸盐缓冲液或无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为47℃，时间为5min；
进一步地，透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，温度为4℃；
进一步地，PDA修饰的PS细胞培养基为在pH＝8.5的弱碱性条件下将多巴胺溶液加入到聚苯乙烯为基底的细胞培养板中，多巴胺溶液的终浓度为2mg/mL，37℃轻轻摇匀过夜；并需经过无菌蒸馏水中进行超声清洗；
所述地塞米松/米诺环素脂质体缓释体系粒径大小为164.56±3.04nm；PDI值均在0.2左右；ζ电势几乎是中性的；地塞米松和米诺环素额包封率分别为11％左右和69％左右；该缓释体系利用多巴胺的自聚合及迈克尔加成反应，将Dex/Mino脂质体共价接枝在植入物表面，实现植入物表面功能化改性，可有效提高基底的抑菌、抗炎和促成骨活性。
本发明提供如上所述基于脂质体的活性小分子控释方法在制备治疗组织缺损的生物材料的应用；
进一步地，所述生物材料靶向作用于组织的再生与修复，缓释活性小分子物质；
进一步地，所述组织为骨组织或肿瘤组织。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)构建了基于脂质体控释小分子的功能化表面修饰方法并以聚苯乙烯(PS)为基底对该方法进行体外理化性能及生物学评价，即利用聚多巴胺(pDA)涂层作中间介质实现共价接枝，将活性小分子脂质体共价接枝在聚苯乙烯(PS)表面，利用脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放；
(2)建立了基于阿司匹林的脂质体缓释体系，通过一系列体外的阿司匹林缓释实验，细胞相容性实验，成骨相关实验的检测结果证明该缓释体系仍能够保持阿司匹林的促进干细胞骨向分化的属性，且在脂质体的缓释作用下，药物的作用时间得到了延长，诱导分化效果也更好，阿司匹林的促进干细胞成骨分化能力得到了进一步的提升，有利于推进阿司匹林在骨组织工程中的发展及应用；
(3)将阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)与BFP-1多肽成功整合到PS培养板基底材料上，并通过一系列体外细胞成骨实验研究结果，说明了阿司匹林与BFP-1多肽能够协同发挥作用，共同刺激骨诱导过程从而促进新生骨的生成。双因子共同修饰的PS体系有了更好更强的促骨再生能力，为其更好的应用于骨组织工程及再生医学领域创造了一定的有利条件；
(4)用pDA涂层作中间介质，成功构建了Dex/Mino脂质体修饰方法；该方法使用的原料简单易得、操作步骤简单、反应条件温和而且适用性广；使用该两步法进行表面修饰，可有效提高基底的抑菌、抗炎和促成骨活性。
因此，这一表面改性方法可能为开发多功能植入物应用于临床开辟一条新的道路。
附图说明
图1为实施例1.4.1中透射电镜表征与阿司匹林脂质体包封率测定；
图2为实施例1.4.2中Aspirin脂质体修饰的PS表面的表征；
图3为效果试验例1.1中阿司匹林释放率；
图4为效果试验例1.2中相容性检测(*p<0.05)；(标尺大小为50μm)；
图5为效果试验例1.3中阿司匹林脂质体对干细胞炎症及骨向因子的表达量的影响；$，#，&分别代表Asp@Lipo组与(PS，Lipo，Asp)组之间的差异($，#，&，and*p<0.05)；
图6为效果试验例1.5中成骨基因的表达；#，&分别代表Asp@Lipo组与(PS，Asp)组之间的差异；$代表PS组与Asp组之间的差异(#，&，$p<0.05；**p<0.01)；
图7为效果试验例1.6、1.7和1.8中阿司匹林脂质体对干细胞骨向分化能力的影响；#，&，$分别代表Asp组与(PS，Lipo，Asp@Lipo)组之间的差异(#，&，$，*p<0.05；**p<0.01)(标尺大小为200μm)；
图8为实施例2中Asp@Lipo与BFP-1修饰培养表面的表征情况(标尺大小为200μm)；
图9为效果试验例2.2中PS基底上细胞ALP的表达；#，$分别代表B7A3与(Asp@lipo，BFP-1)之间的差异(#，$，*p<0.05；**p<0.05)；(标尺大小为200μm)；
图10为效果试验例2.3中PS基底上细胞钙结节的表达；#，$分别代表B7A3与(Asp@lipo，BFP-1)之间的差异(#，$，*p<0.05)；(标尺大小为100μm)；
图11为效果试验例2.3中PS基底上细胞OCN及OPN的表达；(标尺大小为100μm)；
图12为实施例3.1.1中Dex/Mino脂质体示意图；
图13为实施例3.2.1中Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的制备示意图；
图14为实施例3.3.2中pDA修饰的QCM芯片(QCM chip-pDA组)与脂质体修饰的QCM芯片(QCM chip-lipo组)表面的频率(a、c、e)和质量增量(b、d、f)；*代表与QCM chip-pDA组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；图中0.5、1.0和2.0分别表示脂质体的不同接枝浓度(mg/mL)；
图15为实施例3.3.2中不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组和PS-lipo组)表面的荧光检测；(a)代表性荧光图像；(b)半定量分析；*代表与PS组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；图中0.5、1.0和2.0分别表示脂质体的不同接枝浓度(mg/mL)；
图16为实施例3.3.2中不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组和PS-Dex/Mino lipo组)的表面形貌观察；
图17为实施例3.3.2中使用高效液相色谱仪检测的三组样品表面(PS-Dex/Mino组、Dex/Mino lipo组和PS-Dex/Mino lipo组)Dex(a)和Mino(b)的体外累积释放曲线；n＝3；
图18为效果试验例3.1中hBMSCs在不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组、PS-blanklipo组和PS-Dex/Mino lipo组)表面培养1、4和7天后，细胞增殖检测；图中0.5、1.0和2.0分别表示脂质体的不同接枝浓度(mg/mL)；*代表0.5和1.0mg/mL的PS-blank lipo组与2.0mg/mL的PS-blank lipo组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；#代表0.5和1.0mg/mL的PS-Dex/Mino lipo组与2.0mg/mL的PS-Dex/Mino lipo组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；
图19为效果试验例3.1中hBMSCs在不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组、PS-1.0blank lipo组和PS-1.0Dex/Mino lipo组)表面培养3天后，使用SEM观察细胞粘附情况；
图20为效果试验例3.1中hBMSCs在不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组、PS-1.0blank lipo组和PS-1.0Dex/Mino lipo组)表面培养3天后，使用CLSM观察细胞骨架；
图21为效果试验例3.2中不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组、PS-1.0blank lipo组和PS-1.0Dex/Mino lipo组)对分别培养4h和24h的牙龈卟啉单胞菌(a)和变形链球菌(b)的体外抑菌活性定量分析；*表示PS组与PS-1.0blank lipo组或者PS-1.0Dex/Mino lipo组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；图中1.0表示脂质体接枝浓度为1.0mg/mL；
图22为效果试验例3.2中不同修饰的PS样品(PS组、PS-pDA组、PS-1.0blank lipo组和PS-1.0Dex/Mino lipo组)对分别培养24h的革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌和革兰氏阳性变形链球菌的体外抑菌活性分析(SEM观察)；图中1.0表示脂质体接枝浓度为1.0mg/mL；
图23为效果试验例3.2中不同修饰的玻片样品(Glass组、G-pDA组、G-1.0blanklipo组和G-1.0Dex/Mino lipo组)对分别培养24h的革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌和革兰氏阳性变形链球菌的体外抑菌活性分析(活/死荧光染色)；图中1.0表示脂质体接枝浓度为1.0mg/mL；
图24为效果试验例3.3中Dex/Mino脂质体修饰的PS样品对hBMSCs(经LPS诱导24h)的抗炎活性分析；(a)RT-PCR分析；(b)ELISA分析；*表示PS-1.0blank lipo组和PS-1.0blank lipo+LPS组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；#表示PS-1.0blank lipo+LPS组和PS-1.0Dex/Mino lipo+LPS组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝3)；图中1.0表示脂质体接枝浓度为1.0mg/mL；
图25为效果试验例3.4中不同脂质体修饰的PS表面的ALP活性检测；(a)定量检测hBMSCs在第3和7天的ALP活性；(b)染色分析hBMSCs在第7天的ALP活性；*，$，#：分别表示与blank lipo(–)组、blank lipo(+)组、Dex/Mino lipo(–)组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝6)；+和–分别表示成骨分化培养基中含有或者不含有Dex；
图26为效果试验例3.4中不同脂质体修饰的PS表面的钙结节检测；(a)茜素红定量检测hBMSCs在第21天的钙沉积量；(b)茜素红染色分析hBMSCs在第21天的钙结节表达；*，$，#：分别表示与blank lipo(–)组、blank lip(+)组、Dex/Mino lipo(–)组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝6)；+和–分别表示成骨分化培养基中含有或者不含有Dex；
图27为效果试验例3.4中不同脂质体修饰的PS表面的成骨标志物表达分析；(a)成骨相关基因(ALP、Runx 2、OCN和Col1α1)的RT-PCR分析；*，$，#：分别表示与blank lipo(–)组、blank lip(+)组、Dex/Mino lipo(–)组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝6)；(b)成骨相关蛋白(Runx2、OPN、OCN和Col1α1)的免疫荧光染色分析；Runx2和OCN用绿色荧光标记，OPN和Col1α1用红色荧光标记，细胞核用蓝色荧光标记；+和–分别表示成骨分化培养基中含有或者不含有Dex。
具体实施方式
本发明中，我们首先构建了基于脂质体控释小分子的生物材料功能化表面修饰方法并以聚苯乙烯(PS)为基底(便于实验操作和镜下观察)对该方法进行体外理化性能及生物学评价，即利用聚多巴胺(pDA)涂层作中间介质实现共价接枝，将活性小分子脂质体共价接枝在PS表面，利用脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放，为了便于实验操作和镜下观察，我们首先选用PS作为基底进行表面修饰及体外评价。
阿司匹林，一种非甾体类抗炎药(NSAID)，于1899年合成，至今阿司匹林仍然是世界上使用最广泛的药物之一，尽管有其局限性，阿司匹林在治疗骨疾病方面仍然有积极的作用，且在未来也是如此。阿司匹林微粒胶囊能够控制药物的缓慢释放同时可以增加药物的半衰期，改善药物的吸收，并可更精确地靶向作用于组织的再生。本发明将阿司匹林加载到脂质体中同样也保持其对干细胞成骨分化的积极作用。
BMPs在骨再生过程中发挥了重要的作用，同时来源于BMP-7蛋白非成熟区的一段含有15个氨基酸的BFP-1多肽，具有比BMP-7蛋白更高的成骨诱导活性，可以有效的促进hMSCs的成骨分化作用。此外，作为非甾体类抗炎药物，阿司匹林被证明能够抑制破骨细胞形成并改善骨形成。本发明将Asp@Lipo与BFP-1联合应用在复杂的骨修复过程中取得更好的治疗效果。
本发明构建地塞米松/米诺环素(Dex/Mino)脂质体表面修饰方法，使用脂质体作为药物运输载体同时包载Dex和Mino，然后进一步利用多巴胺的自聚合及迈克尔加成反应，将Dex/Mino脂质体共价接枝在植入物表面，实现植入物表面功能化改性。该表面释放的Mino在体外可有效预防细菌粘附，Dex可有效减轻细胞炎性反应且发挥促成骨活性。
发明主要包括以下几个部分：
1)合成并制备了包载阿司匹林的脂质体(Asp@Lipo)缓释体系，并通过一系列体外实验(碱性磷酸酶，茜素红染色，免疫荧光)证明了Asp@Lipo作为骨诱导给药系统的疗效，该缓释体系能够保留阿司匹林自身的抗炎及促成骨分化特性，且由于脂质体的缓释效应，阿司匹林的作用时间及作用效果均有所提升，有助于将阿司匹林进一步更好的应用于骨组织工程。
2)以PS作为基底，通过同时将药物缓释体系(Asp@Lipo)与生长因子(BFP-1)共同接枝在其表面，构建一种双因子复合活性生物支架体系用于协同促进骨修复。以加速骨重塑效力为目的，同时加载两种药物或者生长因子，在适当的时间点以可控的方式控制药物或生长因子的释放，以实现更好的促进骨再生的目标。
3)Dex/Mino脂质体修饰方法的构建及其体外评价：采用薄膜分散法制备Dex/Mino脂质体，并对其进行基本性质评价；然后利用pDA涂层作中间介质，将Dex/Mino脂质体共价接枝到PS表面；通过石英晶体微天平(QCM)检测、荧光脂质体接枝定性定量检测和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察，评价脂质体是否成功共价修饰在PS表面；通过高效液相色谱仪检测Dex和Mino的释放量并制作缓释曲线；通过细胞粘附和增殖检测，评价功能化修饰表面的细胞相容性，并筛选脂质体接枝的最佳浓度；通过微生物活力定量检测和细菌活/死荧光染色，评价功能化修饰表面的抑菌情况；使用脂多糖(LPS)刺激hBMSCs后，通过炎性基因和蛋白表达检测，评价功能化修饰表面的抗炎能力；通过碱性磷酸酶(ALP)定量定性检测、茜素红染色及定量分析、成骨相关基因和蛋白表达检测等方法，评价功能化修饰表面的体外促成骨分化作用。
脂质体可以同时包载水溶性和脂溶性小分子的特性，本发明利用脂质体同时包载一种到两种具有不同功能的小分子，共价修饰于生物材料表面，通过控制生物活性小分子的双重释放实现有效的局部给药，最终将会实现修饰表面的多功能化。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 Aspirin脂质体(Asp@Lipo)的制备
1.1 Aspirin脂质体(Asp@Lipo)的制备
采用薄膜分散的方法制备脂质体包载阿司匹林。
取一个圆底烧瓶，将阿司匹林和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)，预先确定好阿司匹林在甲醇和氯仿的混合物中的配比，然后以不同的混合体积比例加入阿司匹林。紧接着，采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用磷酸盐缓冲液(PBS)水化脂质膜。水浴超声5分钟(T＝47℃)后即可获得包载阿司匹林的脂质体。将其依次通过孔径为450nm、220nm和100nm的多孔聚碳酸酯膜(Millipore公司，美国)，每个挤压5遍，以确保最终获得的脂质体大小的均匀性。然后，将载有阿司匹林的脂质体PBS缓冲液4℃透析过夜。
测定聚合物的分散性指数(PDI)、粒径和zeta电势大小。
计算阿司匹林的包封率EE＝(W1/W2)×100％，其中W1为隔夜透析后脂质体悬浮液中阿司匹林的测定量，W2为阿司匹林在最初的脂质体悬浮液中测定的量。
1.2 Aspirin脂质体修饰培养板表面(PS-Asp@Lipo)的制备
在pH＝8.5的弱碱性条件下，以每孔2mL体积的多巴胺溶液(2mg/mL)加入到12孔板的细胞培养板(PS)中，并在37℃下轻轻摇匀过夜。为了除去多余的未参加反应的多巴胺(PDA)颗粒，接下来将PDA修饰的PS表面(PS-PDA)在无菌蒸馏水中进行超声清洗5min，然后经过NHS/EDC溶液活化40min后，弃去活化液并每孔依次加入1mL载有阿司匹林的脂质体在37℃条件下静置反应24h。再用无菌PBS清洗三次后即可获得Asp@Lipo修饰的培养板表面(PS-Asp@Lipo)。
1.3材料表征
采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM；Carl Zeiss Jena；德国)，x射线光电子能谱(XPS；Kratos analysis；英国)和透射电子显微镜(TEM；h-9000；日本)等方法对材料表面是否已成功接枝脂质体进行表征。通过CLSM分析PS表面PE-Rho脂质体的接枝密度；采用XPS测定已接枝脂质体表面化学成分的变化；通过TEM分析载有阿司匹林的脂质体与空白脂质体之间的形态差异。
1.4实验结果
1.4.1 Aspirin脂质体(Asp@Lipo)的表征
脂质体是包含一个或多个围绕在离散的水相周围的同心脂质双分子层构成的磷脂泡。已有研究证明脂质体无论对亲水还是亲脂药物均可以提供良好的载药量，同时也能够提高药物的溶解度和稳定性。有关脂质体包载药物可以用于治疗的研究于1971年被第一次报道出来。随后，相继有研究报道指出，相比于直接加载阿霉素，包载有阿霉素的脂质体的药物利用度有5.9倍的改善。脂质体能够促进药物的生物医学应用，并已成为研究最深入、应用最广泛的靶向药物递送的纳米载体。
表1分别列出了空脂质体与阿司匹林脂质体的粒径、Polydensity index(PDI指数)和ζ电势值。脂质体的分布具有高度的单分散性和多样性。空脂质体粒径大小为194.5±2.81nm，而阿司匹林脂质体粒径大小为198.6±1.37nm；PDI值均在0.2左右；ζ电势几乎是中性的，证明包载阿司匹林后并没有改变脂质体原有的性质。
表1空白脂质体与阿司匹林脂质体的表征
脂质体 粒径(nm) PDI指数 ζ电势(mV)
空白脂质体 194.5±2.81 0.281±0.007 0.291±0.024
阿司匹林脂质体 198.6±1.37 0.183±0.034 0.366±0.002
如图1所示，TEM图像显示出包载阿司匹林的脂质体也并没有改变原有脂质体的形状及大小。
同时，为了测定阿司匹林脂质体的药物包封率，共设置了三种不同浓度的阿司匹林(50、75和100μg/mL)并将其包载至脂质体中，通过21天的连续取样测定了三种浓度的阿司匹林在脂质体中的包封率分别为99.46％、99.89％和96.81％，所以最终选择了包封率最高的75μg/mL的阿司匹林脂质体进行深入的研究。
1.4.2 Aspirin脂质体修饰材料表面(PS-Asp@Lipo)的表征
在弱碱性条件下(pH＝8.5)，多巴胺分子可以发生自聚合反应形成聚多巴胺(PDA)结构。该类聚合物含有氨基和邻苯二酚官能团。本研究通过胺-邻苯二酚反应，阿司匹林脂质体就能够接枝到PDA表面从而制备出脂质体修饰的培养表面。
采用CLSM和XPS来分析阿司匹林脂质体修饰前后的PS表面的形态学以及化学成分的变化。如图2a所示，脂质体荧光图像均匀地分布在PS表面上；相比之下，纯PS上并没有观察到任何荧光信号，这表明脂质体已经成功的接枝到了PS表面上。如图2b所示，XPS结果显示出脂质体接枝前后PS底物表面化学成分的差异。在只有PDA修饰的PS表面上只发现了(N(1s))氮峰，而当再接枝脂质体时发现了(P(2s)和P(2p))磷峰，表明脂质体的接枝是成功的。CLSM和XPS数据均表明我们已经成功获得了由脂质体修饰的培养表面。
效果试验例1 Aspirin脂质体(Asp@Lipo)对hMSCs骨向分化作用的研究
1.1基于阿司匹林的脂质体缓释体系
用PBS透析法分别测定阿司匹林脂质体在游离状态(Asp@Lipo)以及固定接枝到材料表面(PS-Asp@Lipo)上的阿司匹林的释放率。
首先，取1mL阿司匹林脂质体加入到透析袋中(MW 8000-14000Da；美国联合碳化物公司)并将其悬浮于50mL PBS中。同样的，将阿司匹林脂质体固定在PS表面也浸没于PBS介质中。透析的环境维持在37℃，60rpm/min。在预设的时间节点时取样，每次从透析体系中取出100μL释放的介质。通过全波长酶标仪(Model 680；Bio-Rad；加拿大)测量溶液在277nm处的吸光度值来间接反应出阿司匹林浓度的大小。
实验结果：
图3显示了在21天内阿司匹林脂质体的体外缓释情况，主要分为阿司匹林脂质体以自由悬浮状态(Asp@Lipo)和固定在培养板表面(PS-Asp@Lipo)两种状态。观察到在初始阶段5天内的释放率是持续稳定的，然后在接下来的5-13天内释放率是递减的，随后在14-16天释放率又明显增高随后释放率便趋于稳定。总的来说，在21天的时间里，阿司匹林的释放量由脂质体控制，缓慢持续的释放着高浓度的阿司匹林。此外，相比于自由状态的Asp@Lipo组，PS-Asp@Lipo组的阿司匹林释放速度更趋于平缓且稳定。
1.2 hMSCs的培养及相容性检测
细胞培养：人骨髓间充质干细胞(hMSCs；美国ATCC)培养于正常生长培养基中，该培养基的组成成分为：DMEM培养基(Gibco，美国)，10％胎牛血清(FBS；Gibco，美国)，1％青霉素和链霉素(Amresco，美国)。培养条件为：37℃，含5％二氧化碳的恒温细胞培养箱中。
相容性检测：将细胞分别接种到PS，Lipo，Asp@Lipo(PS：正常的PS细胞培养板表面；Lipo：在PS表面接枝的空白脂质体；Asp：阿司匹林(Aspirin)，以自由状态存在)三种不同的材料基底上，同时设置向培养基中加入Aspirin组为阳性对照组，PS组为阴性对照组。细胞经生长培养基正常培养1、3和5天后通过CCK-8试剂盒(Dojindo实验室；日本)检测其增殖情况。按照试剂盒说明书步骤：分别在细胞培养的第1、3和5天时，将细胞液弃去，PBS冲洗两次，将CCK-8试剂与细胞培养基以1:10(v/v)混合，并以每孔1mL体积加入到细胞表面并在37℃恒温培养箱中避光孵育2h。然后转移上清(100μL)至新的96孔板，通过全波长酶标仪(Model 680；Bio-Rad；加拿大)测量溶液在450nm处的吸光度值。每组实验设3个平行试样用于实验数据的平均值和标准差分析。
实验结果：
考虑到生物材料的应用，阿司匹林脂质体与细胞相容性是否良好是一个关键的评估因素。
将hMSCs分别接种到空脂质体与阿司匹林脂质体修饰的培养板表面(PS-Asp@Lipo)上，其中纯PS板表面为阴性对照组，在培养基中加入阿司匹林组为阳性对照组，各组细胞均正常用细胞生长培养基培养1、3、5天。从图4可以看出，各组细胞的生长均呈时间依赖性，即随着培养时间的增加，OD值也呈现增长趋势，说明阿司匹林脂质体修饰的培养表面(PS-Asp@Lipo)具有良好的细胞相容性，能够确保hMSCs的正常增殖，对细胞活力具有积极的影响，证明阿司匹林脂质体修饰的培养表面(PS-Asp@Lipo)可以用于干细胞的扩增生长。
1.3 ELISA检测炎症因子表达量
炎症细胞模型的制备：取正常生长的骨髓间充质干细胞，建立炎症细胞模型前需对细胞进行24h的饥饿处理，即细胞的培养基更换为不含有血清的培养基，用以排除血清中其他成分的影响。接下来在相同培养条件下分别培养12、24及48h，每个时间点分别以1μg/mL浓度的脂多糖结合无血清的培养基刺激hMSCs，形成炎症细胞。将未加入脂多糖的培养基组设置为阴性对照组。
采用ELISA试剂盒(奇松生物技术，中国)检测肿瘤坏死因子(TNF-α)，干扰素γ(IFN-γ)，核因子-κb受体激活剂(RANKL)和骨保护素(OPG)的表达水平。收集细胞上清液，通过ELISA试剂盒检测炎症因子(TNF-α，IFN-γ，OPG，RANKL)的表达量。
Aspirin抗炎浓度的筛选：
实验组为向已加入脂多糖的培养基中再加入0.1，0.5，1，5和10mM的Aspirin组，阴性对照为正常未加入脂多糖的培养基组，阳性对照为已加入脂多糖的培养基组。共培养1d后，收集细胞上清液，通过ELISA试剂盒检测炎症因子(TNF-α，IFN-γ)的表达量。
主要实验步骤为：
1)从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需板条；
2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔加不同浓度的标准品50μL；
3)样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，空白孔不加；
4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板模封住反应孔，恒温箱孵育60min；
5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗版5次；
6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；
7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果：
通过ELISA实验分析阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)是否仍能够保留阿司匹林的抗炎特性，所以就主要检测TNF-a和IFN-γ两种炎症因子的表达量。脂多糖(LPS)是一种强的炎症激活剂，可通过诱导上述细胞因子和其他趋化因子发生炎症反应，从而抑制Myd88通路进一步导致成骨细胞的分化也被抑制。我们首先建立通过LPS刺激hMSCs形成炎症细胞模型，24小时后，收集细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒检测TNF-a、IFN-γ炎症因子的表达水平。如图5a、b所示，阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)也可以显著降低以上两种炎症因子的表达量，表明了在阿司匹林缓释体系中仍可以保留阿司匹林自身的抗炎能力。
此外，也有报道称，阿司匹林对绝经后的大鼠(卵巢切除)的骨质疏松症有拮抗作用，表明了阿司匹林对骨流失的保护作用。因此，我们同样也检测了阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)是否也可以调控细胞成骨因子的表达，主要通过ELISA实验测定OPG和RANKL的表达水平。RANKL在hMSCs中的表达趋势与TNF-a、IFN-γ相似(图5d)，但OPG的表达趋势却有显著差异(图5c)。阿司匹林的骨保护作用是由于其可以刺激成骨细胞进而促进OPG蛋白表达水平(图5c)。相反，阿司匹林却可以通过降低RANKL蛋白的表达水平从而减少破骨细胞的形成。基于以上实验结果，我们得出的结论是阿司匹林缓释体系也可以保留阿司匹林自身的促进细胞成骨分化能力，在降低炎症因子表达的同时也可以提高成骨因子的表达。
1.4 hMSCs成骨诱导分化
将hMSCs分别接种到由阿司匹林脂质体和空脂质体修饰的培养板表面上。对照组分别为PS板上接种的hMSCs组(阴性对照)和在细胞培养基中加入阿司匹林(自由状态，75μg/mL)组。干细胞成骨诱导培养基的主要成分为在基础培养基的基础上，补充添加成骨诱导三因子，分别为：抗坏血酸(AA；50μg/mL)，地塞米松(Dex；100nM)和β-甘油磷酸酯(β-GP；10mM)。
1.5定量RT-PCR检测
采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)裂解细胞提取RNA，然后通过逆转录试剂盒形成cDNA，应用ABI 7500RT-PCR仪进行实时定量聚合酶链式反应，以β-actin为内参基因，以骨钙素(OCN)，细胞外主要的胶原成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)，成骨关键转录因子(Runx-2)，碱性磷酸酶(ALP)，骨保护素(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)作为目的基因，从基因水平上分析细胞的骨向分化能力。相关引物由上海生工生物技术公司合成，引物序列如表2所示。
1)Trizol提取细胞RNA：细胞经冰PBS清洗两次后，用1mL Trizol对其进行裂解，收集细胞悬液，移至1.5mL EP管。在静置10min后，每个EP管中加入200μL氯仿，振荡器上充分震荡后，室温静置5min。高速离心机(4℃，13000rpm)离心20min，离心后样品分层，取上清液移至新的EP管，然后加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温孵育10min。高速离心机(4℃，13000rpm)离心15min后弃上清液，向每个EP管中加入1mL 75％的乙醇，上下颠倒进行清洗。高速离心机(4℃，7500rpm)离心5min后弃上清液。待RNA样品晾干后，加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀。充分溶解后，将EP管置于冰盒中，使用Nanodrop2000仪器测量RNA浓度。
2)逆转录PCR：通过RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA。按照试剂盒说明书将各个待测样本配成共20μL的反应体系，涡旋混匀后放入PCR仪中。反应程序为70℃，5min；42℃，1h；95℃，6min。
3)实时荧光定量PCR：使用ABI 7500RT-PCR仪器进行荧光定量PCR反应。该反应体系为20μL，共包括10μL的SYBR Green、8.5μL的DEPC水、1μL的primer和0.5μL的cDNA。β-actin作为内参。反应程序为50℃，2min，1cycle；95℃，10min，1cycle；95℃，15s，60℃，1min，40cycle。
最后确定各个基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法进行进一步的数据分析。
表2基因引物序列
基因 正向引物 反向引物
Col1a1 AGACACTGGTGCTAAGGGAGAG GACCAGCAACACCATCTGCG
OCN CCTGAAAGCCGATGTGGT AGGGCAGCGAGGTAGTGA
ALP CAACCCTGGGGAGGAGAC GCATTGGTGTTGTACGTCTTG
Runx-2 AGGAATGCGCCCTAAATCACT ACCCAGAAGGCACAGACAGAG
OPG CTGGAACCCCAGAGCGAAAT GCCTCCTCACACAGGGTAAC
RANKL GGTTGGGCCAAGATCTCCAA TCCGGATCCAGTAAGGAGGG
β-actin CCCAGAGCAAGAGAGG GTCCAGACGCAGGATG
实验结果：
为了进一步验证阿司匹林脂质体对hMSCs成骨分化作用的影响，在成骨诱导第14天时，我们检测了Runx-2，Col1a1，OCN，ALP，OPG和RANKL等在hMSCs中具有典型骨特异性基因的转录水平。如图6所示，在PS板和空脂质体修饰的培养表面上的hMSCs成骨基因的mRNA表达水平较低。然而，阿司匹林脂质体修饰的培养表面上的hMSCs成骨基因的mRNA表达水平却明显升高，可能是由于阿司匹林在缓释体系中的持续释放刺激了成骨细胞，从而提升了骨向分化效率。虽然相比于PS组，Asp组也增加了成骨基因的表达，但是Asp@Lipo组表现出更高的成骨基因(OCN，Col1a1，ALP和OPG)mRNA的表达水平(图6a-e)，但RANKL的表达却相反(图6f)。分析原因可能是一方面阿司匹林的促成骨作用与Wnt信号的形成至关重要；另一方面，阿司匹林可以通过抑制NF-κB通路减少破骨细胞的形成，从而导致RANKL表达水平的降低。如图6e和f所示，Asp@Lipo组RANKL的表达量最低，而OPG的表达量是最高的。以上结果证实了相比于阿司匹林本身，阿司匹林脂质体缓释体系可以进一步地增强干细胞的成骨分化作用。
1.6 ALP染色
在细胞诱导培养第7天和14天时，对各组样品(PS：正常的PS细胞培养板表面；Lipo：在PS表面接枝的空白脂质体；Asp：Aspirin，以自由状态存在)进行ALP定性和定量检测。
在适当的检测时间点，吸弃样品培养基，PBS冲洗三次。室温下，用无水乙醇固定30min后，PBS冲洗三次。按照康为世纪盒说明书用BCIP/NBT对ALP进行原位酶组织化学染色，以500μL/孔的体积加入到待测孔中，避光反应30min后，弃去工作液，PBS清洗一次后立即拍照。
ALP定量实验首先需要通过BCA法测定蛋白的浓度，以每孔200μL的体积的工作液加入到待测样孔中，37℃恒温箱中避光孵育30min后，562nm下测定OD值。
ALP活力检测，准备一个96孔板，向其中加入30μL的酚标准品、PBS溶液(空白对照)及待测样本，然后向每孔中各加入50μL的基质液及缓冲液，摇匀后放入37℃的恒温箱中孵育15min，最后向每孔中加入150μL的显色液，15min内避光条件下在酶标仪520nm条件下读板，测定OD值。
按照以下公式计算ALP活性：
1.7钙沉积检测
待诱导hMSCs成骨分化21天时，对不同样品上的细胞进行ARS染色已检测成骨分化效果。首先用4％多聚甲醛固定细胞，然后用2％浓度的茜素红溶液进行室温染色30min，无菌水清洗2次后置于显微镜(Eclipse TE2000-U；尼康，日本)下拍照。同时为了定量的测定染色样品中钙的含量，所以将1％浓度的十六烷基氯化吡啶洗脱茜素红染色，室温摇床恒温摇动24h后，将100μL/孔的上清液转移至新的96孔板中，在酶标仪中550nm下测定吸光度值，从而定量钙结节的形成量。
实验结果：
骨形成过程中的早期标志物是碱性磷酸酶的表达。在成骨诱导14天时，采用ALP染色实验对hMSCs的骨向分化效果进行了评价。如图7a，b所示，相比于PS，Lipo和Asp组，ALP表达量在Asp@Lipo组中是最多的，说明了阿司匹林脂质体对细胞的骨向分化有明显的促进作用，能够诱导ALP表达的上调。
此外，在成骨诱导21天时，对四组样品也进行了ARS染色以检测钙结节(晚期成骨分化的标志)的形成能力。如图7c和d所示，与ALP活性表达情况相似，相比于PS和Lipo组，阿司匹林组(Asp@Lipo和Asp)均观察到更强烈的红色染色结果。定量结果表明Asp@Lipo组比Asp组产生了更多的钙量，且在Asp@Lipo表面上培养的hMSCs表达了最多的钙结节量(图7d)。这些结果同样证实了相比于阿司匹林本身，阿司匹林脂质体缓释体系能够更大程度地增强干细胞的成骨分化作用。
1.8免疫荧光检测
为了进一步的验证干细胞的骨向分化作用，在成骨诱导21天时通过免疫荧光实验检测骨钙蛋白(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。
首先用4％的多聚甲醛固定细胞30min后，然后用0.1％的Triton X-100室温通透细胞30min，再用3％的BSA溶液室温封闭2h。接下来即可孵育一抗抗体，使用的主要抗体小鼠抗骨钙素(anti-OCN)(Abcam，英国)和兔抗骨桥蛋白(anti-OPN)(Abcam，英国)，稀释比例均为1:200，每孔加200μL一抗后置于4℃过夜反应。经PBS冲洗3次后，开始避光孵育二抗1h，所使用的二抗分别是TRITC-543山羊抗鼠(1:500；美国)和FITC-488山羊抗兔(1:500，美国)。最后用DAPI对细胞核进行染色后，立即将样品置于CLSM下拍摄荧光图像。
实验结果：
在成骨诱导第21天时，采用免疫荧光实验进一步验证阿司匹林脂质体缓释体系的作用效果。主要对骨钙蛋白(OCN)和骨桥蛋白(OPN)两种重要的成骨标志物进行免疫荧光染色。如图7e所示，与其他组相比，在Asp@Lipo组中可以发现更强的OCN(绿色)和OPN(红色)密度。这与我们之前的(qPCR，ALP和ARS)的结果相一致。总而言之，以上数据结果共同证明了阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)在诱导hMSCs成骨分化上具有巨大的潜力。
效果试验例1结果：
基于长期服用阿司匹林会带来的一些副作用，我们建立了基于阿司匹林的脂质体缓释体系，通过一系列体外的阿司匹林缓释实验、细胞相容性实验、成骨相关实验的检测结果证明该缓释体系仍能够保持阿司匹林的促进干细胞骨向分化的属性，且在脂质体的缓释作用下，药物的作用时间得到了延长，诱导分化效果也更好，阿司匹林的促进干细胞成骨分化能力得到了进一步的提升。事实证明基于阿司匹林的缓释体系能够提升干细胞成骨分化性能，有利于推进阿司匹林在骨组织工程中的发展及应用。
实施例2 Aspirin/BFP-1双因子复合PS体系的构建
不同比例Aspirin/BFP-1修饰培养板表面(PS-Asp@Lipo/BFP-1)的制备及表征
首先，按照实施例1中1.1的实验方法制备Asp@Lipo。
通过多巴胺技术，我们将Asp@Lipo和BFP-1多肽按照预设的比例Asp@Lipo：BFP-1＝7:3，5:5，3:7接枝在PS培养板上。
主要实验步骤为：首先向培养板的每个孔中加入2mL多巴胺溶液(pH＝8.5，2mg/mL)，然后置于恒温摇床(37℃，70rpm)孵育24h。PBS清洗2次后，室温下每孔加入2mL活化液(5mM NHS，2mM EDC溶于0.1M MES缓冲液中)预处理聚多巴胺(PDA)修饰的表面，活化40min后，吸弃活化液，在孔板表面上按照预设比例分别加入Asp@Lipo和BFP-1多肽，置于4℃冰箱孵化24h。最后，培养板经无菌PBS洗涤后备用，不同体积比的Asp@Lipo/BFP-1依次被命名为B7A3，B5A5和B3A7。
PS培养板经PDA涂层后，培养表面继续被Asp@Lipo和/或BFP-1多肽修饰。
为进一步验证Asp@Lipo和BFP-1多肽均能够成功以预定体积比接枝上来，我们采用PE-Rho负载的Asp@Lipo和Rhodamin标记的BFP-1多肽接枝到培养板表面，并通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)进行分析。
实验结果：
细胞培养表面功能化修饰是一种很好的能够控制细胞行为的方法。其中，近年来已报道的方法中就有一种应用多巴胺溶液涂层修饰技术来固定生物活性因子的方法。多巴胺分子在弱碱性溶液中能够发生自聚合反应形成聚多巴胺(PDA)结构，进一步的能够通过迈克尔加成反应与含胺或巯基的生物活性因子发生偶联，使得共价接枝的生物活性因子能够不易从修饰后的底物中清除，在组织工程中具有良好的应用前景。
通过PE-Rho脂质体和FITC标记的BFP-1多肽的信号分布情况来验证生物活性分子是否能够在按照既定的比例分布下成功地接枝到培养板表面上。如图8所示，不同强度的红、绿荧光信号表示脂质体与荧光多肽已经成功地接枝在培养表面上。可以发现从左到右，随着多肽与脂质体接枝比例的降低，FITC标记的BFP-1多肽的绿色信号也在逐渐降低，而PE-Rho脂质体的红色荧光信号却在显著加强，证明了二者能够按照设定比例接枝在培养板表面上。
效果试验例2 Aspirin/BFP-1双因子复合PS体系影响hMSCs骨向分化作用的研究
2.1 hMSCs在Aspirin/BFP-1双因子复合PS基底上进行成骨诱导分化
将hMSCs分别接种在以PS为基底的培养表面上(PS，PS-Asp@Lipo，PS-BFP-1，PS-B7A3)。对细胞进行成骨诱导，所需的成骨诱导培养基为在基础培养基的基础上添加0.1×10-6M地塞米松(Sigma-Aldrich)，10×10-3Mβ-甘油磷酸(Sigma-Aldrich)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich)。每隔一天更换一次成骨诱导培养基。
2.2 ALP染色及定量检测
在分别诱导第7天和14天时，对细胞早期成骨标志物(ALP)的表达进行了评价。利用ALP检测试剂盒(CW-BIO，中国)进行染色，并分析Asp@Lipo和/或BFP-1多肽修饰的培养表面对干细胞骨向分化的影响。此外，我们通过Bicinchoninic Acid Protein Assay试剂盒(Thermo，USA)检测细胞总蛋白浓度，以统一检测标准，进而采用AKP检测试剂盒(NJJC-BIO，中国)定量测定ALP的活性。
ALP定性检测：吸弃样品培养基，PBS冲洗三次。室温下，用无水乙醇固定30min后，PBS冲洗三次。按照康为世纪盒说明书配置1:1:38比例的工作液，以500μL/孔的体积加入到待测孔中，避光反应30min后，弃去工作液，PBS清洗一次后立即拍照。
ALP定量检测：吸弃样品培养基，PBS冲洗三次。然后加入以每孔400μL体积的1％TritonX-100，20min后，用细胞刮刮细胞，将细胞悬液收集到EP管中。超声破碎细胞后，高速离心机(12000rpm，4℃)离心30min。收集上清液至新的EP管中。通过BCA法测定蛋白的浓度，首先配置工作液，以每孔200μL的体积加入到待测样孔中，37℃恒温箱中避光孵育30min后，562nm下测定OD值。
ALP活力检测：准备一个96孔板，向其中加入30μL的酚标准品、PBS溶液(空白对照)及待测样本，然后向每孔中各加入50μL的基质液及缓冲液，摇匀后放入37℃的恒温箱中孵育15min，最后向每孔中加入150μL的显色液，15min内避光条件下在酶标仪520nm条件下读板，测定OD值。
ALP活性的计算公式如下：
实验结果：
为了研究hMSCs在基于修饰有Asp@Lipo和/或BFP-1多肽的PS培养板表面的成骨分化能力，我们检测了在成骨细胞中表达强烈的碱性磷酸酶(ALP)的表达情况。对照组为GM(在不含成骨因子的正常生长培养基中培养的hMSCs，阴性对照)和OM(在成骨培养基中培养的hMSCs，阳性对照)，hMSCs接种在两种PS基质上，连续诱导培养14天。如图9所示，Asp@Lipo和BFP-1中hMSCs的ALP活性高于GM、OM和Lipo组。此外，B7A3组hMSCs的ALP表达在第14天时显著提高，在各组中均为最高水平。同时，与对照组相比，B7A3组的ALP活性具有明显差异(p<0.01)；与Asp@Lipo组或BFP-1组相比，B7A3组也具有绝对优势(p<0.05)。以上结果表明基于B7A3修饰的PS表面对hMSCs的成骨分化具有积极的影响。
2.3茜素红染色及茜素红定量
在成骨诱导21天时，检测了细胞成骨分化晚期标志物钙结节的形成情况。通过茜素红染色分析Asp@Lipo和/或BFP-1多肽修饰的培养表面对干细胞骨向分化的影响。进一步的，通过向培养孔中加入1％的氯化十六烷基吡啶以洗脱ARS染色，定量的分析钙的含量。
ARS定性检测：弃去培养基，PBS溶液清洗三次后，以1mL/孔的体积加入4％多聚甲醛溶液，固定20min后，用蒸馏水清洗三次。加入1mL的茜素红溶液(2％，pH＝4.2)，反应30min后，蒸馏水清洗多次以除去未反应的茜素红溶液以及非反应性着色。通过倒置光相差显微镜下观察钙结节的染色情况，并拍摄钙结节形貌图。
ARS定量检测：拍照结束后，向每孔中加入1mL的十六烷基吡啶(1％)溶液，将样品转移至恒温摇床(37℃，70rpm)摇动以洗涤茜素红染色。待反应完全后，将100μL/孔的上清液转移至新的96孔板中，在酶标仪中550nm下测定吸光度值，从而定量钙结节的形成量。
实验结果：
为进一步地验证表面活性因子对hMSCs成骨活性的影响，在成骨连续诱导第21天时，我们采用茜素红S(ARS)染色对hMSCs的成骨能力进行了评价。与ALP结果相一致，相比较于其他各组，B7A3组hMSCs在21d时表现出更明显的钙结节和钙沉积含量(图10)，证明了其在骨组织工程中的应用具有很大的潜力。
2.4免疫荧光检测
在成骨诱导第21天，通过免疫荧光实验对OCN与OPN两种成骨分化后期的蛋白进行染色，分析Asp@Lipo和/或BFP-1肽修饰的培养表面对干细胞骨向分化的影响。细胞通过固定，通透，封闭后分别孵育一抗和二抗，然后置于CLSM下观察荧光信号及图像。主要实验步骤为：
1)吸弃旧培养基，PBS洗两次，加入0.5mL 4％多聚甲酵室温孵育30min；
2)吸去多聚甲醛，PBS洗两次；
3)加入0.5mL 0.2％TritonX-100室温通透30min，PBS洗两次；
4)加入0.5mL 3％BSA溶液室温封闭2h；
5)配制一抗(小鼠抗人OCN单克隆抗体和小鼠抗人OPN单克隆抗体)，稀释比例为1：200，每孔加200μL一抗后置于4℃过夜反应；
6)吸走一抗，PBS冲洗三次；
7)准备稀释二抗，开始避光操作。以1：400比例稀释二抗，然后每孔中加入400μL反应1h。
8)PBS冲洗三次，以1:5000比例稀释DAPI后，每孔中加入0.5mL室温染色5min。
9)PBS冲洗一次后再加入新的PBS，通过共聚焦显微镜进行观察和拍照。
实验结果：
在成骨诱导第21天时，我们也采用了免疫荧光染色法以进一步验证成骨后期相关蛋白(OCN和OPN)的表达情况。如图11所示，在B7A3组，CLSM图像中OCN和OPN信号明显增强，这是由于Asp@Lipo和BFP-1多肽的修饰促进了hMSCs的骨向分化效率。这也与ALP和ARS的结果相一致。综上所述，我们可以得出这样的结论：:在PS培养板上，Asp@Lipo和BFP-1多肽等生物活性因子都可以成功的固定在培养表面上。更重要的是，当BFP-1和Asp@Lipo比值为7比3时，能够最大程度的提升hMSCs的成骨分化效率。
效果试验例2结果：
本部分的研究内容是将阿司匹林脂质体(Asp@Lipo)与BFP-1多肽成功整合到PS培养板基底材料上，并通过一系列体外细胞成骨实验研究结果，最终确定了二者的最佳接枝比例(3:7)以促进hMSCs的成骨分化效率。实验结果共同说明了阿司匹林与BFP-1多肽能够协同发挥作用，共同刺激骨诱导过程从而促进新生骨的生成。双因子共同修饰的PS体系有了更好更强的促骨再生能力，为其更好的应用于骨组织工程及再生医学领域创造了一定的有利条件。
实施例3 Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的制备
3.1.1 Dex/Mino脂质体制备
采用薄膜分散法制备；按比例(1.85∶1∶0.15∶0.25，molar/molar/molar/molar)精密称取适量的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和Dex于茄形瓶中，加入甲醇和氯仿的混合溶剂(1∶1，v/v)，摇动使溶质溶解；使用旋转蒸发仪(75rpm)在恒温水浴(47℃)中减压干燥彻底除去有机溶剂，瓶内壁形成一层均匀的脂膜；取适量的水化液(120mM无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液，pH＝7.9)加入茄形瓶中，于恒温水浴(47℃)中超声水化至内壁脂膜完全脱落形成悬液；迅速将所得脂质体悬液依次通过孔径为220nm和100nm的滤器挤出数次得到具有浓度梯度的Dex脂质体，使用0.9％氯化钠缓冲液4℃过夜透析；透析后的Dex脂质体与适量Mino储液(药脂比为1∶10，w/w)混合，50℃条件下振摇茄形瓶30min使Mino载入脂质体水相中，即得到Dex/Mino脂质体(图12)，使用PBS过夜透析后，4℃保存备用。
3.1.2空白脂质体制备
按比例(1.85∶1∶0.15，molar/molar/molar)精密称取适量的DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-NH2于茄形瓶中，加入甲醇和氯仿的混合溶剂(1∶1，v/v)，摇动使溶质溶解；使用旋转蒸发仪(75rpm)在恒温水浴(47℃)中减压干燥彻底除去有机溶剂，瓶内壁形成一层均匀的脂膜；取适量的PBS加入茄形瓶中，于恒温水浴(47℃)中超声水化至内壁脂膜完全脱落形成悬液；迅速将所得脂质体悬液依次通过孔径为220nm和100nm的滤器挤出数次得到空白脂质体，使用PBS过夜透析后，4℃保存备用。
3.1.3荧光脂质体制备
避光条件下完成；DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-NH2和PE-Rho的称取比例为1.85∶1∶0.15∶0.002(molar/molar/molar/molar)，制备过程同空白脂质体。
3.1.4脂质体的性质评价
将待测脂质体稀释至合适倍数，使用光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径、多分散度(PDI)和zeta电位。
Dex和Mino的包封率测定公式为：包封率＝(Wencap/Wtotal)×100％。其中，Wtotal是透析前脂质体中Dex或Mino的测量值，Wencap为透析后脂质体中Dex或Mino的测量值。
收集等体积的透析前后的脂质体，分别加入适量的甲醇充分破坏脂质体，使用高效液相色谱仪测定透析前后样品中Dex或Mino的峰面积，用标准品所得线性回归曲线换算得到相应的含量值。Mino的色谱检测条件为：C18色谱柱；以0.2mol/L醋酸铵/二甲基甲酰胺/四氢呋喃(600∶398∶2，v/v，内含0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠)为流动相；检测波长为280nm；流速为1.0mL/min。Dex的色谱检测条件为：C18色谱柱；以乙腈/水/磷酸(35∶65∶0.5，v/v/v)为流动相；检测波长为242nm；流速为1.0mL/min。
3.2.1 Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的制备
1)配制Tris缓冲液(10mM)
称取0.121g Tris盐酸盐溶解于100mL去离子水中，使用滴管搅拌混匀，调节pH为8.5。
2)配制多巴胺溶液(2mg/mL)
于Tris缓冲液中加入0.2g多巴胺粉末，搅拌混匀并使用0.22μm滤膜过滤。
3)PS表面功能化修饰
PS片置于2mg/mL多巴胺溶液中反应18h(37℃，70rpm)，去离子水超声清洗3次，得到pDA修饰的PS(命名为PS-pDA)；继续加入空白脂质体或Dex/Mino脂质体(浓度分别为0.5、1.0和2.0mg/mL)，37℃静置24h，得到脂质体修饰的PS(命名为PS-blank lipo或PS-Dex/Mino lipo)。该功能化表面的制备流程如图13所示。
3.2.2 Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的表征
1)QCM检测
使用QCM和表面镀金的AT切型二氧化硅芯片(直径为14mm，共振频率为5MHz)检测脂质体接枝前后的质量变化，评估脂质体是否成功接枝。在使用之前，芯片需要置入紫外臭氧清洗仪中处理30min，然后利用纯水和无水乙醇交替清洗3次后用氮气吹干。二氧化硅芯片的压电效应是QCM的测量基础；物质沉积于芯片表面，芯片的共振频率会受到影响；Sauerbrey等式(Δm＝-CΔf/n)可用来换算芯片共振频率的变化和芯片表面沉积的质量；n为使用的共振频率阶数；Δm为每单位面积发生的质量变化，单位为(ng·cm-2)；Δf为频率变化；C为一常数(17.7ng·cm-2·Hz-1)。多巴胺和脂质体(浓度分别为0.5、1.0和2.0mg/mL)接枝方法同实施例3中3.2.1，频率和质量变化采用QCM检测，每组使用3枚芯片。
2)PS表面接枝的荧光标记的脂质体定性及定量检测
荧光脂质体接枝检测用于表征脂质体在PS表面接枝强度及分布情况。本实验全程避光。按照实施例3中3.1.3的方法制备荧光标记的脂质体(浓度分别为0.5、1.0和2.0mg/mL)；按照实施例3中3.2.1的方法接枝在PS-pDA表面，轻轻清洗去除物理吸附的脂质体；使用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察并拍摄PS表面脂质体荧光强度及分布情况；每孔加入PBS 500μL，使用酶标仪检测PS表面的荧光接枝密度。
3)PS表面形貌检测
使用SEM检测不同PS样品的表面形貌，样品包括PS、PS-pDA和PS-Dex/Mino lipo(脂质体接枝浓度为1.0mg/mL)。检测前，所有样品均真空干燥并且表面喷金处理。
4)缓释曲线
体外释放实验分为3组：①游离Dex/Mino脂质体(命名为Dex/Mino lipo组)：将Dex/Mino脂质体封装于透析袋内并浸没在PBS中；②Dex/Mino脂质体共价接枝的PS(命名为PS-Dex/Mino lipo组)：将PS-Dex/Mino lipo浸没在PBS中；③Dex/Mino混合液浸泡24h后的PS(命名为PS-Dex/Mino组)：将PS-Dex/Mino浸没在PBS中。
将3组待测样品置于100rpm的摇床上，在预先设定的时间点，收集释放介质并使用高效液相色谱仪检测各样品中Dex或Mino的峰面积，用标准品所得线性回归曲线换算得到相应时间点的累积浓度(Dex和Mino的色谱检测条件同实施例3中3.1.4)。
3.3实验结果
3.3.1脂质体的性质评价
脂质体的结构和表面性质易于优化，因而在调控生物活性分子的运输与释放方面具有显著的优势。常规脂质体由DPPC和Chol组成；空间稳定的脂质体由DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-NH2组成。DSPE-PEG2000-NH2修饰在脂质体的表面，PEG2000能有效稳定脂质体，避免其聚集。脂质体在pDA修饰的PS表面(PS-pDA)的共价接枝是通过DSPE-PEG2000-NH2的NH2基团与PS-pDA表面的邻苯二酚基团的稳定结合而实现的。
表3脂质体的性质评价
表3为本研究使用的脂质体的粒径大小、PDI和zeta电位。空白脂质体的粒径约为154.93±2.73nm，Dex/Mino脂质体的粒径约为164.56±3.04nm，两者的PDI约为0.2，说明脂质体粒径均一性良好；脂质体呈近中性zeta电位。Dex和Mino的包封效率分别约为11％和69％。Dex和Mino包封效率的显著差异归因于不同的载药方法。亲脂性药物Dex采用传统的被动载药法包载在脂质体中，而两亲性、弱酸性Mino采用高效主动载药法(pH梯度法)包载在脂质体中。与被动脂质体包封方法相比，主动加载(也称为跨膜梯度法)具有更高的药物包封效率；值得注意的是，主动载药的驱动力是pH不平衡。
3.3.2Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的表征
在弱碱性(pH＝8.5)条件下，通过简单浸泡方式，多巴胺分子在PS表面发生自聚合形成pDA涂层；该涂层含有丰富的邻苯二酚基团，与Dex/Mino脂质体表面修饰的氨基(DSPE-PEG2000-NH2)进一步反应形成稳定的共价结合，形成脂质体修饰的PS表面。功能化表面制备完成后，我们分别使用QCM、CLSM、SEM和高效液相色谱仪对Dex/Mino脂质体修饰的PS表面进行了表征。
1)QCM检测
QCM是一种非常灵敏的用于检测质量变化的传感器系统；在本实验中，我们用QCM检测pDA涂层表面接枝脂质体前后的质量变化，用于评估脂质体是否成功修饰在pDA修饰的表面。图14为QCM芯片表面分别修饰pDA和脂质体后的频率和质量变化。pDA修饰后，QCM芯片表面的频率信号明显增强，证实了QCM芯片表面的pDA层的存在。进一步，脂质体的修饰略微增加了pDA修饰的表面的频率信号，证实了芯片表面脂质体层的存在。同样地，脂质体修饰的QCM芯片表面的质量变化(6622±506ng/cm2)明显高于pDA修饰的QCM芯片表面的质量变化(4057±702ng/cm2)，说明脂质体成功修饰在pDA涂层表面。
2)荧光脂质体定性及定量分析
接下来，我们制备了荧光脂质体(PE-Rho标记的脂质体)，并将其修饰在PS表面，然后使用CLSM观察脂质体是否成功接枝及其在PS表面的空间分布。图15a和b分别为不同修饰的PS样品的代表性荧光图像及其相应的半定量分析。荧光图像显示脂质体均匀分布在PS表面；随着接枝脂质体浓度的增加，红色荧光强度明显增加，这与半定量结果一致。相反，PS或PS-pDA样品的制备不需要在荧光脂质体中浸泡修饰，镜下未见红色荧光信号，说明其表面无自发荧光且无荧光脂质体共价附着。以上结果说明脂质体成功修饰于PS表面并在其表面均匀分布。
3)表面形貌分析
pDA接枝和Dex/Mino脂质体修饰，改变了PS基底的表面形貌。从SEM图像(图16)可以看出，原始PS样品的表面较为光滑；pDA修饰的PS样品(PS-pDA组)表面观察到大量的多巴胺颗粒，其表面比原始的PS基底表面粗糙，证实了PS表面pDA层的存在。此外，在PS-pDA表面修饰Dex/Mino脂质体(PS-Dex/Mino lipo组)后，样品表面粗糙度略有增加，证实脂质体层的存在。
4)缓释曲线
图17是使用高效液相色谱仪检测的PS-Dex/Mino组、Dex/Mino lipo组和PS-Dex/Mino lipo组中Dex和Mino的体外累积释放曲线。如图所示，PS-Dex/Mino组中几乎未检测到Dex和Mino的释放，说明两种药物不能直接物理吸附在PS表面。通过脂质体将Dex和Mino包载，得到Dex/Mino lipo组，并进一步将其修饰在PS表面，得到PS-Dex/Mino lipo组，将以上两组分别放入缓释体系中，在设定时间点检测Dex和Mino的累积释放量。如图17a所示，Dex/Mino lipo组中Dex在24h内呈持续释放，之后释放减慢；将Dex/Mino脂质体接枝到PS板(PS-Dex/Mino lipo组)后，Dex的释放较游离时更慢且更稳定。如图17b所示，Dex/Mino lipo组中Mino在16h内呈持续释放，之后释放速度降低；将Dex/Mino脂质体接枝到PS板(PS-Dex/Mino lipo组)后，Mino的释放在14h内呈稳定缓慢释放，之后渐渐趋于平缓。综上所述，PS-Dex/Mino组的PS基底几乎不吸附游离的Dex和Mino，释放量为零；使用脂质体包载Dex和Mino后，两种药物的释放得到了很好地控制；载药脂质体共价固定在PS基底表面，通过脂质体控制药物释放实现了材料表面功能化。
效果试验例3 Dex/Mino脂质体修饰的PS表面在骨再生应用中的效果实验
3.1体外细胞相容性检测
(1)溶液配制
1)正常生长培养基
含有90％DMEM高糖培养基、10％胎牛血清和1％双抗(青霉素/链霉素)。
2)CCK-8工作液
CCK-8原液与DMEM高糖培养基以1∶10体积比混合，4℃避光保存。
3)鬼笔环肽(异硫氰酸荧光素标记)
0.1mg鬼笔环肽粉末溶于1mL无水甲醇，配成储存液，-20℃避光保存；工作液浓度为5μg/mL，由储液加PBS稀释20倍即可。
(2)hBMSCs接种
将hBMSCs接种于原始PS和不同修饰的PS表面(命名为PS组、PS-pDA组、PS-blanklipo组和PS-Dex/Mino lipo组，脂质体接枝浓度为0.5、1.0和2.0mg/mL)，接种密度为2.5×104个/孔。每孔加入正常生长培养基1mL，隔天换液，并在镜下观察细胞生长状态。
(3)细胞增殖检测
采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。细胞分别培养1、4、7天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入500μL CCK-8工作液，避光条件下放入37℃恒温箱温育2h；取100μL上清液转移至96孔板，避光条件下，在450nm波长处使用酶标仪检测光密度(OD)值。
(4)细胞粘附形态观察
细胞培养3天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL 2.5％戊二醛，放入4℃冰箱，固定细胞2h；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入1mL梯度乙醇(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)脱水15min，继续用无水乙醇脱水2次；使用冷冻干燥机干燥样品，喷金后使用SEM观察拍照。
同样地，细胞培养3天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定细胞20min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.5mL Triton X-100(0.1％，v/v)，反应5min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.3mL异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(5μg/mL)，避光静置30min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.3mL DAPI(10μg/mL)，避光静置5min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入少量新PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
实验结果：
(1)细胞增殖分析
细胞相容性是新型的功能化修饰材料作为植入物应用前需要评估的重要因素之一。本研究中，我们采用CCK-8检测hBMSCs在原始PS及各种浓度(0.5、1.0和2.0mg/mL)的脂质体修饰的PS样本表面，分别孵育1、4和7天后的增殖能力。如图18所示，所有样品组的OD值随着时间的延长而增加(显示良好的时间依赖性)，说明脂质体的修饰没有影响hBMSCs的增殖，其修饰表面仍具有良好的细胞相容性。但是，与PS对照组相比，在细胞培养的过程中各脂质体修饰的实验组的OD值均较低(p<0.05)，说明脂质体修饰表面对细胞有一定的消极影响；合理的解释是，用于递药系统的脂质体的疏水性和PEG化修饰可能在一定程度上抑制了初始细胞粘附量。hBMSCs分别培养1、4和7天后，0.5和1.0mg/mL的PS-Dex/Mino lipo组和PS-blank lipo组的OD值分别高于2.0mg/mL的PS-Dex/Mino lipo组和PS-blank lipo组的OD值；0.5和1.0mg/mL的PS-Dex/Mino lipo组和PS-blank lipo组的OD值在细胞培养期间无统计学差异(p>0.05)。以上结果表明，接枝脂质体的浓度会影响样品表面的细胞相容性，而1.0mg/mL脂质体修饰表面可满足最大程度载药及促进hBMSCs的增殖；综上所述，1.0mg/mL脂质体浓度可能是修饰PS表面用以引导细胞命运的最佳浓度。
(2)细胞粘附形态观察
为了进一步研究脂质体修饰表面的细胞相容性，我们观察了hBMSCs的粘附形态。图19为hBMSCs在不同修饰的PS表面培养3天后的SEM图像。如图所示，在所有样本表面培养的hBMSCs都具有健康的粘附形态，细胞出现丝状伪足且紧密粘附在不同修饰的PS表面。图20为hBMSCs在不同修饰的PS表面培养3天后的荧光染色图像。如图所示，PS组和PS-pDA组表面细胞粘附数量要多于脂质体修饰的表面，这与细胞增殖检测结果一致。hBMSCs在PS-blank lipo组呈现狭窄的伸展形态，肌动蛋白发育不良；然而，在PS-Dex/Mino lipo组，hBMSCs的铺展形态更好，有发育成熟的肌动蛋白张力微丝。一个可能的解释是，PS表面的空白脂质体修饰引起hBMSCs轻度炎性反应，Dex/Mino脂质体修饰的PS表面可以缓慢释放Dex(著名的糖皮质激素类抗炎药)，从而减轻负面影响；这意味着Dex/Mino脂质体修饰对细胞生长有积极作用。以上研究表明，脂质体修饰的表面可能会影响细胞的初始粘附，但不会影响细胞后续增殖，而且脂质体包载的Dex和Mino使改性表面具有更好地细胞相容性。
3.2体外抑菌检测
(1)溶液配制
1)BHI固体培养基
称取7.4g BHI粉末和3g琼脂粉，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基冷却至50℃时，于超净台中将培养基倒入细菌培养皿，静置约20min使培养基充分凝固，培养皿封口，倒置存放于4℃冰箱。
2)BHI液体培养基
称取7.4g BHI粉末溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基完全冷却后，使用封口膜封口，存放于4℃冰箱。
3)TSB固体培养基
称取6g TSB粉末、0.2g酵母提取物和4g琼脂粉，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基冷却至约50℃时，于超净台中加入1支维生素K1、2mL氯化血红素储液和10mL脱纤维羊血，使用转子搅拌混匀后将培养基倒入细菌培养皿中铺板，静置约20min使培养基充分凝固，培养皿封口，倒置存放于4℃冰箱。
4)TSB液体培养基
称取6g TSB粉末和0.2g酵母提取物，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基完全冷却后，于超净台中加入1支维生素K1和2mL氯化血红素储液，使用转子搅拌混匀，使用封口膜封口，存放于4℃冰箱。
5)氯化血红素储液
称取1.74g磷酸氢二钾和0.5g氯化血红素粉末溶于100mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，得到5mg/mL的氯化血红素储液；待液体完全冷却后，使用封口膜封口，避光存放于4℃冰箱。
6)WST-8工作液
按9∶1的比例混合WST-8原液和电子载体溶液后，与液体培养基以1∶20体积比混合，4℃保存备用。
7)细菌活/死荧光染色工作液
细菌活/死荧光染色试剂盒中含有两种核酸染料(SYTO-9和PI)，分别取1.5μLSYTO-9和1.5μL PI溶于1mL PBS，避光混匀即可；根据实验实际用量可成比例扩大，4℃避光保存。
(2)细菌培养
牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)，革兰阴性、专性厌氧菌，由北京大学口腔医院中心实验室微生物平台提供。培养方法：于-80℃冰箱取出甘油冻存菌，溶化后与TSB液体培养基混匀，使用螺旋接种仪将菌液复苏于TSB固体培养基上，将培养皿倒置于厌氧箱中，培养14天，待细菌产黑后挑取一个单克隆于TSB液体培养基(1mL)中，继续厌氧培养48h备用。
变形链球菌(UA159)，革兰阳性、兼性厌氧菌，由北京大学口腔医院中心实验室微生物平台提供。培养方法：于-80℃冰箱取出甘油冻存菌，溶化后与BHI液体培养基混匀，使用螺旋接种仪将菌液复苏于BHI固体培养基上，将培养皿倒置于37℃孵箱(含5％二氧化碳)培养48h，挑取一个单克隆于BHI液体培养基(1mL)中，继续培养24h备用。
分别将牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌菌液与相应液体培养基混匀后接种于原始PS和不同修饰的PS表面(命名为PS组、PS-pDA组、PS-1.0blank lipo组和PS-1.0Dex/Minolipo组)，脂质体接枝浓度为1.0mg/mL。
(3)细菌粘附和增殖定量检测
采用WST-8试剂盒检测材料表面细菌粘附情况。细菌分别培养4h和24h后，将各组PS片小心取出，移至新的24孔板，PBS轻轻冲洗3次；每孔加入400μL WST-8工作液，避光条件下放入37℃恒温箱温育2h；取100μL上清液转移至96孔板，避光条件下，在450nm波长处使用酶标仪检测OD值。
(4)细菌粘附形态观察
细菌分别培养24h后，将各组PS片小心取出，移至新的24孔板，PBS轻轻冲洗3次；每孔加入1mL 2.5％戊二醛，放入4℃冰箱，固定细胞1h；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入1mL梯度乙醇(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)脱水15min，继续用无水乙醇脱水2次；使用冷冻干燥机干燥样品，喷金后使用SEM观察拍照。
(5)细菌活/死荧光染色
细菌分别培养24h后，将各组玻片小心取出，移至新的24孔板，PBS轻轻冲洗3次；每孔加入500μL活/死荧光染色工作液，避光静置15min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入少量新PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
实验结果：
细菌对植入界面的初始粘附是生物膜形成的关键步骤，也是感染发病机制的重要组成部分。术后早期，预防细菌在植入物表面的初始粘附，是提高植入成功率和维持植入物长期稳固的关键。革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌是一种与牙周炎和种植体周围炎密切相关的致病微生物；革兰氏阳性变形链球菌是龋齿的主要致病微生物，也是牙菌斑生物膜的早期定植菌。在本研究中，我们分别使用牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌来评估细菌在Dex/Mino脂质体修饰表面的初始粘附和增殖情况；我们通过在预定的时间检测细菌粘附在材料表面的数量、形态和活力，来评估功能化表面的抑菌效果。
(1)微生物活力定量检测
首先，我们利用WST-8试剂盒对不同修饰的PS表面的活菌进行定量分析(图21)。在细菌粘附初期(4h)，牙龈卟啉单胞菌在所有样品表面的粘附量均较少；与PS组相比，Dex/Mino脂质体修饰表面的变形链球菌粘附量更少。在细菌增殖阶段(24h)，原始PS和pDA修饰的PS表面培养的牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌的OD值均随时间而增加，说明原始PS和pDA修饰的PS基底易于细菌增殖；与PS组相比，牙龈卟啉单胞菌在空白脂质体和Dex/Mino脂质体修饰的表面粘附量均大大降低，说明脂质体的修饰和Mino的释放有效地抑制了牙龈卟啉单胞菌在材料表面的粘附；与PS组相比，变形链球菌在空白脂质体修饰的表面粘附量略有降低，而Dex/Mino脂质体的修饰大大抑制了变形链球菌的表面粘附和增殖。以上结果表明Dex/Mino脂质体修饰的表面具有有效的抑菌性能。
(2)细菌粘附形态及活/死荧光染色分析
采用SEM观察原始PS和改性PS表面分别培养细菌24h后的粘附形态和数量。如图22所示，牙龈卟啉单胞菌呈短杆状，变形链球菌呈短链状；在原始PS和pDA修饰的PS表面均发现了大量的细菌，相比之下，空白脂质体修饰的表面细菌减少，Dex/Mino脂质体修饰的表面几乎没有细菌粘附，这与WST-8定量测定结果一致。同样地，细菌培养24h后，我们进行了细菌活/死荧光染色实验，并使用CLSM来观察活菌和死菌。如图23所示，在原始基底和pDA修饰的表面，有大量的细菌(牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌)存活。然而，在空白脂质体修饰的表面，变形链球菌的活菌量减少，在Dex/Mino脂质体修饰的表面上只发现了很少量的变形链球菌；此外，在空白脂质体和Dex/Mino脂质体修饰的表面几乎没有观察到牙龈卟啉单胞菌的存在。以上研究表明，脂质体修饰和Mino释放有效抑制了细菌粘附和增殖。此外，值得注意的是，在细菌增殖过程中会发生自然凋亡，因此材料表面可能会发现死菌。如图23所示，我们在单通道(PI，543nm)中发现少量标记为红色的死菌；同时，我们在单通道(SYTO 9，488nm)中也发现了大量标记为绿色的活菌；然而，当我们将这两个通道组合在一起时，我们几乎没有观察到标记为红色的荧光信号，这可能是因为较强的绿色荧光信号掩盖了较弱的红色荧光信号。
Mino具有广谱抗菌作用，其抗菌机制是通过与特定的核糖体亚基结合，阻断氨酰基tRNA与细菌核糖体的结合；这种抑制阻碍了细菌肽和核糖体蛋白的合成，导致细菌死亡。在植入材料表面进行生物小分子共价修饰很有意义，因为共价固定不仅提高修饰表面的功能，而且能使生物分子附着牢固稳定。但是，通过化学共价偶联直接固定在植入物界面的抗菌剂不易释放，限制了一些进入细胞内发挥作用的抗菌剂(如Mino)的应用。然而，将脂质体递送系统共价结合到材料表面，然后通过脂质体运输和缓慢释放包载的药物，可以解决上述问题。此外，脂质体独特的双层结构可以与细菌的细胞膜融合，并将其内容物释放到细胞质中。因此，本研究构建的脂质体功能化表面修饰方法为材料基底提供有效的抗菌活性，这对于预防植入相关感染具有重要意义。
3.3体外抗炎检测
(1)溶液配制
LPS储液：1mg LPS粉末溶于1mL无内毒素水中，混匀；取其中100μL加入900μL去离子水中，配成储存液，-20℃保存；工作液浓度为1μg/mL，由储液加去离子水稀释100倍即可。
(2)hBMSCs接种及LPS诱导
将hBMSCs接种于脂质体表面修饰的6孔PS培养板，接种密度为7×104个/孔，每孔加入正常生长培养基(配制方法同效果试验例3中3.1)2mL，培养1-2天左右(根据镜下观察的细胞贴壁形态及细胞粘附量而定)；换用无血清正常培养基过夜(即血清饥饿处理)；吸弃培养基，加入新的无血清正常培养基，根据实验分组加入LPS刺激24h后，收集各组细胞和细胞上清液，分别进行实时聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附检测(ELISA)，评估hBMSCs的炎性反应。根据无血清培养基中是否含有LPS，以及空白脂质体(1.0mg/mL)、载药脂质体(1.0mg/mL)的不同修饰表面，将实验分为4组：PS-1.0blank lipo组、PS-1.0blank lipo+LPS组、PS-1.0Dex/Mino lipo组和PS-1.0Dex/Mino lipo+LPS组。
(3)RT-PCR
1)提取总RNA
吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL TRIzol，静置5min；反复吹打细胞团块，回收细胞悬液于1.5mL EP管中。每管加入150μL三氯甲烷，使用涡旋振荡器涡旋30s后静置2-3min，开始出现分层后离心(13000g，20min，4℃)。小心吸取上层清液300μL至新标记的EP管，加入等体积的异丙醇，上下翻转10下使其混匀，离心(12000g，10min，4℃)。倒去上清液，每管加入75％乙醇1mL，离心(7500g，5min，4℃)。小心倒尽上清液，使RNA沉淀干燥；每管加入DEPC水20μL溶解RNA沉淀，使用NanoDrop 2000仪器检测RNA浓度，样品存放于-80℃冰箱备用。
2)逆转录PCR合成cDNA
根据逆转录试剂盒配成20μL的反应体系，包括RNA、DEPC水、OligodT(1μL)和MIX液(8μL)。根据该反应体系需要RNA量(2μg)和检测的RNA浓度，计算所需的RNA和DEPC水的体积；按照计算结果将每份样品的RNA、DEPC水和1μL OligodT加至200μL EP管中。涡旋混匀后放入PCR仪中，设置程序为65℃，5min。根据样本量计算所需MIX总量，每个样本需要8μL MIX液，包括逆转录酶(1μL)、dNTP(2μL)、5×buffer(4μL)和Inhibitor(1μL)。继续向每个样本中加入8μL MIX液，涡旋混匀，放入PCR仪中，设置程序为42℃，1h和70℃，5min。反应结束后，将cDNA置于-20℃冰箱保存。
3)RT-PCR
配制每个样本的反应体系(20μL)为：DEPC水(8.5μL)、SYBRGreen(10μL)、cDNA(0.5μL)和上下游引物混合液(1μL)。使用β-actin作为内参，检测炎性基因白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。各种引物序列见表4。将样本放入RT-PCR仪中，设置程序为：95℃，10min，1个循环；95℃，5s和60℃，30s，40个循环。反应结束后，采用2-ΔΔCt法计算各个基因的Ct值。
表4 RT-PCR检测所需引物的序列
基因 上游序列(5′-3′) 下游序列(5′-3′)
IL-6 GTGAGGAACAAGCCAGAGC TACATTTGCCGAAGAGCC
TNF-α CGAGTGACAAGCCTGTAGCC TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT
β-actin CCCAGAGCAAGAGAGG GTCCAGACGCAGGATG
(4)ELISA试剂盒检测
细胞上清液离心(3000rpm)10min后回收，使用ELISA试剂盒检测上清液中炎性因子(TNF-α和IL-6)的表达量。ELISA试剂盒使用步骤如下：
1)微孔酶标板在室温平衡20min后使用；
2)分别设置标准品孔和样品孔；标准品孔中各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
3)每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，使用封板膜覆盖反应孔，37℃恒温箱温育60min；
4)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，弃去液体，吸水纸上拍干，重复洗板5次；
5)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光温育15min；
6)每孔加入终止液50μL，于450nm波长处使用酶标仪检测OD值。由标准品做出标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样品浓度。
实验结果：
据文献报道，炎症反应期间分泌的破坏性炎症介质会抑制成骨细胞功能，促进破骨活性，并使炎症持续。TNF-α是一种常见的促炎性细胞因子，可激活并诱导其他炎症介质的释放。IL-6是一种多功能细胞因子，具有活化破骨细胞和诱导骨吸收及组织破坏的潜能。这些促炎性细胞因子的释放量增加可能导致组织损伤，进而加速植入物的植入失败。Dex是一种有效缓解炎症的糖皮质激素，主要通过调节炎症介质的合成和释放来发挥其抗炎作用。Dex虽然广泛应用于各种生物材料的修饰中以减轻炎性反应，但其副作用较严重。既往文献报道，脂质体局部递送糖皮质激素有助于减少全身副作用。在本研究中，我们将Dex通过脂质体包载，借助pDA修饰在PS表面，通过RT-PCR分析和ELISA试剂盒检测，研究Dex/Mino脂质体功能化表面释放的Dex是否具有活性，以及其释放量是否足以减轻LPS引起的细胞炎性反应。
hBMSCs在不同修饰的PS表面培养且经LPS刺激24h后，RT-PCR分析表明，Dex/Mino脂质体修饰的表面有效地抑制了促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达。如图24a所示，与PS-1.0blank lipo组相比，PS-1.0blank lipo+LPS组的TNF-α和IL-6的表达略有增加，提示LPS刺激hBMSCs产生轻微的炎性反应；与PS-1.0blank lipo+LPS组相比，PS-1.0Dex/Minolipo+LPS组的TNF-α和IL-6的表达下调，这是由于PS表面修饰的脂质体缓慢释放Dex的缘故。为了进一步证实Dex的抗炎活性，我们使用ELISA试剂盒检测不同修饰表面培养的hBMSCs经LPS诱导24h后TNF-α和IL-6的表达。如图24b所示，与PS-1.0blank lipo组相比，PS-1.0blank lipo+LPS组的IL-6和TNF-α蛋白表达增加；与PS-1.0blank lipo+LPS组相比，PS-1.0Dex/Mino lipo+LPS组的TNF-α和IL-6的蛋白表达下调，与RT-PCR结果一致。此外，与对照组(PS-1.0blank lipo组)相比，单独使用Dex治疗(PS-1.0Dex/Mino lipo组)几乎没有影响IL-6和TNF-α的基因和蛋白表达。以上结果表明，LPS刺激hBMSCs后，可上调IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平；然而，Dex/Mino脂质体修饰表面释放的Dex在mRNA和蛋白水平上均能有效抑制LPS诱导的促炎介质表达。
既往文献报道，Dex发挥抗炎作用的有效浓度在100～10 000nM范围内。上述研究表明，虽然Dex在脂质体中的包封率仅11％，但其具有足够的抗炎活性；此外，脂质体包载、运输和释放过程并没有改变Dex的结构和功能。总之，PS表面局部释放Dex的抗炎效果表明，Dex/Mino脂质体修饰方法在植入物表面改性方面具有潜在的临床应用价值。
3.4体外成骨分化能力检测
(1)溶液配制
1)成骨分化培养基(+)
含有90％DMEM低糖培养基、10％胎牛血清、1％双抗(青霉素/链霉素)、50μg/mL维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠和100nM Dex。
2)成骨分化培养基(–)
含有90％DMEM低糖培养基、10％胎牛血清、1％双抗(青霉素/链霉素)、50μg/mL维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠。
3)Dex储存液(500×)
称取5mg Dex粉末，溶解于5mL无水乙醇中，吹打混匀；然后吸取1mL加入到49mLDMEM低糖培养基中，得到5×10-5M的储存液，使用0.22μm的针头式滤器过滤，避光、分装保存于-20℃冰箱。
4)维生素C储存液(100×)
称取50mg维生素C粉末，溶解于10mL PBS中，使用0.22μm的针头式滤器过滤，避光、分装保存于-20℃冰箱。
5)β-甘油磷酸钠储存液(100×)
称取2.16gβ-甘油磷酸钠粉末，溶解于10mL PBS中，使用0.22μm的针头式滤器过滤，分装保存于-20℃冰箱。
6)茜素红溶液(w/v，2％)
称取1g茜素红粉末，溶解于50mL去离子水中，搅拌混匀并调节pH至4.2。使用滤纸过滤去除未溶解的颗粒，4℃保存。
7)十六烷基吡啶溶液(w/v，1％)
称取0.5g十六烷基吡啶粉末，溶解于50mL去离子水中，振荡混匀，4℃保存，使用前需要先恢复至室温。
8)BSA溶液(w/v，3％)
称取1.5g BSA粉末，溶解于50mL PBS中，4℃保存，现用现配。
9)一抗稀释液
使用3％BSA和0.2％Triton X-100的混合液(混合比例为1∶1)作为稀释液，稀释比例为1∶200。
10)二抗稀释液
使用PBS作为稀释液，稀释比例为1∶200。
(2)hBMSCs接种及成骨诱导
将hBMSCs接种于脂质体表面修饰的6孔PS培养板，接种密度为1.0×105个/孔，每孔加入正常生长培养基(配制方法同效果试验例3中3.1)2mL，培养1-2天左右(根据镜下观察的细胞贴壁形态和细胞粘附量而定)；换用成骨分化培养基(此时记为诱导第1天)，隔天换液，持续诱导至21天。根据成骨分化培养基中是否含有100nM Dex(–/+)，以及空白脂质体(1.0mg/mL)、载药脂质体(1.0mg/mL)的不同修饰表面，将实验分为4组：blank lipo(–)组、blank lipo(+)组、Dex/Mino lipo(–)组和Dex/Mino lipo(+)组。
(3)ALP活性定量检测及ALP染色
1)在成骨诱导第3和7天分别进行ALP活性定量检测
吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL Triton X-100(1％，v/v)反应20min，使用1mL移液枪反复吹打细胞并将悬液收集于1.5mL EP管，使用涡旋振荡器振荡后离心(12000rpm，30min，4℃)；小心转移上清液至新标记的EP管，保存于-80℃冰箱备用。
BCA法测蛋白质的浓度：使用去离子水将标准品稀释成一系列梯度标准液(25、125、250、500、750、1000、1500和2000μg/mL)；于96孔板中分别加入20μL梯度标准液、20μL待测蛋白样品和20μL去离子水(作为空白对照)；每孔加入200μL工作液(由BCA试剂盒中的A液和B液以50∶1的比例混合而成)，摇匀30s后置于37℃恒温箱中30min；避光条件下，在562nm波长处使用酶标仪检测；由标准品做出标准曲线，然后根据标准曲线计算待测蛋白样品浓度。
ALP定量试剂盒检测：取10μL酚标准品加到500μL去离子水中，获得酚标准品稀释液；于96孔板中分别加入30μL酚标准品稀释液、30μL待测样品和30μL去离子水(作为空白对照)；每孔分别加入50μL一号基质液和50μL二号缓冲液，摇匀后置于37℃恒温箱中15min；每孔加入150μL三号显色液，15min内避光条件下，于520nm波长处使用酶标仪检测OD值。ALP活性的计算公式为：ALP活性＝(待测样品OD值-空白OD值)/(标准品OD值-空白OD值)×酚标准品浓度/待测样品的总蛋白浓度。
2)在成骨诱导第7天进行ALP染色
吸弃培养基，PBS清洗3次；使用无水乙醇固定细胞30min后PBS清洗三次，每孔加入1mL工作液(显色试剂盒中的BCIP∶NBT∶buffer＝1∶1∶38，v/v/v)，避光反应30min；吸去工作液，PBS清洗后5倍显微镜下观察并拍照。
(4)茜素红染色和定量检测
在成骨诱导第21天进行茜素红染色。吸弃培养基，PBS清洗3次；使用4％多聚甲醛固定细胞30min后，去离子水清洗3次，每孔加入1mL茜素红溶液(2％，pH＝4.2)，室温反应20min；用去离子水轻轻冲洗，除去未反应的茜素红溶液和非反应性着色；5倍显微镜下观察并拍照。拍照完成后，每孔加入1mL十六烷基吡啶溶液(1％，w/v)，放入摇床(30rpm，37℃)2h以便溶解着色的钙结节；待反应完全后，将溶解液吹打混匀，取100μL/孔转移到96孔板中，于550nm波长处使用酶标仪检测OD值。
(5)RT-PCR
在成骨诱导第14天进行RT-PCR检测。实验步骤同效果试验例3中3.3，包括1)提取总RNA；2)逆转录PCR合成cDNA；3)RT-PCR。使用β-acti为内参，检测成骨相关的基因包括：ALP、OCN、Runx2和Col1α1。各种引物序列见附表5。
表5 RT-PCR检测所需引物的序列
基因 上游序列(5′-3′) 下游序列(5′-3′)
ALP CAACCCTGGGGAGGAGAC GCATTGGTGTTGTACGTCTTG
OCN TGAGAGCCCTCACACTCCTC ACCTTTGCTGGACTCTGCAC
Runx2 GTGCCTAGGCGCATTTCA GCTCTTCTTACTGAGAGTGGAAGG
Col1α1 GGGATTCCCTGGACCTAAAG GGAACACCTCGCTCTCCA
β-actin CCCAGAGCAAGAGAGG GTCCAGACGCAGGATG
(6)免疫荧光染色
在成骨诱导第21天进行免疫荧光染色。吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL4％多聚甲醛，室温固定30min后PBS清洗3次；每孔加入1mL Triton X-100(0.2％，v/v)，室温通透30min后PBS清洗3次；每孔加入1mL 3％BSA，室温封闭2h，吸弃液体；每孔加入500μL一抗稀释液(鼠抗人Runx2单克隆抗体、兔抗人OPN单克隆抗体、鼠抗人OCN单克隆抗体和兔抗人Col1α1多克隆抗体)，将6孔板放置于湿盒内，4℃过夜(约14h)；吸弃一抗，PBS清洗3次，每孔加入500μL二抗稀释液(FITC标记山羊抗小鼠IgG和罗丹明标记山羊抗兔IgG)，避光静置1h；吸弃二抗，PBS清洗三次，每孔加入1mL DAPI(1μg/mL)，避光静置5min；吸弃液体，PBS清洗3次，加入少量新的PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
实验结果：
理想的植入物界面不仅具有良好的细胞相容性，而且具有高效的促成骨活性以便促进植入物-骨界面骨整合。本部分，我们评价了从Dex/Mino脂质体修饰的PS表面释放的Dex是否有效促进hBMSCs的成骨分化。在预定时间点，我们通过检测ALP活性、钙沉积量、成骨相关基因和蛋白的表达，来评价hBMSCs在Dex/Mino脂质体修饰的PS表面的成骨分化能力；其中，–表示成骨培养基中不含有Dex(100nM)，+表示成骨培养基中含有Dex(100nM)。
(1)ALP活性评价
ALP是成骨分化的关键指标之一，而且ALP活性的增加是成骨早期发生的重要事件。图25a为hBMSCs在不同脂质体修饰的PS表面按预定时间培养后ALP的表达水平。hBMSCs分别诱导培养3和7天后，Dex/Mino lipo(–)组的ALP表达值均高于blank lipo(–)组，这是由于Dex/Mino脂质体修饰的PS表面释放了Dex；同样地，Dex/Mino lipo(+)组的ALP表达值高于blank lipo(+)组，说明Dex/Mino脂质体成功修饰在PS表面，而且该表面释放的Dex仍具有促成骨活性。在hBMSCs诱导培养的第3天，我们发现Dex/Mino lipo(–)组与blank lipo(+)组在ALP活性表达值上无统计学差异，提示PS表面固定的脂质体释放的Dex至少与标准成骨培养基中的Dex发挥同等作用；但是在hBMSCs诱导培养的第7天，与blank lipo(+)组相比，Dex/Mino lipo(–)组的ALP表达值较低，这可能是因为PS表面修饰的Dex的释放量不足以驱动该时间点下的成骨分化；尽管如此，Dex/Mino lipo(+)组在该时间点对hBMSCs的ALP活性上调最高，这是由于表面释放的Dex和培养基中添加的Dex的累积作用。hBMSCs诱导培养7天时的ALP染色(图25b)也证实了上述结果，说明Dex/Mino脂质体表面修饰可有效促进hBMSCs成骨分化。
(2)钙结节形成能力评价
钙沉积是成骨分化的另一重要标志，其表达上调是成骨后期发生的重要事件；因此，钙结节形成情况的检测常常作为评价材料的成骨活性的“金标准”。材料表面的钙化结节可以通过茜素红染色形成特异性的红色，因此，hBMSCs诱导培养21天后，我们采用茜素红染色方法测定载药脂质体修饰表面的钙沉积。如图26a和b所示，Dex/Mino lipo(–)组和Dex/Mino lipo(+)组的OD值均高于blank lipo(–)组和blank lipo(+)组，这意味着与空白脂质体修饰的PS表面相比，Dex/Mino脂质体修饰的PS表面具有促成骨优势。此外，通过Dex/Mino lipo(–)组与blank lipo(+)组的比较，可以清楚地发现，虽然培养基中未引入Dex，但是由于Dex/Mino脂质体可以释放Dex，所以功能化表面对提高钙沉积的影响仍然显著。值得注意的是，Dex/Mino lipo(+)组中钙沉积量最大，提示Dex/Mino脂质体修饰的PS表面可以通过提高矿化作用以便促进成骨。总之，ALP活性检测和钙结节形成评价表明，Dex/Mino脂质体修饰的表面具有良好的促成骨分化能力。
(3)成骨相关基因和蛋白表达评价
本部分，我们通过成骨相关基因检测和免疫荧光染色进一步研究功能化修饰PS表面的促成骨分化能力；成骨分化相关的标志物包括ALP(成骨分化早期标志物)、OPN(成骨分化中期标志物)、OCN(成骨分化晚期标志物)、Runx2(成骨细胞特异性转录因子)和Col1α1(细胞外骨基质产生相关标志物)。如图27a所示，hBMSCs诱导培养14天后，Dex/Mino lipo(–)组与blank lipo(–)组相比，所有成骨相关基因表达均上调；与blank lipo(+)组相比，Dex/Mino lipo(–)组中OCN和Col1α1的表达略有增强，ALP和Runx2的表达没有统计学差异；以上结果说明功能化修饰的PS表面在该时间点释放的Dex促进了成骨相关基因表达。值得注意的是，Dex/Mino lipo(+)组的四种基因表达均低于其他组(P<0.05)；考虑到Dex在促进成骨分化过程中的最高有效浓度为100nM，高浓度Dex可能通过下调基因表达受体发挥抑制作用，因而进一步减弱Dex的促成骨效果；因此，在这个时间点(14天)，Dex/Mino lipo(+)组基因表达量的降低可能与Dex(功能化表面释放的Dex以及培养基中添加的Dex)的累积浓度过高有关。为了进一步分析hBMSCs诱导培养21天后，成骨相关蛋白表达情况，我们选择对OPN、OCN、Runx2和Col1α1四种蛋白进行免疫荧光染色分析。如图27b所示，与RT-PCR分析结果一致，在Dex/Mino脂质体修饰的表面诱导培养的hBMSCs具有提高成骨相关蛋白表达的特点。
Dex是成骨诱导培养基中最常见的添加因子，也是促进hBMSCs体外成骨分化的有效促进剂。将Dex装载入脂质体中，可使其实现持续递送，延长其稳定性和生物活性，最终增强其促成骨作用。在PS表面共价修饰Dex/Mino脂质体可实现在细胞周围局部释放Dex，提高Dex的生物利用度，无需在培养基中进一步添加Dex，避免不必要的药物浪费。以上成骨相关实验证实，将Dex/Mino脂质体共价修饰在PS表面，可有效促进hBMSCs的成骨分化。这种效应可能归因于Dex/Mino脂质体与细胞的直接相互作用，或者可能是由于细胞直接将Dex/Mino脂质体摄取到细胞质内。
效果试验例3结果：
1)采用薄膜分散法制备Dex/Mino脂质体，并对其进行基本表征；然后利用pDA涂层作中间介质，将Dex/Mino脂质体共价接枝到PS表面，构建出一种简单通用的功能化表面修饰方法。材料表征结果显示，Dex/Mino脂质体成功共价接枝在PS表面，而且Dex和Mino通过脂质体在PS表面实现缓慢释放。
2)细胞粘附和增殖检测结果显示，1.0mg/mL为脂质体的最佳接枝浓度，该浓度下Dex/Mino脂质体修饰的PS表面具有良好的细胞相容性。
3)微生物活力定量检测和细菌活/死荧光染色结果显示，功能化PS表面释放的Mino可有效抑制细菌粘附和增殖。
4)LPS刺激hBMSCs后，炎性相关基因和蛋白表达检测结果显示，功能化PS表面释放的Dex可有效减轻细胞炎性反应。
5)ALP定量定性检测、茜素红染色及定量分析、成骨相关基因和蛋白表达检测结果显示，功能化PS表面释放的Dex可有效促进hBMSCs成骨分化。
综上所述，我们利用pDA涂层作中间介质，成功构建了Dex/Mino脂质体修饰方法；该方法使用的原料简单易得、操作步骤简单、反应条件温和而且适用性广；使用该两步法进行表面修饰，可有效提高基底的抑菌、抗炎和促成骨活性。
因此，这一表面改性方法可能为开发多功能植入物应用于临床开辟一条新的道路。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (10)

1.一种基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于，采用薄膜分散法制备包载活性小分子的脂质体，包括以下步骤：
(1)将活性小分子和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载活性小分子的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；
(3)将多巴胺溶液加入到生物材料中，轻轻摇匀过夜；在无菌蒸馏水中进行超声清洗；
(4)加入载有活性小分子的脂质体静置反应；再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可获得活性小分子的脂质体修饰的生物材料。
2.根据权利要求1所述的一种基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；
步骤(2)中，所述水化液为磷酸盐缓冲液或无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为47℃，时间为5min；所述多孔聚碳酸酯膜的孔径为依次为450nm、220nm和100nm，或220nm和100nm；透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于，
所述活性小分子为两种时，步骤(2)中透析具体如下：使用透析液4℃过夜透析第一种活性小分子脂质体，后与适量第二种活性小分子储液混合，50℃条件下振摇30min，即得到载有两种活性小分子的脂质体，使用透析液过夜透析后，4℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于：步骤(3)中，所述生物材料为植入物、支架、培养板；将多巴胺溶液加入到生物材料是在pH＝8.5的弱碱性条件下，多巴胺溶液的终浓度为2mg/mL，在37℃下轻轻摇匀过夜；所述培养板为聚苯乙烯为基底的细胞培养板。
5.根据权利要求1所述的基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于：步骤(4)中，静置反应在37℃条件下进行过夜；无菌磷酸盐缓冲液清洗三次；还包括直接加入活性小分子接枝到生物材料的步骤。
6.根据权利要求1所述的基于脂质体的活性小分子控释方法，其特征在于：所述活性小分子可以为具有生物活性的脂溶性和/或水溶性小分子中的一种或多种；所述活性小分子可以为硫酸庆大霉素、表阿霉素、布洛芬、米诺环素、地塞米松、阿司匹林和BFP-1多肽中的一种或两种。
7.一种阿司匹林脂质体缓释体系，其特征在于，通过以下步骤制备：采用薄膜分散法制备脂质体包载阿司匹林，透析过夜后，加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，37℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
8.一种阿司匹林脂质体/BFP-1缓释体系，其特征在于，通过以下步骤制备：
采用薄膜分散法制备脂质体包载阿司匹林，透析过夜后，加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，并接枝BFP-1多肽，4℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
9.一种地塞米松/米诺环素脂质体缓释体系，其特征在于，通过以下步骤制备：采用薄膜分散法制备脂质体包载地塞米松，透析过夜后，与米诺环素储液混合，透析过夜加入到PDA修饰的PS细胞培养基中，37℃条件下静置反应过夜，再用无菌磷酸盐缓冲液清洗后即可。
10.权利要求1-6任一项所述基于脂质体的活性小分子控释方法在制备治疗组织缺损的生物材料的应用，其特征在于：所述生物材料靶向作用于组织的再生与修复，缓释活性小分子物质；所述组织为骨组织或肿瘤组织。
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