CN110279890A - 基于脂质体的地塞米松/米诺环素在peek表面的修饰方法及应用 - Google Patents

基于脂质体的地塞米松/米诺环素在peek表面的修饰方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法及其应用，采用薄膜分散法制备包载地塞米松和米诺环素的脂质体后修饰于PEEK表面，包括以下步骤：(1)将地塞米松和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载地塞米松的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；(3)与米诺环素储液混合，振摇，即得到载有地塞米松/米诺环素的脂质体，使用透析液过夜透析后，4℃保存备用；(4)将PEEK植入物放入多巴胺溶液中反应，超声清洗；(5)加入地塞米松/米诺环素脂质体溶液中浸泡，轻轻清洗即得产物。所得产物能够促进骨修复、再生及整合。

Description

基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种基于脂质体的活性小分子表面修饰方法及其应用，属于药物控制释放和生物材料技术领域，特别涉及基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法及应用。
背景技术
目前，由创伤、骨肿瘤、感染、炎症等原因导致的骨缺损仍然是世界范围内医学领域一个快速增长的严重挑战；临床上，骨科/牙科植入物是骨缺损修复常用的硬组织替代物。
PEEK是替代钛及其合金制成的传统金属植入物的首选材料，是一种半结晶热塑性高分子材料，具有良好的机械性能、化学稳定性和热稳定性。自上世纪90年代末获得美国食品药品管理局批准以来，PEEK已被广泛用作脊柱、创伤和骨科的植入材料。此外，PEEK已被证实具有与天然人体骨骼相似的生物力学性能(如弹性模量)，可以有效降低传统金属植入物应用中经常观察到的应力屏蔽效应，避免可能的骨损伤。然而，尽管PEEK具有上述吸引人的特性，但是其自身的生物惰性导致其生物活性较差，并阻碍了其植入体内后的骨整合。生物惰性材料植入活体后，形成纤维组织的包覆层，将植入物与周围骨组织隔离。长期临床观察表明，生物惰性材料植入失败的主要原因是植入物与骨组织之间的固定不牢靠。
骨整合是指新生骨与植入物直接接触的过程，中间没有纤维结缔组织干预；该过程为植入物提供有序和持久的功能连接。骨整合作为成功骨再生的决定因素，对于植入物最初稳固的锚定和长期的功能化至关重要。然而，不成功的骨整合可能会增加植入物松动或最终完全失败的风险。影响植入物-骨界面骨整合的因素很多，目前研究认为最重要的主要包括植入物表面的促成骨活性、感染、非细菌性炎症及异物反应等。因此，为了拓宽PEEK在骨科或口腔科等领域的临床应用前景，必须提高惰性PEEK的成骨和抗炎活性，同时使其能预防细菌污染。
表面性能决定了植入物与体内周围组织整合的最终能力。表面改性是在不牺牲材料自身优良性能的前提下，提高材料生物性能的一种有吸引力的方法。在众多表面修饰方法中引起特别重视的是，将生物活性小分子通过共价结合方式在材料表面形成生物化学固定。植入物表面的不可逆修饰为生物活性小分子的有效固定和定向提供了机会，并使其在较长时间内持续调节细胞行为。因此，植入物表面改性的关键在于是否能够携带和传递生物活性小分子以增强材料表面的生物功能(如预防植入相关的炎症和感染，提高促成骨活性)。但是，以可控的方式将生物活性小分子从固体基底表面释放出来，进入细胞内发挥作用，以降低植入物松动和失败的风险是非常困难的。
为了实现植入后的最佳骨整合，在不破坏PEEK众多优点的前提下，采用表面改性方法增强PEEK表面的生物活性是首选途径。最常用的方法是通过物理或化学方法制备生物活性涂层使PEEK功能化。既往文献报道，许多涂层(包括磷酸钙、生物活性小分子、羟基磷灰石、钛等)在增强PEEK植入物的骨整合方面具有实用价值。然而，这些方法仍然存在许多亟待解决的问题，包括涂层易降解、化学步骤复杂耗时、涂层与基底粘结不良等。此外，PEEK植入物的表面修饰目前主要侧重于提高生物活性、调节炎症以及避免感染等多功能特性，这些也是促进PEEK植入物生理骨整合所必须的重要功能。目前，虽然有学者针对提高PEEK的抑菌与促成骨活性进行了研究，但是在评价骨替代修复材料的骨整合能力时，免疫反应往往是一个被忽略的关键因素。目前，针对PEEK表面功能化以便同时获得抑菌、抗炎和促进成骨三大关键功能的研究报道较少。
pDA涂层作为一种易于操作的表面改性方法，近年来引起了广泛的关注。通过在弱碱性水环境中简单浸泡方式，多巴胺几乎可以在所有材料表面(无需预处理)形成结构稳定的pDA薄膜；而且，pDA的邻苯二酚结构可以进一步连接含氨基或巯基的生物活性分子，进而实现材料表面的二次修饰；该方法已被广泛用于各种生物材料的功能化。但是，pDA不适合直接固定进入细胞内发挥作用的生物活性小分子，如Mino(一种广谱四环素类抗生素)和Dex(一种具有抗炎和促成骨作用的糖皮质激素)。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法及其应用，使用脂质体作为药物运输载体同时包载Dex和Mino，然后进一步利用多巴胺的自聚合及迈克尔加成反应，将Dex/Mino脂质体共价接枝在PEEK植入物表面，实现植入物表面功能化改性。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，采用薄膜分散法制备包载地塞米松和米诺环素的脂质体后修饰于PEEK表面，包括以下步骤：
(1)将地塞米松和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载地塞米松的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；
(3)与米诺环素储液混合，振摇，即得到载有地塞米松/米诺环素的脂质体，使用透析液过夜透析后，4℃保存备用；
(4)将PEEK植入物放入多巴胺溶液中反应，超声清洗；
(5)加入地塞米松/米诺环素脂质体溶液中浸泡，轻轻清洗即得产物。
进一步地，步骤(1)中，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；
进一步地，步骤(2)中，所述水化液为无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为45-50℃，时间为5min；所述多孔聚碳酸酯膜的孔径为依次为450nm、220nm和100nm，或220nm和100nm；透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液，温度为4℃；
进一步地，步骤(3)中，与米诺环素储液混合振摇是在50℃条件下，振摇30min，使其载入脂质体水相中；
进一步地，步骤(4)中，将PEEK植入物放入多巴胺溶液中反应18h，条件为37℃，70rpm，超声清洗3次；
进一步地，步骤(5)中，浸泡为37℃浸泡24h。
优选地，步骤(1)中，脂类与地塞米松的比例为二棕榈酰磷脂酰胆碱：胆固醇：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基：地塞米松＝1.85∶1∶0.15∶0.25。
优选地，步骤(2)中，所述无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液的pH为7.9。
更优选地，步骤(2)中，所述无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液的终浓度为120mM。
优选地，步骤(4)中，所述PEEK植入物还经过以下处理：使用不同型号的碳化硅砂纸打磨，放置于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗各1h，50℃干燥。
优选地，步骤(5)中，加入地塞米松/米诺环素脂质体溶液浓度为1mg/mL。
所述地塞米松和米诺环素加入顺序不可更改，地塞米松是脂溶性药物，与脂类一起加入，盐酸米诺环素为水溶性药物，需要在后面通过pH梯度载入。
本发明提供一种包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物，采用薄膜分散法制备包载地塞米松和米诺环素的脂质体后修饰于PEEK表面。
进一步地，包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物的表面的水接触角为59.80±3.8°；地塞米松/米诺环素脂质体的粒径约为164.56±3.04nm，PDI约为0.2，呈近中性zeta电位；地塞米松和米诺环素的包封效率分别约为11％和69％。
本发明提供如上所述包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物在制备促进骨修复、再生及整合的药物中的应用。
进一步地，所述包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物通过以下任一种或多种方法实现促进骨修复、再生及整合：
A)提高植入物亲水性，从而提高细胞相容性；
B)提高抗感染活性，抑制细菌粘附和增殖；
C)促进hBMSCs成骨分化；
D)提高抗炎活性，缓解植入物引起的异物反应；
E)功能化PEEK植入物与新生骨牢固结合，提高骨整合能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)利用pDA涂层作中间介质实现共价接枝，将Dex/Mino脂质体共价接枝在PS表面，利用脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放，并将该功能化表面修饰方法应用于生物惰性PEEK表面，制备Dex/Mino脂质体修饰的PEEK材料；
(2)Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面具有良好的细胞相容性，可以有效抑制细菌粘附和增殖，有效促进hBMSCs成骨分化，在骨诱导和骨传导条件下均具有较强的促成骨活性；
(3)Dex/Mino脂质体修饰提高了惰性PEEK的抗感染活性、抗炎活性，有效地缓解了植入物引起的异物反应；
(4)促进更多新骨生成，而且功能化PEEK植入物与新生骨牢固结合，说明Dex/Mino脂质体修饰提高了惰性PEEK的骨整合能力。
功能化PEEK表现出良好的细胞相容性，有效的抑菌、抗炎和促成骨活性，提示该材料具有提高植入物-骨界面骨整合的潜力，在临床具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1.1中Dex/Mino脂质体示意图；
图2为实施例2.3中不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)的表面静态接触角检测；*，#：分别表示与纯PEEK组和PEEK-pDA组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝6)；
图3为实施例2.3中不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)的表面化学元素检测；
图4为实施例2.3中不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组和PEEK-Dex/Minolipo组)的表面形貌观察；
图5为实施例2.3中不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组和PEEK-pDA-lipo组)表面的荧光定性及定量检测；*代表PEEK-pDA-lipo组与PEEK组或PEEK-pDA组之间的统计学差异(p<0.05，n＝6)；
图6为实施例3.1中hBMSCs在不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面培养1和3天后，使用SEM观察细胞粘附情况；
图7为实施例3.1中hBMSCs在不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面培养1和3天后，使用CLSM观察细胞骨架荧光染色分析；
图8为实施例3.1中hBMSCs在不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面培养1、3、5和7天后，细胞增殖检测；*代表PEEK-Dex/Mino lipo组与PEEK-blank lipo组相比，差异有统计学意义(P<0.05，n＝6)；
图9为实施例3.1中hBMSCs在不同修饰的PEEK样品(PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面培养4天后的活/死荧光染色分析；
图10为实施例3.2中纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)对分别培养4h和24h的革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌(a)和革兰氏阳性变形链球菌(b)的体外抑菌活性定量分析；*表示与PEEK组相比，p<0.05；n＝6；
图11为实施例3.2中纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)对分别培养24h的革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌和革兰氏阳性变形链球菌的体外抑菌活性分析(活/死荧光染色)；
图12为实施例3.3中骨诱导条件下，纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)表面的ALP活性检测；(a)染色分析hBMSCs在第7天的ALP活性；(b)定量检测hBMSCs在第3和7天的ALP活性；*表示与PEEK(+)组相比，p<0.05；n＝6；+表示成骨分化培养基中含有Dex(即骨诱导培养基)；
图13为实施例3.3中骨诱导条件下，纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)表面的钙结节检测；(a)茜素红染色分析hBMSCs在第21天的钙结节表达；(b)茜素红定量检测hBMSCs在第21天的钙沉积量；*表示与PEEK(+)组相比，p<0.05；n＝6；+表示成骨分化培养基中含有Dex(即骨诱导培养基)；
图14为实施例3.3中骨传导条件下，纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)表面的ALP活性及钙结节检测；(a)染色分析hBMSCs在第7天的ALP活性；(b)定量检测hBMSCs在第3和7天的ALP活性；(c)茜素红染色分析hBMSCs在第21天的钙结节表达；(d)茜素红定量检测hBMSCs在第21天的钙沉积量；*表示与PEEK(–)组相比，p<0.05；n＝6；–表示成骨分化培养基中不含有Dex(即骨传导培养基)；
图15为实施例4.1中C57BL/6小鼠皮下植入感染模型；(a)备皮；(b)接种菌液的PEEK皮下植入；(c)皮肤缝合；(d)术后24h；
图16为实施例4.1中纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)表面接种变形链球菌后植入小鼠皮下进行抑菌作用评估；(a)术后24h，小鼠皮下组织液涂板获得的活菌落的代表性图像；(b)相对应的琼脂板中活菌落计数；*表示与纯PEEK组相比，p<0.05；n＝6；
图17为实施例4.1中纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)表面接种变形链球菌后植入小鼠皮下进行抑菌作用评估；术后24h，代表性的皮下组织HE染色图像；
图18为实施例4.2中C57BL/6小鼠皮下植入异物反应模型；(a)备皮；(b)皮下PEEK植入；(c)皮肤缝合；(d)术后1天；
图19为实施例4.2中小鼠皮下植入相关异物反应的组织学评价；(a)纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)植入1、3和7天后，代表性的皮下组织HE染色图像；(b)纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)植入1天后，使用ELISA试剂盒检测皮下组织中炎性因子(TNF-α和IL-6)的表达；*和#：分别表示与NT组(NT：正常组织)和纯PEEK组相比，p<0.05；n＝6；
图20为实施例4.3中比格犬股骨植入模型；(a)和(b)备洞；(c)PEEK植入；(d)皮肤缝合；
图21为实施例4.3中Dex/Mino脂质体功能化修饰的PEEK在比格犬体内新骨形成评估；(a)Dex/Mino脂质体修饰的PEEK植入比格犬股骨的大体图像；(b)比格犬股骨植入8周后，比格犬股骨纵切面的示意图及Micro-CT二维图像，蓝色矩形显示为示意图区域的局部放大；
图22为实施例4.3中比格犬股骨植入8周后，Micro-CT评价新骨形成情况；(a)Micro-CT三维重建图像；(b)新生骨评价参数：骨体积比值、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间距；*表示与纯PEEK组相比，p<0.05；n＝5；
图23为实施例4.3中Dex/Mino脂质体功能化修饰的PEEK在比格犬体内骨整合的组织学分析；(a)横向示意图及相应的HE染色(左)和甲苯胺蓝染色(右)图像，蓝色矩形显示为示意图区域的局部放大；(b)骨-植入物接触比率；*表示与纯PEEK组相比，p<0.05；n＝3。
具体实施方式
本发明构建地塞米松/米诺环素(Dex/Mino)脂质体表面修饰方法，并将其应用于PEEK表面改性，旨在提高惰性PEEK的骨整合能力(包括抑菌、抗炎和促成骨作用)。使用脂质体作为药物运输载体同时包载Dex和Mino，然后进一步利用多巴胺的自聚合及迈克尔加成反应，将Dex/Mino脂质体共价接枝在植入物表面，实现植入物表面功能化改性。
本发明中，我们首先构建了基于脂质体控释小分子的功能化表面修饰方法制备Dex/Mino脂质体，利用脂质体作为药物递送载体实现药物的可控释放；释放的Mino在体外可有效预防细菌粘附，Dex可有效减轻细胞炎性反应且发挥促成骨活性；然后，我们将该功能化表面修饰方法应用于生物惰性PEEK表面，利用pDA涂层作中间介质实现共价接枝，制备Dex/Mino脂质体修饰的PEEK材料，分别从体外和体内验证该修饰方法是否有效地提高了PEEK表面的多种生物活性(包括抑菌、抗炎和促成骨活性)。
本发明中地塞米松和米诺环素加入顺序不可更改，地塞米松是脂溶性药物，与脂类一起加入，盐酸米诺环素为水溶性药物，需要在后面通过pH梯度载入。
发明主要包括以下几个部分：
1)Dex/Mino脂质体修饰方法的构建及其体外评价：采用薄膜分散法制备Dex/Mino脂质体，使用光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径、多分散度(PDI)和zeta电位；测定Dex和Mino的包封率。
2)Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的制备及体外验证，验证脂质体表面修饰是否能有效提高PEEK材料的抑菌和促成骨活性：利用pDA涂层作中间介质，将基于脂质体控释小分子的功能化表面修饰方法应用到生物惰性PEEK的改性中，制备了Dex/Mino脂质体修饰的PEEK材料，并对该功能化修饰表面的理化性能进行表征，使用静态接触角检测、X射线光电子能谱(XPS)、SEM和荧光脂质体接枝定性定量检测等方法，表征功能化PEEK表面亲水性、化学元素、表面形貌和荧光分布的变化；通过细胞粘附和增殖检测，评价功能化PEEK表面的细胞相容性，使用SEM和细胞骨架荧光染色，评价细胞在该材料表面的粘附能力，同时使用CCK-8试剂盒和细胞活/死荧光染色，评价细胞在该材料表面的增殖能力；通过微生物活力定量检测和细菌活/死荧光染色，验证Dex/Mino脂质体修饰对PEEK材料抑菌性的影响，即功能化PEEK表面的抑菌效果；通过ALP活性检测及染色分析、茜素红染色及定量分析，分别在骨诱导和骨传导条件下，验证功能化PEEK表面的促成骨分化能力。
3)Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的体内植入验证：分别建立小鼠皮下植入感染模型、小鼠皮下植入异物反应模型和比格犬股骨植入模型，通过Micro-CT及组织学分析，进一步深入研究Dex/Mino脂质体修饰的PEEK在体内应用时是否能有效增强骨整合能力(包括预防感染、缓解异物反应且促进新骨再生)，为进一步将该材料用于临床提供前期实验基础与依据。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 Dex/Mino脂质体修饰方法的构建及其体外评价
1.1 Dex/Mino脂质体制备
采用薄膜分散法制备；按比例(1.85∶1∶0.15∶0.25，molar/molar/molar/molar)精密称取适量的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG2000-NH2)和Dex于茄形瓶中，加入甲醇和氯仿的混合溶剂(1∶1，v/v)，摇动使溶质溶解；使用旋转蒸发仪(75rpm)在恒温水浴(47℃)中减压干燥彻底除去有机溶剂，瓶内壁形成一层均匀的脂膜；取适量的水化液(120mM无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液，pH＝7.9)加入茄形瓶中，于恒温水浴(47℃)中超声水化至内壁脂膜完全脱落形成悬液；迅速将所得脂质体悬液依次通过孔径为220nm和100nm的滤器挤出数次得到具有浓度梯度的Dex脂质体，使用0.9％氯化钠缓冲液4℃过夜透析；透析后的Dex脂质体与适量Mino储液(药脂比为1∶10，w/w)混合，50℃条件下振摇茄形瓶30min使Mino载入脂质体水相中，即得到Dex/Mino脂质体(图1)，使用PBS过夜透析后，4℃保存备用。
空白脂质体制备：
按比例(1.85∶1∶0.15，molar/molar/molar)精密称取适量的DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-NH2于茄形瓶中，加入甲醇和氯仿的混合溶剂(1∶1，v/v)，摇动使溶质溶解；使用旋转蒸发仪(75rpm)在恒温水浴(47℃)中减压干燥彻底除去有机溶剂，瓶内壁形成一层均匀的脂膜；取适量的PBS加入茄形瓶中，于恒温水浴(47℃)中超声水化至内壁脂膜完全脱落形成悬液；迅速将所得脂质体悬液依次通过孔径为220nm和100nm的滤器挤出数次得到空白脂质体，使用PBS过夜透析后，4℃保存备用。
荧光脂质体制备：
避光条件下完成；DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-NH2和PE-Rho的称取比例为1.85∶1∶0.15∶0.002(molar/molar/molar/molar)，制备过程同空白脂质体。
1.2脂质体的性质评价
将待测脂质体稀释至合适倍数，使用光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径、多分散度(PDI)和zeta电位。
Dex和Mino的包封率测定公式为：包封率＝(Wencap/Wtotal)×100％。其中，Wtotal是透析前脂质体中Dex或Mino的测量值，Wencap为透析后脂质体中Dex或Mino的测量值。
收集等体积的透析前后的脂质体，分别加入适量的甲醇充分破坏脂质体，使用高效液相色谱仪测定透析前后样品中Dex或Mino的峰面积，用标准品所得线性回归曲线换算得到相应的含量值。
Mino的色谱检测条件为：C18色谱柱；以0.2mol/L醋酸铵/二甲基甲酰胺/四氢呋喃(600∶398∶2，v/v，内含0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠)为流动相；检测波长为280nm；流速为1.0mL/min。
Dex的色谱检测条件为：C18色谱柱；以乙腈/水/磷酸(35∶65∶0.5，v/v/v)为流动相；检测波长为242nm；流速为1.0mL/min。
1.3实验结果
脂质体的结构和表面性质易于优化，因而在调控生物活性分子的运输与释放方面具有显著的优势。常规脂质体由DPPC和Chol组成；空间稳定的脂质体由DPPC、Chol和DSPE-PEG2000-NH2组成。DSPE-PEG2000-NH2修饰在脂质体的表面，PEG2000能有效稳定脂质体，避免其聚集。脂质体在pDA修饰的PS表面(PS-pDA)的共价接枝是通过DSPE-PEG2000-NH2的NH2基团与PS-pDA表面的邻苯二酚基团的稳定结合而实现的。
表1脂质体的性质评价
脂质体 粒径(nm) 多分散度(PDI) zeta电位
空白脂质体 154.93±2.73 0.241±0.032 -0.78±0.08
Dex/Mino脂质体 164.56±3.04 0.173±0.017 -2.29±0.38
表1为本研究使用的脂质体的粒径大小、PDI和zeta电位。空白脂质体的粒径约为154.93±2.73nm，Dex/Mino脂质体的粒径约为164.56±3.04nm，两者的PDI约为0.2，说明脂质体粒径均一性良好；脂质体呈近中性zeta电位。Dex和Mino的包封效率分别约为11％和69％。Dex和Mino包封效率的显著差异归因于不同的载药方法。亲脂性药物Dex采用传统的被动载药法包载在脂质体中，而两亲性、弱酸性Mino采用高效主动载药法(pH梯度法)包载在脂质体中。与被动脂质体包封方法相比，主动加载(也称为跨膜梯度法)具有更高的药物包封效率；值得注意的是，主动载药的驱动力是pH不平衡。
实施例2地塞米松/米诺环素脂质体修饰的聚醚醚酮的制备与表征
2.1 Dex/Mino脂质体修饰的聚醚醚酮的制备
PEEK表面功能化修饰
纯PEEK棒切割成的圆片，依次使用不同型号的碳化硅砂纸打磨纯PEEK片，放置于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗各1h，50℃干燥。
空白脂质体、Dex/Mino脂质体和荧光标记脂质体均按照薄膜水化法制备，具体方法同实施例1.1.
功能化PEEK表面的制备方法同实施例1.2。简单讲，首先将多巴胺粉末加入Tris缓冲液(10mM，pH＝8.5)中混匀得到多巴胺溶液(2mg/mL)；然后将纯PEEK片放入多巴胺溶液中反应18h(37℃，70rpm)，超声清洗3次，得到的样品命名为PEEK-pDA；将PEEK-pDA分别在空白脂质体和Dex/Mino脂质体溶液(浓度为1mg/mL)中浸泡24h(37℃)，轻轻清洗去除物理吸附的脂质体，得到的样品分别命名为PEEK-blank lipo和PEEK-Dex/Mino lipo。
2.2材料表面表征
(1)材料表面静态接触角检测
使用接触角测量仪测量不同PEEK表面(PEEK、PEEK-pDA、PEEK-blank lipo及PEEK-Dex/Mino lipo)的水接触角，接触角的大小表征不同PEEK表面的亲水性。使用悬滴法，于清洗干燥后的样品表面滴加2μL去离子水，稳定后测量并拍照，每种样品测六个点。
(2)材料表面元素检测
使用XPS对不同PEEK表面(PEEK、PEEK-pDA、PEEK-blank lipo及PEEK-Dex/Minolipo)的化学成分进行了检测。工作电压15kV，发射电流15mA，测试过程在6.7×10-8Pa的高真空状态下进行，经284.8eV的C1s峰进行校准。
(3)材料表面形貌检测
使用SEM检测不同PEEK样品(PEEK、PEEK-pDA及PEEK-Dex/Mino lipo)的表面形貌。检测前，所有样品均真空干燥并且表面喷金处理。
(4)材料表面接枝的荧光标记的脂质体定性及定量检测
荧光脂质体接枝检测用于表征脂质体在PEEK表面的空间分布情况。本实验全程避光。按照2.1.1的方法将制备的荧光标记的脂质体溶液(浓度为1.0mg/mL)接枝在PEEK-pDA表面，轻轻清洗去除物理吸附的脂质体；使用CLSM拍摄PEEK表面脂质体分布情况；加入甲醇400μL溶解化学接枝的脂质体(37℃，70rpm，5min)，取100μL到96孔板中，使用酶标仪检测PEEK表面脂质体的荧光接枝密度。
2.3实验结果：
(1)亲水性分析
采用静态接触角检测来研究不同修饰的PEEK样品的表面润湿性变化(图2)。纯PEEK表面的水接触角约是71°，pDA修饰的PEEK(PEEK-pDA组)表面的水接触角约是24°，接触角的急剧降低说明pDA修饰后的PEEK表面的亲水性大大增加；亲水性的增加是由于成功修饰的pDA为超亲水性分子(含有大量亲水基团)。与PEEK-pDA组相比，脂质体修饰的PEEK(PEEK-blank lipo组或PEEK-Dex/Mino lipo组)表面的水接触角大约增加至61°；材料表面润湿性的变化表明，在pDA修饰的PEEK表面成功地修饰了疏水性脂质体。与纯PEEK组相比，脂质体修饰的PEEK表面的水接触角降低约10°，表明脂质体功能化修饰轻微改善了PEEK表面的亲水性。既往研究表明，与疏水性材料表面相比，亲水性材料表面对促进细胞的粘附和增殖更有利。因此，功能化修饰的表面对于提高惰性PEEK的细胞相容性可能会产生积极影响。
(2)表面化学元素分析
通过XPS检测不同修饰的PEEK样品的表面化学元素变化(图3)；纯PEEK和pDA修饰的PEEK(PEEK-pDA组)表面的主要组成元素是C元素和O元素；脂质体修饰的PEEK(PEEK-blank lipo组或PEEK-Dex/Mino lipo组)表面的主要组成元素也是C元素和O元素，此外，该表面还有P元素的出现(脂质体特征性元素，纯PEEK组和PEEK-pDA组中未出现)，说明PEEK表面成功修饰了脂质体。
(3)表面形貌分析
采用SEM检测不同修饰的PEEK样品的表面形貌(图4)。纯PEEK样品的表面呈现均一光滑的表面形态；pDA修饰的PEEK(PEEK-pDA组)表面有大小不一的pDA颗粒，表面较粗糙；pDA修饰的PEEK表面进一步共价接枝Dex/Mino脂质体(PEEK-Dex/Mino lipo组)后，其表面粗糙度轻度增加。
(4)荧光脂质体定性及定量分析
应用荧光标记的脂质体来确定共价修饰于PEEK表面的脂质体的空间分布；代表性荧光图像及其相对应的半定量脂质体接枝强度如图5所示。红色荧光标记的脂质体均匀分散在脂质体修饰的PEEK表面(PEEK-pDA-lipo组)；相反，纯PEEK或pDA修饰的PEEK(PEEK-pDA组)样品的制备不需要在荧光标记的脂质体中浸泡修饰，镜下未见红色荧光信号，说明PEEK表面无自发荧光、无荧光标记的脂质体共价附着。脂质体半定量荧光值进一步证实了上述结果，说明脂质体成功修饰于PEEK表面并在其表面均匀分布。
实施例3地塞米松/米诺环素脂质体修饰的聚醚醚酮的体外验证
3.1体外细胞相容性检测
既往文献报道，细胞粘附是细胞发挥功能及体内组织整合的基础，细胞增殖与新骨生成量密切相关；良好的细胞粘附和增殖能力可以促进材料(如骨科/牙科植入物)周围大量骨组织的产生。因此，体外评估材料细胞相容性的常见方法为检测细胞在该材料表面的粘附和增殖能力。在本研究中，我们验证了hBMSCs在Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面的粘附和增殖能力，这是判断该材料是否可以在生物医学领域应用的关键。
3.1.1溶液配制
(1)Calcein-AM和PI染色工作液
使用PBS配制，使Calcein-AM的终浓度为2μM，PI的终浓度为4.5μM；混匀后4℃避光存放。
(2)正常生长培养基、鬼笔环肽(异硫氰酸荧光素标记)、CCK-8工作液的配制
正常生长培养基：含有90％DMEM高糖培养基、10％胎牛血清和1％双抗(青霉素/链霉素)。
CCK-8工作液：CCK-8原液与DMEM高糖培养基以1∶10体积比混合，4℃避光保存。
鬼笔环肽(异硫氰酸荧光素标记)：0.1mg鬼笔环肽粉末溶于1mL无水甲醇，配成储存液，-20℃避光保存；工作液浓度为5μg/mL，由储液加PBS稀释20倍即可。
3.1.2hBMSCs接种
将hBMSCs分别接种于纯PEEK和不同修饰的PEEK表面(命名为PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)，接种密度为3.0×104个/孔。每孔加入正常生长培养基1mL，隔天换液。
3.1.3细胞粘附形态观察
分别使用SEM和CLSM观察hBMSCs在不同修饰的PEEK表面的粘附形态。
细胞培养3天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL 2.5％戊二醛，放入4℃冰箱，固定细胞2h；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入1mL梯度乙醇(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)脱水15min，继续用无水乙醇脱水2次；使用冷冻干燥机干燥样品，喷金后使用SEM观察拍照。
同样地，细胞培养3天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定细胞20min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.5mL Triton X-100(0.1％，v/v)，反应5min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.3mL异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(5μg/mL)，避光静置30min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入0.3mL DAPI(10μg/mL)，避光静置5min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入少量新PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
实验结果：
通过SEM观察hBMSCs在不同修饰的PEEK样品表面的粘附形态及数量(图6)。培养1天后，所有样品(纯PEEK组、PEEK-pDA组、PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面粘附的细胞均开始铺展；在细胞粘附数量上，纯PEEK组高于PEEK-Dex/Mino lipo组，而PEEK-Dex/Mino lipo组高于PEEK-blank lipo组。培养3天后，细胞出现丝状伪足且紧密粘附在不同修饰的PEEK表面；随着培养时间的延长，每个样品表面粘附的细胞数量均增加；细胞成簇，几乎占据了整个材料表面。
为了进一步研究细胞在材料表面的粘附行为，我们对生长在不同修饰的PEEK表面的hBMSCs的细胞骨架(肌动蛋白)进行了荧光染色分析(图7)。培养1天后，细胞在所有样品表面均开始铺展，但呈现狭窄的长梭状形态，肌动蛋白发育不良；更多的细胞粘附在纯PEEK表面，而仅有少数细胞粘附在改性的PEEK表面。培养3天后，细胞在所有样品表面均能很好地铺展，呈典型的多边形形貌，而且均可见明显的细胞间接触，以及发育成熟的肌动蛋白张力微丝；同样地，所有样品表面生长的细胞都增殖至几乎完全覆盖材料表面，这与SEM的观察结果一致。因此，SEM和荧光染色的分析表明，脂质体修饰的PEEK表面可能会影响细胞的初期粘附数量，但不会影响hBMSCs后期的正常粘附形态及增殖，因此具有良好的细胞相容性。
3.1.4细胞增殖检测
采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。细胞分别培养1、4、7天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入500μL CCK-8工作液，避光条件下放入37℃恒温箱温育2h；取100μL上清液转移至96孔板，避光条件下，在450nm波长处使用酶标仪检测光密度(OD)值。
实验结果：
理想的植入物表面不仅有利于细胞粘附，而且有利于细胞增殖。图8为hBMSCs在不同修饰的PEEK表面培养1、3、5和7天后，细胞增殖情况的检测。显然，CCK-8实验表明，所有PEEK样品表面的hBMSCs均正常增殖，而且具有时间依赖性。随着时间的推移，OD值的增加意味着脂质体修饰的PEEK表面可以促进细胞正常增殖。尽管如此，细胞分别培养1、3、5和7天后，脂质体修饰的PEEK(PEEK-blank lipo组和PEEK-Dex/Mino lipo组)的OD值均略低于纯PEEK组(P<0.05)，这种差异可能归因于脂质体自身的疏水性和PEG化修饰。脂质体作为Dex和Mino的运输载体共价修饰于PEEK表面，在一定程度上可能会降低细胞的初始粘附，但后续细胞增殖未受影响；虽然脂质涂层降低了细胞初始粘附量，但细胞培养7天后数量仍达到纯PEEK组的78％以上。由此我们可以推断，脂质体修饰的PEEK表面具有良好的细胞相容性。此外，在所有细胞培养期间，PEEK-Dex/Mino lipo组的OD值均高于PEEK-blank lipo组，说明虽然脂质修饰会对细胞产生一定的消极影响，但是Dex和Mino的释放会进一步提高材料表面的细胞相容性。
3.1.5细胞活/死荧光染色
采用细胞活/死染色试剂盒检测不同修饰的材料表面对细胞存活的影响。细胞培养4天后，吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入300μL Calcein-AM和PI染色工作液，37℃避光静置5min；吸弃液体，PBS洗3次，每孔加入少量新PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
实验结果：
图9为hBMSCs在不同修饰的PEEK表面培养4天后，细胞活/死荧光染色情况。荧光染色显示hBMSCs在所有样品表面均生长良好；细胞培养4天后，死细胞比例均非常低；说明纯PEEK和改性PEEK表面对hBMSCs均具有良好的细胞相容性。
总的来讲，通过细胞粘附、增殖和活力的检测，我们可以得出结论，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面具有良好的细胞相容性，这在骨科/牙科植入物领域具有广阔的应用前景。
3.2体外抑菌检测
3.2.1溶液配制
(1)BHI固体培养基
称取7.4g BHI粉末和3g琼脂粉，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基冷却至50℃时，于超净台中将培养基倒入细菌培养皿，静置约20min使培养基充分凝固，培养皿封口，倒置存放于4℃冰箱。
(2)TH液体培养基
称取6g TH粉末溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基完全冷却后，使用封口膜封口，存放于4℃冰箱。
(3)改良BHI固体培养基
称取7.4g BHI粉末、1g酵母提取物、0.2g L-半胱氨酸和3g琼脂粉，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基冷却至约50℃时，于超净台中加入1支维生素K1、2mL氯化血红素储液和10mL脱纤维羊血，使用转子搅拌混匀后将培养基倒入细菌培养皿中铺板，静置约20min使培养基充分凝固，培养皿封口，倒置存放于4℃冰箱。
(4)改良BHI液体培养基
称取7.4g BHI粉末、1g酵母提取物和0.2g L-半胱氨酸，溶于200mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，待培养基完全冷却后，于超净台中加入1支维生素K1和2mL氯化血红素储液，使用转子搅拌混匀后用封口膜封口，存放于4℃冰箱。
(5)氯化血红素储液、WST-8工作液及细菌活/死荧光染色工作液
氯化血红素储液：称取1.74g磷酸氢二钾和0.5g氯化血红素粉末溶于100mL去离子水中，充分混匀；121℃高压灭菌，得到5mg/mL的氯化血红素储液；待液体完全冷却后，使用封口膜封口，避光存放于4℃冰箱。
WST-8工作液：按9∶1的比例混合WST-8原液和电子载体溶液后，与液体培养基以1∶20体积比混合，4℃保存备用。
细菌活/死荧光染色工作液：细菌活/死荧光染色试剂盒中含有两种核酸染料(SYTO-9和PI)，分别取1.5μL SYTO-9和1.5μL PI溶于1mL PBS，避光混匀即可；根据实验实际用量可成比例扩大，4℃避光保存。
3.2.2细菌培养
牙龈卟啉单胞菌(W83)，革兰阴性、专性厌氧菌，由北京大学口腔医院中心实验室微生物平台提供。培养方法：于-80℃冰箱取出甘油冻存菌，溶化后与改良BHI液体培养基混匀，使用螺旋接种仪将菌液复苏于改良BHI固体培养基上，将培养皿倒置于厌氧产气袋中，于37℃孵箱中培养7天，待细菌产黑后挑取一个单克隆于改良BHI液体培养基(1mL)中，继续厌氧培养24h备用。
变形链球菌(UA159)，革兰阳性、兼性厌氧菌，由北京大学口腔医院中心实验室微生物平台提供。培养方法：于-80℃冰箱取出甘油冻存菌，溶化后与TH液体培养基混匀，使用螺旋接种仪将菌液复苏于BHI固体培养基上，将培养皿倒置于含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养48h，挑取一个单克隆于TH液体培养基(1mL)中，继续培养24h备用。
分别将牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌菌液与相应液体培养基混匀后接种于纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面(命名为PEEK组和PEEK-Dex/Mino lipo组)。
3.2.3细菌粘附和增殖定量检测
采用WST-8试剂盒检测材料表面细菌粘附情况。细菌分别培养4h和24h后，将各组PS片小心取出，移至新的24孔板，PBS轻轻冲洗3次；每孔加入400μL WST-8工作液，避光条件下放入37℃恒温箱温育2h；取100μL上清液转移至96孔板，避光条件下，在450nm波长处使用酶标仪检测OD值。
3.2.4细菌活/死荧光染色
细菌分别培养24h后，将各组玻片小心取出，移至新的24孔板，PBS轻轻冲洗3次；每孔加入500μL活/死荧光染色工作液，避光静置15min；吸弃液体，PBS清洗3次，每孔加入少量新PBS保持表面湿润，使用CLSM观察拍照。
3.2.5实验结果：
就植入而言，生物材料表面的细菌粘附和细胞粘附之间的竞争决定了植入物最终的命运。理想的植入应确保组织整合先于细菌粘附，从而防止细菌在植入界面增殖。图10显示了牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌的活力定量检测结果。在细菌初始粘附阶段(4h)，两组样品(纯PEEK组和PEEK-Dex/Mino lipo组)表面均未检测到牙龈卟啉单胞菌；与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的变形链球菌粘附较少，提示PEEK表面修饰的脂质体释放的Mino有效发挥抑菌作用。在细菌增殖阶段(24h)，两种细菌的数量都随着纯PEEK表面孵育时间的延长而增加；相反，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌的粘附数量显著下降。因此，我们推断Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面的Mino释放可以有效地阻止细菌粘附和增殖。图11为纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面分别培养牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌24h后的活/死荧光染色图像。纯PEEK表面的绿色荧光明显多于Dex/Mino脂质体修饰的PEEK，即纯PEEK表面的活菌(牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌)较PEEK-Dex/Mino lipo组更多，这与微生物活力定量检测结果一致。综上所述，纯PEEK表面易于细菌粘附和增殖，而Dex/Mino脂质体的应用提高了生物惰性PEEK表面对牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌的抑菌活性。
作为一种广谱的四环素类抗生素，Mino通过干扰细菌蛋白的合成发挥抑菌作用。体外研究发现，功能化PEEK表面不仅具有良好的细胞相容性，而且其表面修饰的脂质体可以缓慢释放Mino，这样的表面更有利于细胞粘附而不是细菌粘附，从而对Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的抑菌活性产生积极影响。综上所述，Dex/Mino脂质体功能化修饰提高了生物惰性PEEK的抑菌作用，这可能对预防植入物相关感染具有重要意义。
3.3体外成骨分化检测
3.3.1溶液配制
(1)骨诱导培养基(+)
含有90％DMEM低糖培养基、10％胎牛血清、1％双抗(青霉素/链霉素)、50μg/mL维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠和100nM Dex。
(2)骨传导培养基(–)
含有90％DMEM低糖培养基、10％胎牛血清、1％双抗(青霉素/链霉素)、50μg/mL维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠。
(3)Dex储存液(100×)、维生素C储存液(100×)、β-甘油磷酸钠储存液(100×)、茜素红溶液(w/v，2％)和十六烷基吡啶溶液(w/v，1％)
Dex储存液(500×)：称取5mg Dex粉末，溶解于5mL无水乙醇中，吹打混匀；然后吸取1mL加入到49mL DMEM低糖培养基中，得到5×10-5M的储存液，使用0.22μm的针头式滤器过滤，避光、分装保存于-20℃冰箱。
维生素C储存液(100×)：称取50mg维生素C粉末，溶解于10mL PBS中，使用0.22μm的针头式滤器过滤，避光、分装保存于-20℃冰箱。
β-甘油磷酸钠储存液(100×)：称取2.16gβ-甘油磷酸钠粉末，溶解于10mL PBS中，使用0.22μm的针头式滤器过滤，分装保存于-20℃冰箱。
茜素红溶液(w/v，2％)：称取1g茜素红粉末，溶解于50mL去离子水中，搅拌混匀并调节pH至4.2。使用滤纸过滤去除未溶解的颗粒，4℃保存。
十六烷基吡啶溶液(w/v，1％)：称取0.5g十六烷基吡啶粉末，溶解于50mL去离子水中，振荡混匀，4℃保存，使用前需要先恢复至室温。
3.3.2 hBMSCs接种及成骨诱导
将hBMSCs分别接种于纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面(命名为PEEK组和PEEK-Dex/Mino lipo组)，接种密度为3×104个/孔。每孔加入正常生长培养基1mL，培养2天后换用骨诱导培养基或骨传导培养基(此时记为诱导第1天)，隔天换液，持续诱导至21天。
3.3.3 ALP活性定量检测及ALP染色
(1)在成骨诱导第3和7天分别进行ALP活性定量检测
吸弃培养基，PBS清洗3次；每孔加入0.5mL Triton X-100(1％，v/v)反应20min，使用1mL移液枪反复吹打细胞并将悬液收集于1.5mL EP管，使用涡旋振荡器振荡后离心(12000rpm，30min，4℃)；小心转移上清液至新的标记的EP管，保存于-80℃冰箱备用。
BCA法测蛋白质的浓度：使用去离子水将标准品稀释成一系列梯度标准液(25、125、250、500、750、1000、1500和2000μg/mL)；于96孔板中分别加入20μL梯度标准液、20μL待测蛋白样品和20μL去离子水(作为空白对照)；每孔加入200μL工作液(由BCA试剂盒中的A液和B液以50∶1的比例混合而成)，摇匀30s后置于37℃恒温箱中30min；避光条件下，在562nm波长处使用酶标仪检测；由标准品做出标准曲线，然后根据标准曲线计算待测蛋白样品浓度。
ALP定量试剂盒检测：取10μL酚标准品加到500μL去离子水中，获得酚标准品稀释液；于96孔板中分别加入30μL酚标准品稀释液、30μL待测样品和30μL去离子水(作为空白对照)；每孔分别加入50μL一号基质液和50μL二号缓冲液，摇匀后置于37℃恒温箱中15min；每孔加入150μL三号显色液，15min内避光条件下，于520nm波长处使用酶标仪检测OD值。ALP活性的计算公式为：ALP活性＝(待测样品OD值-空白OD值)/(标准品OD值-空白OD值)×酚标准品浓度/待测样品的总蛋白浓度。
(2)在成骨诱导第7天进行ALP染色
吸弃培养基，PBS清洗3次；使用无水乙醇固定30min后PBS清洗三次，每孔加入0.5mL工作液(显色试剂盒中的BCIP:NBT:buffer＝1：1：38，v/v/v)，避光反应30min；吸去工作液，PBS清洗后使用相机拍照。
3.3.4茜素红染色和定量检测
在成骨诱导第21天进行茜素红染色。吸弃培养基，PBS清洗3次；使用4％多聚甲醛固定30min后，去离子水清洗3次，每孔加入0.5mL茜素红溶液(2％，pH＝4.2)，室温反应20min；用去离子水轻轻冲洗，除去未反应的茜素红溶液和非反应性着色；使用相机拍照。拍照完成后，每孔加入0.5mL十六烷基吡啶溶液(1％，w/v)，放入摇床(30rpm，37℃)2h以便溶解着色的钙结节；待反应完全后，将溶解液吹打混匀，取100μL/孔转移到96孔板中，于550nm波长处使用酶标仪检测OD值。
3.3.5实验结果：
就植入材料而言，新骨再生的一个关键因素是hBMSCs在植入物表面的成骨分化能力。Dex/Mino脂质体修饰的PS表面具有增强的成骨分化能力，提示Dex/Mino脂质体修饰方法可用于植入材料的生物功能化。本部分，我们将功能化表面修饰方法应用于PEEK表面改性，进一步验证该表面脂质体释放的Dex是否提高了hBMSCs的成骨分化能力。
(1)骨诱导条件下的成骨分化能力评价
如前所述，Dex具有促进hBMSCs成骨分化的作用；因此我们合理推断，体外联合使用成骨分化培养基和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面诱导hBMSCs，可能比单独使用成骨分化培养基更有利于hBMSCs成骨分化。接下来，我们比较了纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(PEEK-Dex/Mino lipo组)分别培养的hBMSCs的成骨分化能力；其中，+表示成骨分化培养基中含有Dex(即骨诱导培养基)。
ALP活性检测：
如图12b所示，我们分别在第3和7天检测PEEK组和PEEK-Dex/Mino lipo组的ALP活性表达量。hBMSCs的ALP表达在两组中均表现出良好的时间依赖性；PEEK-Dex/Mino lipo组在第3和7天的ALP表达值均高于纯PEEK组，说明PEEK表面的Dex/Mino脂质体修饰有效地促进了hBMSCs的成骨分化。此外，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的ALP活性表达在第7天增强了约1.9倍，这说明两种来源的Dex(在成骨分化培养基中添加的Dex和功能化PEEK表面修饰的脂质体释放的Dex)对hBMSCs成骨分化具有有效的累积作用。此外，我们在第7天进行了ALP染色(图12a)，PEEK-Dex/Mino lipo组表面的ALP阳性区域明显大于纯PEEK表面，这也与ALP定量结果一致。
钙结节形成能力分析：
进一步我们进行了茜素红染色和定量检测，评估hBMSCs在骨诱导培养基中诱导21天后的钙结节形成情况。如图13a所示，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组表面呈现更致密的红色区域(典型的钙沉积)，这表明Dex/Mino脂质体涂层有效地发挥了促成骨作用。图13b为钙沉积的定量分析；与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的OD值更高(即钙沉积更多)，与茜素红染色结果一致。PEEK-Dex/Mino lipo组矿化效率的提高表明，Dex/Mino脂质体的修饰可有效提高生物惰性PEEK材料的成骨分化活性。
综上所述，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK在骨诱导条件下具有良好的促成骨活性，提示可能会加速植入物与骨组织界面的骨整合。
(2)骨传导条件下的成骨分化能力评价
考虑到骨诱导培养基中可溶性骨诱导因子Dex的存在，hBMSCs可能会自发的发生成骨分化；因此，我们同时分析了在骨传导条件下(不含Dex的成骨分化培养基)hBMSCs的成骨分化能力，以避免骨诱导培养基中Dex的干扰，揭示Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的内在促成骨活性。
同样地，我们进行了ALP活性检测和钙结节形成能力分析；其中，–表示成骨分化培养基中不含有Dex(即骨传导培养基)。如图14所示，hBMSCs在纯PEEK表面培养3和7天后，ALP活性表达较低，21天后钙结节形成也较少，说明在骨传导条件下，由于缺乏可溶性骨诱导因子Dex，纯PEEK表面的促成骨分化能力下降。但是，与纯PEEK组相比，hBMSCs在Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面培养3和7天后，ALP活性显著增强，21天后有更多的钙沉积，提示Dex从脂质体修饰的PEEK表面释放出来，替代可溶性骨诱导因子Dex，有效促进了hBMSCs在骨传导条件下的成骨分化。虽然在骨传导培养基中培养的hBMSCs的成骨分化能力可能低于在骨诱导培养基中培养的hBMSCs的成骨分化能力，但是在缺乏可溶性骨诱导因子Dex的情况下，Dex/Mino脂质体的应用有效地激活了hBMSCs的成骨分化能力。
3.4小结
1)我们使用功能化表面修饰方法改性生物惰性PEEK材料，成功制备了Dex/Mino脂质体修饰的PEEK。材料表征结果显示，利用pDA作中间介质，脂质体成功修饰于惰性PEEK表面；与纯PEEK相比，功能化PEEK表面的亲水性略微提高，提示功能化修饰的PEEK表面对于提高惰性PEEK的细胞相容性产生积极影响。
2)细胞粘附和增殖检测结果显示，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面具有良好的细胞相容性。
3)微生物活力定量检测和细菌活/死荧光染色实验结果显示，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK材料可以有效抑制细菌粘附和增殖。
4)促成骨分化检测(ALP活性检测及染色分析、茜素红染色及定量分析)结果显示，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面在骨诱导和骨传导条件下均具有较强的促成骨活性，这是因为该表面释放的Dex可有效促进hBMSCs成骨分化。
综上所述，我们成功对生物惰性PEEK进行功能化改性，使其具有良好的细胞相容性，而且在体外有效发挥抑菌和促成骨作用，为提高PEEK体内骨整合研究提供了前期实验基础。
实施例4地塞米松/米诺环素脂质体修饰的聚醚醚酮的体内植入验证
4.1小鼠皮下植入感染模型建立
4.1.1小鼠皮下植入材料的制备
实验分为两组：纯PEEK组和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK组(即PEEK-Dex/Minolipo组)；纯PEEK片表面打磨及清洗、PEEK-Dex/Mino lipo片制备方法同实施例2.1，制备过程保持无菌操作。
4.1.2变形链球菌菌液准备
同实施例3.2。
4.1.3小鼠皮下PEEK片的植入
1)使用记号笔对每一只小鼠进行编号，并将其随机分为两组；
2)小鼠称重，使用1％戊巴比妥钠(0.1mL/10g)腹腔注射使其麻醉；
3)将小鼠俯卧位固定，用脱毛膏对其背部皮肤进行脱毛，使皮肤充分暴露，使用0.9％生理盐水将脱毛膏清洗干净并碘伏消毒；
4)使用组织剪剪开小鼠皮肤，钝性分离形成皮下囊袋；使用加样枪在两组PEEK片表面分别接种10μL变形链球菌(1×108CFU mL-1)；将表面接种了细菌的PEEK片置于皮下，使用角针缝合皮肤；
5)术后将小鼠放于37℃保温台上，观察小鼠麻醉后苏醒状态。手术过程如图15所示。
4.1.4小鼠皮下组织液提取、涂板及计数
手术24h后，腹腔注射1％戊巴比妥钠(0.2mL/10g)处死小鼠，剪取皮下组织。将获得的皮下组织放入15mL离心管中，用剪刀剪碎，加入适量0.9％生理盐水，使用匀浆仪将组织打碎，使用离心机(3000rpm)离心10min，收集上清液；取100μL上清液，使用螺旋接种仪接种于BHI固体培养基(配制方法同实施例3.2)中，放置于二氧化碳恒温培养箱48h后，计数并记录。
4.1.5小鼠皮下组织石蜡切片制备及苏木精-伊红染色
术后24h，腹腔注射1％戊巴比妥钠(0.2mL/10g)处死小鼠，剪下组织块并修整边缘；将组织块浸泡于4％多聚甲醛中固定24h后，用自来水流动冲洗；组织脱水透明；样本浸蜡并包埋形成蜡块；使用石蜡切片机切蜡块，切片厚度约5μm；于38℃水浴中展片后使用载玻片捞片，放置于58℃烤片台上烤片2h，转移至58℃烤箱过夜。烤片后即可进行苏木精-伊红(HE)染色，步骤如下：
1)将石蜡切片浸泡于二甲苯溶液中3次，每次分别浸泡15min、10min和10min，以便完全脱蜡；
2)先后浸泡于无水乙醇(2次，每次2min)、95％乙醇(2min)、90％乙醇(2min)、80％乙醇(2min)、70％乙醇(2min)和自来水(2min)中水化；
3)浸泡于苏木精中染色2min，流水冲洗1min；于1％盐酸-酒精中分化数秒，流水冲洗返蓝10min，自来水洗2min；
4)浸泡于0.5％伊红液中染色3min，自来水冲洗2s；
5)先后浸泡于80％乙醇(2min)、90％乙醇(2min)、95％乙醇(2次，每次2min)、无水乙醇(2次，每次2min)、二甲苯溶液(3次，每次2min)中脱水透明；
6)使用中性树胶封片，晾干后拍摄。
4.1.6实验结果：小鼠皮下PEEK片植入后抑菌作用的评价
由于植入物表面与周围组织的界面易受细菌侵袭，如果感染得不到控制，可能会导致术后植入失败，因此植入物表面的抑菌作用至关重要。细菌在植入物界面上的初始粘附是感染的一个关键因素，也是生物膜形成的一个关键步骤；考虑到植入物的持久使用，在术后植入初期阻断细菌对植入生物材料的粘附是至关重要的。实施例2、3的研究结果显示，Dex/Mino脂质体功能化修饰的表面可有效抑制细菌粘附；在本章节中，我们进一步将Dex/Mino脂质体修饰的PEEK(表面接种变形链球菌菌液)植入C57BL/6小鼠皮下，评估其体内抗菌活性和组织学反应。
图16为小鼠组织液涂板后的活菌菌落及其计数结果。纯PEEK组和PEEK-Dex/Minolipo组的菌落数分别为77±44和2±1；与纯PEEK相比，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK表面的活菌数量显著减少，这与体外抑菌研究结果一致。此外，我们估算了PEEK-Dex/Mino lipo组的抑菌效率约为97.4％。进一步，我们采用HE染色评估小鼠体内组织学反应。如图17所示，两组样品周围的皮下组织中都有炎性细胞；但是，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的炎性细胞数量较低；这说明纯PEEK组的感染严重程度高于功能化PEEK组，提示Dex/Mino脂质体修饰的PEEK在体内可有效地抑制感染。
4.2小鼠皮下植入异物反应模型建立
4.2.1小鼠皮下植入材料的制备
同4.1.1。
4.2.2小鼠皮下PEEK片的植入
1)使用记号笔对每一只小鼠进行编号，并将其随机分为两组；
2)小鼠称重，使用1％戊巴比妥钠(0.1mL/10g)腹腔注射使其麻醉；
3)将小鼠俯卧位固定，用脱毛膏对其背部皮肤进行脱毛，使皮肤充分暴露，使用0.9％生理盐水将脱毛膏清洗干净并碘伏消毒；
4)使用组织剪剪开小鼠皮肤，钝性分离形成皮下囊袋；将PEEK片放置于皮下，使用角针缝合皮肤；
5)术后将小鼠放于37℃保温台上，观察小鼠麻醉后苏醒状态。手术过程如图18所示。
4.2.3小鼠皮下组织石蜡切片及HE染色分析
术后1、3和7天，腹腔注射1％戊巴比妥钠(0.2mL/10g)处死小鼠，剪取皮下组织。石蜡组织切片的制备和HE染色步骤同4.1.5；染色后用光学显微镜观察并拍摄。
4.2.4小鼠皮下组织液提取和ELISA试剂盒检测
术后1天，腹腔注射1％戊巴比妥钠(0.2mL/10g)处死小鼠，剪下植入物周围的组织块放置于离心管中，剪碎，加入适量0.9％生理盐水，使用匀浆仪将组织块打碎，离心(3000rpm)10min后回收上清液；使用ELISA试剂盒检测上清液中促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达量。ELISA试剂盒使用步骤如下：
1)微孔酶标板在室温平衡20min后使用；
2)分别设置标准品孔和样品孔；标准品孔中各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
3)每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，使用封板膜覆盖反应孔，37℃恒温箱温育60min；
4)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，弃去液体，吸水纸上拍干，重复洗板5次；
5)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光温育15min；
6)每孔加入终止液50μL，于450nm波长处使用酶标仪检测OD值。由标准品做出标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样品浓度。
4.2.5实验结果：小鼠皮下PEEK片植入后异物反应的评价
免疫系统和骨骼系统被发现是密切相关的，共享许多细胞因子、受体、信号分子和转录因子。免疫细胞在骨内稳态中起关键作用。作为异物，植入物被免疫系统识别，并引发重大的免疫反应，影响骨细胞的生物学行为；这样的事件可能最终决定骨替代修复材料在体内的命运。因此，高级的骨替代修复材料的设计应从相对惰性转向具有免疫调节特性，强调免疫应答的重要作用。新一代的PEEK材料应该能够调节局部免疫环境，使其有利于成骨和植入物的骨整合。
实施例2、3的研究证实，Dex/Mino脂质体功能化修饰有助于减轻体外细胞炎性反应；本章节，我们进一步建立皮下植入异物反应模型来验证，功能化修饰的PEEK材料表面的脂质体释放的Dex是否能够有效缓解PEEK植入物引起的异物反应，代表性HE染色图像如图19a所示。众所周知，早期异物反应的表现为炎性细胞的浸润。术后第1和3天，纯PEEK组均发现由手术创伤及异物反应引起的强烈的炎性细胞浸润；相比之下，PEEK-Dex/Mino lipo组的炎性细胞浸润程度较轻。术后第7天，PEEK-Dex/Mino lipo组几乎未见炎性细胞(与未处理小鼠正常组织类似)，提示脂质体释放的Dex有效地发挥了免疫调节作用；此外，我们还发现，术后第7天，纯PEEK周围浸润的炎性细胞减少，这可能是受宿主先天性免疫的影响。然而，既往研究强调免疫抑制状态或免疫功能受损会使宿主对炎症和感染的抵抗能力下降。因此，开发一种具有免疫调节作用的PEEK材料来控制异物反应是非常重要的。如图19b所示，我们进一步使用ELISA试剂盒检测PEEK样品在C57BL/6小鼠皮下植入1天后的炎性因子(TNF-α和IL-6)表达水平；与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的促炎性细胞因子释放量明显降低，这与第1天的HE染色分析一致。综上所述，皮下植入异物反应模型证实了从脂质体修饰的PEEK表面释放的Dex可有效缓解异物植入后的炎症反应，提示Dex/Mino脂质体修饰的PEEK材料能够调节局部免疫环境，在提高PEEK植入物的骨整合方面极具潜力。
4.3比格犬股骨植入模型建立
4.3.1溶液配制
(1)戊巴比妥钠溶液(3％)
称取2.4g戊巴比妥钠粉末溶解于80mL去离子水中，摇匀，使用针头滤器(0.22μm孔径)过滤，避光保存于4℃冰箱；注射剂量为1mL/kg。
(2)青霉素钠注射液
将400U青霉素钠粉末溶于10mL利多卡因注射液，比格犬术后连续3天注射(10U/kg)。
(3)分别配制渗透液Ⅰ(Tochnovit:乙醇＝1:1)、渗透液Ⅱ(Tochnovit:乙醇＝2:1)和渗透液Ⅲ(100％Tochnovit)。
4.3.2比格犬股骨植入材料的制备
实验分为两组：纯PEEK组和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK组(即PEEK-Dex/Minolipo组)；使用前，将纯PEEK种植体放置于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗各1h，50℃干燥；PEEK-Dex/Mino lipo种植体制备方法同实施例2.1(即将纯PEEK种植体先后浸没于多巴胺溶液和Dex/Mino脂质体溶液中充分反应后使用)，制备过程保持无菌操作。
4.3.3比格犬股骨内种植体的植入
1)比格犬称重，使用3％戊巴比妥钠(1mL/kg)胫前静脉注射使其全身麻醉；
2)将比格犬侧卧位固定于恒温手术台上，使用脱毛器对股骨皮肤脱毛，充分暴露皮肤，常规消毒铺巾；
3)切开皮肤，切口处局部注射含肾上腺素的利多卡因，小心分离肌肉、血管，充分暴露股骨；
4)使用高速涡轮机和直径为4mm的钻针备洞，洞深达到7mm，备洞过程中使用生理盐水降温；将样本置于准备好的洞中，每个股骨随机植入2～3个种植体，两组分别植入8个种植体；依次用圆针和角针严密对位缝合肌肉和皮肤；
5)术后及时观察比格犬麻醉苏醒状态；术后连续3天肌注青霉素钠(10U/kg)。术后1周内，密切观察伤口愈合情况，是否出现红肿、感染以及脱线，对症处理；术后第7天拆线。手术过程如图20所示。
4.3.4 Micro-CT扫描及三维重建分析
手术8周后，胫前静脉注射3％戊巴比妥钠(3mL/kg)处死，获取股骨组织标本，将其放置于10％中性福尔马林中充分固定；利用Micro-CT扫描股骨样本，使用Micro-CT分析软件重建二维(2D)和三维(3D)的骨质结构，并获得新生骨参数，包括骨体积比值(即新生骨体积/组织体积)、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间距；以此判断表面功能化修饰的PEEK在比格犬体内促进新骨生成情况。
4.3.5比格犬股骨标本硬组织切片
Micro-CT完成后，将未脱钙的股骨修剪成更小的圆柱形标本，并进行硬组织切片；步骤如下：
1)股骨标本在10％的中性福尔马林中充分固定后，使用自来水充分清洗；分别使用70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％梯度乙醇对标本脱水；
2)将股骨标本先后浸泡于渗透液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，然后置入包埋液中固定；
3)使用硬组织修片机切割修整标本，然后使用硬组织切片机进行切片。
4.3.6 HE染色和甲苯胺蓝染色
采用HE染色和甲苯胺蓝染色观察新骨生长情况，具体步骤如下：
1)HE染色：染色方法同4.1.5。
2)甲苯胺蓝染色：将4.1.5中的苏木精和伊红染色液替换为甲苯胺蓝染色液，其余染色步骤与HE染色一致。
3)使用骨形态分析测量软件计算骨-植入物接触比率，计算公式为：骨-植入物接触比率＝(新生骨和植入物之间的接触长度/植入物植入髓骨腔长度)×100％。
4.3.7实验结果：比格犬股骨内PEEK植入后骨整合能力的评价
实施例3的体外成骨相关实验表明，Dex/Mino脂质体修饰提高了PEEK表面培养的hBMSCs的成骨分化能力；本部分，我们建立了一个比格犬股骨植入模型，将功能化PEEK植入股骨骨髓腔(图21a)，进一步验证改性表面的骨整合能力。既往研究指出，骨整合会指引成骨细胞在植入物表面定植，合成细胞外骨基质，最终形成新骨。研究体内组织细胞对Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的反应是骨整合的重要指标之一，同时与我们的PEEK材料是否能够成为生物医学植入物密切相关。
(1)Micro-CT分析
术后8周，我们采用Micro-CT技术来评估骨样本；该技术提供了PEEK周围新骨形成的详细信息，包括高分辨率的2D/3D图像和骨组织形态测量指标。图21b为骨髓腔内PEEK周围新生骨的纵切面二维CT图像。我们聚焦于虚线以下区域(即皮质骨以下)，发现Dex/Mino脂质体修饰的PEEK周围的新骨体积明显多于纯PEEK周围的新骨体积。3D重建图像中可见，纯PEEK周围的新生骨是不连续的、间断的；与纯PEEK组相比，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK周围形成更多连续的、致密的新骨(图22a)。骨体积比值、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间距的定量分析如图22b所示。PEEK-Dex/Mino lipo组的骨体积比值、骨小梁数量、骨小梁厚度明显高于纯PEEK组，提示新生骨组织更多；此外，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的骨小梁间距较小，提示新生骨组织更致密。上述研究结果表明，与纯PEEK相比，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK显著促进了新骨形成，这与hBMSCs体外增殖和成骨分化的研究结果一致。既往研究指出，Dex修饰的纳米颗粒或纳米纤维可促进体外成骨相关蛋白表达及体内钙化骨形成，提示Dex/Mino脂质体涂层修饰PEEK后，脂质体中Dex的释放必然促进骨髓腔中成骨细胞的生长及新骨再生。经Dex/Mino脂质体修饰后，生物惰性PEEK周围的新骨形成增加，这进一步促进了PEEK与骨之间的骨化，提示Dex/Mino脂质体修饰的PEEK更有利于提高体内骨整合。
(2)组织学分析
术后8周，HE染色和甲苯胺蓝染色如图23a所示。HE染色结果显示，纯PEEK界面有新骨碎片，且与新骨组织的间隙较大。在PEEK-Dex/Mino lipo组中，新骨形成比纯PEEK组多，且牢固地结合在功能化修饰的PEEK表面，沿着PEEK界面延伸。甲苯胺蓝染色显示，仅有少量新骨不连续地分散在纯PEEK周围；相比之下，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK促进了更大面积的新骨形成；新生骨从母体骨长入骨髓腔，且沿PEEK界面延伸，与Micro-CT及HE染色结果一致。以上研究结果提示，Dex/Mino脂质体的修饰大大促进了PEEK界面的骨整合。纯PEEK和Dex/Mino脂质体修饰的PEEK的骨-植入物接触比率如图23b所示；PEEK-Dex/Mino lipo组的骨-植入物接触比率(47.80±5.86％)明显高于纯PEEK组的骨-植入物接触比率(26.39±5.06％)。这一结果与Micro-CT检测和组织学染色结果一致，提示Dex/Mino脂质体的修饰加速了骨沉积，促进了骨融合。综上所述，体内研究结果表明，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK能更好的与宿主骨结合，促进新骨形成，这对于骨科/牙科植入物临床应用是有意义的。此外，体内和体外成骨研究结果一致，提示Dex/Mino脂质体修饰对生物惰性PEEK的骨整合是必要的。
4.4小结
1)建立小鼠皮下植入感染模型，评估功能化PEEK在体内的抑菌活性及组织学反应；活菌涂板计数及HE染色结果显示，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的活菌菌落数更少，炎性细胞浸润程度较轻，说明Dex/Mino脂质体修饰提高了惰性PEEK的抗感染活性，Mino的释放在体内更有效地抑制了PEEK表面的细菌粘附和增殖。
2)建立小鼠皮下植入异物反应模型，评估功能化PEEK对异物植入早期引起的炎性反应的调节能力；HE染色及ELISA检测结果显示，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组的炎性细胞浸润程度较轻，炎性因子(TNF-α和IL-6)的释放较少，说明Dex/Mino脂质体修饰提高了惰性PEEK的抗炎活性，Dex的释放在体内更有效地缓解了植入物引起的异物反应。
3)建立比格犬股骨植入模型，评估功能化PEEK的体内新骨生成及骨整合能力；Micro-CT及组织学分析结果显示，与纯PEEK组相比，PEEK-Dex/Mino lipo组促进更多新骨生成，而且功能化PEEK与新生骨牢固结合，说明Dex/Mino脂质体修饰提高了惰性PEEK的骨整合能力，Dex的释放在体内更有效地刺激和引导新骨再生。
综上所述，研究结果表明，Dex/Mino脂质体修饰的PEEK在体内具有有效的抑菌、抗炎和促进新骨再生的能力，作为牙科/骨科替代修复材料具有很大的临床应用潜力。
功能化PEEK表现出良好的细胞相容性，有效的抑菌、抗炎和促成骨活性，提示该材料具有提高植入物-骨界面骨整合的潜力，在临床具有较好的应用前景。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (10)

1.基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于，采用薄膜分散法制备包载地塞米松和米诺环素的脂质体后修饰于PEEK表面，包括以下步骤：
(1)将地塞米松和脂类溶于甲醇和氯仿的混合物中(1:1，v/v)；
(2)采用旋转真空蒸发仪除去甲醇和氯仿，之后用水化液水化脂质膜；水浴超声，获得包载地塞米松的脂质体，通过多孔聚碳酸酯膜挤压；透析过夜；
(3)与米诺环素储液混合，振摇，即得到载有地塞米松/米诺环素的脂质体，使用透析液过夜透析后，4℃保存备用；
(4)将PEEK植入物放入多巴胺溶液中反应，超声清洗；
(5)加入地塞米松/米诺环素脂质体溶液中浸泡，轻轻清洗即得产物。
2.根据权利要求1所述的基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述脂类为二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；脂类与地塞米松的比例为二棕榈酰磷脂酰胆碱：胆固醇：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基：地塞米松＝1.85∶1∶0.15∶0.25。
3.根据权利要求2所述的基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水化液为无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液；水浴超声温度为45-50℃，时间为5min；所述多孔聚碳酸酯膜的孔径为依次为450nm、220nm和100nm，或220nm和100nm；透析缓冲液为0.9％氯化钠缓冲液，温度为4℃；所述无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液的pH为7.9。
4.根据权利要求2所述的基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于：步骤(2)中，所述无水乙酸钠和无水氯化钙的混合液的终浓度为120mM。
5.根据权利要求4所述的基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于：
步骤(3)中，与米诺环素储液混合振摇是在50℃条件下，振摇30min；步骤(4)中，将纯PEEK片放入多巴胺溶液中反应18h，条件为37℃，70rpm，超声清洗3次。
6.根据权利要求2所述的基于脂质体的地塞米松/米诺环素在PEEK表面的修饰方法，其特征在于：步骤(5)中，加入地塞米松/米诺环素脂质体溶液浓度为1mg/mL；浸泡为37℃浸泡24h。
7.一种包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物，其特征在于：采用薄膜分散法制备包载地塞米松和米诺环素的脂质体后修饰于PEEK表面。
8.根据权利要求7所述的一种包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物，其特征在于：包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物的表面的水接触角为59.80±3.8°；地塞米松/米诺环素脂质体的粒径约为164.56±3.04nm，PDI约为0.2，呈近中性zeta电位；地塞米松和米诺环素的包封效率分别约为11％和69％。
9.权利要求7所述包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物在制备促进骨修复、再生及整合的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述包载地塞米松/米诺环素脂质体的PEEK植入物通过以下任一种或多种方法实现促进骨修复、再生及整合：
A)提高植入物亲水性，从而提高细胞相容性；
B)提高抗感染活性，抑制细菌粘附和增殖；
C)促进hBMSCs成骨分化；
D)提高抗炎活性，缓解植入物引起的异物反应；
E)功能化PEEK植入物与新生骨牢固结合，提高骨整合能力。
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