CN102971019B - 用于复杂组织工程化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备具有异质性和不规则性的功能性复杂组织的简单的、高度灵活且可扩展的平台。该方法包括将未分化的细胞如多能的或专能的干细胞与生物材料组合以制备多种未分化的或幼稚的(naïve)亚单位，将所述未分化的或幼稚的(naïve)亚单位暴露于不同的细胞培养环境用于向所述复杂组织所需的不同系诱导分化，以及仅仅组合然后的功能性亚单位或将然后的功能性亚单位与未分化的亚单位组合。可以在适合微调生物工程化的复杂组织的结构和功能特性的生物、化学和/或物理培养条件下培养因此组合的分化的亚单位以形成模拟天然的复杂组织的结构和功能特征的生物工程化的组织移植物。可以使用所述生物工程化的组织移植物以代替功能异常的组织。

Description

用于复杂组织工程化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年6月15日申请的美国临时申请号61/354,869的权益，所述申请在本文中通过引用被完整地并入本文。
发明领域
本发明总体涉及生物工程化的组织。具体而言，它涉及产生具有多于一种组织成分的组织移植物的方法。
发明背景
外伤，遗传或手术的原因可以引起组织功能障碍。对于轻度损伤，一些组织能够自己再生，而其它组织，尤其是少血供性质的那些几乎不能再生。已经作出了许多尝试来提供组织功能障碍的治疗选择，包括生长因子疗法、细胞疗法和基因疗法。然而，这些尝试仅仅当组织功能障碍的程度不是很大时才是有用的。当组织功能障碍很大时，通过手术方法的替代疗法是必要的。在这方面，用于生长和培养由细胞和基于生物材料的支架构成的三维(3D)组织样结构的组织工程方法，辅以生长刺激信号，为组织替代疗法提供了很大的希望。
在最近二十年中，在生物材料和制造技术、干细胞技术和生物反应器技术中已经取得了巨大的进步，使制备用于替代目的的具有与天然组织结构和功能的相似性的3D组织样结构更容易。然而，所有器官都是由具有多于一种有独特的结构、细胞类型和功能的组织成分的复杂组织构成的。复杂组织是具有多于一种组织成分的组织或器官。另一方面，大多数，如果不是所有，功能性组织由多于一种成分构成，并且具有独特的结构和细胞类型。复杂组织的例子包括：骨软骨移植物，其由具有组织的钙化软骨区的骨和软骨组成；脊柱运动节段，其由一对骨块和由其夹在中间的椎间盘组成，所述一对骨块以一对薄的软骨终板连接，所述椎间盘具有封装髓核的纤维环；韧带骨移植物，其由两个骨块组成，所述骨块在中间连接韧带条。复杂组织的内在异质性使得复杂组织工程化或由复杂组织构成的器官的工程化成为本领域中的挑战。
生物工程化复杂组织是极有挑战性的，因为：(1)需要用于不同的组织成分的多种细胞类型，使来源问题复杂化；(2)鉴于组织接头(tissue interfaces)在保证复杂组织的正常功能中扮演的关键功能，需要多种生物和稳定的组织接头；(3)需要维护多种表型和功能，使培养条件复杂化；以及(4)不同的组织成分和它们的接头的形态、结构和功能特性中的许多不规则存在于复杂组织中，但是难以模拟。
提供用于复杂组织的不同组织成分的多种实质细胞在临床上几乎是不可能的。这是因为来自健康的组织对应物的不同组织成分的多种活检样品侵入性太强，功能障碍的组织中的细胞通常是不正常的。而且，成熟细胞具有有限的寿命和增殖潜能。能够向被工程化的复杂组织的不同的组织成分的所有表型分化的多能性干细胞为这个问题提供了解决方案。然而，目前大多数对生物工程复杂组织的尝试涉及使用或多个来源细胞，使临床应用困难，或者，从不同来源分离的干细胞和成熟细胞的组合，这是非常复杂的解决方案。
生物和功能的组织接头，例如，骨软骨接头，是复杂组织的重要特征。仅仅最近，接头组织工程化的重要性开始受到日益增加的注意(Broom,等., J Anat., 135(1):65-82(1982).;Yang,等., Tissue Eng Part B Rev. 2009; 15(2):127-41 (2009);Keeney,等., Tissue Eng Part B Rev., 15(1):55-73(2009))。以前的方法包括用构建具有异质性(例如，梯度孔隙率)的支架的无固体形式(solid-free-form)制造技术在组合前分别制造用于骨部分和软骨部分的支架，以及使用光聚合在组合前直接将细胞封装在水凝胶中(Sherwood,等., Biomaterials, 23(24):4739-51 (2002); Alhadlaq,等., J. Bone Joint Surg Am., 87(5):936-44 (2005))。然而，结果远未达到模拟结构的分区组织并获得天然骨软骨接头的功能性机械性能的最终目标，许多挑战有待解决(Broom,等., J Anat., 135(1):65-82 (1982); Yang,等., Tissue Eng Part B Rev., 15(2):127-41(2009);和Keeney,等.,Tissue Eng Part B Rev., 15(1):55-73 (2009))。
首先，仍然需要定义细胞和支架的最佳组合。生物陶瓷如羟基磷灰石是用于骨部分(osteo-part)或骨头(bone)方面的最流行的选择，而合成的聚合物如聚-乳酸-共-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)通常用于软骨部分(chondro-part)或软骨(cartilage)方面(Kreklau,等, Biomaterials, 20(18):1743-9 (1999); Gao,等., Clin Orthop Relat Res., 427(Suppl):S62-6 (2004); Huang,等., Biomaterials.2007; 28(20):3091-100 (2007);和Jiang,等., J Orthop Res., 25(10):1277-90 (2007)。从不同区域分离的软骨细胞表现不同，具有工程化具有仿生的分区组织的软骨组织的潜能(Klein,等., Osteoarthritis Cartilage, 11(8):595-602 (2003)。例如，已经在磷酸钙中培养了来自关节软骨的深区的软骨细胞，这作为骨部分的支架，缺乏软骨部分的对应支架的情况下，这些细胞在体外导致钙化区的形成(Yu,等., Biomaterials, 18:1425(1997); Allan,等.,Tissue Eng.,13:167-177 (2007); Kandel,等., Biomaterials, 27(22):4120-31 (2006))。由于(i)需要从非承重区域收获活检样品，和(ii)软骨细胞在体外有限的增殖潜力，这些细胞的临床可用性将可能是有问题的。
专能(Multipotent)和多能干细胞(pluripotent stem cells)如骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)是有希望的，因为它们的自我更新能力和多种分化潜能(Pittenger,等.,Science, 284(5411):143–7 (1999); Pittenger, 等., Circ Res., 95(1):9–20(2004);和Le Blanc,等., Lancet, 363(9419):1439-41 (2004))。尽管MSC有希望，在使用MSC和丝骨架(Augst,等., J R Soc Interface, 5(25):929-39, (2008)或MSC和聚D,L-乳酸支架(Tuli,等., Tissue Eng., 10:1169-1179 (2004)的研究中，尽管软骨样部分与骨样部分持久接触，却没有观察到钙化区。在Tuli研究中，尽管在能够同时维持软骨形成和成骨表型的培养基中培养复合物，培养条件不能支持钙化软骨接头的形成(Tuli,等.,Tissue Eng, 10:1169-1179 (2004))。
第二，与宿主软骨的整合是大多数现有策略的共同问题，因为通常使用多个圆柱形插头(plugs)来填充缺陷。这些插头通常是不规则形状的，导致由于在关节面表面的不均匀性的有限的整合和增加的接触压力(Yang,等., Tissue Eng Part B Rev., 15(2):127-41 (2009); Keeney,等., Tissue Eng Part B Rev., 15(1):55-73 (2009); Martin,等., J. Biomech. 40(4):750-65 (2007))。细胞层技术，其包括层压多个汇合的细胞单层，似乎是能够制备具有异质性的组织的灵活的且可扩展的技术(Shimizu,等.,Biomaterials, 24(13):2309-16 (2003))。然而，多个层压需要时间，因为将一层粘附至前面层是费时的。因此，开放手术的时间是非常长的。因此，仅仅可以使用这种方法制备具有高细胞性的薄层组织如上皮组织和内皮组织。使用这种方法不能制备具有大块基质的组织、需要间充质细胞类型的组织、具有承重功能和具有不规则组织接头等的组织。
因此，生物工程化具有异质性和不规则性的复杂组织需要灵活性和可扩展性更高的技术，其允许从简单的细胞和材料来源形成并维持具有多个稳定的组织接头的多种组织类型，具有更好的疗效和更低的成本。
因此，本发明的一个目的是提供产生由多于一种组织成分构成的复杂组织的灵活的和可扩展的方法。
本发明的另一个目的是通过在需要复杂组织替代的部位移植本文公开的复杂组织支架而修复复杂组织缺陷的方法。
发明概述
本发明描述了用于制备具有异质性和不规则性的功能性复杂组织的简单的、高度灵活且可扩展的平台。使用该平台的代表性方法涉及将多能的或专能的细胞如干细胞与生物材料组合以制备多种未分化的或幼稚的(naïve)亚单位。在一些实施方案中，这些未分化的或幼稚的(naïve)亚单位是微囊化的多能的或专能的细胞。该方法进一步涉及将至少部分的未分化的或幼稚的(naïve)亚单位暴露于不同的环境用于向该复杂组织所要求的不同系诱导分化，以及在有或没有未分化的或幼稚的(naïve)亚单位的情况下组合然后功能性的亚单位以形成在结构性不规则性和异质性方面模拟天然的复杂组织的生物工程化的复杂组织。在一些实施方案中，通过将未分化的多能的或专能的细胞暴露于能够在生物工程化的复杂组织中维持多种表型的适合的微环境(包括但不限于分化培养基和机械负重)而进一步诱导未分化的或幼稚的(naïve)亚单位分化。在其它实施方案中，通过与干细胞的多种分化的后代的相互作用而诱导未分化的多能的或专能的细胞分化。
还提供了制备生物工程化的组织移植物的方法，该方法涉及组合两个或更多个功能性亚单位，所述功能性亚单位任选地被未分化的封装的多能的或专能的细胞分隔，其中两个或更多个功能性亚单位中的每一个是封装的多能的或专能的细胞，所述封装的多能的或专能的细胞被诱导分化为不同的细胞类型；以及培养组合的功能性单位以形成模拟复杂组织的结构和功能特征的生物工程化的组织移植物。
用于细胞移植中的合适的多能的或专能的细胞包括诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、胎干细胞、脐带血干细胞、骨髓衍生的干细胞和脂肪组织衍生的干细胞。
将多能的或专能的细胞封装在生物材料屏障如细胞外基质生物材料中。在优选的实施方案中，细胞外基质生物材料是胶原。可以将细胞封装成任何合适的结构，如微球、立方体、环或微棒。
在一些实施方案中，使用任何可用的方式如化学诱导、遗传操作，或者通过重构生物和机械的微环境而诱导封装的多能的或专能的细胞分化。
在一些实施方案中，该方法进一步涉及通过将生物工程化的组织移植物暴露于合适的生物、化学和物理的共培养条件而微调生物工程化的组织移植物的结构和功能特性。在一些实施方案中，在条件培养基、生长因子、细胞因子、血清及其组合存在的情况下培养组合的功能性单位。在一些实施方案中，在适合促进复杂组织的功能和结构特征的化学条件下的培养组合的功能性单位。化学条件包括抗氧化剂、酸、碱、氧张力及其组合。在一些实施方案中，在选自扭力、压缩、张力及其组合的力存在的情况下培养组合的功能性单位。
与公开的方法相关的复杂组织包括骨软骨组织、椎间盘、脊柱运动节段；韧带骨组织、具有包含有血供的网络的心肌肌肉的心脏条带、具有能够延长和增厚的骨组织的软骨的高度组织的分层的生长板和具有完全血供的肝细胞的肝脏补丁。在优选的实施方案中，复杂组织是具有分区组织的骨软骨组织。在其它实施方案中，复杂组织是具有纤维环的多薄层结构的脊柱运动节段。
另一个实施方案提供了修复组织缺陷的方法，其涉及在受试者中组织损伤的部位使用公开的生物工程化的组织移植物。另一个实施方案提供了修复组织缺陷的方法，其涉及在需要其的部位移植幼稚的(naïve)和/或分化的亚单位的组合。
在另一个实施方案中，在移植前，可以在适合微调生物工程化的复杂组织的结构和功能特性的生物、化学和/或物理培养条件下培养组合的幼稚的(naïve)和分化的亚单位。合适的生物培养条件包括定制的培养基、条件培养基、生长因子和细胞因子、血清和其它血液产品及其组合。合适的化学条件包括抗氧化剂、酸、碱、氧张力及其组合。合适的物理条件包括机械负荷选自扭力、压缩、张力及其组合的力。
还提供了在生物工程化的组织构建体中产生钙化的区域接头的方法，该方法涉及培养具有第一、第二和第三层的体外构建体以诱导所述第一和第三层之间的钙化区域；其中所述第一层包含可以被处理以诱导成骨分化的微囊化的多能的或专能的细胞；其中所述第二层与第一层相邻，分隔所述第一和第三层，并包含未分化的微囊化的多能的或专能的细胞；其中所述第三层与所述第二层相邻并包含可以被处理以诱导软骨形成分化的多能的或专能的细胞。
还提供了产生复杂组织构建体的方法，该方法涉及通过在诱导复杂组织构建体的形成的条件下培养可以被诱导分化的两层封装的干细胞，所述两层封装的干细胞通过一层未分化的封装的干细胞连接在一起。
还提供了通过公开的方法产生的生物工程化的组织移植物。
还提供了生物工程化的骨软骨组织构建体，其包含第一、第二和第三层，其中所述第一层包含可以被处理以诱导成骨分化的微囊化的多能的或专能的细胞，其中所述第二层与第一层相邻，分隔所述第一和第三层，并包含未分化的微囊化的多能的或专能的细胞；其中所述第三层与所述第二层相邻并包含可以被处理以诱导软骨形成分化的多能的或专能的细胞。在优选的实施方案中，生物工程化的构建体具有所述第一和第三层之间的钙化的区域接头。
还提供了在受试者中治疗骨软骨损伤的方法，该方法涉及在骨软骨损伤的部位将公开的生物工程化的骨软骨构建体施用于受试者。
还提供了产生生物工程化的脊柱运动节段的方法，该方法涉及诱导微囊化的多能的或专能的干细胞以形成成骨亚单位；将所述成骨亚单位与可以被诱导形成软骨形成的亚单位的微囊化的多能的或专能的干细胞组合，其中所述成骨亚单位和软骨形成的亚单位的组合形成包含终板的骨块(bone blocks)；用封装髓核的纤维环和包含终板的骨块将椎间盘夹在中间以形成脊柱运动节段。椎间盘可以是天然的，生物工程化的，或合成的。
附图简要说明
图1是概述复杂组织形成的方法的流程图。
图2是显示制备作为复杂组织工程化的例子的具有钙化软骨接头的骨和软骨的骨软骨移植物的方法的流程图。
图3A是显示在软骨形成培养基中培养的微球中葡糖胺聚糖（GAGs）(♦)和羟脯氨酸（HYP）(■)的相对量(μg)作为时间（0、14和21天）的函数的线性图(n=4)。图3B是显示软骨形成微球(♦)相比于正常兔膝关节软骨(■)的GAGs/HYP比值作为时间（0、14和21天）的函数的线性图(n=4)。图3C是显示成骨微球中钙/干重百分比(w/w %)作为时间（0、14和21天）的函数的线性图(n=5)。
图4是显示从成骨分化的MSC-胶原微球分泌的BMP2的累积量(pg)作为培养时间（7、14和21天）的函数的柱状图。
图5是在下列条件后7天（实心柱）和21天（空心柱）生物工程化的骨软骨构建体的拉伸强度(kPa)的柱状图：1）无压缩，用软骨形成培养基(“XC”)；2) 无压缩，用正常生长培养基(“XN”)；3）有压缩，用软骨形成培养基(“CC”)，以及4）有压缩，用正常生长培养基(“CN”)。* p = 0.05。
发明的详细说明
I. 定义
如本文所用，“复杂组织”是指行使分别的生物功能的两种或更多种细胞类型的集合体。示例性的复杂组织包括但不限于骨软骨组织和器官组织。
如本文所用，“生物工程化的复杂组织”和“生物工程化的组织移植物”是指组合物或结构，当被移植进复杂组织时，该组合物或结构产生模拟所述复杂组织的结构和功能的组织。
如本文所用，“未分化的或幼稚的(naïve)亚单位”是由技术如微囊化制备的未分化的细胞生物材料亚单位。
如本文所用，“功能性亚单位”是分化的组织微物质(micromasses)，其要求天然的组织的功能。
如本文所用，“在微球中封装的”是指由于形成微球的材料的相变产生的其中嵌入细胞的纳米纤维性微球。
如本文所用，“干细胞”通常是指无论来源的未分化的细胞，包括专能细胞、多能细胞、去分化的细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和诱导的多能干细胞。干细胞可以胚胎或成体干细胞。
如本文所用，“全能性”是指在生物体，包括胚胎外组织中单细胞分裂并产生所有分化的细胞的能力。
如本文所用，“多能性”是指单细胞分化成三种胚层(内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统))的任一种的细胞的能力。多能细胞不能发育成胎儿或成体动物，因为它们缺乏有助于胚胎外组织如胎盘的能力。
如本文所用，“专能的”是指具有分化为多种细胞系但不是所有三种胚层的细胞的能力的细胞。
如本文所用，“受试者”是指作为施用目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人。该术语并不表明具体的年龄或性别。患者是指受疾病或病症折磨的受试者。术语“患者”包括人和兽受试者。
II. 形成复杂组织的方法
生物工程化复杂组织需要灵活性和可扩展性更高的技术，该技术允许从简单的细胞和材料来源形成并维持具有多个稳定的组织接头的多种组织类型。公开的方法使用组织由功能性亚单位组成这一概念，该功能性亚单位是具有小体积如10-6ml 并且具有例如100-1000细胞的组织微物质。公开的方法还使用各种类型的干细胞的多种分化潜能以及未分化的干细胞、正在分化的干细胞和它们的分化的后代之间的相互作用。公开的方法进一步使用细胞改造它们现有的基质(包括但不限于细胞外基质和微环境) 的能力而用于将细胞微调分化为期望的组织结构。被改造的基质由细胞，优选对各种信号响应的干细胞，形成。具体而言，本文通过尽可能地模拟或重构组织的生物和机械的微环境使得可以维持多种细胞或组织表型并且功能性复杂组织可以生长而提供了在体外为生物工程化的复杂组织提供条件的方法。该方法整合了复杂组织的不同的组织成分的多种功能性亚单位从而生物工程化复杂组织。实施例表明，公开的方法在从单一干细胞来源和单一生物材料制备具有钙化的软骨接头的骨软骨移植物中在5周时是有效的(图2)。其疗效和简单性使复杂组织工程是可能的并且负担得起的。
A. 细胞
公开的方法中有用的代表性细胞包括但不限于，作为用于制备复杂组织的多种组织成分的唯一细胞来源的多能的或专能的细胞，如成体或胚胎干细胞。干细胞可以是通过病毒或非病毒的方法获得的诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、胚干细胞、脐带血干细胞、骨髓来源的干细胞如间充质干细胞(MSC)和脂肪组织来源的干细胞如间充质干细胞等。优选临床可行的干细胞来源如骨髓来源的间充质干细胞，因为它可以很容易地获得，道德上和社会上更可以接受。
细胞也可以是商业获得的干细胞。它们可以从销售干细胞或监管机构批准的任何来源的公司获得。例如，它们可以从Beike Biotechnology购买。
B. 细胞外基质(ECM)生物材料
组合物包括至少一种生物材料，其必须能够为细胞提供支持，与细胞相互作用以便在不引入毒性的情况下允许细胞生长，并允许细胞迁移和渗透。生物材料可以是不同类型的胶原如I、II和III型，或良好支持细胞生长和迁移并且在足够温和以支持细胞生存的条件时具有相变特性的任何材料，如纤维蛋白和透明质酸。使用的胶原可以是牛来源的如美国食品和药物管理局(FDA)批准的皮肤等同物IntegraRTM和ApligrafRTM和已经在临床上用于皱纹减少的软组织填料或产品如DermaLive®和DermaDeep® (Bergeret-Galley,等., Aesthetic Plast.Surg., 25(4):249-55 (2001)，或者用于尿失禁治疗(Corcos,等., Urology, 65(5):898-904 (2005))中使用的那些。生物材料可以源自天然的或合成的来源，在足够温和以支持细胞生存和生长的特定条件下，它可以被诱导以重构为固体形式。可以从各种动物来源，如鼠尾、猪皮、牛跟腱或人胎盘的分离或提取而产生生物材料。优选地，从提取期间的不同部分如酸可溶的、胃蛋白酶可溶的或不溶性部分分离生物材料。
组合物可以进一步包括第二种生物材料，它可以是从鲨鱼软骨、纤维蛋白、弹性蛋白或透明质酸获得的蛋白多糖或葡糖胺聚糖(“GAG”)。第一种生物材料可以以一定方式与活细胞或与第二种生物材料相互作用，这种方式中使得相互作用导致在生长和分化中的细胞反应和微球的物理性质如结构的体积、生物材料密度、细胞密度、机械特性和稳定性等的变化。
合适的生物材料还包括水凝胶如通过添加钙而胶凝的藻酸盐凝胶，其制造条件是足够温和以便在不使用有机溶剂或其它对细胞有毒性的物质的情况下以及在没有严苛条件的情况下维持封装后的高细胞存活率。
生物材料不影响专能的或多能的细胞的干细胞性质。它提供了允许通过所述分化细胞将生物材料改造为天然的组织样基质并在复杂组织工程化过程中支持新的组织成分或组织接头生长的最佳支架。生物材料可以是合成的、天然的或其组合。优选的生物材料包括但不限于在干细胞分化成不同后代或系的细胞之前能够自我组装成捕获干细胞的纤维状网络的生物材料。生物材料包括但不限于胶原、纤维蛋白原、弹性蛋白、自我组装肽及其组合。
C. 复杂组织形成
将未分化的细胞，例如，干细胞，与生物材料组合以形成复杂组织。在一个实施方案中，使用微囊化将细胞/生物材料组合转化为许多未分化的或幼稚的(naïve)亚单位。微囊化不影响未分化的细胞的干细胞性质。微囊化的优选方法包括但不限于在Chan等的美国公开申请号2008/0031858中所述的，或Chan,等., Biomaterials, 28:4652–4666 (2007)中所述的方法，两者都在允许的地方通过引用而完整地并入。在不影响干细胞的性质(其包括干细胞的自我更新能力和多种分化潜能)的情况下，微囊化使未分化的细胞捕获在具有可控大小的微米大小的生物材料结构如微球、立方体或微棒中[Chan,等.,Biomaterials,28:4652 – 4666 (2007))。这些微米大小的生物材料的结构或亚单位可用于随后的分化或组合以形成复杂组织。
使用本领域中已知的方法(包括但不限于，化学诱导、重构生物微环境和遗传操作)将幼稚的(naïve)亚单位分化成与复杂组织中不同的组织成分对应的不同的系或后代。因此处理过的幼稚的(naïve)亚单位变为功能性亚单位，即，是具有天然组织的生物学功能的分化的组织微物质。例子包括软骨样微物质，该微物质通过幼稚的(naïve)MSC-胶原微球的软骨形成分化而制备，骨样微物质通过成骨分化天然的MSC-胶原微球而制备(表1)。
表1. 不同组中对于钙和磷的相对组成的平均值与标准偏差(SD)。
功能性亚单位包含改造的支架和干细胞的分化的后代。例如，可以用Hue,等.,Biomaterials, 29:3201-3212 (2008)中所述的方法从幼稚的(naïve)亚单位形成软骨样功能性亚单位，可以用Chan,等., Tissue Eng Part C Methods, 16(2):225-35 (2010)中所述的方法从幼稚的(naïve)亚单位形成骨样功能性亚单位。在功能性亚单位的分化后，组合功能性亚单位以形成复杂组织样结构。在一些实施方案中，组合相同细胞类型的功能性亚单位，然后与另一种细胞类型的功能性亚单位组合。在一个实施方案中，通过在悬浮液中混合不同的亚单位以随机的方式组合亚单位，然后以高亚单位密度共培养亚单位。另一个实施方案中，通过以模拟天然组织的异质性和不规则性的配置的适当的配置整合亚单位而以预先确定的模式组合亚单位。可以在适当的时间点以适当的配置进行这一点。也应当根据不同的复杂组织优化组合的持续时间。不同的复杂组织具有不同的设计，底线是尽可能地模拟天然的组织结构。
在其它实施方案中，公开的方法利用在适当的配置和条件的干细胞的分化的后代和未分化的干细胞之间的直接或间接的相互作用，使得分化的后代也诱导未分化的干细胞向难以通过化学诱导简单地诱导的系分化。干细胞的分化的后代是在分化途径的早期或晚期通过许多不同的方法从未分化的干细胞来源获得的分化的细胞，所述方法包括已知的化学诱导方案、已知的基因操作方案和当分化方案未知时的间接的诱导方法。如果软骨细胞的分化方案是未知的，例如，间接的方法是通过微囊化将从容易获得的动物或人来源的成熟细胞捕获在生物材料中，并允许成熟软骨细胞生长并将生物材料支架改造为模拟天然组织微环境的生物材料支架，然后丢弃成熟的细胞并用未分化的干细胞重新植入亚单位。由成熟细胞重构的基质和生物环境将重新植入的未分化的干细胞诱导成作为未分化的干细胞的分化的后代的软骨细胞样细胞(Cheng,等., Tissue Engineering Part C. 15(4):697-706 (2009))。
干细胞的分化的后代和它们的未分化的对应物之间的相互作用包括，在具有适当的3D配置的适当的培养条件下，具有干细胞的分化的后代的功能性亚单位与由未分化的干细胞制成的幼稚的(naïve)亚单位共培养适当的时间期间。这种相互作用可以是分化的后代和未分化的干细胞之间的直接接触，或者是通过从分化的后代分泌的因子的间接诱导。相互作用还涉及从分化的干细胞的分泌的因子。这种相互作用可用于将未分化的干细胞诱导为由于未知化学分化方案而不能直接分化的第二或第三或第n的系或后代。例如，难以直接分化干细胞以形成同时具有适当的分区组织的未钙化的软骨和钙化的软骨细胞(肥大软骨细胞)。可能通过以分化后代(在这种情况下为成骨的和软骨形成的)制成的功能性亚单位适当地配置未分化的或天然的亚单位而诱导这种分区组织。将未分化的干细胞诱导分化成构成钙化的软骨层的肥厚系，这可能是由于功能性亚单位中分化的后代分泌的因子，包括但不限于BMP2 。
使用上述组合的分化的亚单位来替代功能障碍的复杂组织。或者，可以在用于微调组织的结构和功能特性的适当条件下将因此组合的分化的亚单位培养适当的时间期间。显示本文公开的方法的示意图如图1中提供。
可以通过改变或修改生物培养条件、化学培养条件、物理培养条件或其组合而分化细胞。可以通过包括来自其它细胞的条件培养基、与其它细胞共培养、包括生长因子和细胞因子、血清和其它血液产品及其组合而修改生物条件。可以通过包括抗氧化剂、酸、碱或修改氧张力等而修改化学条件。可以通过以不同的程度和频率等改变不同模式的力如扭力、压缩和拉伸或这些的任意组合的机械负荷而修改物理条件。可以使用生物反应器，其中可以根据不同的复杂组织的产生定制并优化细胞的生物、化学和机械微环境。
III. 复杂组织
可以根据本文所述的方法形成的复杂组织的例子包括骨软骨移植物，其由具有组织的钙化软骨区的骨和软骨组成；脊柱运动节段，其由一对骨块和由其夹在中间的椎间盘组成，所述一对骨块以一对薄的软骨终板连接，所述椎间盘具有封装髓核的纤维环；韧带骨移植物，其由两个骨块组成，所述骨块在中间连接韧带条；具有有血供的网络的心肌肌肉的心脏条带；具有能够延长和增厚的骨组织的软骨的高度组织的分层的生长板和具有完全血供的肝细胞的肝脏补丁。用于形成骨软骨移植物的示意图，例如，如图2中所示。
用脊柱运动节段作为例子，将幼稚的(naive)微球暴露于成骨分化条件以形成成骨亚单位，然后将其组合以形成骨块。将天然的亚单位暴露于软骨形成分化条件以制备软骨亚单位，然后将其组合以形成作为终板的薄且大的层。可以使用与在骨软骨移植物例子中所示的方法相同的方法形成骨块和终板之间的骨软骨接头–用中间层中的未分化的细胞(例如，MSC)形成三层的构建体，并在最佳的共培养培养基如在这种情况下为软骨形成培养基中共培养。使用两个这种骨软骨单位来形成脊柱运动节段，其中通过多层共培养再次组合中间的盘状部分。当分化方案未知时，可以通过上述方法获得该盘状部分。在多层构建体准备用于移植之前，可以将多层构建体装在提供模拟天然组织的机械负载的生物反应器上而用于不同组织的更好的整合以及连续的组织生长。
通过引用以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
通过引用以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
实施例
实施例1：骨髓穿刺和兔骨髓间充质干细胞(rMSC)分离
通过肌内注射10％盐酸氯胺酮(0.35ml/kg)和2％赛拉嗪(0.25ml/kg)的混合物而麻醉平均重量为3.5kg的三个月大的新西兰白兔。从胫骨抽吸约5ml骨髓。在Ficoll-Hypague梯度分离后，收集界面处的单核细胞并培养在包含10％胎牛血清(FBS)和抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。接种后10天，更新培养基，其后每2天重新填满。在最初铺板后约5-7天，发现粘附的细胞的可见集落。在达到汇合(最初铺板后约12-14天)，通过0.25%胰蛋白酶/EDTA分离细胞用于亚培养。
或者，可以从Beijing YiKeLiHao Biotechnology Co., Ltd购买rMSC。
实施例2：rMSC的培养
在由高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM-HG)、10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、1.875mg/ml碳酸氢钠(NaHCO3)、0.02M HEPES和0.29mg/ml L-谷氨酰胺组成的完全培养基中培养rMSC。用1N氢氧化钠(NaOH)将培养基的最终pH调节至7.4。通过粘附选择在24小时后将培养基中的活细胞与死细胞分离，即，将细胞培养24小时，然后将粘附细胞与培养基中的死细胞分离。在完全培养基中保持细胞，每3天重新填满。通过0.25％胰蛋白酶/EDTA分离亚汇合(subconfluence)的rMSC。来自第2-3代的细胞用于随后的微囊化步骤。
实施例3：幼稚的(naïve)亚单位-胶原-rMSC微球的制造
用1N NaOH中和冰冷的大鼠尾部I型胶原(Becton Dickenson)，并用完全培养基进一步稀释至2mg/ml的最终浓度。在冰浴中用中和的胶原溶液迅速混合完全培养基中的P2-P3的rMSC的等份，导致具有1250细胞/2.5μl滴的最终细胞密度的细胞-基质混合物。将液滴分配至35mm直径的Petri培养皿(Sterlin)中，用UV照射的封口膜覆盖在底层。在具有5%CO2的潮湿空气中在37℃孵育1小时后，液滴凝胶化形成固体的rMSC-胶原微球，然后将其轻轻地冲洗进使用完全培养基的Petri培养皿中，在分化步骤之前培养3天。
实施例4：软骨样功能性亚单位的形成
通过在形成幼稚的(naive)亚单位后3天在软骨形成分化诱导培养基中作为悬浮液培养rMSC-胶原微球而诱导rMSC-胶原微球的软骨形成分化。软骨形成分化诱导培养基被定义为补充10 ng/ml重组人TGF-β1 (Merck, Darmstadt, Germany)、100 nM地塞米松(Sigma)、0.1 mM L-抗坏血酸2-硫酸盐(Fluka, St. Louis, MO, USA)、6 μg/ml胰岛素(Merck)、6 μg/ml转铁蛋白(Sigma)、1 mM丙酮酸钠(Gibco, Grand Island, NY, USA)、0.35 mM L-脯氨酸(Merck)和1.25 mg/ml牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)的Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖(DMEM-HG)。每3天定期更换培养基，持续3周。在分化后第7和21天时，收获约10个微球并进行组织学评价，包括常规H＆E染色、II型胶原免疫组织化学和糖胺聚糖(GAG)分析、测定GAG/羟脯氨酸(HYP)比例的生化评价和软骨形成分化的微球的弹性模量的机械评价。这些微球(是软骨样功能性亚单位)随后被用于复杂组织工程化的整合和组合步骤。
软骨样功能性亚单位为阿尔新蓝(Alcian blue)染色阳性，表明葡糖胺聚糖和II型胶原的存在。尽管对于天然的软骨的GAG/HYP比例仅为7％的值，当它们在共培养培养基中进一步培养14和21天时，微物质的组成和结构得到了改善，该值分别增加值天然组织的12和15％，表明共培养培养基中的进一步改造正在进行。可以使用更长的孵育和用进一步的软骨形成分化信号的刺激。
实施例5：骨样功能性亚单位的制造
通过在形成幼稚的(naïve)亚单位后3天在成骨分化诱导培养基中作为悬浮液培养rMSC-胶原微球而诱导胶原微球中rMSC的成骨分化。将成骨分化诱导培养基定义为补充10% FBS、100 nM地塞米松(Sigma), 0.1 mM L-抗坏血酸2-磷酸盐(Fluka, St. Louis,MO, USA)和10mM β-甘油磷酸酯(Sigma)的Dulbecco改良的Eagle培养基-低葡萄糖(DMEM-LG)。每3天定期更换培养基，持续3周。在分化后7和21天时，收获约10个微球并进行组织学评价，包括常规H&E染色、von Kossa染色、对成骨分化微球的总钙含量的生化分析。
这些骨样功能性亚单位用Von Kossa染色为染色阳性。定量的钙含量测定表明，钙含量达到功能性亚单位的20％以上(图3C)。随着共培养时间增加，钙沉积继续增加，表明共培养条件成功地保持了成骨表型。共培养包括，在以适当的配置组合进三层后，在中间层培养未分化的MSC，这也可以是幼稚的(naive)亚单位、成骨亚单位和软骨形成亚单位，所有一起。
实施例6：软骨样微球的GAG/HYP比例的定量分析
通过1,9-二甲基亚甲基蓝染料结合试验测定GAG含量(Barbosa,等,Glycobiolog, 13(9):647-53 (2003))。简而言之，对于每组，将每份样品的80个微球放置在包含用于溶解蛋白聚糖的300 μg/mL木瓜蛋白酶的pH 6.5的磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，5 mM EDTA和5 mM L-半胱氨酸)中。在60℃进行消化过夜。然后用酶标仪(Safire2; Tecan, Mannedorf, Switzerland)测定在656 nm的吸光度。用使用作为标准品的硫酸软骨素在0.5-2μg/100μL之间的线性区域制备的校准曲线测定样品中GAG的量(Barbosa等,Glycobiology, 13:647-653 (2003)。
通过Sircol胶原试验测定胶原含量。简而言之，对于每组，将每份样品的80个微球放置在包含胃蛋白酶的0.5N乙酸溶液中。在4℃过夜进行消化。然后用酶标仪(Safire 2;Tecan, Mannedorf, Switzerland)测定在555nm的吸光度。用通过牛胶原标准品在6.25-25μg/100μL之间的线性区域制备的校准曲线测定样品中胶原的量。羟脯氨酸含量为总胶原含量的14％。GAG/HYP比例如图3B中所示。实施例7：整合不同的亚单位用于双和三层的骨软骨构建体的制造和共培养。
包装三百六十个成骨分化的胶原-rMSC微球。在临包装三百六十个软骨形成分化的胶原-rMSC微球作为上层之前，将2 mg/ml具有5x105细胞/ml的未分化的rMSC的200μl胶原凝胶的等份加入中间层。然后将三层的骨软骨构建体分成3组，在正常培养基(NM)、软骨形成培养基(CM)或成骨培养基(OM)培养或14天或21天的另一个期间。以类似的方式制造由软骨形成的或成骨的部分连同未分化的rMSC-胶原凝胶层组成的双层构建体，并用作对照。用作为软骨形成标记的GAG和Ⅱ型胶原、作为成骨标记的钙沉积和作为接头标记的X型胶原，组织学、组织化学和免疫组织化学地评价所有共培养的构建体。还通过扫描电子显微镜(SEM)和能量散射X射线(EDX)分析评价三层构建体的超微结构。包括整个构建体的微物质仍然可见。
实施例7：组织学和免疫组织化学评价
将样品(共培养之后的整个构建体，或三层的或双层的构建体)固定在4％多聚甲醛(PFA)中，包埋在石蜡中并切成7μm片。使用苏木精和伊红(H＆E)染色来显示细胞形态，使用番红精O染色来显示GAG丰富的区域，使用针对II型胶原和X型胶原的免疫组织化学分别作为软骨细胞和肥大软骨细胞的表型标记。
对于II型胶原免疫组织化学，将切片用0.5％胃蛋白酶在5 mM HCl在37℃孵育30分钟用于抗原恢复。在用在PBS中1:2000稀释的小鼠抗-II型胶原多克隆抗体(Calbiochem)在4℃孵育过夜后，将切片用在PBS中1:200稀释的抗-小鼠二级抗体在室温孵育30分钟。
对于针对X型胶原的免疫组织化学，将切片用在PBS中的0.2%透明质酸酶在37℃孵育1小时，然后用0.1％链霉蛋白酶(在PBS中)孵育9分钟用于抗原恢复。在用在正常马血清中1:2000稀释的小鼠抗-X型胶原单克隆抗体(Abcam)在4℃孵育过夜后，将切片用在正常马血清中1:800稀释的抗-小鼠二级抗体在室温孵育30分钟。根据供应商的说明书，在两种情况下都使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories) 和DAB底物系统(Dako)用于显色。
使用von Kossa染色来鉴定矿物质区域中的钙沉积。简而言之，在UV照射30分钟下将切片浸渍在1％硝酸银溶液(Sigma)中。通过2％硫代硫酸钠溶液5分钟去除未反应的银。使用核固红(Nuclear Fast Red)作为复染料。
在三层的配置中鉴定具有钙化软骨接头分隔骨样和软骨样层的适当的分区组织。阳性的Von Kossa染色鉴定了钙沉积，阳性的II型胶原和阳性的阿尔新蓝染色表明软骨，阳性的X型胶原表明三层结构的肥大性质。相反，在双层的配置(对照)或者当在中间层中没有未分化的亚单位的情况下构建三层的配置时，没有鉴定到任何这种分区组织。在双层的对照中，没有中间层；在三层的对照(即，无细胞的三层的)中，纯胶原凝胶构成中间层。
实施例8：钙含量的定量
为了评价在三层培养期间在软骨形成分化培养基中是否维持成骨表型，用1％三氯乙酸提取来自微球的成骨层的钙沉积24小时，并用钙测定试剂盒(Bioassay Systems,Hayward, CA, Cat#:DICA-500)定量。简而言之，在使用前将相同体积的试剂A与试剂B组合并平衡至室温。通过在蒸馏水中系列稀释而制备Ca2+的标准溶液(12.5 - 200 μg/mL)。将5μL标准品或样品的等份转移到底部透明的96孔板的孔中，加入200μL工作试剂。在测定在612nm的吸光度之前在室温孵育混合物3分钟。通过针对标准曲线的线性区域校准而测定样品中存在的Ca2+的量。如图3C中所示，骨样功能性亚单位中的钙沉积是天然的软骨中的钙沉积的十分之一。随着共培养的时间增加，共培养物中的钙沉积继续增加，表明共培养条件维持并进一步支持成骨表型。
实施例9：骨软骨构建体和天然的骨软骨插头(plug)的SEM和EDX分析
为了检查三层够简体的显微结构，处理样品用于扫描电子显微(SEM)分析。用磷酸盐缓冲的盐水漂洗样品，并在4℃在2.5％戊二醛中固定2h。通过梯度系列的乙醇脱水后，临界点干燥三层的构建体并断裂以暴露它们的横截面。在检查之前用碳树脂将样品安装到固定器上并用金-钯溅射包被。然后用结合能量散射的X-射线(EDX)光谱测定法的SEM (LEO1530; LEO Electron Microscopy, Cambridge, UK)检查样品用于显微结构分析(数据未显示)并用于检测样品中钙、磷以及它们的相对分布。测定这些钙和磷的量，计算钙与磷的摩尔比(表1)。钙与磷酸盐含量和它们的摩尔比提示，接头处的钙含量是高的，而在未钙化的软骨形成或软骨层中的含量是微不足道的。这再次验证了骨软骨移植物的分区组织。而且，在不同层的纤维结构的纤维形态与其它组织学和生化评价也是一致的，因为可以发现许多基质物质包括GAG沉积在软骨层中的胶原纤维网络上，而在骨层中的胶原纤维周围可以发现许多钙磷酸盐颗粒或沉积。最重要的是，在钙化的软骨接头中不能鉴定到许多良好对齐的胶原束或纤维，这已经由垂直排列的胶原纤维所表征。
实施例10：SEM图像预处理和通过Radon转换分析胶原纤维对齐
在进一步分析前使用MATLAB®软件来校正非均匀照明(non-uniformillumination)并增加SEM图像的对比度。简而言之，首先将灰度SEM图像转化为二进制图像。然后在Radon转换前对二进制图像进行骨架化(Skeletonization)。在MATLAB中，可以将图像视为强度的矩阵。Radon转换是以特定角度θ的方向沿辐射线的图像强度的投影。通过使用Radon转换，将θ指定为0-179度，产生180的值代表对于180角度的每一个在该特定角度的方向为直线的大小的数值。然后产生每个角度的强度图(intensity plot)使得可以发现纤维的方向。
显示是否有优选的对齐的峰的变异如下面的表2中所示。
表2：骨软骨移植物的不同层中具有中间值以上强度的所有或前50%的峰的95%置信区间的平均差异
结果表明，在接头区域中的峰角度变化很小，提示了纤维或束的优选角度。这进一步验证了扫描型电子显微图。
实施例11：rMSC的BrdU标记
为了追踪接头形成过程中的未分化的MSC，在将其与预先分化层结合之前，用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记中间的未分化的rMSC-胶原凝胶层。然后，在分析前，将三层的构建体培养14天。三层的培养完成后，固定构建体并进行BrdU免疫组织化学以追踪是否从未分化的rMSC分化接头细胞。简而言之，将切片用2N HCl在37℃孵育30分钟用于抗原恢复。然后用四硼酸钠溶液将它们中和10分钟。在用在PBS中1:1000稀释的小鼠抗- BrdU单克隆抗体(克隆BMC 9318; Roche)在4℃孵育过夜后，将切片用在PBS中1:800稀释的抗-小鼠二级抗体在室温孵育30分钟。根据供应商的说明书，在两种情况下都使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories) 和DAB底物系统(Dako)用于显色。还通过将BrdU标记的MSC与正常培养基孵育1、7和21天或者与软骨形成培养基孵育21天而研究BrdU标记是否与分化过程相互作用。
BrdU标记的未分化的MSC定位在接头区域处，提示中间层中存在的未分化的MSC至少贡献了接头处的肥大软骨细胞的形成。
实施例12：从骨样功能性亚单位中MSC的成骨分化后代分泌BMP2
使用小鼠MSC和胶原，如实施例5中所述制备不同大小的成骨功能性亚单位。制备从2.5，10，50和150μL液滴制备的构建体并在成骨分化培养基中培养21天。在这3周期间，从这些功能性亚单位收集条件培养基并通过ELISA分析骨形态发生蛋白2(BMP2)。针对校准曲线测定收集的培养基中BMP2的量。从不同大小的的骨样功能性亚单位的BMP2分泌随时间的增加在图4中显示。结果表明，随着培养时间增加，BMP2分泌增加，这提示，成骨亚单位中存在的MSC的成骨分化的后代连续地合成并分泌BMP2。由于BMP2能够刺激软骨细胞肥大，可能从成骨的功能性亚单位(底层)分泌的因子，包括BMP2，诱导中间层的未分化的MSC向钙化的软骨表型分化。
实施例13：通过功能性亚单位的层的骨软骨修复
在这些实验中，使用骨骼成熟的新西兰白兔(>5个月大)。将来自相同的兔的双边膝关节随机分为实验侧和对照侧。全身麻醉后，在双侧膝关节上进行内侧髌旁切口。继续切开，直到暴露内侧股骨髁。使用无菌冲头在内侧股骨髁产生直径为4 mm并且深度为4 mm的全厚骨软骨缺陷。在手术过程中，将如上所述制备的成骨和软骨形成的功能性亚单位放在旁边。植入多个成骨的功能性亚单位以压配(press-fit)缺陷，顶端留下一薄层。然后将多个软骨形成功能性亚单位置于成骨层上，再次压配缺陷。使用抹刀压配缺陷。通过在光化学交联的胶原膜下用一层胶原凝胶保护并通过缝合固定而将植入的构建体定位在缺陷中。在对照侧，缺陷是空的。在层中进行伤口愈合。手术后，允许兔自由移动。植入后一个月，检查并记录缺陷的大体外观。采集全厚骨软骨活检用于固定并脱钙，然后组织学、组织化学和免疫组织化学分析。
发现软骨区域和具有分隔软骨和软骨下骨层的波浪潮标记的钙化的软骨接头的层的优异的分区组织。相反，自然康复(上面讨论的对照)和用未分化的或幼稚的(naïve)亚单位修复的缺陷仍然表现出在该时间点完全没有分区组织的大量纤维组织。
实施例14：通过体外再生的具有适当的分区组织的三层的骨软骨构建体的骨软骨修复
在这些实验中，如实施例14中所述在骨骼成熟的新西兰白兔(>5个月大)中产生全厚骨软骨缺陷。如在实施例1和2中分离并培养rMSC。使用自体细胞并使用实施例3-5和7中所述的步骤制备具有完整的钙化的接头和因此适当的分区组织的三层的骨软骨构建体并注入以压配缺陷。将胶原凝胶的等份应用于构建体表面，使用光化学交联的胶原膜以用单一的缝合线保护植入物。对照侧的处理、其它的程序、样品收获的时间和制备方法都是和实施例14中所述的相同的。
发现软骨区域和具有分隔软骨和软骨下骨结构的波浪潮标记的钙化的软骨接头的层的优异的分区组织。相反，自然康复(上面讨论的对照)仍然表现出在该时间点完全没有分区组织的大量纤维组织。
实施例15：在基于压缩的生物反应器中共培养骨软骨移植物
如在实施例1和2中分离并培养rMSC。如实施例3中所述制造70μL体积的幼稚的(naive)亚单位。如实施例4和5中所述分别制造具有圆柱形和100μL体积的软骨样和骨样功能性亚单位，持续21天。在21天结束时组合功能性亚单位和幼稚的(naïve)亚单位以形成具有异质的组织成分的复杂组织。使用生物反应器设置，用10％峰至峰替代，0.5 Hz，每天1小时，持续21天的方案而机械压缩这些结构，同时如实施例4中所述在软骨形成分化培养基中培养。然后处理复杂组织样结构，用于如实施例8中所述的组织学、组织化学和免疫组织化学评价。样品的组织学评价显示，接头区域对于作为软骨的标记的GAG、II型胶原是阳性的，对于作为钙化的标记的von kossa染色也是阳性的。对于基于压缩的生物反应器共培养的所有构建体，接头是完整的，整个构建体是稳定并且可操纵的。另一方面，没有暴露于基于压缩的生物反应器共培养的一些构建体不能保持完整性，不同层散开。在共培养期间存活的完整构建体进行拉伸强度测试后，具有软骨形成共培养培养基的那些中的接头强度比正常培养基中的那些高得多，而在负载期间过程中具有压缩的那些中，接头强度也比尤其在正常培养基和以后的时间点没有压缩的那些更高(图5)。
实施例16：使用基于扭力的生物反应器控制细胞对齐(cell alignment)
如在实施例1和2中分离并培养rMSC。齿轮样聚碳酸酯杆上如实施例5中所述制造1000 μl的骨样亚单位，持续21天。使用定制的容器(其由插在大外筒的中央的更小的内筒组成)如实施例5中所述在两个骨样亚单位之间制造3000 μl的中空管或薄层亚单位。通过在外筒和内筒之间的腔中填充细胞-基质混合物而形成薄层状亚单位。去除外筒后，将由两个骨样亚单位和薄层亚单位组成的复杂组织安装至生物反应器并用在0.5Hz的15度和每天2小时持续14天的方案负载扭力，同时在使用生物反应器设置正常培养基中培养。通过简单地将结构钳在生物反应器上而使对照结构暴露于静态负荷。使用生物反应器使结构在正常培养基中培养相同的时间期间。然后处理复杂组织结构，用于如实施例8中所述的组织学评价。使用基于MATLAB的图像分析软件来评价构建体中的细胞对齐。结果显示，在环状扭力负载下的那些中，细胞方向为约45°的优选角度，而在静态负载下的那些为约100°(沿生物反应器的长轴)(表3)。可以使用多个薄层来产生在不同优选角度的细胞对齐，这种结构对于组织如椎间盘的纤维环是重要的。
表3. 在静态负荷和环状扭力负荷下的细胞对齐
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语和本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。本文引用的出版物和它们被引用的材料特定地通过引用而加入。
仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认可或者能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同内容。下列权利要求旨在涵盖这些等同内容。

Claims (22)

1.制备生物工程化的组织移植物的方法，包括
组合两个或更多个功能性亚单位，所述功能性亚单位被未分化的封装的多能的或专能的细胞分隔，其中所述两个或更多个功能性亚单位每一个包含封装的多能的或专能的细胞，其中所述两个或更多个功能性亚单位包含的封装的多能的或专能的细胞被诱导分化为不同细胞类型；以及
培养组合的功能性亚单位以形成模拟复杂组织的结构和功能特征的生物工程化的组织移植物。
2.权利要求1的方法，其中所述多能的或专能的细胞选自诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、脐带血干细胞和脂肪组织衍生的干细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述多能的或专能的细胞是骨髓衍生的干细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述功能性亚单位包括细胞外基质生物材料。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞外基质生物材料包括胶原。
6.权利要求1的方法，其中所述功能性亚单位具有选自微球、立方体、环和微棒的结构。
7.权利要求1的方法，其中使用选自化学诱导、遗传操作和重构生物和机械的微环境的方法将所述细胞诱导分化。
8.权利要求1的方法，其中所述复杂组织选自骨软骨组织、椎间盘、脊柱运动节段、韧带骨组织、具有包含有血供的网络的心脏肌肉的心脏条带、具有能够延长和增厚的骨组织的软骨的高度组织的分层的生长板和具有完全血供的肝细胞的肝脏补丁。
9.权利要求1的方法，其中在条件培养基、细胞因子、血清及其组合存在的情况下培养所述组合的功能性亚单位。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞因子是生长因子。
11.权利要求7的方法，其中所述化学诱导条件选自抗氧化剂、酸、碱、氧张力及其组合。
12.权利要求1的方法，其中在选自扭力、压缩、张力及其组合的力存在的情况下培养所述组合的功能性亚单位。
13.权利要求1的方法，其中所述复杂组织是包括骨块、软骨终板、髓核和纤维环结构的脊柱运动节段。
14.权利要求1的方法，进一步包括通过将所述生物工程化的组织移植物暴露于合适的生物、化学和物理的共培养条件而微调所述生物工程化的组织移植物的结构和功能特性。
15.权利要求1的方法产生的所述生物工程化的组织移植物在制备用于通过包括以下步骤的方法修复受试者中组织损伤的药物中的用途：
在受试者中组织损伤的部位施用权利要求1的方法产生的所述生物工程化的组织移植物。
16.权利要求1的方法产生的生物工程化的组织移植物。
17.在生物工程化的组织构建体中产生钙化的区域接头的方法，包括
在体外培养包含第一、第二和第三层的构建体以诱导产生所述第一和第三层之间的钙化区域；
其中所述第一层包含微囊化的多能的或专能的细胞，所述微囊化的多能的或专能的细胞被处理以诱导成骨分化；
其中所述第二层与所述第一层相邻，分隔所述第一和第三层，并包含未分化的微囊化的多能的或专能的细胞；
其中所述第三层与所述第二层相邻并包含微囊化的多能的或专能的细胞，所述微囊化的多能的或专能的细胞被处理以诱导软骨形成分化。
18.生物工程化的组织构建体，其包含第一、第二和第三层；
其中所述第一层包含微囊化的多能的或专能的细胞，所述微囊化的多能的或专能的细胞被处理以诱导成骨分化；
其中所述第二层与第一层相邻，分隔所述第一和第三层，并包含未分化的微囊化的多能的或专能的细胞；
其中所述第三层与所述第二层相邻并包含微囊化的多能的或专能的细胞，所述微囊化的多能的或专能的细胞被处理以诱导软骨形成分化。
19.权利要求18的生物工程化的构建体，其中所述构建体在所述第一和第三层之间包含钙化的区域接头。
20.权利要求18的生物工程化的组织构建体在制备用于通过包括以下步骤的方法在受试者中治疗骨软骨损伤的药物中的用途：在骨软骨损伤的部位将权利要求18的生物工程化的组织构建体施用于受试者。
21.产生复杂组织构建体的方法，包括
在诱导复杂组织构建体的形成的条件下培养被诱导分化的两层封装的干细胞，所述被诱导分化的两层封装的干细胞通过一层未分化的封装的干细胞连接在一起。
22.产生生物工程化的脊柱运动节段的方法，包括
诱导微囊化的多能的或专能的干细胞以形成成骨亚单位；
将成骨亚单位与微囊化的多能的或专能的干细胞被诱导形成的软骨形成的亚单位组合，其中所述成骨亚单位和软骨形成的亚单位的组合形成包含终板的骨块；以及
用包含终板的骨块将具有封装髓核的纤维环的椎间盘夹在中间以形成脊柱运动节段。
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