CN109152864A - 一种用于制备三维软骨类器官块的方法 - Google Patents

一种用于制备三维软骨类器官块的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供通过将间充质干细胞分化成三维球状软骨组织，三维软骨球状块的基本单位，而制备的三维软骨类器官块。发明人发现，GAG基质的量和胶原蛋白2型的表达均增加。因此，本发明的方法通过根据二维培养物有效地增强软骨分化构建体的功能来提供临床上可应用的软骨组织。所述三维软骨类器官块可以有用地应用于诸如，需要软骨组织恢复的关节软骨再生和整形手术的领域。

Description

一种用于制备三维软骨类器官块的方法
技术领域
本发明涉及制备人造组织。本发明直接涉及体外制备人造软骨组织的方法。
背景技术
老龄化以及社交和体育活动的增加导致患有软骨损伤的患者数量增加，因此开发恢复受损软骨的医学技术的需求也在增加。然而，由于软骨组织没有血管并且软骨细胞的运动性受到细胞外基质(ECM)的限制，所以难以轻松地使受损的软骨再生。
在目前治疗受损软骨的方法中，人造关节置换具有缓解疼痛的优点，并且在成功完成手术时能使患者自然地行走。由于与人造关节置换相关的技术近来得到了很大的改进，人造关节置换手术被用于治疗严重损伤的软骨。此外，微创人工关节置换手术有助于人工关节的寿命延长并从手术中快速恢复。然而，人造关节手术在各个方面仍然是患者的负担。人造关节的磨损限制了人造关节的寿命，并且耐用性取决于管理和手术的结果。进一步地，如果手术过程中存在细菌感染，则需要再次手术。进一步地，在骨切割手术期间存在副作用或并发症的风险。因此，对使用细胞(employee cells)的再生医疗解决方案的需求不断提高。在这方面，已经开发了使用从患者自身获得的细胞进行自体软骨细胞植入(aci)、异体软骨细胞植入以及通过将自体和/或异种干细胞分化为软骨细胞来开发治疗剂的研究。
自体和/或异体软骨细胞植入具有由软骨细胞培养引起的去分化问题，因此无法获得用于有效治疗的足够数量的细胞。使用间充质干细胞的治疗具有提供足够数量的细胞的优点。尽管目前还没有完善的软骨分化方法，但近来已经开发了大量技术。应当开发诸如软骨细胞生存力增强、表型维持和机械强度保持等技术，以使得使用细胞的治疗方法成功。迄今为止，已经引入了各种方法以克服上述问题(韩国专利登记No.10-1367221)，例如通过使用三维支撑物(诸如，水凝胶)来增强细胞粘附率，通过控制周围微环境来维持更多天然软骨组织，保持对外部压力的弹性。然而，诸如细胞和生物材料之间的相互作用、生物相容性以及尤其是与邻近软骨的结合等问题尚未解决。
近来，在不使用支持物的情况下，细胞被制备成高密度三维小球。这种球状体成形方法具有制备工艺简单和容易重复的优点。尽管开发了使用96孔的细胞群培养技术，其在每个单孔中包含一个球状体，但是很难在结构上形成球状体彼此融合处的一个组织。用诸如水凝胶的生物材料制备软骨组织是不可能的，因此难以用常规技术制备治疗剂。KR专利No.10-1109668公开了使用介孔PLGA-二氧化硅支架，从脂肪干细胞分化的骨用于组织工程，KR专利No.10-0839875公开了关于用于关节软骨再生的支架的发明，其中，支架是通过将细胞接种到包含可生物降解聚合物和磷酸钙生物相容性陶瓷的介孔支架中而制备。
发明内容
发明人已经研究了用于制备三维软骨类器官块的新方法以解决上述问题。结果，我们首先发现，在相互接触的三维球状软骨组织分化为软骨的情况下，组织彼此连接以提供大的三维软骨类器官块。其次，当通过将三维球状软骨组织(间充质干细胞构建体或在间充质干细胞向软骨细胞分化的中间步骤中的构建体)加载在二维高密度软骨分化细胞层(间充质干细胞或由间充质干细胞分化的软骨细胞的中间状态的细胞层)的中心部分上，来持续诱导软骨分化时，我们发现二维高密度软骨分化细胞层自组装以环绕三维球状软骨组织，从而形成结构致密的三维软骨类器官块。
就此而言，本发明提供了一种制备三维软骨类器官块的方法，其通过融合和连接三维球状软骨组织本身，或通过在三维球状软骨组织存在下诱导二维软骨分化细胞层的自组装，所述三维球状软骨组织通过间充质干细胞分化成三维球体状态软骨组织而制备，其中通过在二维平板上将间充质干细胞分化成高密度软骨组织来制备二维软骨细胞层。
另外，本发明的目的是将三维软骨类器官块用于需要软骨修复的任何区域或领域。
本发明的目的是提供一种制备三维软骨类器官块的方法，其包括以下步骤：
(a)通过间充质干细胞的三维培养使所述间充质干细胞分化成三维球状软骨组织；(b)通过间充质干细胞的二维培养使所述间充质干细胞分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在所述二维软骨分化细胞层上孵育所述三维球状软骨组织以诱导自组装。
间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带(cord)、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜、软骨膜、扁桃体、皮肤、毛囊、外周血、肌肉、肝脏、神经元组织、胎膜、羊膜、半月板或前十字韧带的细胞。
本发明的方法进一步包括通过融合和培养三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体的步骤。
三维球状体融合构建体可以通过自然融合、使用生物相容性胶融合或使用缝合纤维融合来制备。可以使用含有三维球状体的生物相容性聚合物支架，通过融合和培养不同的三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体。
与常规软骨分化方法相比，本发明提供了用于制备三维软骨类器官的结构大且致密且功能上有效的三维软骨组织。进一步地，可以通过被认为是小功能单元的三维球状软骨组织的自组装的融合来制备更多类人软骨组织。进一步地，本发明结合了常规软骨分化方法的有利特点。具体地，高密度的二维软骨分化的细胞层通过自组装与板分离，并因此包含细胞自身ECM，引起三维球状体软骨组织之间的间隙的有效填充和提高其生物相容性。进一步地，由于三维球状软骨组织在结构上是致密的，所以其起到支柱作用以增强强度。在这点上，本发明使得制备治疗剂成为可能，所述治疗剂在植入到患者的软骨损伤的部分或附加软骨是必要的身体的部分时，增强了强度并增加了生物相容性。
附图说明
图1示出3种干细胞阳性标志物[CD44(+)，CD105(+)，CD29(+)]和2种阴性标志物[CD34(-)，CD45(-)]的FACS分析结果，以评估间充质干细胞的干性；
图2示出ECM标志物(col2，聚集蛋白聚糖)表达的qRT-PCR分析结果。在二维培养条件下将间充质干细胞分化成软骨细胞，并使用阿尔新蓝染色定量分析软骨分化标志物GAG的表达；
图3示出制备三维软骨类器官的整个过程，其中三维球状软骨组织由脂肪来源的间充质干细胞产生；
图4分别是用于评估三维球状体融合构建体和三维软骨类器官的软骨分化能力的阿尔新蓝免疫染色(A)和II型胶原(B)的qRT-PCR的结果
具体实施方式
本发明涉及一种用于制备三维软骨类器官块的方法，其特征在于：(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在二维软骨分化细胞层上孵育三维球状软骨组织以诱导自组装。
在本发明中，术语“二维细胞培养”是指细胞在平板上以一层培养，而术语“三维培养”是指细胞与其他相邻细胞在三维上培养。所述间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜或软骨膜的细胞。
在本发明中，术语“软骨细胞”是指通过包括人的动物的干细胞的分化而获得的软骨细胞，并且进一步包括从软骨组织培养的软骨细胞。所述干细胞优选指成人间充质干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和未分化祖细胞等。所述软骨细胞优选指获自人软骨组织的在体外的软骨细胞，和更优选提及从人正常软骨玻璃化(vitrification)获得的在体外的软骨细胞。
除步骤(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在二维软骨分化细胞层上孵育三维球状软骨组织以诱导自组装之外，本发明可进一步包括通过融合和培养三维软骨组织来制备融合构建体的步骤。
此外，所述三维球状体融合构建体可以通过自然融合，通过使用生物相容性胶或缝合纤维进行融合来制备，或者可以通过使用含有三维球状体的生物相容性聚合物支架，融合和培养不同的三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体。
在本发明中，提供了一种制备软骨组织类器官的方法，其中软骨组织通过自组装来制备，而不使用支架。尽管本发明的三维软骨类器官块基本上优选不使用支架的方法，但并不排除使用适当的生物相容性支架。通过使用作为基本单元的三维球状软骨组织来制备三维球体融合构建体的方法包括以下方法：(i)三维球体软骨组织自身的自然融合，(ii)在组织上施用生物相容性胶后连接三维球状软骨组织，(iii)使用生物相容性聚合物支架和三维软骨组织，(iv)用缝合线制造框架，然后将三维球状软骨组织连接至框架上，以及(v)通过用缝合线穿过三维球状软骨组织制备自由形成的构建体(融合构建体)。
上述方法(i)利用如果三维球状软骨组织彼此接触的自然事件，随后ECM从软骨组织向外分泌，并且分泌的ECM彼此连接，从而各个软骨组织无需人工操作而形成构建体(融合构建体)。
对于上述方法(ii)，医用生物相容性胶模仿ECM的特征，并具有快速附着各个三维球状软骨组织的优点。天然胶包括纤维蛋白胶、明胶、海藻酸盐胶和透明质酸胶、以及合成聚合物胶。
根据上述方法(iii)，三维球状体融合构建体可以通过使用可包含三维球状软骨组织的生物相容性聚合物来制造。该方法对增强三维融合构建体的强度有特殊的效果。
根据上述方法(iv)，使用医用缝合线制备具有特定形式的框架，然后将三维球状软骨组织装载框架上以在上面提供三维球状体融合构建体。该框架可以是网型，线性阵列型或螺旋型，但不限于这些类型。该方法对于制造具有特定形式的三维球状体融合构建体是有效的。
根据方法(v)，可以通过用医疗缝合线穿透三维球体来制造各种形式的三维球状体融合构建体。该方法提供了各种形式的软骨块构建体，因此三维球状体融合构建体的应用价值有利地增加。
由于制备方法简单，本发明的三维软骨类器官块可以容易地由任何人制备。阿尔新蓝染色的结果表示GAG基质的量增加和胶原蛋白2(正常软骨细胞的指示物)的表达增加，其支持正常软骨组织良好地形成。
以下实例提供说明性的实施方案。根据本发明的公开和本领域的普通技术水平，本领域技术人员将理解，以下实施例仅旨在示例性的，并且可以采用许多改变、修饰和变更而不脱离本发明的权利要求的范围。
实施例1、人类间充质干细胞的分离、孵育和干性的评估
将脂肪组织随机地切成小块，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma，St.Louis，MO)将获得的碎片洗涤三次。然后，将小块的脂肪组织放入50ml锥形管中。向管中加入PBS并搅拌，然后离心。弃去液体，加入杜伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)至体积为50ml，然后使混合物在37℃下反应90分钟。在2,000rpm离心10分钟后，除去悬浮在上层中的未溶解的脂肪组织。然后，重复用DMEM洗涤，离心和去除。将分离的脂肪来源的干细胞与无血清干细胞培养基(化学成分确定的培养基)在37℃，5％CO2培养箱中孵育并增殖。包含10％FBS的DMEM可用于增殖。通过流式细胞荧光分选(FACS)检测干细胞阳性抗原标志物CD44、CD105和CD29s以及干细胞阴性抗原标志物CD34和CD45，分析增殖的间充质干细胞。
实施例2、间充质干细胞向软骨分化的评估
将获得的干细胞以1x10 4个细胞/cm 2接种并在37℃下在5％CO 2培养箱中培养，而细胞每2天用软骨分化培养基处理，以便将间充质干细胞分化成软骨细胞。软骨分化培养基包含50μg/ml抗坏血酸2-磷酸盐、100nM地塞米松、1％ITS和10ng/ml TGF-β1。通过用10％甲醛处理二维软骨板中的细胞30分钟来固定GAG基质形成水平，然后将细胞用3％乙酸溶液处理3分钟，接着用500μl阿尔新蓝溶液(pH 2.5)染色30分钟。染色的样品用蒸馏水洗涤几次并用显微镜检测。为了获得定量的GAG值，将阿尔新蓝染色的板用3％乙酸处理10分钟，并且收集100μl的溶液以确定OD值。该分析结果得到图2A、B的支持。
实施例3、使用实时PCR的软骨刺激
为了分析未分化干细胞和软骨分化细胞之间的基因修饰，软骨分化基因的表达被评估。为此目的，使用ColⅡ和聚集蛋白聚糖作为与软骨细胞有关的基因标志物，并且使用GAPDH作为管家基因。实时PCR如下进行。也就是说，将从各组获得的细胞用PBS洗涤，然后用胰蛋白酶-EDTA收集它们，并用TRIzol(Life Technologies，Inc.Grand Island，NY)方法提取RNA。提取的RNA 1μg用于制备cDNA，并研究基因表达的变化。引物组和相应的分化标志物如下表1所示。
表1
*NCBI登录号
上述实时PCR的结果显示在图2C中。软骨分化后，与未分化组相比，软骨分化指示标志物II型胶原蛋白和聚蛋白多糖复合物显著升高至更高水平。
实施例4、三维软骨类器官制备
对于三维软骨细胞分化，将2×10个间充质细胞放入15ml聚丙烯管中并以1,000rpm离心10分钟。此后，将细胞在具有软骨分化培养基的5％CO2培养箱中于37℃孵育24小时以产生三维球状软骨组织。进一步地，诱导彼此接触的三维球体组织的天然融合。培养24小时后，将三维球状软骨组织彼此连接以产生三维球状体融合构建体。将获得的三维球状体融合构建体装载在细胞分化的二维软骨分化细胞层上。然后，软骨分化持续3周以诱导自组装，而二维软骨分化细胞层围绕三维球状体融合构建体，由此制备三维软骨类器官块。进一步地，这种三维类器官块可以自发诱导，同时连接不同的三维球状体融合构建体。为了评估三维软骨类器官块的组织学特征，在制备并切片石蜡组织块后分析GAG基质形成水平。将间充质细胞分化为二维软骨细胞层的方法和用于从三维球状体制备三维软骨组织的分化方法和条件是相同的。每2天更换一次新的软骨分化培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养。产生软骨的培养基包含50ug/ml抗坏血酸-2-磷酸，100nM地塞米松，1％ITS和10ng/mlTGF-β1。上述三维软骨类器官制备方法的进行如图3所示，并导致10mm×5mm×4mm(宽×长×高)软骨组织的制备。进一步地，三维软骨类器官块用阿尔辛蓝染色和胶原2型基因增强确认。
工业实用性
在这点上，本发明可以有效地应用于需要软骨修复的整形手术和组织工程，因为用于医疗的软骨组织是在体外制备。
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Claims (4)

1.一种用于制备三维软骨类器官块的方法，所述方法包括以下步骤，
(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；
(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和
(c)在所述二维软骨分化细胞层上孵育所述三维球状软骨组织以诱导自组装。
2.根据权利要求1所述的用于制备三维软骨类器官块的方法，其中，所述间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜、软骨膜、扁桃体、皮肤、毛囊、外周血、肌肉、肝脏、神经元组织、胎膜、羊膜、半月板或前十字韧带的细胞。
3.根据权利要求1所述的用于制备三维软骨类器官块的方法，其中，所述方法进一步包括通过融合和培养所述三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体的步骤。
4.根据权利要求3所述的用于制备三维软骨类器官块的方法，其中，通过自然融合、使用生物相容性胶融合或使用缝合纤维融合来制备所述融合构建体；或者使用含有三维球状体的生物相容性聚合物支架，通过融合和培养不同的三维球状软骨组织来制备所述融合构建体。
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