CN106061438A - 组织移植物及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

在一些实施方案中，本发明提供诸如血管化骨移植物的组织移植物和制备和使用这些组织移植物的方法。在一些实施方案中，使用多能干细胞来制备组织移植物，例如自体多能干细胞。在一些实施方案中，通过创造待替换或修复的组织部分(例如骨骼缺损)的数字模型、将模型划分为两个或更多个模型区段、然后生产具有与模型区段相对应的尺寸和形状的组织移植物区段来制成组织移植物。可将这些组织移植物区段组装以形成具有与待替换或修复的组织部分相对应的尺寸和形状的组织移植物。

Description

组织移植物及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年12月30日提交的美国临时专利申请No.61/921,915和2014年12月4日提交的美国临时专利申请No.62/087,614的优先权权益，其各自内容通过引用方式在此并入。
版权和援引并入
本专利文件公开的一部分包括属于版权保护的材料。版权所有人不反对任何人传真复制专利文件或专利公开，因为其在美国专利商标局专利文件或记录中出现，但是无论如何均保留所有版权。
发明背景
发明领域
由创伤、出生缺陷和疾病导致的骨缺损情况非常多，并且迅速增加，到2017年，美国市场每年骨修复和再生治疗合计预期达到35亿人。目前治疗骨骼缺损方法基于可植入材料的插入或者骨组织的移植。这些方法具有受限的适用性，携带感染和/或排异反应的风险，并且不能提供临床相关性结果。
尽管通过在生物反应器中合适培养条件下对接骨感受态细胞与生物材料来对功能骨替代品的离体培养采用仿生组织工程方法，但是使用目前的工程学方法来工程化大量骨骼重建的大和几何复杂的骨移植物仍然是个问题。尤其，由于移植物的大尺寸导致的流阻，使用常见的灌注生物反应器对大的骨移植物培养存在问题。新形成骨组织的发育逐渐限制介质灌注，并伴随着对灌注系统功能性和移植物生存能力的消极结果。因此，对新方法和新工具仍然存在需求，从而便于体外制备功能性骨组织和大的骨移植物。这些新方法和新工具也可以用于体外制备除了骨之外的其他类型的组织移植物。
发明概述
本发明的一些主要方面概述如下。本发明的另外方面描述在本专利申请文件的发明详述、实施例、附图和权利要求书部分中。本专利申请文件中各部分描述应当结合其他部分一起阅读。而且，在本专利申请文件中各部分描述的各实施方案可以各种不同方式结合，并且所有这些结合均旨在落入本发明的范围内。
在一些实施方案中，本发明提供可用于克服目前体外生成功能组织(例如骨)的方法相关的障碍的新型方法、组合物和设备。在一些实施方案中，通过本发明提供的方法利用特定组织部分(例如待构建、替换或修复的部分组织)的三维模型，从而制造用于生产这些组织移植物的定制组织培养支架、定制组织移植物和/或定制生物反应器。在一些这类实施方案中，设计和生产组织培养支架、组织移植物和/或生物反应器，使得它们具有与所需组织部分或其区段相对应的尺寸和形状。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过产生之后能够组装/连接以产生最终组织移植物的两个或更多个组织移植物区段来制备组织移植物。这些方法在本文中可称为区段添加组织工程(segmental additive tissueengineering)(SATE)方法。除了本文提供的各种不同方法之外，本发明也提供某些组合物和设备，包括定制组织移植物、定制组织培养支架、定制生物反应器移植室和定制生物反应器移植室插入物。在以下和本专利说明书中更加详细描述本发明的这些和其他方面。
在一些实施方案中，本发明提供用于制备组织移植物及其区段(组织移植物区段)的各种方法。
在一个这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：(a)获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，和(b)将三维模型划分为两个或更多个区段(模型区段)。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，其中已将该模型划分为两个或区段(模型区段)。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：制备或获得两个或更多个组织移植物区段。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：组装两个或更多个组织移植物区段。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：(a)制备或获得两个或更多个组织移植物区段，和(b)组装两个或更多个组织移植物区段以形成组织移植物。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备组织移植物的方法，包括：(a)获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，(b)将三维模型划分为两个或更多个模型区段，(c)制备两个或更多个组织移植物区段，其中每个组织移植物区段具有与步骤(b)模型区段之一相对应的尺寸和形状，以及(d)组装两个或更多个组织移植物区段以形成组织移植物。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如用于制备组织移植物，如上或本文其他处所述)，其中该方法包括：获得支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如用于制备组织移植物，如上或本文其他处所述)，其中该方法包括：获得支架前体，其中支架前体具有与待生产、替换或修复的组织部分(组织区段)或其三维模型相对应的尺寸和形状，以及划分(例如切断)支架前体以形成两个或更多个支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如联合上述或者本文其他处所述的方法之一使用)，其中该方法包括：(i)获得支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状，和(ii)将一个或多个细胞群体涂布至支架。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如联合上述或者本文其他处所述的方法之一使用)，其中该方法包括：(i)获得支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状，(ii)将一个或多个细胞群体涂布至支架，以及(iii)在支架上培养细胞以形成组织移植物区段。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如联合上述或者本文其他处所述的方法之一使用)，其中该方法包括：(i)获得支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状，(ii)将一个或多个细胞群体涂布至支架，(iii)获得包括移植室的培养容器，该移植室配置为容纳支架，(例如具有移植室或移植室插入物，该移植室或移植室插入物具有与支架相对应的内部尺寸和形状)，(iv)将支架插入培养容器的移植室内，以及(v)在培养容器内的支架上培养所述细胞以形成组织移植物区段。
在一些实施方案中，本发明提供制备组织移植物区段的方法(例如联合上述或者本文其他处所述的方法之一使用)，其中该方法包括：(i)获得支架，其中支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状，(ii)获得包括移植室的培养容器，该移植室配置为容纳支架，(例如具有移植室或移植室插入物，该移植室或移植室插入物具有与支架相对应的内部尺寸和形状)，(iii)将支架插入培养容器的移植室内，(iv)将一个或多个细胞群体涂布至移植室中的支架，以及(v)在培养容器内的支架上培养细胞以形成组织移植物区段。
在一些实施方案中，本发明提供制备可用于生产组织移植物或组织移植物区段的支架的各种方法。
在一个这类实施方案中，本发明提供制备支架前体的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，其中支架前体具有与组织部分或其三维模型相对应的尺寸和形状。
在一个这类实施方案中，本发明提供制备支架的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，其中支架具有与组织部分的区段或组织部分的三维模型的区段相对应的尺寸和形状。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备支架的方法，包括：(a)获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，和(b)将三维模型划分为两个或更多个区段(模型区段)。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备支架的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，其中已将模型划分为两个或更多个区段(模型区段)。
在一些实施方案中，本发明提供制备支架的方法，其中该方法包括：获得支架前体，其中支架前体具有与待生产、替换或修复的组织部分或其三维模型相对应的尺寸和形状，以及划分(例如切断)支架前体以形成两个或更多个支架，其中每个支架具有与待生产、替换或修复的组织部分的区段(组织区段)或其三维模型(模型区段)相对应的尺寸和形状。
在一些实施方案中，本发明提供适合用于制备本文所述的组织移植物和/或组织移植物区段的生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的各种方法。
在一个这类实施方案中，本发明提供制备生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的方法，包括：(a)获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，和(b)将三维模型划分为两个或更多个区段(模型区段)。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的方法，包括：获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，其中已将模型划分为两个或更多个区段(模型区段)。
在另一这类实施方案中，本发明提供制备生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的方法，包括：(a)获得待生产、替换或修复的组织部分的三维模型，(b)将三维模型划分为两个或更多个模型区段，(c)制备两个或更多个生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物，其中每个具有与步骤(b)的模型区段之一的尺寸和形状相对应的内部尺寸和形状。
除了上述方法之外，设想到在这些实施方案中多种变化形式，并且它们均在本发明的范围之内，其包括但不限于合并上述方法或方法步骤中任一种或多种或者改变上述任意方法步骤顺序的实施方案。
在一些实施方案中，本发明提供组织移植物及其区段(组织移植物区段)。例如，在一些实施方案中，本发明提供使用本文所述的任意方法制备的组织移植物和组织移植物区段。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物。在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物，其中组织移植物具有与待替换或修复的组织部分或其三维模型相对应的形状和尺寸。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物，其中每个组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度(即在其最厚点处)。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物，其中每个组织移植物区段包含由干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)分化的组织细胞。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物，其中每个组织移植物区段包含内皮细胞，例如由干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)分化的内皮细胞。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个组织移植物区段的血管化组织移植物，其中每个组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度(即在其最厚点处)。
在一个实施方案中，本发明提供包括两个或更多个骨移植物区段的血管化骨移植物，其中每个骨移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度(即在其最厚点处)且其中骨移植物包含来源于干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)的骨细胞和来源于干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)的内皮细胞。
除了上述的组织移植物之外，设想到这类组织移植物的多种变化形式，并且它们均在本发明的范围之内，其包括但不限于在本说明书中其他处描述的那些和合并在本申请中上述或其他处描述的元件任一种或多种的那些。
在一些实施方案中，本发明提供生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物。例如，在一些实施方案中，本发明提供使用本文所述的任意方法制备的生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物。
在一个实施方案中，本发明提供生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物，其中其内部具有与待替换或修复的组织部分、待替换或修复的组织部分的区段或其任意三维模型相对应的尺寸和形状。
在一个实施方案中，本发明提供生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物，其中设计其内部以容纳支架或具有与待替换或修复的组织部分的区段相对应的尺寸和形状的组织移植物区段。
在一个实施方案中，本发明提供生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物，其中设计其内部以容纳支架或组织移植物区段，其中每个组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度(即在其最厚点处)。
除了上述的生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物之外，设想到这类生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室插入物的多种变化形式，并且它们均在本发明的范围之内，其包括但不限于在本说明书中其他处描述的那些和合并在本申请中上述或其他处描述的元件任一种或多种的那些。
在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段为骨组织移植物或骨组织移植物区段。在一些实施方案中，组织移植物或组织移植物区段为软骨移植物或软骨移植物区段。
在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段包含哺乳动物细胞，例如来自非人灵长类、羊或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)的细胞。在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段包含人细胞。在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段包含来源于组织移植物待植入的相同受试者的一个或多个细胞群体(即自体细胞)。在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段包含来源于干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)的一个或多个细胞群体。
在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段经血管化。在以上实施方案的一些中，组织移植物或组织移植物区段包含内皮细胞，例如来源于干细胞或祖细胞(例如诱导型多能干细胞)的内皮细胞。
在以上实施方案的一些中，三维模型和/或模型区段为数字模型，例如提供组织部分或其区段的三维结构表示法的数字模型。
在以上实施方案的一些中，组织移植物区段具有约20毫米或更小、或者15毫米或更小、或者10毫米或更小的厚度，例如在它们最厚点处。例如，在以上实施方案的一些中，组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的厚度，例如在它们最厚点处。
在以上实施方案的一些中，培养容器为生物反应器，例如直接灌注生物反应器。在以上实施方案的一些中，在压力配合条件下将支架或组织移植物区段放置在生物反应器内。在以上实施方案的一些中，在直接灌注和/或压力配合条件下将组织移植物区段在生物反应器中培养。
在以上实施方案的一些中，使用计算机辅助制造、三维打印、浇注、铣削、激光切割、速成原型或其任意组合来生成或定制支架。
在以上实施方案的一些中，使用计算机辅助制造、三维打印、浇注、铣削、激光切割、速成原型或其任意组合来生成或定制生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物。
在以上实施方案的一些中，组织移植物包括使用生物相容性粘合剂、缝线、缝合线、缝钉、板、销钉、螺钉或其任意组合连接的两个或更多个组织移植物区段。
在一些实施方案中，通过本发明提供的方法、组合物和设备及由此制备的组织可用于各种应用中，包括用于治疗目的(例如修复病理或创伤组织缺损)、美容目的或者在用于研究疾病或开发治疗剂的模型系统。
附图简述
图1.(i)创建、分段骨骼缺损的数字模型(在此，分为三区段，标记A、B和C)，并将其用于制造定制生物材料支架和生物反应器；(ii)使用CAD软件创建的灌注生物反应器的顶部(A)和底部(B)的例子。
图2.在灌注生物反应器中，从hiPSC生成成骨和血管祖细胞，并将它们共同培养至定制骨诱导性支架上(在此，在三个支架上，标记A、B和C)。
图3.使用生物相容性骨胶来组装经工程化的血管化骨区段(在此，三个区段，标记A、B和C)和/或使用3D打印的钛销钉和孔来加固。可设计另外的研究以修复在大动物中临床相关的骨骼缺损。
图4A-4B.图4A：使用待修复骨缺损(深灰色)的数字重建的人股骨的三维数字模型。图4B：在图4A中所示骨缺损的数字模型划分为五个模型区段(深灰色)。模型区段可用于推动制造具有与每个模型区段相对应的尺寸和形状的生物材料细胞支架(浅灰色)。
图5A-5B.通过本发明提供的示例性细胞培养支架的透视图。图5A显示单个支架的放大图。根据如本文所述的一部分组织的数字图像能够设计和制造支架。图5B显示不同形状和尺寸的多个支架。多个支架能够用于例如制备如本文所述的大骨移植物的互补区段。
图6A-6B.通过本发明提供的示例性多室生物反应器的底部(图6A)和顶部(图6B)的透视图。图6A：底部包括用于组织区段的共同培养的多个移植室(a)。显示如所需的各种尺寸和形状的移植室，从而容纳支架和/或组织区段的尺寸和形状。也显示便于通过螺钉扣紧底部与顶部的孔(b)。图6B：顶部包括与在底部中移植室对齐的流体贮存器(c)、出口(d)和多个开口(e)，从而连接流体贮存器与在底部中移植室(图6A)。也显示便于通过螺钉扣紧顶部与底部的孔(b)。
发明详述
在一些实施方案中，本发明部分提供组织移植物(例如血管化骨移植物)和用于制备这些组织移植物的方法和设备，包括例如适于制备这些组织移植物使用的生物反应器设备。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于通过区段添加骨工程(segmental additivebone engineering)(SABE)和/或区段添加组织工程(SATE)来例如体外生成组织移植物，例如骨移植物。在一些实施方案中，通过本发明提供的方法利用部分组织和/或定制形状的组织培养支架和/或用于组织的区段体外生长的定制生物反应器的数字模型。在一些实施方案中，使用新型工程方法可定制支架和生物反应器的尺寸和形状以与所需组织移植物的尺寸和形状相对应，该新型工程方法包括但不限于医学图像、计算机辅助设计(CAD)和/或计算机辅助制造(CAM)方法。在一些实施方案中，使用能够形成所需组织的任何合适细胞可使功能组织生长，例如骨形成细胞(例如，用于制备骨移植物)或血管形成细胞(例如，用于制备血管化组织移植物)或者能够分化为所需组织形成细胞的任何细胞，例如祖细胞或多能细胞。在一些实施方案中，这些细胞可以为或者可以包括患者自身细胞(即自体细胞)或者来源于患者自身细胞的细胞，例如，诱导型多能干细胞。在一些实施方案中，在生物反应器中培养之后，可将多个组织区段组装和固定到一起(例如，以“类似乐高积木”方法)以形成组织移植物，例如与特定组织部分(例如需要替换或重建的组织部分)的规格和几何形状相对应的组织移植物。这些技术在本文中可称为区段添加组织工程(SATE)或者具体而言骨的情况下，称为区段添加骨工程(SABE)。
在一些实施方案中，通过本发明提供的组织移植物和方法可便于用于临床应用(例如用于修复或替换在受试者中组织缺损，例如骨缺损)的组织或组织替代品的可重复和/或大规模制造。如在本申请的实施例和其他部分所进一步描述，本发明的一些实施方案可用于制备功能血管化组织移植物，例如功能血管化骨移植物。大的几何限定的组织移植物(例如使用诸如诱导型多能干细胞的细胞)的生产是介于干细胞生物学和医学工程学交界之间的新颖的、新型方法，其可用于各种目的，包括但不限于临床应用、病理和药物筛选的建模。
本发明的一些主要实施方案在本申请的上述发明概述部分以及实施例、附图和权利要求书部分描述。本发明部分的详细描述提供与本发明的组合物和方法相关的另外的描述，并且其应当联合本专利申请的所有其他部分一起阅读，包括本申请的发明概述、实施例、附图和权利要求书部分。
缩写和定义
缩写“CAD”是指计算机辅助设计。
缩写“CAM”是指计算机辅助制造。
缩写“CNC”是指计算机数字控制。
如本文所使用，术语“细胞/支架”和“支架/细胞”以及“细胞/支架构建体”和“细胞/支架复合体”以及“支架/细胞构建体”和“支架/细胞复合体”可交换地用于表示已应用至细胞的支架。
如本文所使用，当与数值相关使用时，术语“约”和“大约”是指在指定数值的+或-20％之内。
在本专利说明书其他处提供另外的定义和缩写，并且它们均为本领域众所周知。
尺寸和形状变化
如本文所使用，在构思两个或更多个元件的尺寸和形状匹配处与本发明的任何方面相关使用时，术语“与……相对应”和“对应于”可表示在该部分描述的任何尺寸和形状变化。构思两个或更多个元件的尺寸和形状匹配处，在该部分中描述的这些变化可平等地适用于在本发明的所有方面。这些元件包括组织部分、组织模型、组织移植物、模型区段、组织区段、生物反应器、生物反应器室(例如生物反应器移植室)和插入物(例如生物反应器移植室插入物)、支架、支架前体、细胞/支架构建体以及如在本申请中描述的本发明的任何其他元件。
本部分中的示意性实施方案描述介于本发明的两个元件-第一元件和第二元件之间的尺寸和形状变化。然而，本发明构思任何所需数目的元件(例如三个、四个、五个或更多)均可具有如本文所述对应的尺寸和形状。设想到元件的多种组合，并且它们均在本发明的范围之内，其包括但不限于在本说明书中其他处描述的那些和合并在本申请中上述或其他处描述的元件任一种或多种的那些。在本部分中描述的变化均等地适用于在通过尺寸和形状可匹配元件处任何这类组合。
在其中第一元件具有与第二元件相对应的尺寸和形状的一些实施方案中，第一元件具有与第二元件相同或者约相同或几乎相同的尺寸和形状。在其中第一元件具有与第二元件相对应的尺寸和形状的一些实施方案中，第一元件具有与第二元件类似或互补的尺寸和形状。
在其中第一元件具有与第二元件的尺寸和形状相对应的尺寸和形状的一些实施方案中，第一元件的尺寸和形状变化为第二元件的尺寸和形状的正或负0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％。
例如，在一些实施方案中，本发明提供具有与特定组织部分(例如待构建、替换或修复的一部分组织)相对应的尺寸和形状的三维模型。在一些实施方案中，本发明提供具有与细胞支架、生物反应器、移植室、移植室插入物和/或组织区段相对应的尺寸和形状的三维模型区段。在一些实施方案中，本发明提供具有与组织部分模型、模型区段、生物反应器、移植室、移植室插入物、组织区段和/或组织移植物相对应的尺寸和形状的细胞支架或细胞支架前体。在一些实施方案中，本发明提供具有与组织部分模型、模型区段、支架、移植室、移植室插入物、组织区段和/或组织移植物相对应的尺寸和形状的生物反应器。在一些实施方案中，本发明提供具有与组织部分模型、模型区段、组织区段和/或组织移植物相对应的形状和尺寸的生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物。在一些实施方案中，本发明提供具有与模型区段、生物反应器、支架、移植室和/或移植室插入物相对应的尺寸和形状的组织区段。在一些实施方案中，本发明提供具有与特定组织部分和/或特定组织部分的三维模型相对应的尺寸和形状的组织移植物。
根据通过尺寸和形状待匹配的两个或更多个元件的期望功能也可测定尺寸和形状的可接受变化。在其中第一元件具有与第二元件的尺寸和形状相对应的尺寸和形状的一些实施方案中，第一和第二元件可具有任何合适的尺寸和形状，只要适合于使得一个或两个元件进行期望功能和/或具有期望性质。例如，在一些这类实施方案中，只要组织移植物能够适合于修复组织部分，则组织移植物具有与待修复的一部分组织相对应的尺寸和形状。在一些这类实施方案中，只要在压力配合条件下细胞支架配合至移植室或移植室插入物之内，则细胞支架具有与移植室或移植室插入物相对应的尺寸和形状。
此外，本领域普通技术人员将意识到，可测定尺寸和形状的其他可接受变化以及这些变化均旨在落入本发明的范围之内。
三维模型
在本发明的一些实施方案中，可生成和/或使用特定组织或组织部分的三维模型，从而例如用作生产组织移植物或组织移植物区段的模板，和/或用作生产在制造这些组织移植物或组织移植物区段中待使用的支架材料的模板，和/或用作生产能够用于生产组织移植物或组织移植物区段的生物反应器、生物反应器室或生物反应器室插入物的模板。参见例如，图4A-4B和图6。在一些实施方案中，这些三维模型为数字模型，例如代表目标组织部分的三维形状和尺寸的数字模型。例如，通过本领域已知任何合适的方法可生成三维模型或图像，例如身体内结构的数字模型或图像，该方法包括例如计算机断层扫描(CT)(包括小型CT，例如微型-CT)，其使用x-射线得到体内结构和器官的详细图片。在一些实施方案中，医学成像技术可用于生成期望组织部分的数字模型，例如包括缺损的组织部分，例如骨骼缺损，并且该数字模型然后可用于促进制造组织移植物和/或一个或多个组织移植物区段-例如通过使能生产定制设计用于制造期望组织移植物或组织移植物区段的支架材料和/或生物反应器。组织部分的模型优选解剖学上精确，它具有与身体组织部分和/或期望组织移植物相对应的规格、几何结构、尺寸和形状。在一些实施方案中，组织的该部分可包括缺损，例如创伤或病理缺损。在一些实施方案中，这些缺损可使用根据本发明制备的组织移植物来修复。使用任何合适的计算机辅助设计(CAD)软件可创建组织部分的数字模型，例如Autocad、Solidworks、ProE或Creo。在一些实施方案中，可编辑和分段/划分组织部分的数字模型为两个或更多个更小的子部分或区段(其可称为“模型区段”或“模型部分”)，例如代表根据本发明可制备的组织移植物区段和/或代表可用于制备这些组织移植物区段的支架材料或生物反应器室。可选择模型区段的厚度，使得可在生物反应器中有效地灌注具有相同厚度的组织移植物区段。因此，在一些实施方案中，模型区段和/或对应的组织移植物区段(例如骨移植物区段)具有约一厘米或更小的厚度或最大厚度。在一些实施方案中，模型区段和/或对应的组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米或约0.3毫米至约5毫米或者约0.3毫米至约1毫米的厚度或最大厚度。在一些实施方案中，模型区段和/或对应的组织移植物区段具有约0.3、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10毫米的厚度。
本文所述的模型(例如数字模型)可用于设计和制造定制生物反应器和/或定制支架，从而生长具有与互补模型相对应的尺寸和形状的身体组织移植物区段。在数字模型的情况下，可使用任何合适的文件格式创建模型或模型区段，或者将模型或模型区段转化为任何合适的文件格式，例如IGES或SLT格式，并且可使用任何合适的计算机辅助制造(CAM)软件创建模型或模型区段，或者导入合适的计算机辅助制造(CAM)软件内，例如SprutCAM。定制生物反应器和支架的制造进一步如本文所述。
可如本文所述生成、编辑和另外操作通过本发明提供的组织及其区段的数字模型。此外，本领域普通技术人员将理解，任何其他合适的方法可用于生成、编辑或另外操作如本文所述的组织或其区段的数字模型。
细胞支架
在一些实施方案中，本发明提供适合用于制备例如本文所述的组织移植物和/或组织移植物区段的支架。支架可由用于预期用途的具有合适孔径、孔隙率和/或机械性质的任何合适材料制成。这类合适的材料通常为无毒、生物相容性和/或生物可降解，并且能够被期望组织移植物类型的细胞浸润，例如在骨组织移植物情况下的骨形成细胞。这些材料的非限制性例子包括脱细胞组织(例如脱细胞骨)、包含诸如骨胶原、层粘连蛋白和/或纤维蛋白的一种或多种胞外基质(“ECM”)成分的材料以及天然或合成聚合物或复合物(例如陶瓷/聚合复合材料)。在一些实施方案中，支架材料可能够被细胞吸收(例如，可再吸收材料)，而在其他实施方案中，可使用非可再吸收支架材料。在一些实施方案中，支架可包括任意以上列出材料、由任意以上列出材料组成或者基本由任意以上列出材料组成或其任意组合。
在一些实施方案中，支架的规格和几何形状对应于三维模型的规格和几何形状，例如组织部分或组织区段的数字模型，和/或对应于如上述的组织移植物区段的期望组织移植物的规格和几何形状。在一些实施方案中，根据这类模型可设计或选择支架的规格和几何形状，从而便于在生物反应器内支架上培养细胞，例如，组织形成细胞或者如本文所述的其他细胞；如下进一步所述，例如从而产生具有与模型或模型区段相对应的尺寸和形状的组织移植物或组织移植物区段。在一些实施方案中，可设计支架以配合至合适尺寸和形状的生物反应器室内，从而使得在压力配合条件下可直接灌注支架和细胞至其中(例如在产生组织移植物和/或组织移植物区段的过程中)。图5A-5B显示如本文所提供的示意性支架。
在一些实施方案中，使用计算机辅助制造来生成或定制支架。例如，使用CAM软件可使用组织模型区段文件，从而使用本领域已知的任何合适方法或其组合来驱动制造几何限定的支架，例如，计算机控制的铣削方法、速成原型方法、激光切割方法、三维打印和/或浇注技术。在一些实施方案中，支架的制造包括使用速成原型、铣削机器、浇注技术、激光切割和/或三维打印或其任意组合。在一些实施方案中，支架的制造包括使用计算机数字控制，例如当制造包括激光切割或使用铣削机器时。例如，可将数字模型(例如使用如上所述的CAD软件生成的那些)处理以生成合适编码(例如“G-编码”)，从而驱动计算机数字控制(CNC)铣削机器(例如，Tormach，Bridgeport)和选择合适加工工具二进制数字和程序加工途径以切割支架材料为期望形状和尺寸(例如，与组织区段的数字模型的形状和尺寸相对应)。
尽管如本文所述可设计和制造通过本发明提供的支架，但是本领域普通技术人员将意识到，各种其他设计和制造方法可用于生成根据本发明的支架。
生物反应器
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的适合用于制备组织移植物和组织移植物区段的培养容器，例如生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器为灌注生物反应器，例如直接灌注生物反应器。用于组织工程应用的灌注生物反应器为通常包括多个元件的培养系统，该多个元件包括但不限于放置细胞/支架构建体的一个或多个室(本文称为“移植室”)、培养基贮存器、管道回路和使能物质输送营养物质和氧气的泵。根据培养基是否灌注在细胞/支架构建体周围或通过细胞/支架构建体，灌注生物反应器广义上可分为间接和直接系统。对于生物反应器的综述，参见Sladkova和de Peppo(2014)，“Bioreactorsystems for human bone tissue engineering，”Processes 2(2)494-525，其内容在此通过引用方式并入。
使用直接灌注生物反应器，将细胞/支架构建体以压力配合方式放置在合适的移植室中，从而迫使培养基递送通过细胞/支架构建体，而不是在细胞/支架构建体周围。已将直接灌注生物反应器用于使用不同的人骨感受态细胞和生物材料支架的组合的工程骨骼替代品。而且，在骨骼工程的情况下，研究表明：细胞/支架构建体的不同组合的直接灌注可支持细胞存活和增殖以及体外形成成熟骨样组织(对于综述，参见Sladkova和de Peppo(2014)，如上所引用)。
在一些实施方案中，本发明提供某些新型生物反应器，例如新型直接灌注生物反应器以及设计和制造这类新型生物反应器的方法。例如，在一些实施方案中，可将如上所述的组织部分或其区段的模型(例如数字模型)用于设计和制造在直接灌注条件下以压力配合方式可容纳一个或多个细胞/支架构建体的生物反应器。在一些这类实施方案中，组织区段的CAD文件可用于制造生物反应器或生物反应器的移植室或者用于生物反应器移植室的插入物，使得生物反应器移植室具有定制设计与本文待生产的组织移植物或组织移植物区段相适应的尺寸和几何形状，以及使得支架和/或组织移植物/移植物区段在压力配合配置中在生物反应器移植室内紧密配合。这些生物反应器或其移植室或其移植室插入物可由任何合适的材料制成。适合制造生物反应器或其插入物的材料是本领域已知的，并且可使用任何这类材料。例如，在一些实施方案中，生物反应器或其室或其插入物可由诸如不锈钢的惰性金属制成或者由生物相容性塑料或本领域已知的任何其他合适的材料制成。
在一些实施方案中，使用计算机辅助制来生成或定制生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物。例如，在一些这类实施方案中，可将组织区段文件导入CAM软件以使用本领域已知的任何合适的方法或其组合来驱动能够容纳几何定义的支架和/或组织移植物或组织移植物区段的生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的制造或定制。在一些这类实施方案中，生物反应器的制造或定制可包括使用速成原型方法、使用铣削机器、使用浇注技术、使用激光切割和/或使用三维打印。在一些实施方案中，例如当制造或定制工艺涉及激光切割或使用铣削机器时，生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的制造或定制可包括使用计算机数字控制方法。例如，在一些实施方案中，可将例如如上述使用CAD软件生成的数字模型加工生成合适的G-编码，从而驱动计算机数字控制(CNC)铣削机器(例如，Tormach，Bridgeport)和/或选择合适的加工工具二进制数字和/或程序加工途径以切割生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物材料为期望形状(例如，与组织区段的数字模型互补)。此外，数字绘图和模拟软件可用于最佳化生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物的设计以及用于驱动其受控的制造或定制。在一些实施方案中，可基干组织或组织区段的数字模型设计生物反应器、生物反应器移植室或生物反应器移植室插入物以便于在支架上培养细胞，例如组织形成细胞或如本文所述或本领域已知的其他细胞，从而产生具有与组织或组织区段的互补数字模型相对应的尺寸和形状的组织移植物或组织移植物区段。
在一些实施方案中，根据本发明的生物反应器可包括顶部元件和底部元件，其中例如通过螺钉或插销将顶部元件和底部元件固定在一起，从而形成包括但不限于移植室的一个或多个内室。在一个实施方案中，顶部元件包括培养基的贮存器、流体出口和一个或多个流体通道。在一个实施方案中，底部元件包括流体入口和一个或多个流体通道。
在一些实施方案中，本发明的生物反应器可包括设计或定制以容纳期望形状和尺寸的支架、组织移植物或组织移植物区段的移植室。在一个实施方案中，通过设计或定制自身的生物反应器，使得它包括具有期望形状和尺寸的移植室，可完成这点。在另一实施方案中，使用移植室插入物可完成这点，当将其放置在生物反应器内时，会产生具有期望形状和尺寸的移植室。在一个实施方案中，根据本发明的生物反应器包括具有约0.3毫米至约10毫米厚度的尺寸足以容纳支架、组织移植物或组织移植物区段的移植室。在一些实施方案中，使用移植室插入物可将支架和/或组织移植物区段定位于移植室，该移植室插入物在本文中也可称为“框架”。如上所述，如所期望，框架或移植室插入物可用于定制移植室的尺寸和形状和定位支架和/或组织移植物区段在移植室中，例如从而使得可在直接灌注、压力配合条件下培养组织移植物区段以最大化流体流动通过支架和/或组织移植物区段和最下化流体流动在支架和/或组织移植物区段周围。在一些实施方案中，移植室可具有一般形状或尺寸，但是如所期望，一种或多种框架或移植室插入物可用于定制移植室的尺寸和形状(例如，内部尺寸和形状)，从而容纳支架和/或组织移植物区段。框架或移植室插入物可由任何合适的材料制成。例如，在一些实施方案中，框架和/或移植室插入物可包括生物相容性、无毒、可塑性塑料(例如硅酮或类似硅酮的材料)、基本上由其组成或者由其组成。在一些这类实施方案中，框架和/或移植室插入物可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。可通过包括但不限于本文所述的方法的任何合适的方法设计和制造框架或移植室插入物。
在一些实施方案中，本发明的生物反应器可包括多于一个的移植室，从而便于共同培养多个组织移植物区段(参见图6A-6B)。例如，在一个实施方案中，可配置根据本发明的生物反应器以容纳如所期望的一个、两个、三个、四个、五个或更多组织移植物区段的培养。
在一些实施方案中，如本文所述，例如使用计算机辅助设计(CAD)和计算机辅助制造(CAM)方法可设计和制造如本发明所提供的生物反应器、生物反应器移植室和移植室框架或插入物。然而，本领域普通技术人员将意识到，根据本发明，各种其他方法可用于生成和定制生物反应器、生物反应器移植室和生物反应器移植室框架或插入物。
细胞
如本文所述，根据本发明，任何合适或期望类型的一种或多种细胞可用于制备组织移植物或组织移植物区段。典型地，选择的细胞能够形成期望组织移植物(例如，如本文进一步所述，用于适合于或能够形成骨和血管的血管化骨移植物、间充质祖细胞和内皮祖细胞或任何其他细胞类型)或者能够分化为期望组织形成细胞的任何细胞(例如，多能细胞)。可使用的细胞的非限制性例子包括多能细胞、干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、祖细胞、组织形成细胞或分化细胞。
使用的细胞可由任何合适来源获得。在一些实施方案中，细胞可以为人细胞。在一些实施方案中，细胞可以为哺乳动物细胞，包括但不限于来自非人灵长类、羊或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)的细胞。例如，细胞可由组织库、细胞库或人受试者获得。在一些实施方案中，细胞为自体细胞，例如由制备的组织移植物随后将植入的受试者中获得的细胞或者细胞可来源于这些自体细胞。在一些实施方案中，细胞可由“匹配”供体获得或者细胞可来源于由“匹配”供体获得的细胞。对于细胞和组织移植，通过本领域众所周知的方法可匹配供体和受体细胞。例如，人类白细胞抗原(HLA)分型广泛用于匹配组织或细胞供体与受体，从而减少移植排异反应的风险。HLA是在身体大部分细胞中发现的蛋白标志物，并且它用于通过免疫系统检测细胞属于身体和细胞不属于身体。因为受体识别移植物为外源性可能性更小，所以HLA匹配增加成功移植可能性。因此，在本发明的一些实施方案中，所使用的细胞为HLA-匹配细胞或来源于HLA-匹配细胞的细胞，例如由已与将接受组织移植物的受体受试者HLA匹配的供体受试者获得的细胞。在一些实施方案中，所使用的细胞可以为经修饰以避免被受体的免疫系统识别的细胞(例如万能细胞)。在一些这类实施方案中，细胞为遗传修饰的万能细胞。例如，在一些实施方案中，万能细胞可以为MHC万能细胞，例如主要组织相容性复合体(MHC)I类沉默细胞(参见例如Figueiredo C.等人，“MHC universal cellssurvive in an allogeneic environment after incompatible transplantation”Biomed Res Int 2013：：796046.Doi：10.1155/2013/796046)。人MHC蛋白被称为HLA，因为它们首先在白细胞中被发现。万能细胞具有用于任何受体的潜能，因此不再需要匹配细胞。
在一些实施方案中，用于制备本发明的组织移植物的细胞为或包括多能干细胞，例如诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些这类实施方案中，多能干细胞可由从将接受组织移植物的受体中获得的细胞(即自体细胞)中生成。在其他这类实施方案中，多能干细胞可由从不同个体-即不是将接受组织移植物的受试者中获得的细胞生成(即异体细胞)。在一些这类实施方案中，多能干细胞可由从不同个体-即不是将接受组织移植物的受试者中获得的细胞生成-但在此，不同个体为“匹配”供体-例如如上所述。在一些实施方案中，所使用的细胞为分化细胞，例如骨细胞。在一些实施方案中，分化细胞来源于多能干细胞，例如诱导型多能干细胞。在一些实施方案中，分化细胞通过分化的体细胞的转分化或通过诸如由体细胞生成的诱导型多能干细胞的多能细胞(例如多能干细胞或诱导型多能干细胞)的转分化得到。
多能干细胞是能够(a)自我更新和(b)分化以产生所有三个胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)细胞的细胞。术语“诱导型多能干细胞”涵盖多能干细胞，即类似于胚胎干细胞(ESC)，它能够培养很长一段时间但维持分化细胞为所有三个胚层的能力，但是不同于ES细胞(它来源于囊胚的内细胞团)，其源自体细胞，即具有更窄更确定潜能的细胞，并且在没有实验操作下，不能够得到所有三个胚层的细胞。iPSC通常具有类似hESC的形态，生长为具有大的核质比、确定边界和突出核的扁平菌落。此外，iPSC通常表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键多能标志物，其包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT和zfp42。此外，类似于其他多能干细胞，iPSC通常能够形成畸胎瘤。此外，它们通常能够在活有机体中形成或贡献外胚层、中胚层或内胚层组织。
示意性iPSC包括如通过Takahashi和Yamanaka(Cell 126(4)：663-76(2006)，其内容在此通过引用方式整体并入)所述的已将基因Oct-4、Sox-2、c-Myc和Klf转导入的细胞。其他示例性iPSC为已将OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转导入的细胞(Yu等人，Science 318：1917-1920(2007)，其内容在此通过引用方式整体并入)。本领域技术人员清楚，重编程因子的各种不同的混合物可用于产生iPSC，例如选自由OCT4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog和Lin28组成的组的因子。本文所述用于产生iPSC的方法仅为示意性，并不意图限制。并且可使用本领域已知的任何合适的方法或重编程因子的混合物。在使用重编程因子的实施方案中，可使用本领域已知的任何合适的方法来递送这些因子。例如，在一些实施方案中，可使用任何合适的载体，例如仙台病毒载体。在一些实施方案中，使用经修饰的RNA方法和体系可递送重编程因子。递送重编程因子的各种不同方法和体系均为本领域已知的，并且可使用任何这类方法或体系。
根据本发明可使用适合于培养细胞(例如多能干细)的任何培养基，并且多种这类培养基为本领域已知的。例如，用于培养多能干细胞的培养基可包括敲除DMEM、20％敲除血清替代物、非必需氨基酸、2.5％FBS、Glutamax、β-巯基乙醇、10ng/微升bFGF和抗生素。所采用的培养基也可为该培养基的变化形式，例如没有2.5％FBS或者具有更高或更低％的敲除血清替代物或者没有抗生素。所采用的培养基也可以为支持未分化条件下人多能干细胞生长的任何其他合适培养基，例如mTeSR(得自STEMCELL Technologies)或Nutristem(得自Stemgent)或ES培养基或者本领域已知的任何其他合适培养基。在本申请的实施例中提供了从受试者获得的细胞群体中生成/获得多能干细胞的其他示例性方法。
在一些实施方案中，使多能干细胞分化为期望细胞类型，例如骨形成细胞或血管形成细胞或任何其他期望细胞类型。使用例如成人干细胞、胚胎干细胞(ESC)、外胚层干细胞(EpiSC)和/或诱导型多能干细胞(iPSC；已经重编辑为多能状态的体细胞)，通过本领域已知的各种方法可得到通过本发明提供的分化细胞。例如通过使用各种分化因子，用于直接分化或自发分化多能干细胞的方法是本领域已知的。通过本领域已知的各种方法可监控多能干细胞的分化。在干细胞和经分化因子处理的细胞之间参数变化可表明，经处理的细胞已经分化。显微镜检查法可用于直接监控在分化过程中细胞的形态。
在每个本发明的实施方案中，任何合适或期望类型的细胞可用于产生本文所述的组织移植物和组织移植物区段，这些细胞包括但不限于多能干细胞或祖细胞或者分化细胞。在一些实施方案中，多能干细胞可以为诱导型多能干细胞。在使用诱导型多能干细胞的实施方案中，例如通过使这些分化的体细胞接触一种或多种重编程因子，这些细胞可由受试者获得的分化的体细胞中得到。在一些实施方案中，可将多能细胞朝向期望谱系诱导，例如间充质谱系或内皮谱系。在一些实施方案中，分化细胞可以为任何合适的分化细胞类型。在一些实施方案中，例如通过使这些多能细胞接触一种或多种分化因子，分化细胞可由多能干细胞(例如诱导型多能干细胞)得到。在一些实施方案中，例如通过使细胞接触一种或多种重编程因子，分化细胞可由另外的分化细胞类型转分化得到。在涉及分化细胞的本发明的各个实施方案中，这些分化细胞可以为任何期望分化细胞类型，这些细胞包括但不限于骨细胞和血管细胞。
细胞/支架构建体
可将任何合适或所需类型的细胞(例如本文所述的细胞类型)涂布到或接种到支架上，从而制备根据本发明的组织移植物或组织移植物区段。
在一些实施方案中，在涂布到支架之前，细胞可以为分化状态。例如，在一些实施方案中，可直接获得和使用分化细胞。类似地，在一些实施方案中，例如在培养皿或多孔板中或者在悬浮液中，根据本领域已知的任何合适方法可培养未分化细胞适合时间段或时间长度，例如直至达到理想水平细胞生长或分化或达到其他参数，然后可将分化细胞转移到支架，并且随后将细胞/支架构建体插入生物反应器内以便于组织移植物或组织移植物区段的发育。在一些实施方案中，可将未分化细胞(例如，干细胞(例如iPSC)或祖细胞)涂布到支架上。在这些实施方案中，在支架上培养同时，未分化细胞可经历分化。
在一些实施方案中，可将两个或更多个不同细胞群体接种到支架上，从而制备细胞/支架构建体。例如，在一些实施方案中，可将骨形成细胞和血管形成细胞接种到支架上，并且共同培养用于制备血管化骨移植物(参见图7)。在一些实施方案中，在将细胞/支架构建体插入生物反应器之前，将两个或更多个细胞群体在支架上共同培养适合时间段，例如直至达到期望水平生长或分化或其他参数。细胞群体可包括任何生长或分化阶段的任何期望类型细胞及其任意组合、基本上由它们组成或者由它们组成。例如，在一些实施方案中，每一细胞群体可包括能够形成不同组织(例如用于制备血管化骨移植物)的细胞，包含能够形成骨的细胞(例如间充质祖细胞)的第一群体以及包含能够形成血管的细胞(例如内皮祖细胞)的第二群体。在一些实施方案中，各细胞群体可包括能够形成相同组织(例如，骨)的细胞，但是各细胞群体可以为不同分化阶段(例如，间充质干细胞和骨髓基质细胞)。如所期望，可将待共同培养的细胞群体同时或不同时涂布到支架。在将两个或更多个细胞群体不同时涂布时，例如取决于待使用的细胞类型、细胞群体状态或生长或分化或者如所期望的任何其他参数，如所期望可选择共同培养的顺序或次序(例如，哪个群体首先涂布到支架，哪个群体第二涂布到支架等)。在待将两个或更多个细胞群体涂布到支架的情况下，可将它们如所期望的任何合适细胞比例涂布。例如，在一些实施方案中，可将两个不同细胞群体以约1∶1的比例或约2∶8至约8∶2的任何比例接种。在一些实施方案中，可将细胞群体以约2∶8、约3∶7、约4∶6、约5∶5、约6∶4、约7∶3或约8∶2的比例接种。
可在任何合适的点处将细胞/支架构建体转移到生物反应器，例如在接种细胞之后立即，在接种之后细胞培养某段时间之后，在接种的细胞已达到期望分化状态或如所期望的任何其他所需状态之后。在一些实施方案中，将细胞/支架构建体插入生物反应器内，并且在压力配合条件下培养，使得形成组织移植物或组织移植物区段。可使用本领域已知的任何合适的定性或定量方法评估组织/移植物发育，包括但不限于组织学和免疫组织化学检查、生物化学测定法、高分辨率表征技术(例如，SEM、FIB-TEM、Tof-SIMS)、成像程序(例如，CT或微型CT)和机械测试(例如，杨氏模量、张力和抗压强度)。
本领域普通技术人员将意识到，细胞和培养方法的无数变化形式和组合将落入本发明范围之内。例如，根据待使用的期望细胞类型或待制备的组织移植物来典型地确定细胞培养方法，包括细胞接种比例、分化因子浓度和共同培养顺序。
组织移植物及其组装和用途
在一些实施方案中，本发明提供由多个组织移植物区段组装的组织移植物，例如骨移植物。本发明也提供制备这类组织移植物的方法。这种方法可称为区段添加组织工程(SATE)方法。尤其在骨移植物的情况下，这种方法可称为区段添加骨工程(SABE)方法。在任何合适点处，例如当已经产生具有期望性质的组织移植物区段时，可将组织移植物区段从它们所产生的生物反应器中移除，并且可将多个组织移植物区段组装到一起以形成具有期望尺寸和形状的组织移植物，例如与待替换组织部分相对应的尺寸和形状。
通过能够维持区段预期组装的任何合适方式或方法可将组装的组织移植物区段固定或粘附到一起。例如典型地，这类固定方式或方法为无毒、生物相容性和/或可再吸收(例如，能够被身体吸收)，例如，在将组装的组织移植物移植到受试者内处。例如，在一些实施方案中，如所期望，使用粘合剂、缝线或缝合线、缝钉、板、销钉和孔、螺钉、螺栓等可将组织移植物区段彼此固定在一起。在一些实施方案中，用于将组织区段固定在一起的方法为生物相容性或可再吸收的或两者均是。
在其中将粘合剂用于移植物区段彼此固定的一些实施方案中，粘合剂可以为生物相容性胶水，例如生物相容性聚合物胶水，例如NovoSorb(PolyNovo Biomaterials，Melbourne)或任何凝胶、液体、橡胶样物质或能够使两个或更多个组织移植物区段彼此固定的其他生物相容性粘合剂材料。例如，在骨移植物的情况下，可用于骨移植物区段彼此固定的示例性骨胶包括但不限于基于聚合物的骨胶或聚合骨胶，例如基于聚氨酯的骨胶和基于聚甲基丙烯酸甲酯的骨胶。在一些实施方案中，粘合剂可以为胶带，例如外科胶带。在一些实施方案中，可使用例如由塑料、金属(例如，钛)或任何其他合适材料制成的一种或多种板、销钉、螺钉、螺栓、缝钉、缝线、缝合线等将组织移植物区段彼此固定。在一些实施方案中，使用3D打印或本领域已知的任何其他合适方法可制造这类销钉、螺钉、螺栓、缝钉、缝线、缝合线等。
在一些实施方案中，各种不同方式和/或方法可联合使用以使组装的组织移植物区段固定在一起，例如，从而加强组装的组织移植物区段之间的连接和/或将组织移植物粘附或锚定或固定至宿主组织，例如在将组织移植物移植至宿主内的情况下(参见图8)。例如，在一些实施方案中，可使用生物相容性骨胶和金属或可再吸收销钉将如本文所述经工程化的骨移植物区段组装在一起。
在将组织移植物区段组装和固定在一起之后，可将所得组织移植物移植到受试者内，此处也可将它锚定到受试者的组织(例如在骨移植物情况下为骨周围)。在一些实施方案中，通过本发明提供的方法和组合物可用于工程化用于临床应用的组织移植物，包括治疗剂和/或化妆品应用。这些应用的非限制性例子包括组织缺损或损坏或组织缺失的修复或替代、组织重建或再建、组织强化(例如，从而预防或延迟组织损坏或组织缺失的进展)或者辅助植入手术设备(例如，骨移植物可用于帮助在诸如关节替代物、板或螺钉的手术植入设备周围的骨康复)。在一些实施方案中，受试者具有通过伤害、疾病、出生缺陷、创伤或感染导致的组织缺损或组织缺失。
在一些实施方案中，本发明提供修复或替代组织缺损、组织缺失或组织损坏的方法，包括：将根据本发明的组织移植物移植入受试者内，从而修复或替代受试者中组织缺损、组织缺失或组织损坏。在一些实施方案中，组织移植物将具有与待修复或替换的组织相对应的尺寸和形状。使用本文提供的区段添加组织工程或SATE方法可制备根据本发明的组织移植物。因此，在一些实施方案中，根据本发明的组织移植物可包括两个或更多个组织移植物区段、由它们组成或基本由它们组成，其中组织移植物区段具有小于约1厘米的厚度或约0.3毫米至约10毫米的厚度。在一些实施方案中，例如在受试者自身细胞或组织(例如，自体细胞或组织)用于生成组织移植物的情况下，这种组织移植物可以为自身移植物(也称为自体、同体或自身移植物)。在一些实施方案中，例如在供体和受体受试者通过例如HLA-匹配已经匹配的情况下，组织移植物为同种异体移植物(例如，从与受体受试者相同种类的供体受试者中获得的细胞或组织中生成组织移植物)。在一些实施方案中，组织移植物为异种移植物(例如，从与受体受试者不同种类的供体受试者中获得的细胞或组织中生成组织移植物)。例如，可将包含人组织的组织移植物移植入诸如羊的非人哺乳动物内，例如用于进行某些体内测试等。
通过例如上述的能够固定组织的任何合适方法可将根据本发明制备和移植入受试者内的组织移植物锚定或粘附或固定至受试者中现存结构(例如，组织)。在一些实施方案中，通过粘合剂、缝线或缝合线、缝钉、板、销钉等固定植入的组织移植物。在一些实施方案中，在受试者体内固定组织移植物的方法为生物相容性或可再吸收的或者两者均是。
模型系统和筛选方法
在一些实施方案中，本发明提供用于研究各种生物过程或生物性质和用于测定各种试剂对这些生物过程和/或生物性质作用的筛选方法。在一些实施方案中，这类生物过程可包括例如与疾病或疾患相关的那些或与手术程序相关的那些。在一些这类实施方案中，这类生物过程或性质可包括例如与生物组织形成相关的那些(包括但不限于组织移植物生成)，例如与各种细胞类型的分化或培养相关的那些，或与各种细胞类型形成功能组织的能力相关的那些，或与组织(或组织移植物)的生物、机械、免疫或其他生物性质相关的那些等。例如，本文所述的方法、组合物(例如组织移植物)和设备(例如生物反应器)可用于或联合用于模型系统，例如用于研究特定疾病或疾患的模型或者用于研究细胞能力的模型系统，例如形成功能组织的干细胞(例如iPSC)。类似地，本文所述的方法、组合物(例如组织移植物)和设备(例如生物反应器)可用于或联合用于筛选系统，用于研究一种或多种试剂(例如药物或任何其他试剂)对细胞形成诸如组织移植物的功能组织的能力。例如，在一个实施方案中，本发明提供确定可用于治疗、预防或延缓疾病或疾患进展或者用于支持特定组织(例如来自干细胞)的形成或者用于产生具有一种或多种期望性质的组织移植物的试剂的方法，包括：(a)使根据本发明的组织移植物体外或体内接触测试试剂；和(b)评估测试试剂对组织移植物和/或上述生物过程或性质之一的作用。一些这类方法也可包括：使组织移植物与对照试剂接触以及比较测试试剂与对照试剂的作用。在一些这类实施方案中，组织移植物包括来源于祖细胞、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的细胞或者能够(i)形成期望组织或(ii)分化为能够形成期望组织的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，组织移植物可以为血管化组织移植物，其中组织移植物包括内皮细胞或其他血管细胞，例如来源于祖细胞(例如内皮祖细胞)、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的那些细胞或者能够(i)形成内皮和/或血管或(ii)分化为能够形成内皮和/或血管的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，使用诱导型多能干细胞来生成组织移植物。在一些实施方案中，组织移植物包括来自具有特定疾病或疾患的受试者中的细胞。在一些实施方案中，根据本发明的血管化组织移植物可用于或联合用于模型系统，例如用于研究血管疾病或疾患的模型系统。在一些实施方案中，根据本发明的血管化组织移植物可用于或联合用于研究一种或多种试剂(例如药物或任何其他试剂)对血管化组织作用的筛选系统。
在一些实施方案中，本发明提供包括根据本发明的组织移植物的模型系统。例如，在一些实施方案中，本发明提供包括根据本发明的组织移植物的模型系统，已将该根据本发明的组织移植物移植入非人哺乳动物的受试者内。在一个这类实施方案中，非人哺乳动物是羊。在一些实施方案中，本发明提供包括根据本发明的组织移植物或组织区段的模型系统，该模型系统用于确定测试材料是否适合植入受试者内。例如，在一些这类实施方案中，可筛选或测试测试材料的期望性质，例如生物相容性、机械性质或毒性。在一些这类实施方案中，测试材料可以为合成材料或天然材料或者合成和天然材料的混合物。通过本发明提供的模型系统可以用于各种目的，例如但不限于筛选或测试植入材料和在限定的组织特异性条件下研究疾病，包括理解潜在机制、限定治疗靶和进行化合物筛选等。
而且，本领域普通技术人员将意识到，本文所述的方法、组合物(例如组织移植物)和设备(例如生物反应器)可用于或联合用于各种不同模型系统和筛选方法。
受试者
在一些实施方案中，如所需要或如所期望，在生产本发明的组织移植物中使用的细胞可由任何受试者获得或者来源于任何受试者。在一些实施方案中，如所需要或如所期望，通过本发明提供的方法(例如治疗方法)和组合物(例如，组织移植物)可用于任何受试者(例如，从而修复病理或创伤组织缺损或用于美容或重建目的)。在一些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，包括但不限于非人灵长类、羊或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)。在一些实施方案中，第一受试者为供体受试者以及第二受试者为受体受试者。在一些这类实施方案中，可通过HLA-型匹配使供体受试者或供体受试者的细胞与受体受试者或受体受试者的细胞匹配。
血管化骨移植物
在一个实施方案中，本发明提供制备血管化骨移植物的方法，包括：(a)获得骨部分的三维模型；(b)将步骤(a)的三维模型划分为两个或更多个骨区段模型；(c)制备两个或更多个骨移植物区段，包括：(i)获得具有与步骤(b)的每个骨区段模型相对应的尺寸和形状的支架；(ii)获得具有内室的生物反应器，该内室被配置成容纳支架；(iii)将(1)骨形成细胞或能够分化为骨形成细胞的细胞和(2)血管形成细胞或能够分化为血管形成细胞的细胞涂布到支架；(iv)在生物反应器内支架上培养细胞以形成骨移植物区段；和(v)从生物反应器中去除骨移植物区段；和(d)组装在步骤(c)中制备的两个或更多个骨移植物区段，从而形成具有与步骤(a)的骨部分相对应的尺寸和形状的骨移植物。在一个实施方案中，在(c)(iii)中涂布到支架的细胞包括多能细胞、诱导的多能细胞、祖细胞、分化细胞或其任意组合。在一个实施方案中，(c)(iii)(1)的细胞包括骨髓基质细胞或间充质干细胞或朝向间充质谱系诱导的多能细胞或者分化的骨细胞或其任意组合。在一个实施方案中，(c)(iii)(2)的细胞包括内皮祖细胞或朝向内皮谱系诱导的多能细胞或者分化的内皮细胞或其任意组合。在一个实施方案中，骨移植物区段具有约一厘米或更小的厚度。在一个实施方案中，骨移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的厚度。在一个实施方案中，使用粘合剂、一个或多个销钉和孔或两者来进行骨移植物区段的组装。在一个实施方案中，销钉为金属的或可再吸收的。在一个实施方案中，销钉为钛。在一个实施方案中，粘合剂为生物相容性骨胶，例如诸如NovoSorb (PolyNovo Biomaterials，Melbourne)的聚合物或任何凝胶、液体、橡胶样物质或能够将两个或更多个骨区段固定在一起的任何其他生物相容性材料。骨胶的例子包括但不限于基于聚合物的骨胶，例如基于聚氨酯的骨胶和基于聚甲基丙烯酸甲酯的骨胶。一方面，本发明提供在受试者中修复或替换骨部分的方法，包括上述步骤(a)-(d)，并且还包括植入骨移植物到受试者内，从而修复或替代受试者中骨部分。
一方面，本发明提供通过本发明的方法制备的血管化骨移植物。另一方面，本发明提供在受试者中修复或替换骨部分的血管化骨移植物，其中骨移植物包括两个或更多个骨移植物区段，其中使两个或更多个骨移植物区段连接在一起以形成具有与待替换或修复的骨部分相对应的尺寸和形状的血管化骨移植物。在一些实施方案中，骨移植物区段包括来源于祖细胞(例如间充质祖细胞)、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的骨细胞或者能够(i)形成骨或(ii)分化为能够形成骨的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，骨移植物区段包括来源于祖细胞(例如内皮祖细胞)、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的内皮或血管细胞或者能够(i)形成内皮和/或血管或(ii)分化为能够形成内皮和/或血管的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，每个骨区段具有小于约一厘米的最大厚度或具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度。
在一些实施方案中，根据以上方法使用的细胞或者制备以上骨移植物中使用的细胞均源自或得自从待放置骨移植物入内的相同受试者中获得的细胞，使得它们均为自体细胞或者它们均源自自体细胞。在一个实施方案中，细胞源自多能干细胞，例如诱导型多能干细胞、胚胎干细胞、克隆的干细胞或成熟干细胞(例如骨髓干细胞)。在一些实施方案中，诱导型多能干细胞可源自从待放置骨移植物入内的相同受试者中取得的体细胞或者从合适匹配供体(例如HLA-匹配供体)中取得的体细胞。在一些实施方案中，细胞为间充质干细胞和/或内皮祖细胞。在一些实施方案中，将细胞以1∶1的细胞比例或者约2∶8至约8∶2的任何比例接种到支架上。
在一些实施方案中，本发明提供适合在制备骨移植物中使用的培养容器，例如本文所述的生物反应器。这些培养容器可以为灌注生物反应器，该灌注生物反应器包括在压力配合条件下可插入和培养细胞/支架构建体的一个或多个定制移植室。生物反应器可包括顶部元件和底部元件，其中顶部元件和底部元件固定在一起。在一个实施方案中，顶部元件包括培养基的贮存器、流体出口和一个或多个流体通道。在一个实施方案中，底部元件包括流体入口和一个或多个流体通道。在一个实施方案中，使用计算机辅助制造来生产培养容器。在一个实施方案中，计算机辅助制造包括计算机数字控制铣削机器和/或三维打印。
在一些实施方案中，移植室可以为定制形状的室，该室容纳支架/细胞构建体，直至功能骨成熟。在一些实施方案中，移植室具有足够容纳具有约0.3毫米至约10毫米厚度的骨区段的尺寸。
在一些实施方案中，使用框架或插入物可将支架和/或骨区段定位于移植室中。如所期望，框架或插入物可用于定制移植室的尺寸和形状以及将支架和/或骨区段定位在移植室中，从而在直接灌注、压力配合条件下培养骨区段以最大化流体流动通过支架和/或骨区段和最小化流体流动通过支架和/或骨骼区段以及最小化流体流动在支架和/或骨区段周围。在一些实施方案中，如所期望，移植室可具有一般形状或尺寸，但是框架或插入物可用于定制移植室的尺寸和形状(例如内部尺寸和形状)，从而容纳支架和/或骨区段。框架或插入物可由任何合适的材料制成，例如生物相容性、无毒、可塑性塑料。
在一个实施方案中，本发明提供适合用于制备例如本文所述的骨移植物的支架。在一个实施方案中，使用计算机辅助制造来生产支架。在另一实施方案中，制造包括计算机数字控制铣削机器、浇注技术、激光切割和/或三维打印。在一个实施方案中，支架基本上由脱细胞骨组织组成。在一个实施方案中，支架包括合成陶瓷/聚合复合材料。在一个实施方案中，支架基本上由能够被细胞吸收的材料组成。
在一些实施方案中，本发明提供用于骨疾病或疾患和/或血管疾病或疾患的模型系统，该模型系统包括根据本发明的血管化骨移植物。一方面，本发明提供用于骨缺乏、缺损、疾病或疾患的模型系统，该模型系统包括包含两个或更多个骨移植物区段的血管化骨移植物，其中两个或更多个骨移植物区段连接在一起以形成骨移植物。一方面，本发明提供确定可用于治疗骨缺乏、缺损、疾病或疾患的化合物的方法，包括：(a)使骨移植物体内或体外接触测试试剂，其中骨移植物包括两个或更多个骨移植物区段，其中两个或更多个骨移植物区段连接在一起以形成骨移植物；和(b)测定测试试剂是否能改善(a)的骨移植物的功能、或改善(a)的骨移植物的生长或者预防或延迟(a)的骨移植物的退化。在一些实施方案中，骨缺乏、缺损、疾病或疾患包括先天性病理或创伤缺损、整容手术、退化性疾病、在致瘤性转化或慢性感染之后的手术切除。一方面，本发明提供确定可用于治疗血管疾病或疾患的化合物的方法，包括：(a)使血管化骨移植物体内或体外接触测试试剂，其中血管化骨移植物包括两个或更多个血管化骨移植物区段，其中两个或更多个血管化骨移植物区段连接在一起以形成血管化骨移植物；和(b)测定测试试剂是否能治疗或预防或延缓血管疾病或疾患的进展。在一些实施方案中，骨移植物区段包括来源于祖细胞(例如间充质祖细胞)、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的骨细胞，或者能够(i)形成骨或(ii)分化为能够形成骨的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，骨移植物区段包括来源于祖细胞(例如内皮祖细胞)、多能细胞(例如诱导型多能干细胞)、自体细胞(例如受试者自身的细胞)的内皮或血管细胞，或者能够(i)形成内皮和/或血管或(ii)分化为能够形成内皮和/或血管的细胞的任何细胞。在一些实施方案中，每个骨区段具有小于约一厘米的最大厚度或者具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度。
本发明的各个实施方案也可进一步通过以下非限制性例子说明。
实施例
用于修复大的骨骼缺损的工程血管化骨移植物
引言
由创伤、出生缺陷和疾病导致的骨缺损影响着世界范围内越来越多的患者，到2017年，美国市场每年骨修复和再生治疗合计预期达到35亿人。在大量临床案例中，依赖异质成形材料植入或者骨组织移植的这些患者目前治疗不是最佳的，需要可替代治疗方法以恢复骨骼完整性和功能性。
本实例提出用于工程化血管化骨移植物的方法，该血管化骨移植物来自用于加速复杂骨骼缺损康复的人诱导型多能干细胞(hiPSC)。尤其，在几乎不受限制数量的任何患者中，从hiPSC得到构成健康骨的自体成骨和血管细胞的能力代表空前的治疗资源。使用仿生支架-骨骼发育的生物反应器方法可将血管化骨骼替代品工程化。计算机辅助和速成原型技术使得可制备任何形状和尺寸的骨骼替代品。创建大的骨骼缺损的数字模型，然后按互补子部件分段，该互补子部件将用于通过诸如3D打印的计算机辅助设计和制造技术来生产定制生物材料支架和生物反应器(参见图1)。该提出的工程方法克服与大的骨移植物灌注培养相关的限制。间充质和内皮祖细胞来源自使用任何可获得重编程方法产生的hiPSC，然后与顺应式支架联合和在灌注生物反应器中培养直至功能血管化组织成熟(参见图2)。然后使用生物相容性骨胶将经工程化的骨骼区段组装在一起(类似乐高积木的方法)，和/或使用3D打印钛孔和销钉来加强以匹配最初缺陷的形状和尺寸。进一步研究将旨在使用复杂骨骼缺损的不同动物模型来探究hiPSC-工程化骨的治疗潜能(参见图3)。
工程化来自hiPSC的大的和几何限定的血管化骨移植物代表治疗特征为严重骨缺失的骨骼缺损的新方案，并且开启对大量患者提供个性化治疗的机会。同样重要的是，这些骨移植物代表研究骨骼发育和病理以及筛选新药物和测试生物材料的合格模型。
实施例描述用于加速骨骼缺损恢复设计工程来自人诱导型多能干细胞(hiPSC)的血管化骨移植物。使用仿生支架-骨骼发育的体外生物反应器方法来工程化患者特异性骨移植物，并且在计算机辅助和速成原型技术帮助下定制患者特异性骨移植物以符合特异性临床需求。工程化患者特异性定制骨移植物可用于开发在特征为多块骨缺失的临床情况下恢复骨骼完整和功能性的新型治疗。
排除与例如先天性(1)和创伤(2)骨骼缺损、整容手术、退化性疾病以及致瘤性转化(3)和慢性感染(4)之后手术切除相关的骨缺损需要骨骼重建治疗。骨骼替换和修复治疗的世界市场很大(5，6)，并且由于人口快速增加和平均寿命延长，对骨组织替代品的需求持续增加(7，8)。如今，全球范围内报道与年龄相关骨折的老年人数量每年预计超过1亿人(9-11)，并且在今后十年预期该数目会持续增长，到2050年预计老年人(+65岁)数量有约20亿(12)。因此，需要开发用于复杂骨骼重建有效治疗的新方法。最近已经开发出通过在合适培养条件下在生物反应器中对接骨感受态细胞与生物材料用于功能骨骼替代品离体培养的仿生组织工程化方法，其提供引导功能组织成熟的机械刺激和合适的环境。最近已经报道，工程化几何限定的骨替代品尝试用于在骨诱导性支架-灌注生物反应器体系中培养人间充质干细胞(13)。然而，未处理与1)来源于成人组织的干细胞有限再生潜能、2)缺乏血管化和3)在直接灌注生物反应器中培养大的骨替代品相关的限制，但是所有这些均影响工程用于加速大的和复杂骨骼缺损恢复的功能移植物的能力。尤其，由于通过提供大的构建体到流程所带来的阻力，使用直接灌注生物反应器来工程化大的细胞/支架构建体很麻烦。在支架内新组织发育逐渐限制流体灌注通过构建体，对灌注体系的功能性产生消极结果。独立研究表明，当在直接灌注生物反应器中培养4x4mm构建体5周时，则可观察到类似情况。
该实例提出工程化来自hiPSC的血管化骨骼替代品的研究，并且采取医学成像工序、计算机辅助技术和速成原型的组合，使得可在灌注生物反应器中构建临床相关的骨替代品。该方法代表处理骨缺损问题的新颖和新型解决方案，通过改善许多患者的健康状况和生活质量，该方法的临床转化将具有深刻社会影响。这些研究也提供对hiPSC生物学的新见解，这对于理解多能干细胞功能分化为成熟组织和器官很关键。此外，hiPSC-工程化的血管化骨移植物将提供有价值的高保真模型，从而探究在正常和病理条件下组织发育和测试在与天然骨骼环境多方面类似的环境内新药物和生物材料。
背景
骨具有再生和自身修复的内在能力，但是该能力受限于小骨折，并且在大量临床情况下需要重建治疗以恢复组织完整性和功能性(14)。目前治疗基于自身和/或异源性骨移植物的移植或者植入具有骨引导和骨诱导性的移植物材料。由于支持骨骼再生和修复的基础成分的免疫耐受性和供应，同体骨移植物代表骨骼替代工序的金标准治疗，但有限的利用度和供体位置发病率通常限制它们的临床使用(15)。另一方面，可获得大量异源性脱细胞骨移植物，但是整合慢(16)，携带感染传播风险，并且可显示导致移植排异反应的免疫不相容性(17)。异质成形材料的植入克服使用同体和异源性移植物遇到的一些限制，包括疾病传播、复杂形状和可获得性，但显示交叉的整合性、经常导致生物材料相关的感染和缺乏生物功能和机械依从性，从而导致植入和替代失败(18)。骨组织工程化代表有前景的治疗方案，因为它开启工程化不受限量活的骨替代品的可能性，从而满足特异性临床需求(19)。来源于成人组织的人间充质干细胞(hMSC)已经广泛用于骨工程化应用，得到令人鼓舞的结果，但是由于有限的可用性、不充足再生潜能和与体外扩张和供体年龄相关功能降低，它在临床应用上潜能受限(20-23)。
从成熟干细胞中培养出～1cm大小范围的自体骨替代品，并将其用于在实验动物和人中促进骨骼康复(24，25)。然而，由于缺乏血液供应和有限增殖以及培养的成人干细胞有限形成血管潜能，它们扩大成临床尺寸和功能受到限制。合适的供血已经被认为是正常骨折康复必要组成，并且当出现较差结果时，在骨折位置处缺损血管生成已经是首选考虑(26)。较差的供血导致组织缺氧和移植的组织坏死，并且可导致降低骨形成(“萎缩的骨”)。类似地，在没有连接血管供给下大型细胞化骨替代品的植入可导致植入物内部区域的细胞死亡。为了加快细胞存活和骨再生，最近组织工程化方法已经设计在骨替代品内内皮祖细胞或血管网络的移植(27-29)。研究显示在直接共同培养模型中内皮细胞和成骨细胞的积极效果(30，31)。此外，研究表明，内皮细胞和BMSC的共同移植促进体内新的骨形成(28)，并且在骨替代品内经工程化的内皮网络可与宿主脉管系统功能性汇合(27，32)。
多能干细胞显示高再生潜能和朝向组成健康骨组织的所有专门细胞分化的能力(33，34)。当使用核重编程技术得到时，多能干细胞使得可构建个性化应用的患者特异性骨替代品。间充质和内皮祖细胞目前均来源于多能干细胞(35-40)，开启增强大型骨骼缺损重建的血管化骨替代品不受限制建构的新机会。因此，探索从诱导型多能干细胞中工程化血管化骨移植物的可能性非常重要，从而开发用于受到严重骨骼缺损和骨障碍的许多患者的安全和有效治疗。
结果
从源自成人组织和人多能干细胞的间充质干细胞中培养骨骼替代品，发明人具有丰富经验。开发来源于人胚胎干细胞(hESC)系的hMSC和间充质祖细胞的相关再生潜能的一系列研究已经表明源自hESC的间充质祖细胞用于骨工程化应用的相对优势(20，35，36)。在生物反应器中在支架上单层和3D培养物的研究已经显示，在形态、表面抗原和全部基因表达特性方面，hESC-来源的间充质祖细胞高度类似于hMSC，但显示更高的增殖潜能、生物合成活性和矿化性质、骨工程化应用的功能替代品的不受限制构建的所有最重要特征。起源方案已经延伸到从不同组织和使用基于非整合载体的不同重编程技术生成的hiPSC系，开启用于个性化应用工程化安全患者特异性骨骼替代品的可能性。hiPSC系的特征在于，在朝向间充质谱系诱导7天之前，评估多能性和核型的免疫组织化学。类似间充质的表型特征在于流式细胞术和探测在单层(骨生成，脂肪生成)中表面标志物表达和分化潜能以及团培养(软骨生成)。通过碱性磷酸酶和矿化证实朝向成骨谱系分化，通过氨基葡聚糖显示朝向软骨形成谱系分化，并且通过脂质特征显示朝向脂肪形成系分化。
然后将细胞接种到脱细胞骨骼支架上，并且在12周皮下植入免疫功能不全的小鼠以评估稳定性和进一步组织成熟之前，在恒定灌注(800μm/sec的线性流速)下在成骨培养基中培养5周。在免疫功能不全的小鼠中生物反应器培养和皮下植入之后，进行经工程化的骨的组织学和免疫组织化学分析。显微图显示表型成熟、稳定的类似骨骼的组织和形成血管。经工程化的骨的微型CT分析显示矿物密度和结构参数的增加(41)。
总之，结果表明，间充质祖细胞可源自hiPSC系，并且用于成熟和表型工程在个性化应用中用于骨骼缺损修复治疗的稳定骨组织。在所有研究中，显示灌注生物反应器对于骨骼发育特别重要，因为它们提供对细胞的生物机械刺激(13)，并且支撑在构建体内部细胞存活，导致产生厚的同源性类似骨骼的基质(41)。现在研究导向开发用于加强大型和几何复杂骨骼缺损康复的工程化血管化骨替代品的合适方案。初步研究已经显示，功能内皮祖细胞可来源自hESC系。在受控条件下拟胚体分化之后，当放置在人工基底膜上时，单独的CD34阳性细胞能够特异性使Dil-Ac-LDL内在化和形成管。该方法转化为将hiPSC用于构建患者特异性多细胞复合骨替代品。
此外，在3D培养中初步血管化研究已经显示，在将细胞嵌入纤维蛋白凝块中或接种到脱细胞骨骼支架上时，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对hiPSC来源的间充质祖细胞和人骨髓基质细胞(BMSC)的共同培养导致血管网络的持久形成，其代表骨骼修复治疗的更多依从性基质。有意思的是，当在纤维蛋白凝块中使用hiPSC来源的间充质祖细胞和人BMSC培养HUVEC时，血管结构的数目和稳定性类似。荧光显微照片显示，在接种之后3周出现稳定的3D血管网络。凝块横截面的苏木精/曙红染色显示，在来源于hiPSC系1013A和接种之后使用HUVEC 4周的BMSC的间充质祖细胞共培养物的整个构建体中均出现中空血管。为了追踪血管网络体外形成，在纤维蛋白凝块中嵌入之前，使用不同的Vybrant示踪染料来特异性标记细胞群体，并且在组织学分析收获之前，在成骨和内皮诱导培养基的混合物中培养4周。当单独培养HUVEC时，没有观察到血管结构，这表明间充质细胞支撑和引导组织血管化的至关重要作用。可进行研究以确定该发现潜在分子机制，从而开发支持血管化骨组织体外成熟的改善方案。
当将细胞接种到脱细胞骨支架上和在诱导成骨和血管条件下培养6周时，观察到类似的结果。通过骨钙素、骨桥蛋白和骨唾液蛋白阳性染色所证实的类似骨骼组织成熟伴随着结构内中空管的形成。免疫组织化学检查显示，对于内皮标志物CD31来说，管状结构为阳性。
可测试不同接种比例和培养条件，从而探索增强血管化骨组织形成的潜能以及评估用于工程化血管化骨移植物的其他hiPSC系潜能。进一步研究旨在开发在血管化过程中在灌注生物反应器中动态条件作用。合适血管化方案联合仿生骨诱导性支架-灌注生物反应器方案的开发将使得可构建用于复杂骨骼缺损个性化修复治疗的血管化骨移植物。
研究设计和方法
该实施例提出使用分步分化方法从hiPSC中工程化血管化骨移植物，从细胞系-特异性成骨和内皮祖细胞的起源开始，随后在“仿生”支架-生物反应器模型中共同培养这些祖细胞，其确保体外功能性骨组织的可控发育。采取计算机辅助和速成原型技术，使得能够制造定制用于重建大型和几何复杂骨骼缺损的骨骼替代品。工程化患者特异性定制骨移植物可用于开发新型治疗，从而在特征为严重骨缺失的临床情况下恢复骨骼完整和功能性。该实施例描述如下所述的三个子项目。
1.生物材料支架和灌注生物反应器的骨骼模型和计算机辅助制造(CAM)的计算机 辅助设计(CAD)。部分1的目的是为了创建和制作骨骼缺损的数字模型，从而引导定制生物材料支架和灌注生物反应器的设计和制造。使用CAD软件创建骨骼缺损的数字模型，并分段为互补子部件，然后将这些模型用作对应尺寸和形状的生物材料支架和定制灌注生物反应器的计算机辅助制造参考。使用数字模型机器加工生物反应器和/或树形制作，从而在压力配合模式下容纳各具体细胞/支架构建体，并且使得可在直接灌注下培养。
使用CAD软件(例如，Autocad、Solidworks、ProE、Creo)来创建骨骼缺损的数字模型。为了证实所提出工程化方法治疗潜能，该方法可延伸到不同尺寸和形状的缺损模型。在CAD中将编辑骨骼缺损的参考模型，并将其分段为在不影响灌注系统下可在灌注生物反应器中培养的更小互补子部件(类似乐高积木的结构部分)。然后将分段的骨骼样本文件保存在兼容IGES或SLT格式，并导入CAM软件(例如，SprutCAM)。然后处理CAM软件中将生成的文件以生成合适的G-编码，从而驱动计算机数字控制(CNC)铣削机器(例如，Tormach，Bridgeport)，选择合适加工工具二进制编程机器途径，从而切割支架材料为期望分段形状。钻孔足够尺寸的脊柱骨(牛和/或人)栓塞，在高压流水下清洁以去除骨髓，然后连续洗涤以去除如上所述的细胞材料(41)。然后将脱细胞骨骼栓塞冷冻干燥，并用于制造与骨骼缺损分段样品形状和尺寸相对应的支架。平行开发用于合成的、可再吸收和机械依从性陶瓷/聚合物复合材料的潜能，因为它是用于临床应用的骨骼替代品的可再生和大规模制造的基本必需品。将制造的支架消毒和在细胞接种之前在培养基中适应整夜。然后将在CAD中编辑的分段骨骼样品文件用于设计定制生物反应器，在直接灌注条件下它能够以压力配合方式容纳细胞/支架构建体。而且，将CAD文件转为可兼容格式，然后导入CAM和/或3D打印机软件，并使用不同塑料材料用于制造生物反应器。每个生物反应器由两个部分(顶部和底部)组成，通过例如金属螺钉将这两个部分固定在一起。将细胞/支架构建体培养在顶部和底部元件之间。底部包括包括但不限于入口和流体灌注通道以及容纳细胞/支架构建体的解剖学形室的关键元件。顶部包括诸如培养基储存器和流体灌注出口的元件。管系统可用于连接入口和出口，并且通过控制蠕动泵使得可灌注通过生物反应器。
2.在定制灌注生物反应器中工程化血管化骨。部分2的目的是体外工程化血管化患者特异性骨移植物。在仿生条件下在骨诱导性支架-灌注生物反应器系统中，使用非整合载体从不同组织重编辑的hiPSC系将被诱导朝向在培养之前的间充质和内皮谱系，从而引导功能血管化骨组织成熟。
扩张从不同供体和来源组织(系BC1和1013A)中使用非整合载体重编程的hiPSC，其特征在于在诱导朝向间充质和内皮系之前的多能性和核型。衍生的祖细胞将被扩张，其特征在于流式细胞术和核型，从而评估遗传常态。定性和定量方法将用于体外评估成骨和内皮表型，该方法包括组织学和免疫组织化学检查、生物化学和形态学测定法以及基因表达分析。在特异性因子(BMP-4、激活素、bFGF、VEGF)存在下，在单层培养物和拟胚体中测定血管诱导。基于表面抗原表达(CD34、CD31、KDR、C-KIT)来分类分化的祖细胞，并在内皮培养基中培养。通过流式细胞术、免疫荧光和基因表达来评估特异性标志物(CD31、vWF、VE-钙粘素、SMA)的祖细胞产率、生存能力、增殖和表型表达。在共同培养研究之前通过在骨胶原/纤连蛋白/人工基底膜中封装来测定网络形成和萌芽。市售BMSC(Lonza)和HUVEC(Lonza)将用作评估hiPSC来源的间充质和内皮祖细胞的质量和功能性的参考系。为了工程化血管化骨组织，将hiPSC来源的间充质和内皮祖细胞共同接种到脱细胞骨骼支架(或其他)上，然后在成骨和内皮培养基混合物中在生物反应器中培养。研究预分化、细胞接种比例、分化因子浓度和血纤蛋白粘合剂使用，从而设计体外血管化骨移植物完全发育的最佳培养条件。在生物反应器中培养进行3-5周时间段，直至形成成熟血管化组织。使用定性和定量方法来评估组织发育，该方法包括组织学和免疫组织化学检查、生物化学测定法、高分辨率表征技术(SEM、FIB-TEM、Tof-SIMS)、成像程序(微型CT)和机械测定(杨氏模量、张力和抗压强度)。
3.经工程化的骨区段的胶合和稳定性评价。部分3的目的是制造用于复杂骨骼重建的定制骨移植物。将经工程化的血管化骨区段组装以通过生物相容性骨胶方式匹配骨骼缺损形状或者使用3D打印金属(例如，钛)或可吸收销钉和孔来加强。进一步研究旨在研究在临界尺寸骨骼缺损(负载和非负载型解剖位置)动物模型中经工程化的骨的安全性和效能。
将工程化骨区段组装以通过用于熔接大型骨移植物的生物相容性骨胶来匹配骨骼缺损模型形状，或者使用3D打印金属(例如，钛)或可再吸收销钉和孔来加强。未来的研究将旨在探究在复杂临界尺寸的骨骼缺损(在负载和非负载骨骼位置处)的动物模型中经工程化的骨的安全性和再生潜能。例如，使用医学成像程序(CT扫描)将创建成年动物中股骨头缺损的数字模型，并用3D图像处理和分段(如上所述)，然后用于工程化如本文所述血管化骨。然后在动物中进行股骨头截骨术，从而一定程度上去除匹配生成的数字模型(如上所述)的股骨头，然后将经工程化的血管化骨原位放置以恢复骨骼完整和功能性。使用医学成像程序体内评估再生组织的组织发育、康复和质量，并且使用组织学和免疫组织化学技术、高分辨率表征技术(例如，SEM、FIB-TEM、Tof-SIMS)和机械测定(例如，杨氏模量、张力和抗压强度)进行后续解释。
如本文所述，使用用于个性化重建治疗的来源于人诱导型多能干细胞的成骨和内皮祖细胞可工程化血管化骨移植物。尽管内皮祖细胞可来源于hESC和hiPSC(38-40)，衍生效率低，并且衍生的祖细胞显示几乎没有增殖能力，这限制生成用于工程化大型血管化骨替代品的足够细胞的能力。为了加速平行优化来自hiPSC的高增殖内皮祖细胞衍生的合适血管化方案发展，可使用市售HUVEC，然后将方案转化为来源于hiPSC的内皮祖细胞。在朝向内皮系诱导之前，可将hiPSC来源的间充质祖细胞扩张为所需量，然后将其用于工程化血管化骨替代品。
如本文所述，使用用于熔接大型骨移植物的生物相容性骨胶可将工程化骨替代品组装以匹配骨骼缺损形状，这可能不足以确保在植入之后稳定连接到高负载位置。为了解决该问题，测试可替换方案，包括使用3D打印金属或可再吸收销钉和孔来强化。
人干细胞
提出逐步方案用于制备来自人iPSC的血管化骨移植物，其包括：(a)分化和扩张来自人iPSC的成骨和血管祖细胞，并且测定它们对新组织形成的功能潜能；(b)制备和接种脱细胞骨骼支架或任何其他生物相容性和可再吸收生物材料支架；和(c)分阶段联合/按顺序培养成骨组织，同时形成微血管网络。
细胞系：可使用人iPSC系1013A(在NYSCF实验室通过仙台病毒获得)和BC1(通过附加体质粒载体获得，来自Life Technologies)。使用ESC系H9(来自Wicell ResearchInstitute)和市售成人细胞(来自Lonza的BMSC和HUVEC)平行进行初始研究。
材料来源
从Life Technologies获得人iPSC系BC1。最初从匿名供体骨髓中得到的该细胞系发表在Cell Research(2011年1月18日)中。该细胞系用作对照系，测定其未来对照系。
人iPSC系1013A来源于皮肤活体组织检查的纽约干细胞基金会(New York StemCell Foundation)实验室。
参考BMSC和HUVEC系可市售和从Lonza购买。
结果
期望该方案生成的数据提供来自hiPSC的血管化骨替代品发展概念证据。使用支架和生物反应器，在仿生条件下通过hiPSC培养将获得骨骼形成和血管化的新见解。此外，经工程化的血管化骨替代品将提供在类似于天然骨环境的选择方面环境内用于骨发育和疾病以及药物筛选和生物材料测试的定量体外研究的有价值的高保真模型。
在实施例中引用的参考文献：
以下列出的每篇参考文献和在本专利申请文件中所引用的所有其他参考文献在此通过引用方式完整并入。
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尽管为了清楚和理解之便已经较为详细描述上述发明，但是从阅读本公开，本领域熟练技术人员清楚知道，在未偏离本发明范围下，可进行各种形式和细节变化。本发明也进一步通过以下权利要求描述。

Claims (20)

1.一种制备组织移植物的方法，所述方法包括：
a.获得待生产、修复或替换的组织部分的数字模型，其中将所述数字模型划分为两个或更多个模型区段；
b.制备两个或更多个组织移植物区段，其中每个组织移植物区段具有与步骤(a)的模型区段相对应的尺寸和形状；和
c.组装在步骤(b)中制备的所述两个或更多个组织移植物区段以形成组织移植物，其中所述组织移植物具有与步骤(a)的组织部分相对应的尺寸和形状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中制备所述两个或更多个组织移植物区段包括：
a.获得支架，其中所述支架具有与模型区段相对应的尺寸和形状；
b.获得包括移植室的培养容器，其中所述移植室具有与所述模型区段相对应的尺寸和形状，从而容纳步骤(a)的支架；
c.将一个或多个细胞群体涂布至所述支架；和
d.在所述培养容器内的所述支架上培养所述细胞以形成组织移植物区段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织移植物为骨移植物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织移植物为软骨移植物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织移植物经血管化。
6.根据权利要求1所述的方法，其中每个组织移植物区段具有约一厘米或更小的厚度。
7.根据权利要求1所述的方法，其中每个组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的厚度。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述培养容器为直接灌注生物反应器，并且步骤(d)的培养为在压力配合条件下进行。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(b)的移植室包括移植室插入物。
10.根据权利要求2所述的方法，其中使用计算机辅助制造、三维打印、浇注、铣削、激光切割、速成原型或其任意组合来产生所述支架。
11.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞来源于诱导型多能干细胞。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞包括骨形成细胞和/或能够分化为骨形成细胞的细胞。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞包括血管形成细胞和/或能够分化为血管形成细胞的细胞。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞包括间充质祖细胞。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞包括内皮祖细胞。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(c)的组装包括使用生物相容性粘合剂、缝线、缝合线、缝钉、板、销钉、螺钉或其任意组合。
17.一种包括两个或更多个组织移植物区段的组织移植物，其中每个组织移植物区段具有约0.3毫米至约10毫米的最大厚度，以及其中使用生物相容性粘合剂、缝线、缝合线、缝钉、板、销钉、螺钉或其任意组合将所述组织移植物区段组装在一起以形成组织移植物。
18.根据权利要求17所述的组织移植物，其中所述移植物为骨移植物。
19.根据权利要求18所述的组织移植物，其中所述移植物为血管化骨移植物。
20.根据权利要求19所述的组织移植物，其中所述移植物包括来源于诱导型多能干细胞的骨形成细胞。
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