JP2023529561A - 成熟させた三次元印刷組成物およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般に組織工学、具体的には軟骨性組織の文脈における組織工学の分野に関連する。より具体的には、本発明は三次元構造物であって、十分な数の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、前記三次元組成物が、それを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有する三次元構造物に関連する。さらなる態様において本発明は、そのような三次元組成物の調製方法、例えばバイオプリンティングを介した方法、そのような方法によって得ることができる組成物、およびその三次元組成物の医療用途に関連する。【選択図】図１

Description

本発明は、一般に組織工学、具体的には軟骨性組織の文脈における組織工学の分野に関連する。より具体的には、本発明は三次元構造物であって、十分な数の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、前記三次元組成物が、それを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有する三次元構造物に関連する。さらなる態様において本発明は、そのような三次元組成物の調製方法、例えばバイオプリンティング（ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｉｎｇ）を介した方法、そのような方法によって得ることができる組成物、およびその三次元組成物の医療用途に関連する。

鼻や耳のような顔の美的特徴が損傷され、または完全に失われることは、原因が何であれ、損傷を受けた人々に生涯にわたって社会心理的な問題を与えることになりうる。例えば、負傷者の頭頚部を巻き込む熱傷の大部分において、耳や鼻が損傷される。損傷された場合、外耳はしばしば完全に破壊され、手術による耳の全面再建が必要となるが、しかしこれは非常に困難な作業である。

事故および犬の噛み傷は、特に鼻および／または耳のような顔の一部が損傷されている場合、再建手術が必要になるさらに一般的な原因である。顔面の穿通性外傷は、軟部組織の形状および輪郭の変形を伴う機能喪失に至ることがあり、それは複数回の外科手術および付随する心理的トラウマを要することがある。（Alizadeh et al., Plast Reconstr Surg Glob Open. 2017 Oct; 5(10): e1431）毎年、米国だけでも約３万人の患者が、犬に咬まれた結果として再建手術を必要としている。

顔の美的特徴が損傷されまたは失われる他の原因には、例えば癌のような疾患がある。無耳症または小耳症と呼ばれるまれな先天性疾患は、新生児３８００人に１人の割合で発症し、外耳が完全にない（無耳症）または変形している（小耳症）ことが特徴である。若い小耳症患者に対する現在の標準的な治療法は、耳型を構築するための、数本の肋骨の採取に基づいた自家肋軟骨移植である。外耳の再建には複数回の手術が必要であり、外科医にとって習得が困難なことから、これらの手術を行うことのできる外科専門医の数は世界中でも限られている。患者は肋骨採取によるドナー部位の強い痛みをしばしば経験し、また再建の審美的な結果が低いため、患者が報告する結果も悪いことが多い。

例えばＭｅｄｐｏｒ（登録商標）という商品名で、合成インプラントがいくつか入手できるが、ポリエチレン製であるため異物反応を起こしやすく、高い合併症率が見られる。そのうえ、このようなインプラントは硬いため、患者は睡眠障害を経験する。

人工器官による再建は、手術が低侵襲であることから、特に高齢の患者に使用される可能性があるが、継続的な管理が必要であり、また人工器官は患者自身の器官ではないため、心理的な面から理想的ではない。

積層造形法（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）すなわち「三次元印刷」は汎用性の高い技術であり、これにより複雑な形状の工業製品を、非常に小さな生産サイズかつ手頃な価格で製造することが極めて容易になった。この技術は、液体材料を通常は層状にコンピュータ制御により組み立てることに基づき、続いて固化することで三次元物体を製造する。医療分野において、積層造形法に基づくバイオファブリケーション（ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）技術は、再生医療に用いる生きた患者特有の組織および器官を製造できるため、大きな可能性を持っている。特に注目されるのは、細胞と支持構造物との組み合わせである。

非医療用の積層造形法と同様に、三次元バイオプリンティングを含むバイオファブリケーション技術は、この場合生きた細胞と生体材料とを層ごとに組み立てることに基づき、三次元（３Ｄ）の生体構造物を製造する。これらの構造物は、個々の患者の臨床３Ｄモデルに基づき設計され、パーソナライズされた組織移植片（ｇｒａｆｔｓ）を製造することを可能にする。外耳または鼻の再建は、バイオプリントされパーソナライズされた移植片によって大幅に改善される可能性がある、臨床応用の一つである。このような移植片またはインプラントは、自己の細胞で作られる可能性もある。

しかしながら、大型のハイドロゲルベースの構造物は、機械的強度に限界があることが多く、手術中の機械的負荷に耐えられないため、移植という文脈での取り扱いには不向きとなる。

耳介軟骨組織工学のためのバイオプリンティング技術の概要は、Kesti（2018; DOI 10.3929/ethz-b-000280389）によって示されている。

Cohenら（2018; PLoS ONE 13(10): e0202356）は、ヒト耳介軟骨細胞とヒト間葉系幹細胞とを１：１の割合で移植することにより生成した、実物大の患者ベースのヒト耳を調査する研究について記載する。そのインプラントは成型（ｍｏｌｄｉｎｇ）によって作られている。実物大の小児の耳は２億個以上の細胞を必要とし、その容積は約１０ｍＬであることを考慮すると、非変形生検では小児サイズの耳を定着させるのに十分な細胞が得られないと著者は指摘している。そのうえ、耳介軟骨細胞はインビトロで増殖するが、単層培養すると脱分化する可能性があり、そのため耳介軟骨細胞と間葉系幹細胞との組み合わせが提案されている。この研究で観察されたさらなる問題は、実験動物に皮下移植する間に、耳の構成物が著しく収縮することであった。

Zhangら（Biomaterials (2014): vol. 35, pp. 4878-4887）は、ヒト小耳症軟骨細胞を骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）と共培養することにより、ヒト耳型軟骨を再生させたことを記載する。使用されたＢＭＳＣは動物由来で、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としてポリグリコール酸（ＰＧＡ）が使用された。第３継代培養（Ｐ３）の小耳症軟骨細胞により形成されたペレットは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンＩＩの発現が弱く組織構造がより緩むことを示し、軟骨形成能の明らかな低下を示すことが観察された。

WO 2016/092106 A1は、軟骨修復のための移植片スキャフォールドを供給する方法、具体的にはヒト患者における方法に関連する。この方法は、粒子および／または繊維、ゲル化多糖類の水溶液、および哺乳動物細胞を供給するステップ；印刷用混合物を得るために粒子／繊維 多糖類と細胞とを混合するステップ；および、印刷用混合物を三次元的形状に堆積させるステップを備える。

Kestiら（Adv. Funct. Mater. 2015; DOI 10.1002/adfm.201503423）は、優れた機械的および生物学的特性を持つ患者特有の軟骨移植片を産する、臨床に適合したバイオプリンティング方法を提示する。彼らは、インビトロで最大８週間培養された印刷された構造物の機械的特性が、天然の軟骨に比べて劣っていることを見出した。

Kestiら（BioNanoMat 2016; DOI 10.1515/bnm-2016-0004）は、ベストプラクティスガイドラインの基礎を確立することができるよう、再現性のあるバイオプリンティングを得るために、最も重要な材料およびバイオプリンティング工程のパラメータを調査するため、Ｖｉｖｏｆｌｏｗバイオインクを用いたパラメトリックスタディについて記載する。

まとめると、再建手術において有用であるためには、インプラントが作られる対象との互換性以外に、組織工学的に作製されたインプラントが手術に伴う負荷に耐える適切な機械的特性を有することが極めて重要である。

本発明者らは驚くべきことに、少なくとも８週間、具体的には１６週間という長いインビトロでの成熟期間により、軟骨細胞とバイオポリマー製剤とを含む三次元組成物が、高い機械強度とともに高い細胞生存率を達成できることを見出した。すなわち少なくとも７０％の生存率、具体的には少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の生存率である。特徴の、この予期できない有利な組み合わせにより、本発明の組成物は、ヒト患者のようなそれを必要とする対象への移植に、特に適するものとなる。

従ってここで与えられるのは、それを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有する三次元組成物であって、その組成物は軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含む。さらに与えられるのは、そのような三次元組成物を調製する方法であり、また軟骨細胞を含む組成物および関連するインプラントの医療用途である。

このように本発明は、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含む三次元組成物に関連し、前記三次元組成物はそれを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有する。

機械的安定性は、弾性係数（Ｅ）の決定によって定量化することができる。従ってその組成物は、具体的には少なくとも１８０ｋＰａ、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。

その軟骨細胞は、様々な組織源に由来することができ、具体的には耳介軟骨細胞、具体的にはヒト耳介軟骨細胞に由来しうる。

具体的にはその組成物は、骨髄由来幹細胞などの幹細胞を実質的に含まず、および／または軟骨前駆細胞などの前駆細胞を実質的に含まないものでありうる。さらにその組成物は、具体的には追加された組織粒子、追加された繊維、マイクロビーズおよびナノ粒子の少なくとも１つを含まず、さらに具体的にはこれらの構成要素すべてを含まない。

本発明によれば、非常に多様なバイオポリマーを使用することができる。いくつかの実施形態では、バイオポリマー製剤は、ゲランガムとアルギン酸とを含む。具体的には、そのバイオポリマー製剤は均質な架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤でありえ、そのゲランガムの含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約２％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）、具体的には約２．０％（ｗ／ｖ）～約３．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約２．５％（ｗ／ｖ）でありえ、および／またはそのアルギン酸の含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）、具体的には約１．０％（ｗ／ｖ）～約２．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約１．５％（ｗ／ｖ）でありうる。

特定の例示的実施形態では、そのバイオポリマー製剤は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、ＣａＣｌ_２架橋された２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤である。

その三次元組成物の形状は、特定のニーズおよび製造の可能性に応じて自由に選択することができる。例えばその組成物は、ウェッジ（ｗｅｄｇｅ）、組織工学的に作製されたヒトの鼻またはヒトの耳介、またはそれらの部分でありうる。

本発明はさらに、前述のいずれか一項に記載された三次元組成物を調製する方法に関連し、以下の各ステップを備える：
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物（ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．増殖させた軟骨細胞をバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより三次元組成物を得るステップ；
ｄ．三次元組成物内のバイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．三次元組成物を成熟させ、それにより軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する三次元組成物を形成することを可能にするステップ；
ここで軟骨細胞は、具体的には耳介軟骨細胞、より具体的にはヒト耳介軟骨細胞、より具体的にはヒト自己耳介軟骨細胞に由来する。

本方法の特定の実施形態によれば、そのバイオポリマー製剤はゲランガム／アルギン酸製剤でありえ、具体的にはバイオポリマー製剤の総体積を基準にして、２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤でありうる。

本発明による方法のステップｅ．が具体的にはインビトロで行われ、具体的には少なくとも８週間、より具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間行われる。またステップｅ．がインビボで行われうることも、本発明に包含される。

本発明はさらに、特定の方法によって得ることができる三次元組成物に関連する。従って本発明は三次元組成物に関連し、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、その組成物は以下の各ステップを備える方法によって得ることができる：
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．増殖させた軟骨細胞をバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより三次元組成物を得るステップ；
ｄ．三次元組成物内のバイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．三次元組成物を少なくとも８週間成熟させ、それにより軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する三次元組成物を形成することを可能にするステップ。

本発明はさらに、上述の三次元組成物の医療用途に関連する。いくつかの実施形態によれば、細胞組成物は医療において使用するために与えられ、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含み、細胞組成物は均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０～２４週間、より具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものである。上記で述べたように、成熟は具体的にはインビトロで行われる。

また細胞組成物が医療において使用するために与えられ、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含み、細胞組成物はバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。

本発明による具体的な医療用途は、無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療である。

最後に、本発明は聴覚の改善に使用するためのインプラントに関連し、少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を含み、インプラントはバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０～２４週間、より具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものである。

生産フローチャート 異なる時点における、２つの生産バッチに対する、血球計数盤により決定された細胞生存率のまとめ。バイオプリンティング後の生存率試験１日目～１７週目が、試験クーポンで行われた。エラーバーは標準偏差を示す。偏差の記載がない場合、サンプル数は１であった。 異なる成熟期間におけるクーポンの切片の押し込みの結果。２つの生産バッチについて、細胞性クーポン（実線）と無細胞性クーポン（破線）の両方を含む。 ４つの異なる時点での、２つの細胞性生産バッチの組織学的分析。対照として、天然の耳介軟骨を染色した。 すべての成熟時点における細胞性クーポンの高倍率（１０倍）、および天然の耳介軟骨の対照。すべての選択は、断面の染色強度が最も高いものを示す。スケールバー：６００μｍ。 ４つの異なる時点での、２つの生産バッチからの無細胞性クーポンの組織学的分析。 異なる時点での、２つの生産バッチについての９種の異なる遺伝子の遺伝子発現。 細胞性および無細胞性クーポンの代表的な画像、および異なる成熟段階における細胞性クーポンの平均重量。 長期にわたる成熟工程の間のＡＵＲ－Ｖ０４７の機械的特性、およびコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩ染色によるそれぞれの組織学的結果。

本発明は、第１の態様において、三次元組成物の供給に関するものであって、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、前記三次元組成物はそれを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有する。例示的な実施形態においてその組成物は、組成物１ｍＬあたり６百万～９百万の細胞、例えば、組成物１ｍＬあたり６百万、約７百万、約８百万または約９百万の細胞を含む。別の例示的な実施形態においてその組成物は、組成物１ｍＬあたり１２百万の細胞または組成物１ｍＬあたり１５百万までの細胞を含む。

その三次元組成物は、バイオプリンティングのようなレイヤーバイレイヤー堆積法（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いて調製することができる。従ってその組成物は、必要に応じて非常に多様な形状を有することができ、その中にはクーポン、ウェッジ、耳介または鼻の全体、具体的にはヒトの耳介または鼻、または、耳介または鼻の部分が含まれる。本明細書で使用される「クーポン（ｃｏｕｐｏｎ）」とは、三次元の基本的な幾何学的形状である。例えばクーポンは、球状、レンズ状、円筒状、円盤状、立方体、立方体状または円錐状の形状を有しうる。本明細書で使用される「ウェッジ（ｗｅｄｇｅ）」とは、例えばヒトの鼻またはヒトの耳介の部分、または、ヒトの鼻全体またはヒトの耳介全体など、解剖学的構造と形状および大きさが酷似している三次元的形状をいう。例として、ウェッジは大文字「Ｄ」のような形状であって、例えば左の直線部分が右の曲線部分よりも薄い形状でありうる。

耳介（ａｕｒｉｃｌｅｓ ｏｒ ｐｉｎｎａｅ）の部分、具体的にはヒトの耳介の部分は、耳輪（ｈｅｌｉｘ）、対耳輪（ａｎｔｉ－ｈｅｌｉｘ）、耳甲介（ｃｏｎｃｈａ）、耳株（ｔｒａｇｕｓ）、対耳株（ａｎｔｉ－ｔｒａｇｕｓ）、またはそれらの実質的な断片であってもよい。鼻の部分、具体的にはヒトの鼻は、鼻中隔（ｓｅｐｔｕｍ）、鼻翼（ａｌａｅ）、またはそれらの実質的な断片であってもよい。本明細書で使用される耳介または鼻の部分、具体的にはヒトの耳介の部分またはヒトの鼻の部分の「実質的な断片（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、完全な耳介の部分または鼻の部分の少なくとも約３分の１、すなわち約３３体積パーセントに相当する。複数の耳介または鼻の部分またはそれらの実質的な断片を組み合わせることは、本発明に包含される。例えば、耳輪と対耳輪は、耳甲介の半分に相当する断片と組み合わせてもよく、それが再建手術での使用に適していることもありうる。

例示的な実施形態において、その三次元組成物は合計で約２×１０^７の軟骨細胞、４×１０^７の軟骨細胞または６×１０^７の軟骨細胞を含みうる。

本明細書に記載の三次元組成物の機械的安定性が、本発明による用途に適しているかどうか決定することを可能にするパラメータが、弾性係数（Ｅ）である。弾性係数（Ｅ）は、材料の弾性変形に対する抵抗を測定する。従って本発明のいくつかの実施形態において、三次元組成物は少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。さらに具体的な実施形態において、弾性係数は、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａである。従って本発明のいくつかの実施形態において、弾性係数は約１８０ｋＰａ～約２６０ｋＰａの間であってよく、例えば１８０ｋＰａ～２６０ｋＰａ、または２００ｋＰａ～２６０ｋＰａであってよい。

弾性係数を決定する１つの確立された方法が、一軸押し込み試験（ｕｎｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）である。そこでは、小さい圧子（ｉｎｄｅｎｔｅｒ）を介して三次元組成物の表面に応力またはひずみが加えられ、その応答が経時的に観測される。その応力－緩和が観測される。得られたデータから、弾性係数（Ｅ）を決定することができる（実施例［方法］の段落参照）。従って本発明のいくつかの実施形態において、三次元組成物の弾性係数は一軸押し込み試験によって決定される。本発明による三次元組成物の機械的安定性を決定するためにさらに可能であるのは、組成物の試料の組織学的および／または免疫組織化学的分析であり、それらは弾性係数の決定を補足しまたはその代替として使用されうる。そのような分析には、当業者によく知られたＥＣＭ（細胞外マトリックス）成分の様々な染色が含まれる。試料は定性的に分析され、例えば細胞外マトリックスタンパク質の特定の組み合わせが組み合わせで観察される場合、機械的に安定であると分類される。非限定的な例として、ＩＩ型コラーゲン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびエラスチンの染色が組み合わせで陽性であり、任意でさらにＳＯＸ９の陽性染色と組み合わさっている試料は、十分な機械的安定性を有していると分類することができる。

本発明によれば、様々な供給源に由来する軟骨細胞を使用することができる。一般に、軟骨細胞は哺乳類起源、具体的にはヒト起源の細胞に由来する。組織工学にとって一般に、同種細胞すなわち他のドナーからの細胞、または自己細胞すなわち個々の患者自身からの細胞が、有利に使用される。軟骨細胞は様々な組織源から、例えば関節軟骨、鼻軟骨または耳介軟骨から由来しうる。具体的な実施形態において、三次元組成物の軟骨細胞は、耳介軟骨細胞、具体的にはヒトの鼻または耳介軟骨細胞に由来する。ある望ましい実施形態によれば、軟骨細胞はヒト自己耳介軟骨細胞に由来する。

軟骨細胞を得るための有利な方法の１つは、単離された初代軟骨細胞、具体的にはヒトの単離された初代軟骨細胞からの細胞増殖および成熟によるものである。

本発明によれば、軟骨細胞はバイオポリマー製剤内に分布している。このことは例えば、三次元組成物を組み立てる前に細胞の集団をバイオポリマーと混合すること、例えば本明細書に記載のバイオプリンティングによって達成することができる。

既に述べたように、本発明によれば三次元組成物の高い機械的強度を高い細胞生存率と組み合わせることができる、ということが驚くべきことに見出された。具体的には、本発明による三次元組成物の軟骨細胞の細胞生存率は、少なくとも７０％である。さらに具体的には、軟骨細胞の細胞生存率は、少なくとも８０％または少なくとも８５％である。ある望ましい実施形態においては、軟骨細胞の細胞生存率は、少なくとも９０％または少なくとも９５％にさえなる。

細胞の生存率を決定するための様々な確立された方法が当業者に知られており、例えば自動化セルソーティング（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（具体的にはフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ））または血球計算法（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）に基づく方法などがある。本発明の具体的な実施形態において、軟骨細胞の生存率は、欧州薬局方のモノグラフ「有核細胞の計数および生存率（Nucleated Cell Count and Viability（Ph. Eur. 2.7.29.））」に基づき、血球計算法により決定される。それに従い、細胞の生存率は、トリパンブルー染色および手動または自動計数による血球計算盤（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた顕微鏡試験によって決定することができる。

また本発明者らは、本発明による三次元組成物が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）などの幹細胞を実質的に含まない場合でさえも成功裏に使用できるということを、驚くべきことに見出した。 同様に、本発明による組成物は、軟骨前駆細胞などの前駆細胞を実質的に含まない場合でさえも成功裏に使用できる。

本明細書で使用される「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｏｆ）」とは、三次元組成物内の細胞の総数を基準として細胞の約２％未満、具体的には１％未満、０．５％未満または実に０．１％未満が、幹細胞または前駆細胞であることを意味する。

さらに本発明によれば、三次元組成物に組織粒子および／または繊維および／またはマイクロビーズおよび／またはナノ粒子のような構成要素を追加することは不要である。具体的には、本発明による組成物は、追加された組織粒子；追加された繊維；マイクロビーズ；およびナノ粒子の少なくとも１つを含まない。ある望ましい実施形態においては、本発明による組成物は、追加された組織粒子、追加された繊維、マイクロビーズ、およびナノ粒子のすべてを含まない。

本明細書で使用される「組織粒子（ｔｉｓｓｕｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」とは、ミンチ状にした組織、具体的には軟骨組織を指す。このような組織の例として、関節軟骨、髄核、半月板、気管、鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨、滑液、気管軟骨、硝子体、脳、肝臓、脊髄、筋肉、結合組織および皮下脂肪、膝蓋下脂肪体および小腸粘膜下組織を含む。組織粒子は、ミンチ状にすることに加え、さらなる処理がされていることもある。

本明細書で使用される「繊維（ｆｉｂｅｒｓ）」とは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のような合成繊維、またはエラスチン、レジリン、絹のような天然繊維およびそれらの誘導体でありうる。

「マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）」とは、一般に直径約０．１μｍ～約５ｍｍの合成ポリマー粒子である。

本明細書で使用される「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」とは、1つの構造上の寸法が１００ｎｍ未満である粒子状物質を含む、幅広い種類の材料を指す。

追加された組織粒子、追加された繊維、マイクロビーズ、およびナノ粒子の文脈で使用される「含まない（ｆｒｅｅ ｏｆ）」とは、組成物が特定の化合物を組成物の全重量に対して約０．５％未満、具体的には０．２５％未満、より具体的には０．１％未満または実に０．０％の割合で含むことを意味する。

同様に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはハイドロキシアパタイトのような難溶性カルシウムまたはストロンチウム化合物（２０℃での水への溶解度が１ｇ／１００ｍＬ未満）が三次元組成物に添加されることは、本発明によれば不要である。従ってある実施形態において、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）、リン酸カルシウム（Ｃａ_２（ＰＯ_４）_３）およびハイドロキシアパタイトはそれぞれ、組成物に外部から添加されていない。

特定の状況下または特定の細胞で、転写レベルで発現する遺伝子のパターンを決定し、細胞機能の全体像を与えるために、遺伝子発現プロファイリングを用いることができる。本発明の文脈において、ある実施形態によれば、請求項に係る組成物の細胞は、選択されたハウスキーピング遺伝子またはいくつかのハウスキーピング遺伝子、例えばグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、および軟骨細胞分化、ＥＣＭ産生および／または炎症に関連する選択されたマーカー遺伝子、の発現に関して分析されうる。例えば、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、アグリカンおよびインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）などの選択されたマーカー遺伝子の発現を、決定することができる。具体的には、遺伝子発現は相対的な遺伝子発現プロファイルによって特徴付けられ、すなわちハウスキーピング遺伝子と選択されたマーカー遺伝子との間の相対的な発現によって特徴付けられる。ある実施形態によれば、相対的な遺伝子発現プロファイル、例えば本発明による組成物からの浮遊細胞の試料のプロファイルは、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定される。

自己由来の軟骨細胞を使用する場合、当然ながらドナーごとのばらつきがある。いずれにせよ、遺伝子発現プロファイル、具体的には選択されたマーカーおよびハウスキーピング遺伝子の発現プロファイルは、具体的には最初の自己生検のものと一致することになる。

例として、いわゆるＣｔ値つまり「しきい値サイクル数」、すなわち増幅された産物の量が、参照遺伝子としてのＧＡＰＤＨについて検出可能な蛍光シグナルをもたらすのに十分であるサイクル数は、約１２～約１８、具体的には１２～１８の範囲に設定される。例示的な範囲は、１２．５４～１７．５７である。Ｃｔ値は試薬が制限されない指数関数的段階で測定されるため、リアルタイムｑＰＣＲは、反応中に存在するテンプレートの初期量を確実かつ正確に算出するために使用することができる。

例示的に選択されたマーカー遺伝子、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、アグリカンおよびインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）はそれゆえ、２^－ΔＣｔ値として決定されうる。例えば、コラーゲンＩＩ型／コラーゲンＩ型比の２^－ΔＣｔ値は１×１０^－４以上でありえ、コラーゲンＩＩ型の２^－ΔＣｔ値は１×１０^－２以上でありえ、アグリカンの２^－ΔＣｔ値は３．５×１０^－２以上でありえ、そしてＩＬ－１βの２^－ΔＣｔ値は５×１０^－６未満でありえる。

本発明で使用するバイオポリマーは、様々なものが利用可能である。本明細書で使用される場合、「バイオポリマー（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）」という用語は、植物、動物および微生物のような再生可能な資源に由来する高分子材料を意味すると理解され、その高分子材料は生体適合性（材料と宿主との適合性、例えば組織適合性および血液適合性）があり、生物に対して、具体的には哺乳類に対して無毒であり、インビボで分解可能、具体的には酵素分解可能であり、かつ例えばその架橋から構造物に一定の機械的安定性を供給できる。組織工学的な応用では、例えばアガロース、アルギン酸、セルロース、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロナン、デキストランおよびゲランガムが研究されてきた。またそのようなバイオポリマーを硫酸化したものも含まれる。

本発明の文脈において、バイオポリマー製剤は、組織工学での用途に適した１または複数のバイオポリマーを含む。具体的にはバイオポリマー製剤は、ゲランガムとアルギン酸とを含む。より具体的にはバイオポリマー製剤は、ゲランガムとアルギン酸とからなり、すなわち高分子化合物であるゲランガムおよびアルギン酸のみが、バイオポリマー製剤の構造成分であるが、しかし低分子（ＭＷ≦１０００Ｄａ）、および成長因子のように構造成分でない分子量１０００Ｄａ以上の化合物もまた、任意に存在することもできる。有利に存在しうる成長因子はＴＧＦ－β３であり、例えば１０ｎｇ／ｍｌの濃度である。

本明細書で使用される「構造成分（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」とは、そのままでまたは架橋後に、本発明の三次元組成物の形状を決定し維持するために必要な化学物質である。

本発明の具体的な実施形態において、三次元組成物に使用されるバイオポリマー製剤の全量は細胞と混合され、すなわち三次元組成物は均質なバイオポリマー製剤を含む。従ってこれら具体的な実施形態において、三次元組成物は、単一の、細胞含有バイオポリマー製剤（（細胞性）「バイオインク（ｂｉｏ－ｉｎｋ）」とも呼ばれる）のみを含み、すなわち組成物は、バイオポリマーの無細胞性の追加部分、例えば層によって補強されない。

具体的には、本発明の三次元組成物において使用されるバイオポリマー製剤は、架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤でありうる。架橋は様々な手段で行うことができ、おおまかに物理的架橋（例えばステレオコンプレックス（ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐｌｅｘ）および熱架橋）および化学的架橋（例えばラジカル開始剤、陽イオンまたは酵素を介して）に大別することができる。いくつかの実施形態によれば、バイオポリマー製剤は、化学的架橋された製剤であり、具体的には化学的架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、より具体的にはイオン的に架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤である。本明細書で使用される「ゲランガム／アルギン酸製剤（ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ／ａｌｇｉｎａｔｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、さらなるバイオポリマーのような組成物の構造成分として役立つさらなる化合物を、製剤が含まないということを意味する。

本発明による架橋を行う例示的な方法は、多価イオン、具体的にはアルカリ土類金属イオンの使用による方法である。本発明の三次元組成物のバイオポリマー製剤は、具体的にはカルシウムイオンまたはストロンチウムイオンでイオン結合により架橋されている。具体的には、多価イオンは、水溶性の高い陽イオン源から供給されていて（２０℃での水への溶解度が２５ｇ／１００ｍＬ以上）、例えば多価イオンは塩化ストロンチウムまたは塩化カルシウムにより供給されうる。ある実施形態においては、塩化カルシウムが使用され、具体的には約４０ｍＭ～約１２０ｍＭ、例えば約５０ｍＭの濃度で使用される。

本発明によりゲランガムがバイオポリマーとして使用される場合、バイオポリマー製剤内のゲランガムの量は著しく変化しうる。具体的には、ゲランガムの含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約２％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）の範囲にあり、より具体的には約２．０％（ｗ／ｖ）～約３．０％（ｗ／ｖ）、より具体的にはバイオポリマー製剤の総体積を基準にして約１．５％（ｗ／ｖ）である。ゲランガムは、例えば適当な量のグルコース水溶液（例えば、約３００ｍＭ）に溶解することによって使用のために調製することができ、緩衝化されていてもよい。同様に、本発明によりアルギン酸がバイオポリマーとして使用される場合、バイオポリマー製剤内のアルギン酸の量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）の範囲にあり、具体的には約１．０％（ｗ／ｖ）～約２．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約１．５％（ｗ／ｖ）である。アルギン酸は、例えば適当な量のグルコース水溶液（例えば、約３００ｍＭ）に溶解することによって使用のために調製することができ、緩衝化されていてもよい。

従って本発明のいくつかの実施形態において、バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、そのゲランガムの含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約２％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）、具体的には約２．０％（ｗ／ｖ）～約３．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約２．５％（ｗ／ｖ）である。

いくつかの実施形態によれば、バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、そのアルギン酸の含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）、具体的には約１．０％（ｗ／ｖ）～約２．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約１．５％（ｗ／ｖ）である。本発明によるバイオポリマー製剤は、３．５％（ｗ／ｖ）を超えるアルギン酸を含まない。

本発明のある望ましい実施形態において、バイオポリマー製剤は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、ＣａＣｌ_２架橋された２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤でありうる。

三次元組成物の例示的な特定の実施形態は、少なくとも９５％の細胞生存率を有するヒト耳介軟骨細胞由来の少なくとも６×１０^６の軟骨細胞と、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、架橋された２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤とを含み、その組成物は幹細胞および前駆細胞を実質的に含まず、かつ追加された組織粒子、追加された繊維、マイクロビーズおよびナノ粒子を含まず、その組成物は少なくとも２５０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。

上記で示したように、本発明による組成物は、ウェッジ、組織工学的に作製されたヒト耳介またはそれらの部分でありうる。そのような組成物は、外耳道の外で患者の頭蓋骨に配置されるのに適している。具体的には本発明の三次元組成物は、インビボ移植後も顕著な収縮を示さない。言い換えれば、その組成物は形成外科または再建外科での用途に適している。

さらなる態様において、本発明は本明細書に記載される三次元組成物の調製方法に関連する。その方法は、以下の少なくとも５つの必須ステップを備える。

第１のステップ（ステップａ．）において、単離された軟骨細胞はインビトロで増殖される。この増殖により収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞が得られる。いくつかの実施形態において、その増殖は任意に凍結保存ステップと組み合わされてもよい。

いくつかの実施形態によれば、ステップａ．は３つのサブステップを備えうる。すなわちサブステップ１）－単離した初代軟骨細胞を第１継代培養（Ｐ１）終了まで細胞増殖させるステップ；サブステップ２）－Ｐ１後の軟骨細胞を凍結保存するステップ；および、サブステップ３）－解凍し、第２継代培養（Ｐ２）の終了まで細胞増殖させるステップである。

さらなる実施形態によれば、ステップａ．は、サブステップ４）第３継代培養（Ｐ３）の終了まで細胞増殖させるステップを、さらに備えてもよい。

例えば、単離した軟骨細胞（第０継代細胞）を適切な量、例えば約１０^５の細胞を、補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）のような培地に接種し、第１継代培養が終了するまで培養する。そうして、細胞を回収、アリコートに均等に分割し、凍結保存することができる。続いて必要なら、必要な数の細胞アリコートを解凍し、次のステップ（ステップｂ．）に進む前に最終的な収集まで培養する。

ステップｂ．において、増殖させた軟骨細胞はバイオポリマー製剤と混合される。この製剤に使用できるバイオポリマーは、上述のように本明細書で説明したものである。具体的には、バイオポリマー製剤はゲランガム／アルギン酸製剤である。具体的な実施形態によれば、バイオポリマー製剤は２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤であり、ゲランガムとアルギン酸の割合はそれぞれ、バイオポリマー製剤の総体積を基準にしている。この混合するステップの結果として、バイオインク（すなわち細胞＋バイオポリマー製剤）が得られる。このバイオインクは、例えばバイオプリンティングに適している。具体的には、増殖させた軟骨細胞は、三次元組成物に使用されるバイオポリマー製剤の全量と混合することができ、中に細胞が均一に分布した均質なバイオポリマー製剤をもたらすことができる。従ってこれらの実施形態において、単一のバイオポリマー製剤が三次元組成物全体にわたり適用される。

ステップｂ．に続いて、バイオインクが面上に層状に堆積される（ステップｃ．）。この堆積はバイオプリンティングのようなレイヤーバイレイヤー堆積法で行うことができ、この堆積により三次元組成物が得られる。この組成物は、本明細書に記載されているように任意の形状、例えばヒトの鼻、ヒトの耳介またはそれらの部分の形状を有しうる。

具体的な実施形態によれば、化学的または生理学的に異なる層、例えば無細胞層と細胞層または異なる化学組成の層（異なる化学成分または同じ成分の異なる濃度など）は、堆積させるステップｃ．、具体的にはバイオプリンティングに使用されない。すなわち、堆積は単一の均質なバイオポリマー製剤で行われる。それにより、細胞含有バイオポリマー製剤層のみからなる三次元組成物が得られる。

続いて、三次元組成物内のバイオポリマー製剤が架橋される（ステップｄ．）。ステップｄ．は上述のように、任意の物理的または化学的な架橋を含みうる。具体的な実施形態によればステップｄ．は、化学的に架橋するステップ、具体的には多価イオンにより化学的に架橋するステップである。多価イオンを供給するために、具体的にはアルカリ土類金属塩が使用されうる。従って本方法のステップｄ．は、具体的にはアルカリ土類金属塩により架橋するステップ、より具体的には水溶性の高いカルシウム塩またはストロンチウム塩により架橋するステップ、より具体的には塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウムにより架橋するステップを含む。ある望ましい実施形態においては、架橋するステップｄ．は、例えば約４０ｍＭ～約１２０ｍＭ、例えば約５０ｍＭのような濃度の、塩化カルシウムを使用して行われる。例示的な実施形態において、架橋するステップは、ＣａＣｌ_２を含み例えば４℃の温度を有する培地中に、印刷された組成物を浸漬すること、または印刷容器にＣａＣｌ_２を加えることにより行われる。

本方法の最後の必須ステップ（ステップｅ．）において、三次元組成物は成熟を受ける。成熟により、軟骨細胞は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生し、適切な機械的安定性を有する三次元組成物を形成できるようになる。十分なＥＣＭを形成することが、適切な機械的安定性を達成するために重要である。重要なＥＣＭの構成成分は例えば、コラーゲンＩおよびＩＩである。具体的にはその組成物は、例えばヒト患者への移植の間、機械的負荷に耐えることができるような機械的安定性を有するものとする。バイオポリマー製剤は成熟時間に対して非常に安定しているため、バイオポリマーの濃度が大きくは変化しない。上記で示したように、弾性係数（Ｅ）が適切な機械的安定性のためのパラメータとして役立ちうる。従って本発明のいくつかの実施形態において、本方法のステップｅ．の終了時における三次元組成物は、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。さらなる具体的な実施形態において、弾性係数は少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａである。従って本発明のいくつかの実施形態において、弾性係数は約１８０ｋＰａ～約２６０ｋＰａの範囲でありうる。

具体的には、成熟させるステップｅ．はインビトロで行われる。インビトロでの成熟は、例えば細胞培養フラスコの中で適切な条件下で行われる（下記参照）。本発明者らは長いインビトロでの成熟が、結果として得られた三次元組成物の細胞生存率と機械的安定性の向上との両方に、正の効果を示すことを驚くべきことに見出した。従って成熟が、具体的にはインビトロでの成熟が、少なくとも８週間行われる。より具体的には、インビトロでの成熟は１０～２４週間、すなわち１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週間行われうる。より具体的には、インビトロでの成熟は少なくとも１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間行われうる。別の実施形態において、インビトロでの成熟は１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週間行われうる。このより長い成熟は、患者の手術の予定が成熟中に変更になる場合に必要となりうる。ある望ましい実施形態において、三次元組成物はインビトロでの成熟を１６週間受ける。

成熟がインビトロで行われる場合、いわゆる三次元培地（３Ｄ ｍｅｄｉｕｍ）が使用されうる。具体的にはそのような三次元培地は、ＨＡＭｓ Ｆ１２を伴う標準的なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をベースに、そこへ適切な濃度のＴＧＦ－β３、インスリン、トランスフェリン、セレンおよびアスコルビン酸を加えたものでありうる。本明細書に記載の細胞組成物＋バイオポリマーは、約３６℃～約３８℃の間の温度、具体的には約３７℃の温度で具体的には成熟させられる。大気条件は、具体的には正常酸素（例えば２１％Ｏ_２）または低酸素（例えば約５～１５％Ｏ_２）である。

本発明の別の実施形態において、成熟させるステップｅ．はインビボで行われる。インビボでの成熟は例えば、外科医が再建部位への移植の前に、場合によりバイオバンク（ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ）を行いたい場合に行われうる。インビトロでの成熟と同じく、インビボでの成熟は、少なくとも８週間行われ、具体的には１０～２４週間、すなわち１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週間行われる。より具体的には、インビボでの成熟は少なくとも１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間行われうる。別の実施形態において、インビボでの成熟は１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週間行われうる。ある望ましい実施形態において、三次元組成物はインビボでの成熟を１６週間受ける。

本調製方法に使用される軟骨細胞は、上述の通り本明細書に記載したように様々な供給源に由来するものでありうる。例えば、軟骨細胞は、関節軟骨、鼻軟骨または耳介軟骨に由来するものでありうる。具体的な実施形態において、使用される軟骨細胞は、鼻または耳介軟骨細胞、具体的にはヒト耳介軟骨細胞に由来する。ある望ましい実施形態によれば、軟骨細胞はヒト自己耳介軟骨細胞に由来する。

いくつかの実施形態によれば、本方法は上記以外のいかなるステップも備えない。すなわち本方法は上述のように以下の各ステップを備える。
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．増殖させた軟骨細胞をバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより三次元組成物を得るステップ；
ｄ．三次元組成物内のバイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．三次元組成物を成熟させ、それにより軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する三次元組成物を形成することを可能にするステップ。

さらなる態様によれば、本発明は三次元組成物に関連し、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、その組成物は以下の各ステップを備える方法によって得ることができる：
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．増殖させた軟骨細胞をバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより三次元組成物を得るステップ；
ｄ．三次元組成物内のバイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．組成物を少なくとも８週間成熟させ、それにより軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、三次元組成物を形成することを可能にするステップ。

これらの各ステップを行うことにより、有利な機械的安定性を有する三次元組成物が得られる。具体的には、このように得られた三次元組成物は少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。さらなる具体的な実施形態において弾性係数は、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａである。従って本発明のいくつかの実施形態において、弾性係数は約１８０ｋＰａ～約２６０ｋＰａの間の範囲でありうる。いくつかの実施形態によれば、本方法は上述のステップａ．からｅ．で構成される。

さらなる態様において、本発明はバイオポリマー製剤内の軟骨細胞の医療用途、例えば再建外科分野における用途に関連する。いくつかの実施形態によれば、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物が、医療における用途のために供給され、ここで細胞組成物は、バイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に存在する。この組成物は、少なくとも８週間の成熟期間を受けたものであり、成熟は具体的にはインビトロで行われた。さらに具体的には、成熟期間は１０～２４週続いたものであり、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週続いた。さらに具体的には、成熟期間は、具体的にはインビトロでの成熟期間は、１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週続いた。別の実施形態において、成熟期間は、具体的にはインビトロでの成熟期間は、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週続いた。

本発明のある望ましい実施形態において、記載されたバイオポリマー製剤内の細胞組成物は、１６週間の成熟を、具体的にはインビトロでの成熟を経ている。成熟条件、具体的にはインビトロでの成熟条件は、具体的には上述したものであり、すなわち三次元培地、約３６℃～約３８℃、および正常酸素または低酸素大気である。

いくつかの実施形態において、バイオポリマー製剤および軟骨細胞は、三次元構造に、具体的にはウェッジ、ヒト耳介またはそれらの部分の形状に配置されている。

成熟後のバイオポリマー製剤内の細胞組成物が使用されうる具体的な医療上の適応症は、無耳症または小耳症、または、例えば熱傷または犬に噛まれたことによる耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療である。従って本発明のいくつかの実施形態は、無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療のために、上述のように本明細書に記載された三次元組成物に関連する。

いくつかの実施形態によれば、医療において使用するための細胞組成物は、組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含み、バイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。別の実施形態によれば、弾性係数（Ｅ）は、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａである。従って本発明のいくつかの実施形態において、弾性係数は約１８０ｋＰａ～約２６０ｋＰａの間の範囲でありうる。いくつかの実施形態において、Ｅは少なくとも２５０ｋＰａである。弾性係数の決定は、上述のように本明細書で説明したように、例えば一軸押し込み試験により行うことができる。また例示的な医療用途としては、無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療がある。

医療において使用するための細胞組成物内にある軟骨細胞は、上述のように本明細書で説明したように、様々な供給源に由来するものでありうる。いくつかの実施形態によれば、医療において使用するための細胞組成物内に存在する軟骨細胞は、ヒト耳介軟骨細胞に由来し、具体的にはヒト自己耳介軟骨細胞に由来する。

さらなる態様によれば、本発明は聴覚の改善に使用するためのインプラントに関連する。耳介の中心的な機能は、音波を集め、増幅し、外耳道へ導くことであることはよく知られている。従って、再建手術により損傷し、変形しまたは欠損した耳介を修復することで、患者の聴覚を格段にそして再現性よく改善することができる。

本発明によるそのようなインプラントは、バイオポリマー製剤内に備えられた少なくとも約６×１０^７個の軟骨細胞を含む。例示的なインプラントは、約８ｍｌ～約１０ｍｌの体積および約５～５．５ｃｍ×約３～３．５ｃｍ×約０．８～１．３ｃｍの寸法（実物大の成人の耳）を有しうる。有利なことに、そのインプラントは適切な三次元構造、具体的には哺乳類、具体的にはヒトの鼻またはヒトの耳介、またはそれらの部分の形状を有する。例えば、そのようなインプラントは、鼻の、具体的にはヒトの鼻の１または複数の部分、例えば鼻中隔、鼻翼、または本明細書で定義されるそれらの実質的な断片でありうる。具体的には、そのようなインプラントは、耳介の１または複数の部分、具体的にはヒトの耳介の部分、例えば耳輪、対耳輪、耳甲介、耳株、対耳株、または本明細書で定義されるそれらの実質的な断片でありうる。インプラントの必要な形状によっては、耳介または鼻、またはそのような部分の実質的な断片の、複数の部分を１つのインプラントに結合することも、または別々のインプラントとして供給することも可能である。

移植中の機械的負荷に抵抗するのに十分に安定であるために、インプラントは少なくとも８週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものである。その成熟は、具体的にはインビトロで行われる。

いくつかの実施形態によれば、インプラントは、バイオポリマー製剤内に少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を含み、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する。別の実施形態によれば、弾性係数（Ｅ）は、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａである。いくつかの実施形態において、Ｅは少なくとも２５０ｋＰａである。弾性係数の決定は、上述のように本明細書で説明したように、例えば一軸押し込み試験により行うことができる。

さらなる態様において本発明は、無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療方法に関連し、上述のように本明細書に記載の三次元組成物を、それを必要とする対象に移植するステップを備える。

本発明は、以下の実施例および図面によりさらに説明される。

［方法］
一軸押し込み試験
押し込み（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）の機械的評価は，万能試験機（Zwick Z0.5；Zwick/Roell）で、Software testXpert III（同じくZwick/Roell）を使用し操作説明書に従って行われた。試料は最大ひずみまで一定速度で一軸圧縮を受ける。試験の間、試料にかかる力および長さの変化が連続的に測定され、関連する圧縮ひずみ／圧縮曲線が記録され、弾性係数（Ｅ）が決定される。具体的には、押し込みは試料、例えばクーポン、ウェッジ、耳介、の中央で行われ、平らな円柱状圧子（直径２ｍｍ）を使用して、０．０１ｍｍ／ｓの圧縮速度で１４％ひずみまで行われた。押し込み弾性係数（Ｅ）は、１～５％ひずみに相当する押し込み深さで分析された。

細胞培養
得られた軟骨生検はリン酸緩衝塩類溶液内で洗浄され、結合組織は軟骨のみが残るまで生検から除去された。それから軟骨はミンチ化され、組織から細胞を単離できるようにコラゲナーゼ溶液が軟骨材料の消化に使用された。細胞増殖は、約８０％の細胞コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が観測されるまで、定期的に培地を交換しながら行われた。細胞はそれからＰ１に継代され、再び約８０％のコンフルエンシーに達するまで培養された。この時点で、細胞が収集され、凍結保存のために調製された。十分な数の細胞が解凍され、二次元培養条件（ＤＭＥＭ+２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸+１０％ＦＢＳ）で約８０％のコンフルエントが観測されるまで増殖させた。細胞はそれからＰ２に継代され、再び約８０％のコンフルエンシーに達するまで培養された。この時点で、細胞は３０本の細胞培養フラスコから収集された。収集完了後、細胞は単一の細胞懸濁液内にプールされた。この懸濁液は遠心分離され、適切な量の培地に再懸濁され、バイオポリマー製剤と混合するために準備された。

バイオポリマー製剤およびバイオインクの調製
バイオポリマー製剤は、ゲランガムとアルギン酸とを滅菌・パイロジェンフリーのガラス瓶内で混合することにより調製された。初めに滅菌されたゲランガムが秤量され、無菌状態で混合瓶内に入れられた。緩衝グルコース溶液は、ゲランガムのみを含む混合瓶内にピペットで入れられた。マグネチックミキサー（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｘｅｒ）が加えられ、その瓶を９０℃に加熱したマグネチックスターラー（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）に置いた。ゲランガムが完全に可溶化された後、予め秤量されたアルギン酸が混合瓶に加えられた。混合は、均質なバイオポリマー混合物が得られるまで、９０℃で４５分間続けられた。混合後、その瓶を無菌状態に移し、高粘度のペースト状製剤が得られるまで連続的に混合する。バイオポリマー製剤は回収され、コンビストッパー（ｃｏｍｂｉ－ｓｔｏｐｐｅｒ）で閉じられたシリンジ内に充填され、さらに使用するまで２～８℃で保存される。

バイオインクの調製は、バイオポリマー製剤および細胞懸濁液を合わせる。保存されたバイオポリマー製剤のシリンジが無菌状態で開かれ、構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の印刷のために適切な量が無菌容器内で秤量される。細胞懸濁液は、Ｐ３細胞の収集後、バイオポリマー製剤と直接混合され、バイオインク中での細胞生存率を可能な限り高くすることができる。バイオインクはバイオプリンティング用シリンジ内に装填され、バイオプリンティングの工程に移行することができる。

バイオプリンティング
バイオプリンティングは一般に、参照により本明細書に組み込まれる共同出願WO 2019/106606 A1に記載されているように実施されうる。簡単に言うと、バイオインクを充填した印刷用シリンジを、パスボックスを介してプリンターに持ち込むことができる。印刷用シリンジは、プリンターのシリンジホルダーに取り付けたり、または差し込んだりすることができる。印刷用シリンジノズルはプライミング（ｐｒｉｍｅｄ）され、全ての溜まった空気が印刷システムから除去される。付加的な様式で、バイオポリマーは印刷用シリンジから押し出され、細胞構成物を形成することができる。

架橋
印刷工程の直後に、構成物セットは振とう台（ｓｈａｋｅｒ ｂｅｄ）に移される。５０ｍＭのＣａＣｌ_２を含む架橋溶液を印刷容器内に加え、印刷セットを架橋させる。印刷セットが操作され、または成熟工程への移行が可能になるまで、架橋時間は６０±５分である。

成熟
成熟工程は、生理的条件を模擬したインキュベータ内で行われた。産生セットは、１つの成熟容器内でまとめて成熟させた。ＤＭＥＭ ＨＡＭｓ Ｆ１２ ＋ １０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β３ ＋ ２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸 ＋ １％ＩＴＳを含む成熟培地が使用され、３～４日ごとに培地交換を行う。産生された構成物は１６週±７日間、成熟させた。

［実施例１：細胞の単離および増殖］
この実施例では、１人のドナーからの細胞について説明する。ドナーは３１歳で、軟骨生検は非小耳症的（ｎｏｎ－ｍｉｃｒｏｔｉｃ）であった。生検試料は耳介軟骨４８．８ｍｇで、組織１ｍｇあたり２１３９３個の生細胞が存在した。最終的な細胞懸濁液を作製する組織試料は、「組織提供プログラム（Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｏｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ）」と名付けられた別のプログラムから入手された。輸送は、ヒト組織の国際輸送のために検証および認定された輸送資材を使用して、認定された業者によって行われた。このプログラムには、２～８℃の温度制限がある。

得られた生検はリン酸緩衝塩類溶液で洗浄され、結合組織はメスとピンセットで、軟骨のみが残るまで除去された。それから軟骨はミンチ化され、組織から細胞を単離できるようにコラゲナーゼ溶液が軟骨材料の消化に使用された。Ｐ１終了までの細胞増殖は、標準的な作業手順に従って行われた。簡単に言うと、細胞は３～４日ごとの定期的な培地交換を行いながら、二次元培地（ＤＭＥＭ＋２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸＋１０％ＦＢＳ）で約８０％のコンフルエンシーまで培養された。細胞はそれからＰ１に継代され、再び約８０％のコンフルエンシーに達するまで培養された。この時点で、細胞が収集され、凍結保存のために調製された。合計１２本のバイアルが、それぞれ１．９４３百万の細胞を含み、液体窒素内に保存された。

２つの生産バッチ（ｂａｔｃｈｅｓ）が作成された。両方の生産バッチのために、凍結保存された細胞の２本のバイアルが、解凍され増殖された。細胞は３～４日ごとの定期的な培地交換を行いながら、二次元培地（ＤＭＥＭ＋２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸＋１０％ＦＢＳ）で約８０％のコンフルエントまで培養された。細胞はそれからＰ２に継代され、再び約８０％のコンフルエンシーに達するまで培養された。この時点で、合計３０本の細胞培養フラスコ（Ｔ１７５）での原薬収集が、２人のオペレーターにより１０本のフラスコの収集ブロックにて処理された。

各処理ブロックの収集後、細胞は単一の細胞懸濁液内にプールされた。この懸濁液は遠心分離され、印刷用に放出される前に、細胞の数に適した量の培地に再懸濁された。

［実施例２：バイオポリマー製剤、および細胞のバイオポリマーとの混合］
ゲランガム２．５％とアルギン酸１．５％とのバイオポリマー製剤が試験に用いられ、上記の［方法］の段落に記載された工程に従って生産された。

バイオプリンティングには、改良型バイオプリンターCellInk Inkredible+が印刷用に使用された。両方の産生物のために、４２０μＬの容量の試験クーポンが作製された。細胞性および無細胞性のクーポンが、両方の生産バッチで作製された。印刷されたクーポンは成熟培地に移される前に、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２中で６０±５分間架橋された。

各産生物から、クーポンは、蓋が取り外し可能な1つのＴ１７５細胞培養フラスコ内でまとめて成熟させた。以下の三次元培地が使用された：ｇｌｕｔａＭＡＸ添加ＤＭＥＭ ＨＡＭｓ Ｆ１２ ＋ １０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β３ ＋ ２５μｇ／ｍＬアスコルビン酸 ＋ １％ＩＴＳ。フラスコ１本あたり７０ｍＬ以上、または試験クーポン１枚あたり３．５ｍＬ以上が使用された。培地は３～４日ごとに交換された。クーポンは、３週、８週、１３週、および１７週±３日の期間、成熟させた。

［実施例３：原薬（ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ、ＤＳ）、バイオポリマー製剤、および医療品（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ、ＤＰ）の試験］
原薬リリース試験（ｒｅｌｅａｓｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）
原薬の特性および安全性について、異なる時点で試験を行った。簡単に言うと、Ｐ３細胞を収集する前に、細胞のコンフルエンシーおよび形態を確認するために目視検査を行った。７５～８５％のコンフルエンシーが確認された後、使用済み培地の試料を回収し、マイコプラズマおよび無菌試験を行った。最後の処理ブロックの収集後、細胞を単一バッチの細胞懸濁液にプールした。この細胞懸濁液を遠心分離し、エンドトキシン試験のため上澄みを回収した。これらの安全性試験に加え、細胞の生存率と数とを評価し、下表に示す遺伝子についてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子発現解析を行い、細胞の特徴を明らかにした。

バイオポリマー製剤試験
バイオポリマー製剤が完成した後、印刷特性および安全性が調べられ、具体的には無菌性、レオロジー（ｒｈｅｏｌｏｇｙ）、ｐＨおよびオスモラリティ（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）が試験された。

医療品の工程内試験およびリリース試験
原薬とバイオポリマーとの混合から最終的な医療品が得られるまで、試料の物理的、化学的および薬理学的特性について繰り返し試験を行った。例えば細胞増殖工程の後、放出された（ｒｅｌｅａｓｅｄ）原薬はバイオポリマー製剤と１：１０の割合で混合され、血球計算盤で細胞数および生存率を確認した。印刷された構成物内の細胞数および生存率は、血球計算盤で分析した。細胞の遺伝子発現は、消化後のクーポンで行った。解析した遺伝子を表１に示す。圧子を使用した機械試験が行われ、材料の弾性係数を決定した。

クーポンの組織学的評価は、固定後に表２に示す染色および免疫組織化学マーカーについて行われた。

［実施例４：長期間のインビトロ成熟の研究］
この予備研究においては、同じドナーからの２つの増殖物が、１７週まで成熟させた細胞性クーポンを作製するために使用された。構成物の成熟は細胞外マトリックス産生のための基盤が達成される工程のステップであるので、この経時的な進展をよく理解することが重要である。この理解を深めるため、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩのようなＥＣＭの形成、構成物の機械的特性との関係、細胞の生存率、機能性および数が、１７週の時間枠にわたって調査された。

クーポンの１つのバッチ（ＡＵＲ－Ｖ０４７）は１７週まで培養され、一方２番目のバッチ（ＡＵＲ－０１１）は１２週まで成熟させた。両方のバッチについて、試料は３週間の成熟後に試験され、９週、１２週、および１７週の時点で追加の工程試験が行われた。無細胞性クーポンは細胞性クーポンと同時に作製され、同じ条件下で培養され、該当する場合同じ試験体制に従った。

両方の生産バッチにおいて、細胞生存率は成熟の時間とともに上昇し、ＡＵＲ－Ｖ０４７では１７週の時点で９２．４％、ＡＵＲ－０１１では１３週の時点で８１．２％となった（以下の実施例４．３の詳細参照）。両バッチとも、生存率の上昇に同様の傾きを示している。バッチＡＵＲ－０１１は、ＡＵＲ－Ｖ０４７と比較して、細胞がバイオポリマーと混合された場合に、細胞生存率により大きな影響を示した。この生存細胞のより大きな損失は、１３週間の成熟を通して見られ、ＡＵＲ－０１１の細胞生存率はＡＵＲ－Ｖ０４７の細胞生存率を下回ったままであった。

ＭＴＳ試験による細胞活性は成熟工程を通して記録され、細胞生存率および細胞数に相関していると仮定される。全体として細胞活性の上昇は、成熟期間の３週と９～１３週との間に測定可能であった。各バッチの最後の時点では、減少が記録された。細胞生存率が上昇するにつれて、ＥＣＭ量の増加によりクーポンを通る拡散が制限されたことが、ＭＴＳ値がより低下した理由であると考えられる。

異なる成熟時点で試験クーポンから抽出された細胞の遺伝子発現プロファイルは、経時的な変化を示さない（以下の実施例４．６の詳細参照）。このことは、評価される遺伝子が成熟工程の初期に制御され、成熟期間を通してこのレベルが維持され、結果として組織学的に観察されるようなＥＣＭが沈着する、ということを示している。

クーポンの外観は、色および透明度に関し、細胞性と無細胞性の構成物の間で明らかな違いを示す（以下の実施例４．７の詳細参照）。色は、ｐＨ指示薬であるフェノールレッドの存在により、赤から黄色に変化する培地の色によって決定される。細胞が代謝して培地を使用するにつれて、より酸性の状態が生じ、赤から黄色への色の変化を引き起こす。無細胞性の培養物ではｐＨの変化が起こらないため、培地が赤色となり、その結果無細胞性クーポンは赤く着色される。細胞外マトリックスの沈着により、細胞性クーポンは透明度が低下し、見た目がより不透明になる。

成熟工程を通して、クーポンの全体的な形状は変化しない。１７週までの成熟期間中、バイオポリマーの分解または分解生成物は観察されず、バイオポリマーマトリックスの理論的な安定性を裏付けている。無細胞性クーポンはクーポン内に白い領域を示し、成熟期間を通して大きくなる。現在のところ、白い領域は沈殿しているイオン（主にカルシウムイオン）の蓄積であるという仮説がある。

クーポンの機械的特性は、３週～１７週の成熟の間に著しく向上する（以下の実施例４．４の詳細参照）。陽イオン濃度平衡に達した後、無細胞性クーポンの機械的特性は、３週間の成熟の後に停滞する。このことは、機械的特性の向上はすべて、内在する細胞により合成されるＥＣＭの産生によってもたらされることを証明している。

エラスチン、グリコサミノグリカンおよびコラーゲンＩ型とＩＩ型の組織学的分析がこの相関を裏付けている（以下の実施例４．５の詳細参照）。図９は、１７週の成熟期間を通してのコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩの力学的特性および組織学的分析を示す。このように、機械的特性はこの期間を通して継続的に向上している。沈着したコラーゲンＩＩについても同様の傾向が見られ、一方コラーゲンＩの存在は９週の時点で最大に達し、それ以降は減少する。このことは、機械的特性の向上が、コラーゲンＩよりもむしろコラーゲンＩＩの沈着によってより大きく支えられている、ということを示唆する。コラーゲンＩＩは天然の耳介軟骨のマトリックス内に見出すことができ、組織の機械的健全性の主な要素に関連している。機械的特性の向上および組織学的分析の両方が、１７週成熟させた試料は実際に軟骨様のＥＣＭを設けており、時間の経過とともに機能的な耳介軟骨を形成することが期待される、ということを示唆している。

［実施例４．１：印刷結果］
実施例２に従って得られたバッチについて、細胞および印刷の収量に関して分析した。

両方のＤＳ増殖に同じドナーが使用されたにもかかわらず、３０本のフラスコ収集からの細胞収量は非常に異なっていた。これは、収集時の細胞コンフルエンシーの差に帰することができ、コンフルエンシーはＡＵＲ－Ｖ０４７では７５％と推定され、一方ＡＵＲ－０１１では約８５％と推定される。

［実施例４．２：ＤＳおよびＤＰの安全性－無菌性、エンドトキシン、およびマイコプラズマ試験の結果］
ＤＳの段階およびすべてのＤＰ成熟期間の試料において、安全性に関するすべての出荷基準は要求に従っており、使用済み培地に細菌またはマイコプラズマの汚染、またはエンドトキシンの増加は認められなかった（表４）。

［実施例４．３：成熟期間中の細胞生存率および活性の評価］
実施例１および２に従って得られたバイオポリマーおよび印刷されたクーポン内の細胞生存率および代謝活性について、全工程を通して分析した。図２は、印刷前の工程間管理から成熟終了までの、血球計数盤により決定された細胞生存率の結果をまとめたものである。

細胞生存率は、両方のＤＳ収集物で高かった（９４～９７％）。バイオポリマーと接触すると、細胞生存率はそれぞれ６３％および７６％に低下した。この現象は、本発明による生産方法のよく知られた部分であり、細胞がバイオポリマーと混合される際にさらされるせん断力によって引き起こされる。両方の生産バッチにおいて、生存率は成熟１～３日後に最も低くなった。その後、それぞれの成熟期間の終了まで、生存率の安定した上昇が測定された。経時的な生存率の向上は、両方の生産バッチで同等である。

バッチＡＵＲ－０１１は、細胞がバイオポリマー製剤と混合された時点から、ＡＵＲ－Ｖ０４７よりも一貫して低い生存率を示している。両バッチとも同じドナーおよびバイオポリマー製剤を使用しているため、この差は混合工程によって生じたと考えられる。全体として最終的な生存率は、経時的に上昇するとはいえ、細胞とバイオポリマーとの混合中に維持できる生存率に依存すると結論づけられる。

［実施例４．４：クーポンの機械的特性］
両バッチの細胞性および無細胞性クーポンの機械的特性について、成熟工程を通して分析した（図３）。最初の弾性係数（印刷後１～３日）は高く、続いてその後３週間の成熟期間中に急激に低下する。成熟の初期段階（１～３日目）では、細胞性および無細胞性の全ての構成物の機械的特性は、バイオポリマーマトリックスのイオン性架橋によってのみ寄与される。初期の成熟期間中、カルシウムイオンは構成物から洗い流され、細胞培地からの他のイオンにより置換されながら、培地における平衡濃度に達する。これにより、ハイドロゲルの強度は低下する。時間の経過とともに、成熟培地の条件と一致した平衡状態が達成され、結果として成熟培養の２１日後の弾性係数は約１１５ｋＰａとなる。図３からわかるように、無細胞性構成物の機械的特性（破線）は、両方の生産バッチで、残りの成熟期間中、一定を保つか、またはさらにわずかな減少を示す。同時に、その後２１日目からの細胞性構成物（図３、実線）では、機械的特性が急勾配で向上するのを観測することができる。両生産バッチとも、機械的特性のピークには１３週と１７週のそれぞれの終点で達し、２５６ｋＰａおよび２９６ｋＰａとなる。無細胞性クーポンと比較すると、機械的特性はそれぞれの終点において、ＡＵＲ－０１１では２２７％、ＡＵＲ－Ｖ０４７では３８４％にまで向上した。さらなる成熟で、機械的特性のさらなる向上が期待できる。

［実施例４．５：クーポンの組織学的評価］
各成熟時点において、両バッチの試料クーポンについて異なる組織学的および免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を使用して分析した。図４は、異なる染色法および異なる時点でのクーポンの全画像を示す。対照として、天然の耳介軟骨の試料も含まれた。これらの低倍率画像は、成熟の異なる段階におけるクーポンの全体的な印象および潜在的な変化を定めるために示されている。

Ｈ＆Ｅ染色は、細胞を可視化するための概要染色であるため、染色強度は特に関係がない。この倍率では、細胞の数およびそれらの形態を分析することはできない。ワイゲルトのエラスチン染色とアルシアンブルー染色は両方とも、成熟期間とともに強度が増すように見え、エラスチン、グリコサミノグリカン、および軟骨様組織の増加を示している。しかしながらこの傾向は、アルシアンブルー染色と同様にグリコサミノグリカンにも結合するサフラニン－Ｏ染色では見られない。アルシアンブルー染色およびサフラニン－Ｏ染色は、非特異的なバックグラウンド染色を無細胞性構成物にある程度示し（図６）、これは成熟時間の経過とともに大きな変化を示さない。このことは、アルシアンブルー染色の染色強度の増加は、人工産物ではなく、グリコサミノグリカンの存在の増加を示すということを示唆する。

ワイゲルトのエラスチン染色の強度は、１７週成熟させたクーポンよりも天然の軟骨でずっと高く、一方アルシアンブルー染色およびサフラニン－Ｏ染色の強度は、１７週成熟させたクーポンと天然の軟骨との間でほぼ同等である。

低倍率では、成熟期間中のコラーゲンＩおよびＩＩの染色に最も大きな違いを観察することができる。コラーゲンＩの強度は、成熟２１日目ですでに高い。シグナルの強さは９週までさらに増加し、その後再び減少し始める。さらに、成熟期間中にはコラーゲンの異なる構造秩序が観察される。コラーゲンＩは、２１日目ではより壊れやすく無秩序であるように見え、時間の経過とともに均質性および秩序のレベルが向上している。コラーゲンＩの減少が観察されるところでも（１３週以降）、均質性（滑らかな変化、穴のない状態）および秩序のレベルは高いままであるように見える。天然の軟骨と比較すると、１７週でもコラーゲンＩの強度は高い。コラーゲンＩは修復軟骨と考えられるため、コラーゲンＩは時間とともに減少し続け、最終的にコラーゲンＩがない耳介軟骨を形成すると予想される。

コラーゲンＩＩの染色強度は成熟２１日目では弱いが、９週までには急激に増加し、１３週および１７週の試料ではそれぞれさらに濃くなることが観察された。１７週成熟させた構成物を天然の軟骨と比較すると、低倍率では全体的な強度は異ならないように見える。

図５は、図４に示したバッチＡＵＲ－Ｖ０４７の組織学的画像のより高い倍率（１０倍）を示す。すべての染色において、細胞は健全な形態を示し、時間の経過とともに小空洞（ｌａｃｕｎａｅ）の大きさと数が増加する。目視では、成熟の経過とともに細胞数が増加しているようには見えないが、しかしこの観察を確認するためには、Ｈ＆Ｅ染色による完全な細胞数分析が必要である。成熟３週間後には大部分が単細胞となり、それ以降の時点ではコンドロン（ｃｈｏｎｄｒｏｎｓ）と呼ばれる小さな細胞群を見出すことができる。成熟１７週後には、ほとんどの細胞が小さな群に属し、単細胞はごくわずかしか見出せない。ほぼすべての細胞が、健康な軟骨細胞の望ましい特性である、はっきり見える小空洞を示す。天然の軟骨と比較して、１７週成熟させた試料における細胞密度はより低い。天然の軟骨試料は１７週成熟させた試料と比較して、細胞の大きさがより小さく、小空洞も均一に丸くなっており、より高度に秩序立っていることを示す。

１７週成熟させた試料と天然の軟骨の間の最大の違いは、ワイゲルトのエラスチン染色およびコラーゲンＩ染色された試料において観察される。ワイゲルトのエラスチン染色を使用すると、天然の耳介軟骨はよりいっそう強く染色し、緻密な観察によりエラスチン繊維を確認することができる（細胞間の黒い糸）。１７週成熟させた試料においては、このような繊維のごく初期の形成が細胞に近接して観察できる（オレンジ色の矢印）。組織学的には、１７週成熟させた試料が最も進展しており、天然の耳介軟骨に向かって発達しているように見える。

図６は、細胞性クーポンと同じ期間培養された無細胞性クーポンの組織学的評価を示す。特有の染色であるコラーゲンＩとコラーゲンＩＩを除き、すべての染色はある程度のバックグラウンドを示す。バイオポリマーマトリックスは負に帯電した構造を有し、正に帯電した染色分子を引き寄せ、それらをマトリックス内に取り込む。バックグラウンド染色の強度は成熟工程を通して安定しているように見え、バイオポリマーの著しい損失が発生していないことを示す。

［実施例４．６：長期の成熟期間における細胞の遺伝子発現］
異なる成熟期間後の試験クーポンから抽出した細胞の遺伝子発現プロファイル（図７）は、全工程を通して異ならないように見える。このことはタンパク質の発現として特に興味深く、組織学的分析で観察されるようにコラーゲンＩは明らかに経時変化しており、工程の初期には増加し１７週の成熟の終わりに向けて減少している。このことは、細胞のＰＣＲ分析は、三次元成熟させた構成物内でのタンパク質産生の指標にしかなり得ないことを示す。いくつかの遺伝子で観察できるドナー間の小さな差は、有意ではなく、バッチ間のばらつきの一部である。

［実施例４．７：クーポンの外観および重量］
図８は、異なる成熟期間でのクーポンの外観、大きさおよび重量をまとめたものである。細胞性構成物の全体的な外観は、成熟工程を通して一定である。黄色の着色は、フェノールレッドを含む成熟培地の黄色に起因する。その黄色は、細胞の活動に起因するｐＨの低下を示す。細胞性クーポンは均質かつ不透明に見える。

無細胞性クーポンの着色は、フェノールレッドを含む培地に起因した赤で、細胞がないためにｐＨが下がらず、色が赤のままである。成熟工程を通して、無細胞性構成物の中に白い領域が次第に現れてくる。これらの領域は、時間の経過とともに大きくなる。最初の分析では、この白い領域はイオン性沈殿物に起因するとの仮定が成り立つ。細胞性構成物内では、そのような蓄積は見られない。細胞性および無細胞性クーポンの平均直径は、図８に示した値からわかるように、成熟期間中に変化しない。工程およびリリース管理の一部として、無細胞性クーポンの重量は測定されなかった。細胞性クーポンの重量は成熟期間とともに増加するように見えるが、しかし試料サイズが小さく、増加はクーポン体積の変動の結果でありうることに注意する必要がある。重量が増加する可能性は、クーポン内の細胞外マトリックスの産生が増加すること、および細胞数が増加する可能性があることにより説明することができる。この観察および仮説の妥当性を判断するには、さらなる調査が必要である。

本発明は、以下の各項目によりさらに特徴づけられる。

項目１． 三次元組成物であって、
組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、
前記三次元組成物はそれを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有し、
前記バイオポリマー製剤は、具体的には均質なバイオポリマー製剤である
三次元組成物。

項目２． 項目１に記載された組成物であって、
前記組成物は少なくとも１８０ｋＰａ、少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する
組成物。

項目３． 項目１または２に記載された組成物であって、
前記軟骨細胞は耳介軟骨細胞、具体的にはヒト耳介軟骨細胞に由来する
組成物。

項目４． 項目１～３のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記軟骨細胞は、単離された初代軟骨細胞、具体的にはヒトの単離された初代軟骨細胞から細胞の増殖および成熟によって得られる
組成物。

項目５． 項目１～４のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記軟骨細胞の細胞生存率が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である
組成物。

項目６． 項目１～５のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記細胞生存率が、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．７．２９に基づく血球計算盤によって決定される
組成物。

項目７． 項目１～６のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物が骨髄由来幹細胞などの幹細胞を実質的に含まない
組成物。

項目８． 項目１～７のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物が軟骨前駆細胞などの前駆細胞を実質的に含まない
組成物。

項目９． 項目１～８のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物が、以下の少なくとも１つを含まない
ａ．追加された組織粒子；
ｂ．追加された繊維；
ｃ．マイクロビーズ；および
ｄ．ナノ粒子、
具体的にはａ．ｂ．ｃ．ｄ．すべてを含まない
組成物。

項目１０． 項目１～９のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物に
ａ．炭酸カルシウム、および／または
ｂ．リン酸カルシウム、および／または
ｃ．ハイドロキシアパタイト
が外部から追加されない、具体的には炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびハイドロキシアパタイトのすべてが、より具体的には水に難溶性のカルシウムまたはストロンチウム化合物が、外部から前記組成物に追加されない
組成物。

項目１１． 項目１～１０のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記細胞は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定される、以下の相対的な遺伝子発現プロファイル：
－ ＧＡＰＤＨ（参照遺伝子）：Ｃｔ＝約１２～約１８
－ コラーゲンＩＩ型／コラーゲンＩ型比：２^－ΔＣｔ≧１×１０^－４
－ コラーゲンＩＩ型：２^－ΔＣｔ≧１×１０^－２
－ アグリカン：２^－ΔＣｔ≧３．５×１０^－２
－ ＩＬ－１β：２^－ΔＣｔ＜５×１０^－６
を示す組成物。

項目１２． 項目１～１１のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤がゲランガムとアルギン酸とを含む
組成物。

項目１３． 項目１～１２のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤がゲランガムとアルギン酸のみを構造成分とする
組成物。

項目１４． 項目１～１３のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、具体的には化学的に架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤である
組成物。

項目１５． 項目１３または１４に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤が多価イオンにより、具体的にはアルカリ土類金属イオンにより、より具体的にはカルシウムイオンまたはストロンチウムイオンにより架橋される
組成物。

項目１６． 項目１～１５のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、
前記ゲランガムの含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約２％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）、具体的には約２．０％（ｗ／ｖ）～約３．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約２．５％（ｗ／ｖ）である
組成物。

項目１７． 項目１～１６のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、
前記アルギン酸の含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）、具体的には約１．０％（ｗ／ｖ）～約２．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約１．５％（ｗ／ｖ）である
組成物。

項目１８． 項目１４～１７のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記多価イオンが塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウムにより、具体的には塩化カルシウムにより供給される
組成物。

項目１９． 項目１～１８のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記バイオポリマー製剤は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、ＣａＣｌ_２架橋された２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤である
組成物。

項目２０． 項目１～１９のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記弾性係数（Ｅ）が一軸押し込み試験により決定される
組成物。

項目２１． 項目１～２０のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物の機械的安定性が組織学的におよび／または免疫組織化学的に決定される
組成物。

項目２２． 項目１～２１のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記組成物はウェッジ 、組織工学的に作製されたヒトの鼻またはヒトの耳介、またはそれらの部分である
組成物。

項目２３． 項目２２に記載された組成物であって、
前記組成物は外耳道の外で患者の頭蓋骨に配置されるのに適している
組成物。

項目２４． 項目１～２３のいずれか一項に記載された三次元組成物を調製する方法であって、以下の各ステップ：
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．前記増殖させた軟骨細胞をバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．前記バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより三次元組成物を得るステップ；
ｄ．前記三次元組成物内の前記バイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．前記三次元組成物を成熟させ、それにより前記軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する前記三次元組成物を形成することを可能にするステップ
を備える方法。

項目２５． 項目２４に記載された方法であって、
前記軟骨細胞は耳介軟骨細胞、具体的にはヒト耳介軟骨細胞、より具体的にはヒト自己耳介軟骨細胞に由来する
方法。

項目２６． 項目２４または２５に記載された方法であって、
ステップａ．が以下の各サブステップ
１）単離した初代軟骨細胞を第１継代培養（Ｐ１）終了まで細胞増殖させるステップ；
２）Ｐ１後の軟骨細胞を凍結保存するステップ；
３）解凍し、第２継代培養（Ｐ２）の終了まで細胞増殖させるステップ
を備える方法。

項目２７． 項目２６に記載された方法であって、
ステップａ．がサブステップ
４）第３継代培養（Ｐ３）の終了まで細胞増殖させるステップ
をさらに備える方法。

項目２８． 項目２４～２７のいずれか一項に記載された方法であって、
前記バイオポリマー製剤はゲランガム／アルギン酸製剤であって、具体的にはバイオポリマー製剤の総体積を基準にして、２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤である
方法。

項目２９． 項目２４～２８のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｃ．はバイオプリンティングのようなレイヤーバイレイヤー堆積法で行われる
方法。

項目３０． 項目２４～２９のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｃ．は単一の均質なバイオポリマー製剤で行われる
方法。

項目３１． 項目２４～３０のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｄ．は化学的に架橋するステップ、具体的には多価イオンにより化学的に架橋するステップ、より具体的にはアルカリ土類金属塩により架橋するステップ、より具体的にはカルシウム塩またはストロンチウム塩により架橋するステップ、より具体的には塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウムにより架橋するステップ、より具体的には塩化カルシウムにより架橋するステップである
方法。

項目３２． 項目２４～３１のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｅ．がインビトロで行われる
方法。

項目３３． 項目２４～３１のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｅ．がインビボで行われる
方法。

項目３４． 項目２４～３３のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｅ．が少なくとも８週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間行われる
方法。

項目３５． 項目２４～３４のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｅ．が１０～２４週間、具体的には１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週間行われる
方法。

項目３６． 項目２４～３５のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップｅ．がインビトロで１６週間行われる
方法。

項目３７． 三次元組成物であって、
組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、
前記組成物は以下の各ステップ：
ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
ｂ．前記増殖させた軟骨細胞を均質なバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
ｃ．前記バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより細胞含有バイオポリマー製剤層からなる三次元組成物を得るステップ；
ｄ．前記三次元組成物内の前記バイオポリマー製剤を架橋するステップ；
ｅ．前記三次元組成物を少なくとも８週間成熟させ、それにより前記軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、前記三次元組成物を形成することを可能にするステップ；
を備える方法によって得ることができる
三次元組成物。

項目３８． 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
ここで前記細胞組成物はバイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものであり、
医療において使用するための
細胞組成物。

項目３９． 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
ここで前記細胞組成物はバイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものであり、
無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療方法において使用するための
細胞組成物。

項目４０． 項目３８または３９に記載された細胞組成物であって、
１０～２４週間、具体的には１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週間の成熟期間を経たものである
細胞組成物。

項目４１． 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
ここで前記細胞組成物はバイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有し、
医療において使用するための
細胞組成物。

項目４２． 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
ここで前記細胞組成物はバイオポリマー製剤内に、具体的には均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有し、
無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療方法において使用するための
細胞組成物。

項目４３． 項目３７～４２のいずれか一項に記載された細胞組成物であって、
前記軟骨細胞がヒト耳介軟骨細胞、具体的にはヒト自己耳介軟骨細胞に由来する
細胞組成物。

項目４４． 項目３８～４２のいずれか一項に記載された細胞組成物であって、
前記バイオポリマー製剤および軟骨細胞が三次元構造に、具体的にはウェッジ、ヒト耳介またはそれらの部分の形状に配置されている
細胞組成物。

項目４５． 項目３７～４４のいずれか一項に記載された細胞組成物であって、
前記成熟期間がインビトロでの成熟期間である
細胞組成物。

項目４６． 項目２４～３６のいずれか一項に記載された方法または項目３７～４５のいずれか一項に記載された組成物であって、
前記成熟が三次元培地内で、約３６℃～約３８℃の温度で、正常酸素または低酸素の条件下で行われる
方法または組成物。

項目４７． 項目１～２３のいずれか一項に記載された三次元組成物であって、
無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療のための
三次元組成物。

項目４８． 聴覚の改善に使用するためのインプラントであって、
少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を含み、
ここで前記インプラントはバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものである
インプラント。

項目４９． 項目４８に記載されたインプラントであって、
ここで前記インプラントは、１０～２４週間、具体的には１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週間の成熟期間を経たものである
インプラント。

項目５０． 項目４８または４９に記載されたインプラントであって、
前記成熟期間がインビトロでの成熟期間である
インプラント。

項目５１． 聴覚の改善に使用するためのインプラントであって、
少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を含み、
ここで前記インプラントはバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する
インプラント。

項目５２． 項目５１に記載されたインプラントであって、
弾性係数（Ｅ）が少なくとも２５０ｋＰａである
インプラント。

項目５３． 無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害を治療する方法であって、
項目１～２３のいずれか一項に記載された三次元軟骨組成物を、それを必要とする対象へ移植するステップを含む
方法。

Claims (15)

1. 三次元組成物であって、
   組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋された均質なバイオポリマー製剤とを含み、
   前記バイオポリマー製剤はゲランガムとアルギン酸とを含み、
   前記三次元組成物はそれを必要とする対象への移植に適した機械的安定性を有し、
   および
   前記組成物は少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する
   三次元組成物。
2. 請求項１に記載された組成物であって、
   前記組成物は少なくとも２００ｋＰａ、少なくとも２２０ｋＰａ、少なくとも２４０ｋＰａ、少なくとも２５０ｋＰａ、または少なくとも２６０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有する
   組成物。
3. 請求項１または２に記載された組成物であって、
   前記軟骨細胞は耳介軟骨細胞、具体的にはヒト耳介軟骨細胞に由来する
   組成物。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載された組成物であって、
   前記組成物が骨髄由来幹細胞などの幹細胞を実質的に含まず、
   および／または前記組成物が軟骨前駆細胞などの前駆細胞を実質的に含まず、
   および／または前記組成物が、以下の少なくとも１つを含まない
   ａ．追加された組織粒子；
   ｂ．追加された繊維；
   ｃ．マイクロビーズ；および
   ｄ．ナノ粒子、
   具体的にはａ．ｂ．ｃ．ｄ．すべてを含まない
   組成物。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載された組成物であって、
   前記バイオポリマー製剤は架橋されたゲランガム／アルギン酸製剤であり、
   前記ゲランガムの含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約２％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）、具体的には約２．０％（ｗ／ｖ）～約３．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約２．５％（ｗ／ｖ）であり、
   および／または
   前記アルギン酸の含有量は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）、具体的には約１．０％（ｗ／ｖ）～約２．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約１．５％（ｗ／ｖ）である
   組成物。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載された組成物であって、
   前記バイオポリマー製剤は、バイオポリマー製剤の総体積を基準にして、ＣａＣｌ_２架橋された２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤である
   組成物。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載された組成物であって、
   前記組成物はウェッジ（ｗｅｄｇｅ）、組織工学的に作製されたヒトの鼻またはヒトの耳介、またはそれらの部分である
   組成物。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載された三次元組成物を調製する方法であって、以下の各ステップ：
   ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物（ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
   ｂ．前記増殖させた軟骨細胞を、ゲランガムとアルギン酸とを含む均質なバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
   ｃ．前記バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより細胞含有バイオポリマー製剤層からなる三次元組成物を得るステップ；
   ｄ．前記三次元組成物内の前記バイオポリマー製剤を架橋するステップ；
   ｅ．前記三次元組成物を成熟させ、それにより前記軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する前記三次元組成物を形成することを可能にするステップを備え；
   ここで前記軟骨細胞は、具体的には耳介軟骨細胞、より具体的にはヒト耳介軟骨細胞、より具体的にはヒト自己耳介軟骨細胞に由来する；
   方法。
9. 請求項８に記載された方法であって、
   前記バイオポリマー製剤はゲランガム／アルギン酸製剤であって、具体的にはバイオポリマー製剤の総体積を基準にして、２．５％（ｗ／ｖ）ゲランガム／１．５％（ｗ／ｖ）アルギン酸製剤である
   方法。
10. 請求項８または９に記載された方法であって、
    ステップｅ．がインビトロで行われ、具体的には少なくとも８週間、より具体的には１０～２４週間、より具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間行われる
    方法。
11. 三次元組成物であって、
    組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞と、架橋されたバイオポリマー製剤とを含み、
    前記三次元組成物は以下の各ステップ：
    ａ．単離された軟骨細胞をインビトロで増殖させ、任意に凍結保存ステップと組み合わせて、それにより収集培養物から少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を得るステップ；
    ｂ．前記増殖させた軟骨細胞を、ゲランガムとアルギン酸とを含む均質なバイオポリマー製剤と混合し、それによりバイオインクを得るステップ；
    ｃ．前記バイオインクを面上に層状に堆積させ、それにより細胞含有バイオポリマー製剤層からなる三次元組成物を得るステップ；
    ｄ．前記三次元組成物内の前記バイオポリマー製剤を架橋するステップ；
    ｅ．前記三次元組成物を少なくとも８週間成熟させ、それにより前記軟骨細胞が細胞外マトリックスを産生し、移植に適した機械的安定性を有する前記三次元組成物を形成することを可能にするステップ；
    を備える方法によって得ることができる
    三次元組成物。
12. 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
    ここで前記細胞組成物は均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、１０～２４週間、具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものであり、
    医療において使用するための、具体的には無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療方法において使用するための
    細胞組成物。
13. 組成物１ｍＬあたり少なくとも約６×１０^６の軟骨細胞を含む細胞組成物であって、
    ここで前記細胞組成物は均質なバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも１８０ｋＰａの弾性係数（Ｅ）を有し、
    医療において使用するための、具体的には無耳症または小耳症、または、耳および／または鼻への持続的な損傷を伴う顔面傷害の治療方法において使用するための
    細胞組成物。
14. 請求項１１～１３のいずれか一項に記載された組成物であって、
    前記成熟期間がインビトロでの成熟期間である
    組成物。
15. 聴覚の改善に使用するためのインプラントであって、
    少なくとも約６×１０^７の軟骨細胞を含み、
    ここで前記インプラントはバイオポリマー製剤内に備えられ、少なくとも８週間、具体的には１０～２４週間、より具体的には１０、１２、１３、１４、１５、１６、または１７週間、より具体的には１６週間の成熟期間を経たものである
    インプラント。
    
    

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