KR20210019306A

KR20210019306A - Ｍａｔｒｉｌｉｎ-3 전처리 줄기세포 스페로이드 생산 방법, 및 그에 의해 도출된 연골질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210019306A
Application number: KR1020190098344A
Authority: KR
Inventors: 한인보; 박한수; 최혜민
Original assignee: 의료법인 성광의료재단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-02-22
Also published as: US20220296649A1; KR20210067988A; KR102384953B1; WO2021029651A1

Abstract

마트릴린-3 단백질을 포함하는 배지 중에서 줄기세포를 배양하고, 배양된 줄기세포를 배지 중에서 3차원 세포 배양하여 스페로이드를 생성하는 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 스페로이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 따르면, 연골질환의 예방 또는 치료 효과가 있다. 보다 구체적으로 성체줄기세포의 연골 분화를 더욱 촉진시킬 수 있고, 연골 재생에서 발생될 수 있는 탈분화 현상 및 비대화 현상을 감소시킬 수 있어, 보다 효과적인 연골조직 재생 방법을 제공할 수 있다.

Description

ＭＡＴＲＩＬＩＮ-3 전처리 줄기세포 스페로이드 생산 방법, 및 그에 의해 도출된 연골질환 예방 또는 치료용 조성물{Method for producing spheroid using matrilin-3 primed stem cells, and an substance for treating cartilage disease obtained thereof}

Matrilin-3 전처리 줄기세포의 스페로이드 생산 방법, 및 그에 의해 도출된 연골 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 연골 질환은 전 세계적인 인구의 고령화 현상으로 인해 그 치료법이 주목 받아 왔다. 특히 우리 나라의 경우 좌식 생활과 잘못된 생활습관 등으로 인해 50대 이하의 연령층에서도 발견되는 빈도가 현저하게 늘고 있는 것으로 보고된다. 연골 조직은 노화에 의해 연골 두께, 연골세포 수의 감소, 기질의 구성 변화, 및 세포의 기능에도 변화가 유발되지만, 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없는 조직으로서 손상 후 스스로 재생이 불가능한 것이 특징이기 때문에, 늘어가는 퇴행성 연골 질환의 발병률에 따라 치료법 개발 또한 관심이 더욱 집중되고 있다.

퇴행성 연골질환으로 인한 요통을 치료하기 위하여 기존에는 약물과 물리 치료 등의 보존적 요법이 주로 사용되었으며, 이러한 보존적 요법이 효과가 없는 경우에는 수술적 치료 또한 고려되고 있었다. 후자인 수술적 치료에 의하는 경우, 짧은 기간 내에 큰 폭의 통증 감소 효과는 있을 수 있지만 장기적으로 퇴행성 변화 악화 및 척추 불안정증이 유발되어 요통이 더욱 심해질 수 있었다. 즉, 기존의 수술적 치료는 퇴행성 연골질환을 근본적으로 치료하는 방법이 아니라는 한계점을 가지고 있었다.

이러한 한계점을 극복하기 위하여, 퇴행성 추간판을 재생하기 위한 다양한 생물학적 치료에 대한 연구가 계속 되어 왔다. 대부분의 시도는 부족한 성장 인자를 보충하는 방법이다. transforming growth factor(TGF)β, insulin like growth factor-1, bone morphogenic protein-2 와 같은 성장인자를 변형된 추간판 등 연골 조직에 주입해 기질생성을 자극할 수 있으나, 시간이 지남에 따라 주입된 성장인자는 생체 내 분해단백질에 의해 파괴되어 지속적인 주입이 필요하고, 다른 동물을 통해 만들어지기 때문에 고가의 생산 비용이 들어간다는 한계점이 있다. 이를 극복하기 위하여 유전자 조작을 통하여 성장 인자가 항시 발현되는 치료법에 대한 연구가 진행되었으나, 임상에 바로 적용하기엔 많은 한계점이 존재했다.

이러한 한계점을 극복하기 위한 치료법으로, 성체 줄기세포를 이용한 치료가 주목받고 있다. 성체줄기세포는 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등의 다양한 세포로의 분화가 가능해 세포치료제로서의 가능성이 충분하지만, 아직까지 많은 한계점이 존재하는 것이 사실이다. 구체적으로, 시술에 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 줄기세포의 표현형이 감소되며 탈분화 현상이 일어날 수 있다는 단점이 있다.

따라서 본 발명에서는 조직재생에 많이 이용되고 있는 줄기세포를 이용한 조직재생 중 줄기세포의 3차원 세포배양 방법을 연구하여, 보다 근본적인 치료법을 제시하고자 하였다.

본 발명의 목적은 마트릴린-3(Matrilin-3: MATN-3) 단백질을 포함하는 배지 에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 배지 에서 3차원 세포배양(3D cell culture) 하여 스페로이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 스페로이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 스페로이드를 포함하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 마트릴린-3(Matrilin-3: MATN-3) 단백질을 포함하는 배지 에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 배지 에서 3차원 세포배양(3D cell culture) 하여 스페로이드(Spheroid)를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어 "마트릴린-3(Matrilin-3: MATN-3) 단백질"이란, 매트릴린(matrilin)계 단백질로서, 폴 빌레브란트 인자 A 도메인 (von Willebrand factor A domain)을 구성하는 단백질 중 하나이며, 연골의 세포 외 기질에 존재할 수 있다.

상기 MATN3 단백질은 MATN3 유전자에 의해 발현되는 것일 수 있다. 상기 MATN3 단백질은 구체적으로 마우스 또는 인간 유래의 MATN3 유전자로부터 발현되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 인간 유래의 MATN3 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포"란, 여러 종류의 신체 조직으로 분화 할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 또한 미분화 상태에서 조건 설정 시 다양한 조직 세포로의 분화가 가능한 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 성체 줄기세포란, 분화 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체 단계에서 나타나는 줄기세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 본 발명에서 상기 줄기세포는 구체적으로 골수 유래, 배아 유래, 제대혈 유래, 그 외 태반, 치조골, 근육, 지방, 신경조직 등의 다양한 성체조직 유래의 중간엽줄기세포일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 줄기세포는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다. 종래 연골세포로의 분화를 위해서는 주로 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하여 왔으며, 골수에 비하여 지방-유래 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 분화능이 떨어진다는 점이 지적되었다. 본 발명의 일 실시예에서는 MATN3가 지방 유래 줄기세포의 연골 세포로의 분화능을 촉진한다는 것을 확인함으로써, 연골 세포 분화에서의 지방-유래 중간엽 줄기세포의 단점을 극복할 수 있다. 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 모두 이용될 수 있으나, 구체적으로는 인간, 마우스, 렛트, 토끼, 개, 소, 말, 돼지, 양, 고양이, 원숭이, 및 염소를 포함한 포유동물로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 계대 1(passage 1) 내지 계대 100의 줄기세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포는 계대 1 내지 계대 30의 성체줄기세포(adult stem cell)일 수 있고, 계대 1 내지 계대 100의 배아줄기세포(embryonic stem cell)일 수 있다. 또한 보다 구체적으로는 인간으로부터 유래된 세포일 수 있다. 또한 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal sterm cell: MSC)"는 다분화능 (multipotency)과 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있는 줄기세포를 의미하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 명세서에서 용어 "배양(culture)"이란, 분리된 세포를 배지에서 배양하는 세포배양 과정을 의미할 수 있다. 상기 배지는 줄기세포의 배양 시 일반적으로 사용되는 배지일 수 있다. 예를 들면, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 있다. 상기 배지는 글루코즈 (glucose), 인슐린 (insulin), 셀레늄 (selenium), 트랜스페린 (transferrin) 및 혈관내피세포성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF)를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양은 3차원 세포배양(3D cell culture)일 수 있다.

상기 3차원 세포배양이란, 종래 배지에서 배양하는 2차원적 배양이 아닌 3차원적으로 세포를 배양하는 배양방법이다. 생체와 유사한 환경을 체외에서 인공적으로 조성하여 세포가 모든 차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호작용할 수 있도록 허용하는 세포 배양 모델을 의미할 수 있다. 세포 외 기질로 구성된 3차원 공간에서 3차원적 배양이 이루어지면, 이때 영양분, 산소, 및 약물이 확산구배 및 투과로 세포에 공급되어 생체와 유사한 환경을 제공할 수 있다. 세포 상호간의 3차원 접촉 상호작용, 세포 분비물의 확산에 의한 측분비신호전달 등을 특징으로 할 수 있다. 기존 배양법과 비교하여 이질적 노출이 많고, 세포간 통신이 가능하며, 높은 분화율을 자랑하는 특징을 가질 수 있다.

상기 3차원 배양방법은 펠렛(pellet) 배양법, 고정 현탁액 배양법(static suspension), 회전 챔버 배양법(spinner/rotational chamber), 나노/마이크로 패턴 배양법(nano/micro pattern), 자기부양식 배양법(Magnetic Levitation), 고체 스캐폴드 인웰 배양법(Soild scaffold in well), 하이드로겔 인웰 배양법(Hydeogells in well), 하이드로겔스 온 마이크로필러 배양법(Hydrogells on microplillar), 하이드로겔스 인 마이크로패널 배양법(Hydrogells in microchannel), 행인드랍 배양법(Hang in drop), 유 모양 웰 배양법(U shape well), 및 브이 모양 웰 배양법(V shape well)으로 이루어진 군으로부터 선택될 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 3차원 세포배양은 펠렛(pellet) 배양을 적용할 수 있다. 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이며, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포 외 환경을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "스페로이드(spheroid)는 3차원으로 모델링 된 세포 구조를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 마트릴린-3 단백질은 연골 분화 및 재생에 연관성이 있으며, 줄기세포를 마트릴린-3로 전처리 시킬 경우 연골 세포로의 분화를 촉진하고 연골세포의 비대화 및 탈분화가 억제될 수 있다. 마트릴린-3 단백질을 5 내지 50ng/ml로 포함하는 배지 중에서 배양하는 것이 전처리 과정에 의한 효과가 가장 우수할 수 있다. 상기 농도 범위는 5 내지 45ng/ml, 5내지 40ng/ml, 5 내지 35ng/ml, 5 내지 30ng/ml, 5 내지 25ng/ml, 5 내지 23ng/ml, 5 내지 20ng/ml, 5 내지 18ng/ml, 5 내지 15ng/ml, 5 내지 13ng/ml, 5 내지 12ng/ml, 7 내지 40ng/ml, 7 내지 35ng/ml, 7 내지 30ng/ml, 7 내지 25ng/ml, 7 내지 20ng/ml, 7 내지 18ng/ml, 7 내지 15ng/ml, 7 내지 13ng/ml 일 수 있고, 5 내지 10ng/ml일 수 있다. 바람직하게는 5 내지 15ng/ml일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 10ng/ml일 수 있다.

또한 80시간 내지 130시간 동안 줄기세포가 배양될 때에 마트릴린-3의 전처리 과정에 의한 효과가 가장 우수할 수 있다. 상기 시간 범위는 80 내지 130시간, 80 내지 130시간, 80 내지 125시간, 80 내지 125시간, 90 내지 130시간, 90 내지 130시간, 90 내지 125시간, 90 내지 125시간, 100 내지 125시간, 100 내지 125시간, 110 내지 130시간, 115시간 내지 125시간일 수 있다. 바람직하게는, 110 내지 130시간 내외일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 120시간일 수 있다.

또한, 본 발명의 3차원 세포배양 과정은 마이크로웰 당 50 내지 500개의 세포 범위에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 세포의 범위는 마이크로웰 당 50 내지 450, 50 내지 400, 50 내지 430, 50 내지 400, 50 내지 430, 50 내지 380, 50 내지 350, 50 내지 330, 50 내지 300, 50 내지 280, 50 내지 250, 50 내지 220, 50 내지 200, 50 내지 180, 50 내지 150, 50 내지 140, 50 내지 130, 60 내지 150, 70 내지 150, 80 내지 150, 90 내지 150, 또는 100 내지 150 일 수 있다. 바람직하게는, 80 내지 150 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 마이크로웰당 125개 일 수 있다.

상기 줄기세포 스페로이드는 성체줄기세포로부터 연골세포의 분화를 유도하는 효과를 가지는 것일 수 있다. 더불어 연골세포의 비대화 및 탈분화를 억제하는 효과를 가질 수 있다. 또한 환자에게 채취된 수핵세포와 공배양 시킬 경우 수핵세포를 재생시키는 효과를 가질 수 있다. 세포외 기질 성분이 회복되는 것 또한 확인할 수 있다. 상기 스페로이드를 추간판과 같은 연골 조직에 투입하는 경우 연골세포가 분화되어 연골세포의 재생이 일어나는 효과를 가질 수 있다.

또 다른 양상은, 상기 방법에 의해 제조된 스페로이드를 제공하는 것이다. 상기 스페로이드는 성체줄기세포로부터 연골세포의 분화를 유도하는 효과를 가지는 것일 수 있다. 더불어 연골세포의 비대화 및 탈분화를 억제하는 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 스페로이드는 3차원 세포배양된 구조로서 환자에게 채취된 수핵세포와 공배양 시킬 경우 수핵세포를 재생시키는 효과가 있고, 세포외 기질 성분이 회복되는 것 또한 확인할 수 있다. 상기 스페로이드를 추간판과 같은 연골 조직에 투입하는 경우 연골세포가 분화되어 연골세포의 재생이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

또 다른 양상은, 상기 방법에 의해 제조된 스페로이드를 포함하는 연골질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 예를 들어, 마트릴린-3(Matrilin-3: MATN-3) 단백질을 포함하는 배지 중에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및 배양된 줄기세포를 배지 중에서 3차원 세포배양(3D cell culture) 하여 제조된 스페로이드를 포함하는 연골질환 예방 또는 치료용 조성물을 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 성체줄기세포를 유효성분으로 더 포함할 수 있다.

상기 성체줄기세포는 구체적으로 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.

상기 마트릴린-3, 배양, 줄기세포, 스페로이드는 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 용어 "연골질환"은 연골 질환이란 연골 분화 및 재생을 필요로 하는 연골에 관련된 질환을 의미한다. 상기 연골질환의 예시로서, 퇴행성 추간판, 골관절염, 퇴행성 디스크, 추간판 탈출증, 퇴행성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상, 골연화증, 연골손상, 또는 연골결손이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 연골질환은 퇴행성 추간판, 추간판 탈출증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 연골손상 및 연골결손으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 내재성 줄기세포 또는 이식된 치료용 줄기세포의 연골세포로의 특이적 분화를 유도함으로써 관절 내 연골조직의 재생을 촉진할 수 있다. 따라서 종래의 염증제어와 같은 대중적인 접근방법이 면역기능 이상에 기인한 염증반응으로 관절조직이 파괴되는 류마티스성 관절염을 치료하는 데에 그치는 것과 달리, 폭넓은 관절질환의 치료가 가능하다. 더불어 퇴행성 추간판 치료와 골 관절염의 근본적인 치료를 가능하게 할 수 있다.

또한, 본 발명의 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 개체의 연골 손상 및 결손의 치료에 이용될 경우 성체줄기세포와는 별도로 도입되거나 또는 성체줄기세포와 동시에 체내에 도입될 수 있다. 즉, 성체줄기세포의 투여 전이나 후, 또는 성체줄기세포의 투여와 동시에 마트릴린-3 단백질을 포함하는 조성물이 별도로 투여될 수도 있다. 이 경우 상기 약학적 조성물은 마트릴린-3 단백질의 투여에 적합한 공지의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

상기 마트릴린-3 단백질 및 성체줄기세포를 포함하는 약학적 조성물이 투여되는 개체가 인간일 경우 상기 성체줄기세포는 약학적 조성물이 투여하게 될 환자 자신의 것이 바람직할 수 있다.

상기 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절 내로 직접 주입될 수 있다. 또한, 상기 성체줄기세포의 투여량은 1Х10⁴ 내지 1Х10⁸ 세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 변경될 수 있다. 또한 주입시 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경료, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 조성물의 양 및 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 줄기세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시킬 수 있으며, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 따라 분화 유도된 연골세포 또는 본 발명의 약학적 조성물은 각종 연골 질환 치료를 위한 세포 치료제로 이용될 수 있다. 세포치료제는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.

본 발명의 세포 치료제는 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 렛트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유동물의 연골 손상부에 적용하여, 연골의 재생(분화)을 촉진시키기 위해서, 또는 관절 내에 주입 투여하여 연골손상의 치료를 위해서 이용될 수 있다.

상기 세포 치료제는 공지의 방법에 따라 환자의 관절 내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드(scaffold)와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 조성물 또는 세포치료제는 연골형성을 위한 지지체 상에 접종되어 연골 손상부에 적용될 수 있다. 상기 지지체로 스폰지, 겔, 섬유 및 미세구슬(microbead) 등의 여러 가지 형태를 사용할 수 있으며, 구체적으로 세포부착률을 향상시킬 수 있고, 부피에 대한 고율의 표면장력을 유지할 수 있는 다공성 구조를 사용할 수 있다.

또 다른 양상은, 상기 연골질환 또는 예방용 조성물을 연골질환을 예방 또는 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 연골질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 연골질환, 예방, 치료의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

상기 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 비강, 복강, 피하 또는 국소 투여일 수 있으며, 국소 투여는 예를 들면 병변에 직접, 또는 병변 주위에 투여 일 수 있다. 상기 투여는 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수 있다.

본 발명의 일 양상은 줄기세포의 Matrilin-3 단백질 전처리 과정의 조건과 기간을 설정한 스페로이드 생산 방법을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 방법으로 인해 생산된 스페로이드와 이를 포함하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다. 일 양상에 따른 조성물을 사용할 경우 연골 재생과 세포외기질의 증가를 촉진시킬 수 있고, 탈분화 현상 비대화 현상 또한 감소시킬 수 있어, 결과적으로 더 효과적인 연골질환 치료 및 연골조직 재생 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 스페로이드 형성 방법과 효능 확인의 순서를 조식화하여 나타낸 이미지이다.
도 2는 지방 줄기세포를 연골 분화 유도 배양액에서 배양할 때의 마트릴린-3 mRNA와 단백질 발현의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 3은 마트릴린-3 전처리 후 배양된 줄기세포 내 연골화 관련 마커인 콜라겐2(collagen 2)와 아그레칸(aggrecan)의 발현 증가를 나타내는 그래프이다.
도 4는 마트릴린-3의 농도를 다르게 한 각각의 전처리 후 3차원 펠렛조직의 연골화 관련 마커 콜라겐2(collagen 2)와 아그레칸(aggrecan)의 발현 증가를 나타내는 그래프이다.
도 5는 지방줄기세포 전처리 시 마트릴린-3의 용량을 각각 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml으로 하고, 전처리 기간을 1일(24시간), 3일(72시간), 5일(120시간)으로 하여 실험한 결과를 나타내는 그래프이다; G1은 줄기세포 단독, G2는 줄기세포에 10 ng/ml 의 마트릴린-3를 처리한 그룹, G3은 줄기세포에 20 ng/ml 마트릴린-3를 처리한 그룹, G4는 줄기세포에 50 ng/ml 마트릴린-3를 처리한 그룹을 의미한다. A는 Live and dead assay, B는 Proliferation assay, C는 연골 관련 마커 SOX9, collagen 2, 및 aggrecan의 mRNA 발현을 이용한 사이토카인의 분석방법이다.
도 6은 실험 최적 조건의 확립을 위해, 총 6개의 조건으로 디자인한 것을 나타내는 이미지이다; 6개의 조건은 지방유래 줄기세포 단층(monolayer)조건, Matrilin-3를 처리한 지방유래 줄기세포 단층(monolayer)조건, microwell 당 125개의 세포로 형성된 지방유래줄기세포 스페로이드 조건, Matrilin-3를 처리한 microwell 당 125개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건, Matrilin-3를 처리한 microwell 당 250개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건, 마트릴린-3 를 처리한 microwell 당 500개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건을 말한다.
도 7은 마트릴린-3을 이용하여 지방줄기세포를 5일 동안 전처리 후, 스페로이드를 형성하기 위한 최적조건 확립하기 위한 실험의 결과를 나타내는 그래프이다; G1은 MSCs 단층 배양 그룹, G2는 마트릴린-3로 전처리한 MCSs 단층 배양 그룹, G3은 MSCs 스페로이드 그룹, G4는 마트릴린-3로 전처리한 MCSs 스페로이드 그룹(마이크로웰당 125개의 세포), G5는 G4는 마트릴린-3로 전처리한 MCSs 스페로이드 그룹(마이크로웰 당 250개의 세포)그룹을 나타내며, A는 Live and dead assay, B는 세포사멸의 마커인 p53 및 BAX의 mRNA 발현, C는 Ad-MSCs와 primed Ad-MSCs의 조건부 배지에서 성장 인자 및 사이토카인을 결정하는 데 사용되는 인간 사이토카인 어레이 분석, D는 양성 대조군으로 표준화 된 신호 밀도(signal densities), E는 양성 대조군으로 표준화 된 신호 밀도(signal densities)를 나타낸 이미지이다.
도 8은 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행된 수핵세포를 공배양 시킨 결과, 연골분화 마커는 증가하고, 연골 비대 마커는 감소한 결과를 나타내는 그래프이다; A는 dNPs에서 연골 분화 마커 SOX9, 콜라겐 2 및 aggrecan의 mRNA 발현을, B는 mRNA 연골 비대 마커(hypertrophy markers)의 발현을 나타내었다; 연골 비대 마커의 예는 콜라겐 10(collagen 10), 콜라겐 1(collagen 1) 및 dNP의 MMP13이다(***p<0.001, **p<0.01, * p<0.05).
도 9는 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행된 수핵세포를 공배양 시킨 결과를 나타내는 그래프이다; A는 카드헤린 2(cadherin 2), B는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulphate), C는 콜라겐 1(collagen I)의 면역형광법 이미지와 dNPs의 florescent intensity를 나타내는 것이다(***p<0.001, **p<0.01, * p<0.05).
도 10은 후복막 접근법에 의한 퇴행성 요추 추간판 토끼 모델 제작 과정을 나타내는 이미지이다; 오른쪽의 이미지는 다양한 크기의 스피널 니들을 사용한 결과, 18게이지의 니들을 삽입하였음을 나타낸다.
도 11은 T MRI를 이용한 퇴행성 요추 추간판 재생 검증 결과를 나타내는 이미지이다; 빨간색 화살표는 결함을 일으킨 부분을, 파란색 화살표는 이와 대비되는 정상 부분을 나타내고, 왼쪽에서부터 차례대로 아무 처리도 하지 않은 그룹, 줄기세포만을 투여한 그룹, 마트릴린-3를 전처리한 줄기세포를 투여한 그룹, 줄기세포 스페로이드를 투여한 그룹, 마트릴린-3로 전처리한 줄기세포 스페로이드를 투여한 그룹의 척추 MRI 분석 이미지이다.
도 12은 MRI에서 나타난 결과를 좀 더 자세히 규명하기 위해서 masson's trichrome 대한 조직염색을 실시한 결과를 나타내는 그래프이다; 위에서부터 차례대로 아무 처리도 하지 않은 그룹, 줄기세포만을 투여한 그룹, 마트릴린-3를 전처리한 줄기세포를 투여한 그룹, 줄기세포 스페로이드를 투여한 그룹의 조직학적 분석 결과이다. 맨 아래의 G5이 지방줄기세포 스페로이드를 주입한 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 실험 결과의 모식도를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. MATN3 단백질이 인간 지방 유래 줄기세포의 연골분화에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 MATN3 단백질이 인간 지방 유래 줄기세포의 연골분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인간 지방-유래 MATN3 단백질 처리를 위한 세포로 인간 지방-유래 줄기세포를 이용하였다.

1.1. 인간 지방-유래 줄기세포의 분리

인간 지방-유래 줄기세포를 분리하기 위해, 지방흡입 (liposuction) 방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하여 인산완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS)로 세척하였다. 세척된 지방조직을 1.5 mg/ml의 콜라게나제로 처리한 다음, 눈금 70 ㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 용혈 완충액(0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)으로 적혈구를 제거하고, PBS로 세포를 2회 세척하여 지방-유래 줄기세포를 얻었다. 얻어진 지방-유래 중간엽 줄기세포를 다시 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 항균제를 함유한 DMEM 배지에 1 x 104/cm₂ 농도로 접종하여, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양접시에 배양하였다. 세포들이 바닥 면적의 80%를 차지할 때, 트립신/EDTA를 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 세포를 다시 상기 배지로 현탁하여 동일하게 3회 계대 배양한 후 다음 실험에 사용하였다.

1.2. 줄기세포의 연골화유도에 따른 마트릴린-3의 발현 증가 확인

총 2 Х 105개의 지방유래 줄기세포를 15 mL falcon tube에 수집하고 120rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 원심분리후 생성된 지방줄기세포 pellets을 배양물을 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양하였다. Pellet을 둘로 나누어 무혈청배지 (serum free, SF)와 연골형성 배지 (CF: chondrogenic media)를 처리하였다. 연골형성 배지는 고농도 DMEM 포도당(DMEM-high glucose), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100Х ITS(insulin-transferrin-selenium), 50 μg/ml 아스코르브산(ascorbic acid), 100-nM 덱사메타손(dexamethasone), 1Х 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin), 10-ng/ml TGF-β가 포함된 것을 이용하였다. 3일 마다 배지를 교환해주었으며, 21일 동안 배양한 후에 무혈청 배지와 연골형성 배지에서 배양된 지방 줄기세포의 마트릴린-3 발현 증가를 비교하였다.

결과적으로 줄기세포의 연골화 유도에 따라 마트릴린-3의 mRNA 발현과 단백질 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 2). 더불어 지방 줄기세포를 연골 분화 유도 배양액에서 배양할 때, 마트릴린-3의 분비는 증가하는 것 또한 확인할 수 있었다(도 3). 이를 통해 본 발명자들은 마트릴린-3가 연골 분화와 관련이 있는 단백질임을 확인할 수 있었다.

1.3. 연골 관련 유전자의 발현 분석

지방-유래 줄기세포에서 MATN3 단백질의 처리가 연골 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 3회 계대 배양된 세포를 회수하여 2 x 105 개의 지방-유래 줄기세포로 나누고 1,200 rpm에서 3분간 원심 분리하였다. 수득한 세포를 펠렛 배양 형태로 FBS가 없는 DMEM 배지의 배양환경에서 MATN3 단백질이 존재하는 그룹과 존재하지 않는 그룹으로 분획하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 얻어진 세포의 정량분석을 위하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (Qeuntitative real-time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)을 수행하여 연골 관련 유전자의 RNA 발현을 측정하였다. 즉, 얻어진 펠렛 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 트립신/EDTA로 세포를 회수하고, 트리졸(TRIzol, Life Techologies, Inc. Grand Island, NY) 방법을 통하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 1 ㎍를 cDNA synthesis kit (AB biosystems)를 이용하여 합성하였으며, Master SYBR green (AB biosystems)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제 (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 이용하여 노멀라이즈를 수행하였으며, qRT-PCR에 사용된 프라이머 세트 및 각각의 연골 관련 유전자 마커는 다음 표 1과 같다. 이를 통해 본 발명에서는 MATN3 단백질 처리가 연골 관련 유전자의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있다 (도 4).

Gene	Primer sequence	Accession number	Amplicon (bp)
18S	5'- GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3' 5'-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3'	NR_003286.2	151
SOX9	5'- GTA CCC GCA CTT GCA CAA C- 3' 5'- TCT CGC TCT CGT TCA GAA GTC -3'	NM_000346.3	74
Collagen 2a	5'- GGGAGTAATGCAAGGACCA - 3' 5'- ATCATCACCAGGCTTTCCAG - 3'	NM_001844.4	175
Aggrecan	5'- GCC TGC GCT CCA ATG ACT - 3' 5'- ATG GAA CAC GAT GCC TTT CAC - 3'	NM_013227.3	104

실시예 2. 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드 제조 과정과 재생효과 확인

2.1 지방줄기세포를 마트릴린-3로 전처리 용량과 전처리 기간 선정

마트릴린-3 전처리를 위한 줄기세포로 인간 지방-유래 줄기세포를 이용하였다. 먼저 세포를 12시간 동안 영양공급하지 않은 후 전처리 과정을 진행하였다. 이 때, 전처리 시의 마트릴린-3의 농도와 전처리 기간의 적절한 설정이 문제되었다. 본 실험에서, 지방유래 줄기세포의 마트릴린-3 전처리 농도를 확립하기 위해 마트릴린-3 농도 조건을 각각 10ng, 20ng, 50ng으로 설정하였고, 전처리 기간은 1일, 3일, 5일 각각 설정한 뒤 수확하였다.

상기 마트릴린-3의 용량과 전처리 기간이 최적의 조건인지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 그 다음으로 6 well plate(EZSPHERE)에 옮겨 48시간 후 사이토카인 분석(cytokine array)을 진행하였다. 사이토카인 분석은 샌드위치 면역 측정 원리를 이용한 Ray biotech Ltd의 C-series를 이용하여 커스터마이징한 막을 이용하였다. 커스터마이징한 막의 디자인은 표 2와 같다. 측정 후 디지털 이미지로 시각화된 결과를 각 단백질에 배수 변화를 계산하여 SOX9, 콜라겐 2(CollagenⅡ), 아그레칸(Aggrecan)의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 인간유래 지방줄기세포를 분리하고 마트릴린-3 농도가 10 ng/ml일 때, 5일 동안 전처리한 경우에, 유전자의 함량 및 합성 정도가 가장 높은 것을 확인하였으며(도 5b), 연골분화 마커(콜라겐 2, 아그레칸)가 최대로 발현되었음이 확인되었다(도 5c). 결과적으로 상기 조건이 마트릴린-3 줄기세포 전처리 시 연골분화 효과를 최대로 발휘할 수 있는 기간 및 용량임을 확인할 수 있었다.

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

1

POS

NEG

TGF-β1

TGF-β2

TGF-β3

SDF-1

bFGF

EGF

G-CSF

RANTES
(CCL5)

2

POS

NEG

TGF-β1

TGF-β2

TGF-β3

SDF-1

bFGF

EGF

G-CSF

RANTES(CCL5)

3

IL-11

IL-1β

IL-6

MMP-1

MMP-9

TNF-α

TIMP-1

TIMP-2

HGF

VEGF

IGF-1

GDF-15

4

IL-11

IL-1β

IL-6

MMP-1

MMP-9

TNF-α

TIMP-1

TIMP-2

HGF

VEGF

IGF-1

GDF-15

5

BMP-2

BMP-7

BMP-9

Adipsin

MMP-13

Activin-A

IL-4

IL-10

Matrilin-3

IL-1ra

BLANK

POS

6

BMP-2

BMP-7

BMP-9

Adipsin

MMP-13

Activin-A

IL-4

IL-10

Matrilin-3

IL-1ra

BLANK

POS

2.2.마트릴린-3 전처리 후, 스페로이드 형성 조건 표준화

다음으로, 본 발명자들은 마트릴린-3 전처리 후 스페로이드 형성의 최적 배양환경 조건을 결정하기 위한 실험을 실시하였다. 지방유래 줄기세포 단층(monolayer)조건, Matrilin-3를 처리한 지방유래 줄기세포 단층(monolayer)조건, 마이크로웰 당 125개의 세포로 형성된 지방 유래 줄기세포 스페로이드 조건, Matrilin-3를 처리한 마이크로웰 당 125개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건, Matrilin-3를 처리한 마이크로웰 당 250개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건, 마트릴린-3 를 처리한 마이크로웰 당 500개의 세포로 형성된 지방유래 줄기세포 스페로이드 조건까지 총 6개의 배양 조건을 설정하였다(도 6).

인간유래 지방줄기세포를 세포배양 플레이트에 넣고 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배양 12시간 후, 배양배지를 혈청 결핍배지 (DMEM-LG 및 1x 페니실린 및 스트렙토마이신)로 변경하고 CO₂ 배양기에서 12시간동안 배양하였다. 혈청 고갈 12시간 후, 배양 배지에 10ng/mL의 matrilin-3를 보충하였다. 배양액은 신선한 matrilin-3 보충제로 24시간마다 5일 동안 교체되었다. 그 다음 6-well plate (EZSPHERE 6-well plate)에 상기 줄기세포를 옮기고, 마이크로웰 당 125개의 세포를 넣고 DMEM (Dulbecco's modied Eagle's medium) 저농도 포도당(DMEM low glucose) 에 FBS (Fetal Bovine Serum)가 10 %, Gentamicin (50㎍/㎖) 혼합액 3mL을 넣어준 후, 37℃, 5% CO2로 설정된 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이 과정을 통해 스페로이드를 형성하였다. 결과적으로 125개의 세포를 넣었을 때가 아폽토시스 마커 발현이 가장 적었으며(도 7b), 연골 생성과 관련된 사이토카인의 분비가 가장 많이 증가함을 확인하였다(도 7c 내지 e).

지방유래 줄기세포의 마트릴린-3 전처리 농도조건, 배양환경, 배양기간을 종합적으로 분석한 결과, 전처리 농도가 10ng/ml이고, 배양기간이 5일이며, 배양환경이 마이크로웰 당 125개의 세포를 넣고 스페로이드를 형성하는 것일 때 최적화의 배양 환경 시스템이 되고, 결과적으로 가장 연골 생성 효과가 뛰어남을 확인하였다

실시예 3. 마트릴린-3 전처리 스페로이드의 퇴행된 수핵세포의 재생효과 분석

3.1 마트릴린-3 전처리된 스페로이드와 수핵세포의 공배양 실시

본 발명자들은 상기 방법으로 형성된 스페로이드의 연골 수핵세포 재생효과를 확인하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 먼저, 상기 실시예 2.2와 같이 스페로이드를 형성한 후, 10일 동안 퇴행성 요추 추간판으로 인한 수술을 받은 환자로부터 수핵세포를 채취하였다. 병원 내 IRB(Institutuional Review Board) 승인을 획득한 이후에 경추 또는 요추 수핵탈출증으로 추간판 제거수술을 받는 환자에게서 미리 동의서를 획득하였다. 수술 중에 얻은 추간판으로부터 수핵과 섬유테를 분리하고 수핵에서 수핵세포를 분리하였다. 수핵에서 수핵세포를 분리하기 위해 1 % 페니실린과 스트렙토마이신(Gibco, BRL, USA)을 함유 한 Dulbeccos phosphate buffered saline(DPBS; Hyclone Laboratories)을 사용하여 15 분 동안 세 번 세척 하였다. 조직 샘플을 6 시간 동안 0.05 % (w / v) 타입 2 콜라게나제 (시그마 알드리치, St Luis, NJ, USA)로 분해 하였다. 분해된 혼합물을 세포 여과기 (40 ㎛ 공극 크기, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)로 옮기고 1000 rpm에서 5 분간 원심 분리하고 HBSS로 두 번 세척하여 남아있는 콜라게나제를 제거 하였다. 10 % FBS, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 100 ㎍ / ㎖ 페니실린을 첨가 한 DMEM-LG에 세포를 현탁시키고, 85 % 콘 플루 언트 될 때까지 배양 하였다. 획득한 수핵세포와 마트릴린-3 전처리된 스페로이드와 공동배양 실험에 사용하였다.

3.2. 마트릴린-3 전처리된 스페로이드의 수핵세포 재생효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 3.1의 공배양 후, 세포의 정량분석을 위해서 연골 관련 마커의 발현을 확인하였다. 정량분석은 연골관련마커의 RNA 양을 측정하는 방법으로 진행되었다. RNA는 TRIzol kit (ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 추출하였고, 다음으로 Primescript RT 시약 키트 (Takara Bio Inc, Japan)를 사용하여 0.5 μg의 RNA를 사용한 상보적 DNA(complementary DNA)를 준비하였다. 상기 상보적 DNA를 StepOnePlus Real Time PCR System을 사용하여 RT-PCR 증폭을 수행하였다. 증폭 후 각각의 표적 유전자에 대하여, 상대적인 mRNA 발현 수준을 계산하였다. 계산 방법은 18-S의 발현 수준을 내부 대조로 사용하여 2-ΔCt 방법으로 계산하는 방법을 이용하였다. 실시간 RT-PCR분석에 사용된 표적 프라이머는 표 3에 나타내었다.

Gene	Primer sequence	Accession number	Amplicon (bp)
18S	5'- GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3' 5'-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3'	NR_003286.2	151
SOX9	5'- GTA CCC GCA CTT GCA CAA C- 3' 5'- TCT CGC TCT CGT TCA GAA GTC -3'	NM_000346.3	74
Collagen 2a	5'- GGGAGTAATGCAAGGACCA - 3' 5'- ATCATCACCAGGCTTTCCAG - 3'	NM_001844.4	175
Aggrecan	5'- GCC TGC GCT CCA ATG ACT - 3' 5'- ATG GAA CAC GAT GCC TTT CAC - 3'	NM_013227.3	104
Collagen A1	5'- CCC CTG GAA AGA ATG GAG ATG - 3'5'- TCC AAA CCA CTG AAA CCT CTG - 3'	NM_000088.3	148
MMP13	5'- TCA CCA ATT CCT GGG AAG TCT - 3'5'- TCA GGA AAC CAG GTC TGG AG - 3'	NM_002427.3	95
Collagen 10	5'- ACG CTG AAC GAT ACC AAA TG - 3'5'- TGC TAT ACC TTT ACT CTT TAT GGT GTA- 3'	NM_000493.3	101
p53	5'- GGCCCACTTCACCGTACTAA - 3'5'- GTGGTTTCAAGGCCAGATGT - 3'	NM_000546	156
BAX	5'- TTTGCTTCAGGGTTTCATCC - 3'5'- CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA - 3'	NM_001291428.1	246

그 결과, 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행된 수핵세포와 공배양을 하는 경우, 연골 분화 마커인 SOX9, 콜라겐2, 및 아크레칸의 발현은 증가하고 연골 비대(hypertrophy)마커인 콜라겐 10 및 콜라겐 1의 발현은 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

더불어, 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행된 수핵세포의 효과를 확인하기 위해 면역조직화학염색을 실시하였다. 면역조직화학염색 검사를 위해, 10 일 동안 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드 및 마트릴린-3 전처리되지 않은 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행성 수핵세포를 공배양하였다. 이 세포를 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드로 10 분간 고정시키고, 1x PBS (phosphate buffered saline)로 3 회 세척하고 0.5 % Triton-X로 10 분간 투과시켰다. 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 10 % 정상 염소 혈청을 함유하는 블로킹 버퍼(blocking buffer: 5 % BSA 및 0.5 % Tween-20 중 1x PBS)에서 45 분 동안 차단시켰다. 면역 염색을 위해 카드헤린-2 (1 : 200, Abcam), 콘트로이틴 설페이드 (1 : 100, Abcam) 및 콜라겐 1 (1 : 200, Abcam)과 함께 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 2 차 항체는 goat anti-rabbit Alexa Fluor® 568과 goat anti-mouse Alexa Fluor® 488 (Abcam)으로 실온에서 1 시간 동안 항온 배양 하였다. 세포를 DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 대조 염색하고 Cytation 3 Cell Imaging 다중 모드 판독기 (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 이미지를 획득 하였다. 검출 된 자동 형광 강도를 사용하여 발현을 분석 하였다.

마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드와 퇴행된 수핵세포를 공배양하는 경우, 퇴행된 수핵세포의 재생 및 세포 외 기질 성분이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 세포 외 기질 중 카드헤린 2(cadherin 2)와 코드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)가 증가하고(도 9 a, b), 콜라겐 1(collegen I)의 발현은 감소하는 것을 확인하였다(도 9 c).

실시예 4. 토끼 퇴행성 추간판 질환모델에서의 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드의 연골 재생 효과 확인

4.1 토끼 모델의 준비 및 치료 물질 이식

퇴행성 추간판 질환 모델 내에서 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드가 추간판 재생에 미치는 영향을 평가하였다.

분류된 그룹은 총 5개이며, G1은 지방줄기세포 주입: G2은 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 주입 G3은 지방줄기세포 스페로이드 주입, G4는 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드 주입하였고, G5은 마트릴린-3 전처리된 줄기세포 스페로이드를 주입하였다. 모든 그룹의 토끼는 암컷 3마리로 설정하였다.

토끼 모델의 준비는, 분석을 위하여 차의과학대학교 동물실험윤리위원회의 허가를 얻어 무게 2.5kg 이상 New Zealand White rabbit을 대상으로 퇴행성 요추 추간판 모델을 제작하였다(도 10). 실험은 마트릴린-3 전처리 줄기세포 스페로이드를 이용한 추간판 재생 치료법에 대한 비임상 실험으로, 수술을 위해서 졸레틸(Zoletil) 15 mg/kg과 럼푼(Rompun) 5 mg/kg을 혼합하여 근육주사를 통해 마취하였다. 마취 후 절개하였고, 절개 후 후복막 접근법을 통해 직접 요추 추간판을 노출하였다. 시술은 제 3-4번, 제 4-5번, 그리고 5-6번 요추에 시행하였다. 보다 자세하게는, 요추 3-4번, 4-5번, 5-6번 사이의 추간판을 노출시키고, 18게이지의 스피널 니들(spinal needle)을 삽입하여 추간판 손상을 가하고, 추후 퇴행성 요추 추간판이 유도되는 시점에 실험군마다 치료물질을 삽입하였다. 투여 경로는, 퇴행성 요추 추간판 유도를 위해 수술한 반대편의 피부 절개를 통해 상기 번호의 추간판을 노출시킨 다음, 치료물질을 직접 주입하였다. 투여 시기는 디스크모델 제작 후 2주 되는 시점이며, 투여 횟수는 단회 투여로 하였다. 투여방법은 마취 후 26게이지 척추바늘을 5mm깊이로 주입하는 방식을 채택하였다. 투여 시 면역억제제는 투여되지 않았다. 치료 물질 삽입 후 12 주째에 유효성 평가를 위해 MRI 촬영 및 조직학적 검사를 시행하였다.

4.2. MRI 결과 확인

본 실험에서, 추간판의 퇴행성 변화 정도를 평가하기 위하여 MRI 촬영을 실시하였다. 제작된 토끼 모델 중에 퇴행성의 기준인 Pfirrmann grade 3이상의 동물을 사용하였다. 본 실험에서 영상학적 지표로는 MRI 촬영을 통한 T2 강조 영상(repetition time/echo time; 2000/120ms)을 이용하였다. 다섯 그룹의 토끼 모델의 MRI 촬영을 진행하였다. 그 결과 Sham 그룹, 지방줄기세포 주입 그룹, matrilin-3 전처리 지방줄기세포 주입 그룹, matrilin-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드 주입 그룹 모두에서 퇴행성 요추 추간판의 재생이 확인되었다. 그러나 그 효과의 정도에 대해 본 발명에서 matrilin-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드 주입 그룹의 추간판의 신호강도와 재생 효과가 다른 군과 비교하여 가장 높은 것을 확인하였다. 결과적으로 matrilin-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드의 퇴행성 요추 추간판 재생 효과를 확인할 수 있었으며, matrilin-3 전처리 지방줄기세포 형태보다 우수한 효과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.

4.3. 조직학적 분석 결과 확인

MRI에서 나타난 결과를 좀 더 자세히 규명하기 위해서 masson's trichrome 방법으로 조직염색을 실시하였다. 상기 염색은 Weigert iron hematoxylin 용액에 10분간 핵을 염색시킨 후, Biebrich scarlet-acid fuchsin 용액에 15 분간 세포질 및 근육을 염색시키고, 2% 아닐린 블루(Aniline blue) 용액에 3분간 교원섬유를 염색시키는 방법으로 진행되었다. 상기 염색을 실시한 뒤 결과물을 현미경으로 관찰하였다. 결과적으로, 마트릴린-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드를 주입한 결과 다른 그룹에 비해 추간판 재생이 잘 되었음을 확인할 수 있었다. 또한 matrilin-3 전처리 지방줄기세포 스페로이드가 matrilin-3 전처리 지방줄기세포 보다 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(도 12).

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION Chung-Ang University Industry Cooperation Foundation <120> Method for producing spheroid using matrilin-3 primed stem cells, <130> PN127380 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of 18S <400> 1 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of 18S <400> 2 gtacccgcac ttgcacaac 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of SOX9 <400> 3 gtacccgcac ttgcacaac 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of SOX9 <400> 4 tctcgctctc gttcagaagt c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen2a <400> 5 gggagtaatg caaggacca 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen2a <400> 6 atcatcacca ggctttccag 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of aggrecan <400> 7 gcctgcgctc caatgact 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of aggrecan <400> 8 atggaacacg atgcctttca c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen a1 <400> 9 cccctggaaa gaatggagat g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen a1 <400> 10 tccaaaccac tgaaacctct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of MMP13 <400> 11 tcaccaattc ctgggaagtc t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of MMP13 <400> 12 tcaccaattc ctgggaagtc t 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen 10 <400> 13 acgctgaacg ataccaaatg 20 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of collagen 10 <400> 14 tgctatacct ttactcttta tggtgta 27 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of p53 <400> 15 ggcccacttc accgtactaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of p53 <400> 16 gtggtttcaa ggccagatgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of BAX <400> 17 tttgcttcag ggtttcatcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of BAX <400> 18 cagttgaagt tgccgtcaga 20

Claims

마트릴린-3(Matrilin-3: MATN-3) 단백질을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계; 및
배양된 줄기세포를 배지에서 3차원 세포배양(3D cell culture)하는 단계를 포함하는 줄기세포 스페로이드(spheroid)를 생산하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마트릴린-3 단백질을 포함하는 배지는 마트릴린-3 단백질의 농도가 5 내지 50ng/ml 인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마트릴린 단백질을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것의 기간의 범위는 80 시간 내지 130 시간인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 유래인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 3차원 세포배양은 펠렛(pellet) 배양법, 고정 현탁액 배양법(static suspension), 회전 챔버 배양법(spinner/rotational chamber), 나노/마이크로 패턴 배양법(nano/micro pattern), 자기부양식 배양법(Magnetic Levitation), 고체 스캐폴드 인웰 배양법(Soild scaffold in well), 하이드로겔 인웰 배양법(Hydeogells in well), 하이드로겔스 온 마이크로필러 배양법(Hydrogells on microplillar), 하이드로겔스 인 마이크로패널 배양법(Hydrogells in microchannel), 행인드랍 배양법(Hang in drop), 유 모양 웰 배양법(U shape well), 및 브이 모양 웰 배양법(V shape well) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 3차원 세포배양은 마이크로웰 당 50 내지 500개의 세포 범위에서 배양되는 것인 방법.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 줄기세포 스페로이드.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 줄기세포 스페로이드를 포함하는 연골질환 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 연골 세포로의 분화를 촉진하고, 연골세포의 비대화 및 탈분화를 억제하는 것인 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 추간판, 퇴행성 디스크, 추간판 탈출증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 골연화증, 연골손상, 및 연골결손으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.