KR101907534B1

KR101907534B1 - 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법

Info

Publication number: KR101907534B1
Application number: KR1020160113754A
Authority: KR
Inventors: 임재열; 고원건; 신현수; 최정석
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-05
Filing date: 2016-09-05
Publication date: 2018-10-12
Also published as: KR20180026881A

Abstract

본 발명은 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 선(gland) 조직에서 채취한 조직 샘플을 용해 후 3차원 스페로이드 세포배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 방법이다. 또한, 본 발명은 분리된 선줄기세포 또는 선조직 혼합 세포주를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하여, 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화된 선줄기세포 배양 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 스페로이드가 형성되는 나노섬유 기반의 마이크로 영역과 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 구성된 스케폴드 상에서 직경 200μm 크기의 3차원 스페로이드 형태의 세포 클러스터를 형성하는 선 세포, 바람직하게는 타액선줄기세포를 배양함으로써, 기능이 강화된 우수한 줄기세포 클러스터를 분리하고 배양해내는 방법에 관한 것이다. 장점은 일반적인 2차원적 세포 분리 및 배양 단계를 거치지 않고 기능이 우수한 선줄기세포의 분리 및 대량 균등 배양을 가능하게 하는 방법에 대한 것이다.

Description

3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법{Method for isolating enhanced glandular stem cells from gland tissue through three dimensional spheroid culture}

본 발명은 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 선(gland) 조직에서 채취한 조직 샘플을 용해 후 3차원 스페로이드 세포배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 방법이다. 더욱 구체적으로는, 마이크로패턴화된 나노섬유 스케폴드 상에서 직경 200 μm 크기의 3차원 스페로이드 형태의 세포 클러스터를 형성하는 선 세포, 바람직하게는 타액선줄기세포를 배양함으로서, 기능이 강화된 우수한 줄기세포 클러스터를 분리해내는 방법에 관한 것이다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있다.

첫째는 수정란으로부터 발생한 배아(배아줄기세포)로부터 얻는 것이고, 둘째는 성인이 된 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 상기 세포들은 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들 수 있는 자기재생(self-renewal) 능력을 갖고 있다.

성체줄기세포는 배아줄기세포 만큼 전분화능(totipotency)을 띄지는 않지만 다분화능(multipotency)을 가지고 있고, 또한 난자를 사용하지 않으므로 윤리적인 문제가 없고, 환자 본인의 세포를 추출하여 환자 개개인에 맞게 맞춤형 치료로 사용하기 때문에 면역거부반응도 없다는 점이 가장 큰 장점이다. 대표적인 성체줄기세포로 중간엽(간엽성) 줄기세포가 있으며 골수, 지방, 태반, 탯줄 등에서 분리가 가능하다. 이와 같은 줄기세포는 간엽성 (중간엽성) 조직인 뼈, 연골, 지방 분화가 가능하며 조직내 생착하여 면역조절 및 다양한 치료인자 분비를 통해 손상된 조직을 치유할 수 있다. 그러나 조직 내 생착률이 낮고 조직 내 구성세포로의 분화가 적은 단점이 있다.

타액선은 내배엽성 선세포와 중배엽성 상피세포 및 간질 조직으로 구성되어 있으며 선세포 - 개재도관세포 - 줄무늬관세포 - 분비관세포와 근상피세포로 구성되어 있다. 따라서 하나의 성체 세포로 타액선 조직을 재생할 수 없으며 타액선 조직의 복잡성을 그대로 재생하기 위해서는 다상분화를 유도할 수 있는 줄기세포치료제가 필요할 뿐만 아니라 단순 세포치료제 개념보다는 기능이 우수한 기능조절 줄기세포치료기술이 유용할 수 있다. 특히, 조직 손상이 광범위한 만성 타액선 기능저하 질환의 기능회복을 위해서는 줄기세포의 단일 이식 전략보다는 기능이 강화된 줄기세포의 이식을 통해 내재 줄기세포 증식 및 분화 증대, 치료인자 분비 촉진을 통한 미세환경 제어기술 개발이 새로운 해결방안이 될 수 있다.

아직까지 모든 조직세포로 분화가 가능한 타액선줄기세포는 발견되지 않았으며 다양한 줄기세포 분리 기술이 보고되고 있으나 아직까지도 최적의 분리 배양 기술이 확립되지 않은 상태이다. 기존에 인간 타액선조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법이 연구되었는데(STEM CELLS AND DEVELOPMENT 17:509-518, 2008), 이러한 타액선줄기세포 분리방법은 분리된 세포가 균등하지 않은 혼합세포의 형태이며 수율이 낮으며 대량 배양이 불가능하다는 문제가 있었다. 따라서, 보다 균등하게 대량 수득이 가능하며, 줄기세포 기능이 강화된 타액선 유래 줄기세포를 분리하는 방법이 요구되고 있다.

한편, 방사선에 의한 조직손상으로 인한 타액 분비 감소의 경우 타액선 조직 내 줄기세포 고갈로 인한 조직 재생 및 회복력의 감소가 영구적 손상의 주된 기전으로 알려져 있으며, 따라서 근본적 치료를 위해서는 조직 내재세포의 내인성 인자 분비를 촉진하여 미세환경 복원 (세포 증식, 면역 제어 강화, 신경, 혈관 재생)을 유도하거나 손상된 조직을 재건 및 대체 (내재세포로의 분화 유도 및 치료적 인자 분비를 통한 세포, 조직 재생)할 수 있는 치료 기술 개발이 필요하다. 최근 이에 대한 해결법으로 줄기세포에 기반한 치료기술 개발이 관심을 받고 있다.

한국공개특허 제10-2013-0131815호(2013.12.04 공개)

본 발명의 목적은 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 선(gland) 조직에서 채취한 조직 샘플을 용해한 후 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하여 선줄기세포를 분리하는 방법으로 일반적인 2차원적 세포 분리 및 배양 단계를 거치지 않고 기능이 우수한 선줄기세포의 분리 및 배양을 가능하게 하는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 분리된 선줄기세포 또는 선조직 혼합 세포주를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 3차원 스페로이드를 형성하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화된 선줄기세포 배양 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 3차원 스페로이드 분리배양법을 통해 수득되는 선줄기세포에 기반하는 타액분비감소 치료를 위한 세포치료제를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 200 μm 크기의 3차원 스페로이드 형태의 세포 클러스터를 형성하고 균일한 크기의 선줄기세포 스페로이드 형성을 대량으로 유도할 수 있고 안정적으로 배양 및 회수가 가능한 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 분리된 선조직에 콜라게나아제 타입 1 용액을 첨가하여 상기 선조직을 용해하는 단계; (2) 상기 용해된 선조직을 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 단계; 및 (3) 상기 배양물로부터 선줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선조직 유래 선줄기세포의 분리방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 분리된 선줄기세포 또는 선조직 혼합 세포주를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 단계; 및 (2) 상기 배양물로부터 3차원 스페로이드를 형성하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화된 선줄기세포 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 분리된 선조직 유래 선줄기세포 또는 상기 방법에 따라 배양된 기능 강화된 선줄기세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 선조직 손상 치료용 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 선줄기세포 기능강화 스페로이드 형성용 직경 100 ~ 500 μm의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드를 제공한다.

본 발명은 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능 강화 선조직 유래 선줄기세포의 분리 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 선(gland) 조직에서 채취한 조직 샘플을 용해 후 3차원 세포배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 방법으로 일반적인 2차원적 세포 분리 및 배양 단계를 거치지 않고 기능이 우수한 선줄기세포의 분리 및 배양을 가능하게 하는 방법에 대한 것이다. 본 발명에 의해 분리 및 배양된 선줄기세포 및 선줄기세포 배양액을 기반으로 하는 세포치료제는 타액선뿐만 아니라 다양한 선조직(타액선, 췌장, 신장, 간장)의 재생 및 치료를 위해 사용할 수 있다.

도 1은 타액선 조직에서 선줄기세포의 분리 및 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 수획 및 임상 적용 단계 모식도를 나타낸다.
도 2는 타액선 조직에서 분리된 선줄기세포를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하였을 때 3차원 스페로이드 형성하는 것을 전자현미경(SEM)을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 사이즈에 따라 스페로이드의 형성을 현미경적 사진 및 세포의 증식을 Live/Dead로 확인한 결과를 나타낸다. 타액선 조직에서 분리된 선줄기세포와 일차상피세포의 차이를 현미경적 사진으로 확인 및 특성 분석을 위한 PCR 신호 결과를 나타낸다.
도 3은 타액선 조직에서 분리된 선줄기세포와 기존 배양방식으로 분리한 선줄기세포 및 일차상피세포의 차이를 PCR 신호 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 타액선 조직에서 기존의 방식으로 분리된 선줄기세포와 3차원 스페로이드 배양 방식으로 분리된 선줄기세포의 줄기세포 특성 비교 검증을 위한 PCR 신호 결과를 나타낸다.
도 5는 3차원 스페로이드 배양을 통해 분리한 선줄기세포의 줄기세포 기능 강화 검증을 위한 자가증식능, 분화능에 관한 염색 결과와 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 선줄기세포의 3차원 스페로이드 배양을 통해 형성된 선줄기세포 스페로이드의 현미경적 사진 확인 및 염색 결과를 나타낸다.
도 7은 3차원 스페로이드 배양을 통해 형성된 선줄기세포 스페로이드의 줄기세포 특성 분석을 위한 염색과 FACS 분석, PCR 신호 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 3차원 배양을 통해 형성된 선줄기세포 스페로이드의 기능 강화 분석을 위한 염색과 FACS 분석, PCR 신호 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 3차원 배양을 통해 형성된 선줄기세포 스페로이드의 줄기세포 특성 분석을 위한 Microarray 분석과 PCR 신호 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 3차원 배양을 통해 형성된 선줄기세포 스페로이드의 기능 강화 증명을 위한 분화 유도 분석 결과를 나타낸다.

이에, 본 발명자들은 최적의 스페로이드 크기를 결정하여 이를 규격화, 정량화할 수 있도록 하이드로젤 패턴닝과 나노섬유 마이크로어레이 기법을 통한 스페로이드가 형성되는 나노섬유 기반의 마이크로 영역과 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 구성된 스케폴드의 3차원 배양시스템을 이용하여 타액선 조직 유래 세포를 분리 배양시 기존의 배양법보다 줄기세포능이 강화된 선줄기세포 스페로이드 클러스터를 형성할 수 있음을 발견하였고, 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 (1) 분리된 선조직에 콜라게나아제 타입 1 용액을 첨가하여 상기 선조직을 용해하는 단계; (2) 상기 용해된 선조직을 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 단계; 및 (3) 상기 배양물로부터 선줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선조직 유래 선줄기세포의 분리방법을 제공한다.

이 때, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 스페로이드가 형성되는 나노섬유 기반의 마이크로 영역과 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 구성된 스케폴드로서, 사각형 마이크로패턴의 크기는 100 ~ 500 μm인 것을 특징으로 하며 가장 바람직하게는 200 μm이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의해 형성된 선줄기세포 클러스터는 200 μm의 직경을 가지게 되는데 이러한 크기가 기능이 우수한 선줄기세포 분리에 가장 효과적인 바, 본 발명의 방법이 선줄기세포 분리 배양에 적합한 것이다.

분리 배양에 사용할 수 있는 선 조직은 타액선, 간, 췌장, 신장과 같이 발생 기원이 유사한 선 장기 중 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시에서는 타액선을 사용하였다.

바람직하게는, 분리 배양에 사용할 수 있는 세포주는 타액선, 간, 췌장, 신장에서 일차배양방식으로 배양한 혼합 세포주 중 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시에서는 타액선을 사용하여 분리 배양한 타액선줄기세포를 사용하였다.

바람직하게는, 상기 선줄기세포는 상피성 줄기세포 마커인 Lgr5, 중간엽성 줄기세포 마커인 CD90, CD29, 미분화 줄기세포 마커인 OCT4, Nanog 및 SOX2의 발현이 증가된 선줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 선줄기세포는 간엽성 세포인 연골, 뼈, 지방세포로의 분화능이 향상되며 선 조직 구성세포인 선세포, 간세포로의 분화능도 향상된 기능강화 선줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 스페로이드가 형성되는 나노섬유 기반의 마이크로 영역과 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 구성된 스케폴드로서, 사각형 마이크로패턴의 크기는 100 ~ 500 μm인 것을 특징으로 하며 가장 바람직하게는 200 μm이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 3차원 스페로이드를 형성하는 단계는 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3 내지 7일 동안 배양함으로써 선줄기세포 스페로이드를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 선줄기세포는 타액선줄기세포 또는 타액선상피전구세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 기능 강화된 선줄기세포는 자가복제능 또는 연골세포, 지방세포, 골세포, 선세포 또는 간세포 분화능이 강화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 바닥은 나노섬유 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polycaprolactone(PCL), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), Polylactic acid (PLA) 등으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 PCL을 사용하였다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 벽은 하이드로젤 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid (HA), alginate 등으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 실시예에서는 Polyethylene glycol (PEG)를 사용하였다.

이처럼, 본 발명은 선줄기세포의 분리 배양에 관한 것으로, 선줄기세포 스페로이드 클러스터 형성을 통해 기능이 우수한 선줄기세포를 분리 배양하는 방법에 관한 것으로, 대량 균등 분리 배양이 가능하고 스페로이드 크기 제어가 가능한 하이드로겔 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드, 특히 크기가 200 μm의 직경을 갖는 사각형 마이크로패턴을 이용하여 선 조직을 용해하여 배양함으로써 기능강화 선줄기세포 스페로이드를 형성시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

“타액(saliva)”은 이하선, 악하선, 설하선 및 구강점막에 존재하는 점액선 등으로부터 분비되는 혼합액이다. 타액은 인체의 핵심 성분으로 타액선에서 생성되어 구강 내로 배출된다. 타액은 인체의 필수 성분으로서, 생체활성단백질, 소화효소, 점액, 면역글로불린, 각종 염류 등이 포함되어 있다.

타액은 구강 내 건강뿐만 아니라 인체의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 수행한다. 예를 들어 타액의 주요 성분인 뮤신(mucin), 면역글로불린 등은 외부의 감염으로부터 1차적인 방어 역할을 수행하며, 구강 및 치아의 윤활 및 수분 유지, pH 중화 기능을 통하여 구강점막 및 치아를 보호한다. 뿐만 아니라 타액에는 프티알린(ptyalin) 등의 아밀라아제(amylase)와 같은 소화 효소들이 있어 전분을 말토오스 단위까지 분해하는 등 소화를 촉진시키는 기능을 담당한다. 또한 타액의 분비에 의하여 인체의 수분대사 및 체온 조절이 이루어질 수 있으며, 유독물(I, Hg, Pb 등)을 배설하기도 한다.

“타액선(침샘, salivary gland)”은 타액을 생성, 분비하는 기관으로 이하선(귀밑샘, parotid gland), 악하선(턱밑샘, submaxillary gland), 설하선(혀밑샘, sublingual gland)과 같은 주타액선(major salivary gland)과, 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막(mucous membrane of oral cavity)에 존재하는 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막의 여러 부위에 분포하는 소타액선(minor salivary gland)으로 분류된다.

“구강건조증 (xerostomia)”은 입이 마른다고 느끼는 주관적인 증상을 일반적으로 의미한다. 구강건조증은 객관적인 타액분비의 저하를 동반하는 경우가 많고, 타액의 성분에 변화가 있어도 그 증상이 유발된다고 알려져 있다.

일반적으로 성인은 하루에 1~1.5L의 타액이 분비되며, 정상적인 타액의 양은 자극이 없을 때는 분당 0.3~0.4ml, 자극이 있을 때는 분당 1.5~2.0 ml가 분비되어야 한다. 통상적으로 타액의 분비가 50% 이상 감소된 환자의 경우 구강건조증의 증상이 나타난다고 알려져 있다. 또한 입으로 숨을 쉬면서 입 안의 수분이 증발되면 주관적으로 구강의 건조함을 느낄 수 있다. 타액분비의 저하를 가지고 있는 구강건조증 환자들은 구강점막에서 흡수되는 타액의 양과 구강에서 증발되는 타액의 양을 합친 것보다 타액이 적게 분비될 때 보통 진단이 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 자극 시 분당 05~0.7ml 이하 또는 비자극시 분당 0.1ml 이하의 타액이 분비되는 경우에 “타액분비저하증 (hyposalivation)”으로 정의한다.

본 발명에 있어서, "스페로이드(spheroid)"란 3차 조직배양을 통하여 만들어지는 작은‘구’체로서, 스페로이드는 일종의 작은‘조직’으로서, 외부와 내부가 구분되어 기능이 나뉘기도 하며, 조직의 기능적 단위를 모사하는 형태를 띤다. 스페로이드 배양은 동물이나 인체 조직이 가지고 있는 고유 형태나 성질이 비슷할 뿐만 아니라, 이를 적용하여 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 개발되고 있다.

본 발명에서 있어서, "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "선조직 손상 치료"는 타액선, 췌장, 신장, 간장 등의 선조식의 재생 및 치료를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

다만, 본 발명에 있어서 바람직하게는 타액선 손상 치료에 사용될 수 있다. '타액선 손상'이란 임의의 원인에 의해 타액선이 손상된 경우를 포함하며, 상기 타액선 손상시 타액의 분비가 감소하여, 구강 건조증이 나타날 수 있으며, 구강 건조증으로 인해 충치, 불면, 소화불량, 세균 감염, 미각저하 등이 나타날 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 선조직 손상 치료용 세포 치료제가 타액선 손상 치료에 사용되는 경우, 타액선 손상, 구강 건조증, 구강 건조증으로 인한 충치, 불면, 소화불량, 세균 감염, 미각저하 등의 치료에 사용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 선조직 손상 치료용 세포 치료제는 정맥주사, 피하주사, 또는 근육주사와 같은 비경구 투여 뿐만 아니라, 선조직 손상 부위에 직접 투여할 수 있다. 상기 세포 치료제는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 적절한 투여경로에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 부가하여 제조할 수 있다. 상기 담체의 선택은 특정한 투여 제형의 특성, 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 담체의 효과와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.

상기 본 발명에 따른 세포치료제는 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 언급된 제제에 사용되는 담체와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 바에 따라 선택하고 제조할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 세포 치료제의 투여량은 선조직 손상의 진행 정도, 투여대상의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 투여 횟수에 따라서 달라질 수 있다. 인간에 대한 세포치료제의 통상적인 투여량은 10⁴~10¹⁰ cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 사람 선줄기세포 분리 및 배양

1. 사람 선줄기세포의 3차원 배양을 통한 분리

타액선 조직을 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 타액선 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시킨 조직을 80 ㎛의 조직 거름망 (Cell Strainers)을 이용하여 조직을 걸러낸 뒤, 상청액만 모아서 원심분리기 1500rpm, 5분간 돌려준다. 원심분리 후에 상층액은 제거하고 세포를 분리하였다. 분리한 세포에 DMEM 배지를 넣고 섞어준 뒤 200 ㎛의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드(바닥은 PCL 등과 같은 나노섬유, 벽은 PEG 등과 같은 하이드로젤로 마이크로패턴닝하여 제작) 세포지지체 위에 세포를 깔아주었다. 선줄기세포의 3차원 스페로이드를 유도하는 것을 특징으로 7 일간 200 ㎛의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고, DMEM 배지 (Dulbecco Modified Eagle Medium)에서 배양하여 광학현미경(microscopy)으로 스페로이드를 관찰하였다(도 1 및 도 2).

2. 사람 선줄기세포와 상피세포의 차이 분석

타액선 조직을 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 타액선 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시킨 조직을 2차원 배양하여, KSFM 배지 [Keratinocyte-SFM (serum-free medium)]에서 분리 및 배양하여 광학현미경(microscopy)으로 사람의 타액선 상피세포를 관찰하였다(도 2). 3차원 배양을 통해 분리한 선줄기세포에서 2차원 배양에 비해 Amylase, AQP5의 발현정도가 감소된 것을 Real-time PCR로 확인하였다(도 2).

3. 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

Real-time PCR을 위해서 수거된 세포를 세포 용해 용액 (Trizol solution)을 처리한 후 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4℃에서 10분 동안 방치 후 다시 원심 분리하였다. 상층액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃, 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다(도 3). 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 다음과 같다(표 1).

α-Amylase (AMY1A)	F	CATTGACATTGGCGTAGCAG
α-Amylase (AMY1A)	R	CAGAATGTCAAGATGGATGC
Aquaporin 5 (AQP5)	F	CTCTGCATCTTCTCCTCCACG
Aquaporin 5 (AQP5)	R	TCCTCTCTATGATCTTCCCAG
Integrin β1 (CD29)	F	GAAGGGTTGCCCTCCAGA
Integrin β1 (CD29)	R	GCTTGAGCTTCTCTGCTGTT
CD90 (Thy-1)	F	GACAGCCTGAGAGGGTCTTG
CD90 (Thy-1)	R	CCCAGTGAAGATGCAGGTTT
Leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5 (LGR5)	F	AGGATCTGGTGAGCCTGAGAA
	R	CATAAGTGATGCTGGAGCTGGTAA
POU5F1(OCT4)	F	CTTGATCCTCGGACCGGCTA
POU5F1(OCT4)	R	GGTTGCCTCTCACTCGGTTCT
Nanog	F	TGCAGCACAAGAAAGACCAC
Nanog	R	GCCACATGAAAGGTCTCCAT

4. 3차원 스페로이드 배양을 통해 분리한 선줄기세포체의 줄기세포 특성 분석

마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3차원 스페로이드 분리 배양한 선줄기세포를 Real-time PCR을 통해 분석을 실시하였다. 3차원 배양을 통해 분리한 선줄기세포는 기존에 분리하던 선줄기세포 분리방법에 비해 CD90, OCT4, Nanog, SOX2등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 3 및 도 4).

< 실시예 2> 3차원 스페로이드 배양을 통해 분리 및 배양한 선줄기세포체의 줄기세포 특성 분석

1. 선줄기세포체의 줄기세포 특성 분석

마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3차원 스페로이드 분리 배양한 선줄기세포를 Real-time PCR, western blotting을 통해 분석을 실시하였다. 3차원 배양법을 사용하여 분리 및 배양된 선줄기세포가 2차원 배양, 기존의 선줄기세포의 분리 방법에 비해 CD90, CD29, OCT4, Nanog, SOX2등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 Real-time PCR, western blotting으로 확인하였다 (도 4).

2. 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다(도 4). 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 표 1과 같다.

3. 웨스턴 블랏 분석을 통한 줄기세포 마커 확인

먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색 (electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고, 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: anti-Krt5, anti-Nanog, anti-OCT4, anti-SOX2 (Abcam, Cambridge, UK), β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출 (Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다(도 4).

4. 선줄기세포체의 줄기세포 특성인 자가복제능력, 분화 분석

마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3차원 스페로이드 분리 배양한 선줄기세포를 Self-renewal, mesenchymal cells (adipogenic, osteogenic, and chondrogenic) and hepatic cell로 분화하는 실험을 통해 분석을 실시하였다. 3차원 배양법을 사용하여 분리 및 배양된 선줄기세포는 자가복제 및 분화능력을 확인하였다(도 5).

5. 유세포 분석(Flow cytometry )

분리된 세포를 확인하기 위해 fluorescence-activated cell sorting (FACS)을 시행하였다. 분리 배양된 선줄기세포를 0.05% trypsin/EDTA로 처리한 후 각각 1×10⁴ 씩 분주하고, FACS buffer (1% 우태 혈청과 0.05% sodium azide가 포함된 PBS)로 부유한 다음 anti-CD29, anti-CD90, anti-CD45, anti-OCT4, anti-E-cadherin, anti-HLA-DR (BD Biosciences)를 2 μL씩 넣어 30분간 4℃에서 염색하였다. 이 후, 염색된 세포를 FACS buffer 500 μL에 부유하여 FACS analysis (BD FACSverse flow cytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 수행하였고, BD FACSuite software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 선줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 CD90, CD29, OCT4등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 FACS로 확인하였다 (도 5).

6. 선줄기세포의 분화

(1) 연골세포분화: 우태혈청이 포함되지 않은 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM) 배지에 2×10⁵개의 세포수로 15 mL polypropylene tube에 넣은 후 원심 분리하여 펠렛을 얻었으며 6주간 분화 배양하였다. 연골세포 분화배지는 10 ng/mL TGF-3, dexamethasone, 50 g/mL ascorbicacid, 40 g/mL proline, 100 g/mL pyruvate (Sigma) 그리고 50 mg/mL ITS+ Premix (BectonDickinson)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 연골세포분화를 하였다 (도 5).

(2) 지방세포분화: 중간엽 줄기세포 1×10⁵ 개를 12 well plate에 분주하여 하루 동안 배양한 후 1 ml의 지방분화유도배지는 10% FBS, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX, 200 μl indomethacin를 포함하는 α-MEM에서 7일간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Oil Red O (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 지질적화 형성을 관찰하였다 (도 5).

(3) 골세포 분화: 중간엽 줄기세포 1×10⁵ 개를 12 well plate에 분주하여 하루동안 배양 한 후 1 ml의 골분화유도배지는 10% FBS, 0.1 uM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate, 0.5 mM ascorbate-2-phosphate를 포함하는 α-MEM에서 2주간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Alizarin Red S (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 석회화 결절 형성을 관찰하였다 (도 5).

(4) 선세포분화: 선줄기세포를 1×10⁵ 개를 마트리젤로 코팅한 6 well plate에 분주하여 Hepato-STIMs 배지에서 배양한다. 분화 배지 (Hepato-STIMs, 2mM L-glutamine, 1% PS, 20ng/ml EGF)에서 3 일간 분화를 유도함으로써, 타액선 상피세포의 특징을 관찰하였다 (도 5).

(5) 간세포분화: 줄기세포를 30 ㎜ dish에 ㎜2 당 5×10⁴ 세포로 seeding하고 세포가 85% 이상 자라면 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지로 교환한 후 48시간 배양한다. 분화 배지 (DMEM, 40% MCDB201, 2% FBS, 1X PS, 20ng/ml HGF, 10ng/ml FGF)에서 7일 혹은 14일간 분화를 유도함으로써, 간세포의 형태와 유사한 입방(cuboidal) 형태의 세포로 분화 및 성숙을 광학 현미경 하에서 관찰하였다 (도 5).

< 실시예 3> 기존의 일반배양으로 분리된 선줄기세포의 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능강화 확인

1. 사람 선줄기세포의 3차원 스페로이드 배양

사람 선줄기세포의 3차원 배양을 위해 7 일간 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고 배양하여 광학현미경(microscopy) 및 LIVE/DEAD kit를 이용하여 스페로이드를 관찰하였다. Calcein AM (calcein acetoxymethyl ester)과 ethidium homodimer-1 사용하여 형광 현미경을 통해 줄기세포의 스페로이드(spheroid) 생성 유도시 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다. 3차원 배양법을 이용하여 7 일간 마이크로 웰에서 사람 선줄기세포를 배양한 결과, 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. LIVE/DEAD 염색법을 통해 이미지를 확인한 결과, 스페로이드가 내부 괴사 없이 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다 (도 6).

2. 면역형광 염색법

면역형광 염색법은 4 % 파라포름 알데하이드 용액에서 세포를 고정 후, 0.01% 트리톤 x-100 용액을 상온에서 10분간 처리한 후 세포 표면에 구멍을 내어준다. 막을 PBS 내 1% 보바인 세럼으로 실온에서 1시간 동안 차단시키고 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. anti-α-amylase, anti-ZO-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-Occludin (Thermo Scientific, San Diego, CA, USA) or anti-AQP5 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel) PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척한 후, 각 1차 항체에 상응하는 형광-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며, PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척 후, 핵을 염색하기 위해 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 상온에서 5분간 염색하였다. Slide glass에 fluoresence가 fade되는 것을 막아주는 mounting solution을 떨어뜨려 mounting을 한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 선줄기세포의 스페로이드가 2차원 배양에 비해 Amylase, AQP5의 형광 발현정도가 감소된 것을 보였다(도 6).

3. 3차원 배양을 통해 분리한 선줄기세포체의 줄기세포 특성 분석

사람 선줄기세포의 3차원 배양 조건에서 7 일간 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양한 세포들을 FACS, Real-time PCR, western blotting을 통해 분석을 실시하였다. 3차원 배양법을 사용하여 제조된 선줄기세포의 스페로이드가 2차원 배양에 비해 Amylase, AQP5의 발현정도가 감소된 것을 확인하였다(도 7). 또한 선줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 CD90, CD29, OCT4, Nanog, SOX2등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 FACS, Real-time PCR, western blotting으로 확인하였다(도 7).

4. 3차원 스페로이드 선줄기세포체 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 분석

3차원 스페로이드 선줄기세포체 배양을 거듭함으로써 선줄기세포의 기능강화와 줄기세포의 특징을 관찰하였다. 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고 배양하여(도 8) 광학현미경(microscopy)으로 관찰하였고, 3차원 스페로이드 선줄기세포체 배양을 거듭한 후 passage에 따라 줄기세포의 특성을 FACS, Real-time PCR, western blotting으로 확인하였다(도 8).

(1) 유세포 분석(Flow cytometry)

분리된 세포를 확인하기 위해 fluorescence-activated cell sorting (FACS)을 시행하였다. 분리 배양된 선줄기세포를 0.05% trypsin/EDTA로 처리한 후 각각 1×10⁴ 씩 분주하고, FACS buffer (1% 우태 혈청과 0.05% sodium azide가 포함된 PBS)로 부유한 다음 anti-CD29, anti-CD90, anti-CD45, anti-OCT4, anti-E-cadherin, anti-HLA-DR (BD Biosciences)를 2 μL씩 넣어 30분간 4℃에서 염색하였다. 이 후, 염색된 세포를 FACS buffer 500 μL에 부유하여 FACS analysis (BD FACSverse flow cytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 수행하였고, BD FACSuite software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 선줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 CD90, OCT4등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 FACS로 확인하였다(도 8).

(2) 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열을 표 1과 같다. 줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 CD90, OCT4, Nanog, LGR5등 줄기세포의 마커가 passage 5까지는 유의적으로 증가하지만, passage 10 정도에는 줄기세포의 특징이 감소하는 것을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 8).

(3) 웨스턴 블랏 분석을 통한 줄기세포 마커 확인

먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: anti-Krt5, anti-Nanog, anti-OCT4, anti-SOX2 (Abcam, Cambridge, UK), β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다. 줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 Krt5, OCT4, Nanog, SOX2 줄기세포의 마커가 passage 5까지는 유의적으로 증가하지만, passage 10정도에는 줄기세포의 특징이 감소하는 것을 확인하였다(도 8).

5. Microarray를 통한 선줄기세포 기능 강화 분석

(1) Microarray

구조 유전체학의 결과로 얻어진 모든 유전자들을 대표하는 DNA 조각 (PCR product 또는 oligo-DNA)을 준비하여 최종적으로 수용액 상태로 녹여 각각의 유전자를 384 well plate에 담아 준비한다. 여러 개 핀이 달려 있는 자동화된 제작기를 사용하여 광학 현미경용 슬라이드 유리판에 DNA들을 고밀도로 집적 시킨다. 이때 유리판은 화학적인 코팅을 하여 DNA가 잘 붙을 수 있도록 되어 있다. 핀의 끝부분은 펜촉과 같은 형태로 갈라져 있으며 이로인해 모세관 현상으로 수용액으로 된 DNA를 머금게 된다. 그런 후 핀들은 자동화 시스템에 의해 유리판으로 다가가 바둑판 모양으로 질서정렬하게 DNA들을 심게 된다. 이후 일련의 프로세싱과정을 거쳐 DNA 마이크로어레이 (생화학적인 DNA 칩)가 완성된다. 현재 많이 사용하고 있는 Affymetrix 사에서 개발한 Microarray 방법으로 실험을 진행하였다.

마이크로어레이 실험은 유리판에 붙어 있는 수천 개의 해당유전자 probe 에 경쟁적으로 서로 결합 반응한 타겟 유전자량의 차이에 따라 나타나는 색상 변화에 의해 테스터 세포안의 순간의 유전자들의 발현 상태(up or down-regulation)를 알 수 있다. 수천 수 만개의 유전자를 대상으로 그리고 여러 번의 다른 실험결과를 대상으로 원활한 데이터 분석을 위해서는 색상변화로 나타낸 유전자 발현 양상을 수치화 시켜 데이터베이스화 하였다. 입력된 데이터를 이용하여 전체 실험상에서 유전자 발현 (gene expression pattern)의 유사한 정도(similarity)에 따라 유전자들을 그룹화 하였다. 이때 이용되는 방법은 주로 스탠다드 알고리즘을 응용한 clustering 방법을 사용 하였고, clustering 분석방법의 가장 중요한 목적은 실험간 또는 각 유전자들 간의 유사한 정도를 확인하였다. 3차원 배양을 통해 기능이 강화된 줄기세포의 스페로이드는 실제로 어레이 결과에서 stemness, 줄기세포 관련 신호전달이 증가되어 있음을 확인하였다(도 9).

(2) 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

Real-time PCR을 위해서 수거된 세포를 세포 용해 용액 (Trizol solution)을 처리한 후 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4℃에서 10분 동안 방치 후 다시 원심 분리하였다. 상층액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃ 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열을 다음과 같다. 줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 WNT3A, WNT9A등의 줄기세포 관련 신호전달에 관여하는 Agonist들이 증가하는 것을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 9).

(3) 웨스턴 블랏 분석을 통한 줄기세포 마커 확인

먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: anti-LGR5, anti-AXIN2, anti-GSK3β (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-β-catenin, anti-LaminB1, anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다. 줄기세포의 스페로이드는 2차원 배양에 비해 LGR5, AXIN2, GSK3β, β-catenin과 같은 줄기세포 관련 신호전달 마커가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 9).

6. 3차원 스페로이드 배양 후 선줄기세포의 기능 강화 증명을 위한 분화 유도 분석

3차원 스페로이드 선줄기세포체 배양 후 기능 강화된 선줄기세포를 타액선상피세로로 분화를 유도하여 타액선상피세포의 특징을 관찰하였다. 3차원 PCL-마이크로 웰 (PCL-microwell)에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고 배양하여 분화를 시킨 후(도 10) 광학현미경(microscopy)으로 관찰하였고, 3차원 스페로이드 선줄기세포체 배양 후 타액선상피세로로 분화를 유도하여 타액선상피세포의 특성을 Real-time PCR, western blotting, immunofluorescence assay로 확인하였다(도 10).

(1) 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열을 다음과 같다. 2차원 배양 후 분화시켰을 때 보다 줄기세포의 스페로이드를 분화시켰을 때 amylase, AQP5 타액선상피세포의 마커가 유의적으로 증가하는 것을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 10).

(2) 웨스턴 블랏 분석을 통한 줄기세포 마커 확인

먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다: anti-Krt5, anti-Nanog, anti-OCT4, anti-SOX2 (Abcam, Cambridge, UK), β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다. 2차원 배양 후 분화시켰을 때 보다 줄기세포의 스페로이드를 분화시켰을 때 amylase, AQP5 타액선상피세포의 마커가 유의적으로 증가하는 것을 western blotting으로 확인하였다(도 10).

(3) 면역형광 염색법

면역형광 염색법은 4 % 파라포름 알데하이드 용액에서 세포를 고정 후, 0.01 % 트리톤 x-100 용액을 상온에서 10분간 처리한 후 세포 표면에 구멍을 내어준다. 막을 PBS 내 1% 보바인 세럼으로 실온에서 1시간 동안 차단시키고 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다: anti-α-amylase, anti-ZO-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-Occludin (Thermo Scientific, San Diego, CA, USA) or anti-AQP5 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), anti-E-cadherin (BD Bioscience, Bedford, MA, USA), and anti-F-actin (Abcam, Cambridge, MA, USA) PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척한 후, 각 1차 항체에 상응하는 형광-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척 후, 핵을 염색하기 위해 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 상온에서 5분간 염색하였다. Slide glass에 fluoresence가 fade되는 것을 막아주는 mounting solution을 떨어뜨려 mounting을 한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 2차원 배양 후 분화시켰을 때 보다 줄기세포의 스페로이드를 분화시켰을 때 amylase, AQP5 타액선상피세포의 마커가 유의적으로 많이 발현되는 것을 immunofluorescence assay로 확인하였다(도 10).

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(1) 분리된 선줄기세포 또는 선조직 혼합 세포주를 바닥은 나노섬유 기반의 마이크로 영역, 벽은 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 정사각면체 형태의 패터닝으로 구성된 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 단계;
(2) 상기 배양물로부터 3차원 스페로이드를 형성하는 단계; 및
(3) 상기 형성된 3차원 스페로이드를 1 내지 5회 계대배양하는 단계를 포함하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
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제8항에 있어서, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 100 내지 500 ㎛의 정사각면체 형태의 3차원 배양용 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제10항에 있어서, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 200 ㎛×200 ㎛의 정사각형을 바닥으로 하고, 높이 150 내지 300 ㎛의 벽으로 이루어진 마이크로웰 형태인 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제8항에 있어서, 상기 3차원 스페로이드를 형성하는 단계는 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제8항에 있어서, 상기 선줄기세포는 타액선줄기세포 또는 타액선상피전구세포인 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제8항에 있어서, 상기 기능 강화된 선줄기세포는 줄기세포성 마커인 Lgr5, CD90, CD29, OCT4, Nanog 및 SOX2의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제8항에 있어서, 상기 기능 강화된 선줄기세포는 자가복제능 또는 연골세포, 지방세포, 골세포, 선세포 또는 간세포 분화능이 강화된 것을 특징으로 하는 3차원 스페로이드 배양을 통한 선줄기세포 기능 강화 방법.
제8항, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 기능 강화된 선줄기세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 선조직 손상 치료용 세포치료제.
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